Summary
חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.
Abstract
השינויים post-translational של חלבונים חיוניים לוויסות תקין של אותות תאיים. בין השינויים האלה, צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו) הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently שאריות ליזין מגוון רחב של חלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים, שעתוק גנים, תיקון ה-DNA, חלבונים האינטראקציה השפלה, תחבורה subcellular ו מעבר אותות. הגישה הנפוצה ביותר כדי זיהוי חלבונים SUMOylation מבוסס על הביטוי ולטיהור מתויג חומרים של חיידקים, המאפשרות במבחנה הביוכימי לתגובה וזה פשוט מתאימים למיעון מכניסטית שאלות. עם זאת, בשל המורכבות של התהליך של SUMOylation ויוו, זה יותר מאתגר כדי לזהות ולנתח חלבון SUMOylation בתאים, במיוחד כאשר תחת תנאים אנדוגני. מחקר שנערך לאחרונה על ידי מחברי המאמר חשף רטינובלסטומה אנדוגני (רובידיום) חלבון, מדכאי מהווה מרכיב ברגולציה השלילית של ההתקדמות מחזור התא, הוא במיוחד SUMOylated בשלב G1 מוקדם. מאמר זה מתאר פרוטוקול זיהוי, ניתוח של Rb SUMOylation בתנאים אנדוגני והן אקסוגני בתאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאים החקירה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של הסומו-השינוי של Rb, כמו גם רבים אחרים, ממוקדות סומו חלבונים, בתאים אנושיים.
Introduction
שליטה מדויקת של מחזור התא. להתקדם בתוך התאים האיקריוטים מבוסס על רשת רגולציה הדוקה, אשר מבטיח כי האירועים מתקיימים בצורה מסודרת1,2. אחד השחקנים מפתח רשת זו הוא החלבון רטינובלסטומה (Rb), הראשון משובטים הגידול משתיק קול1,3. חלבון Rb נחשב מווסת שלילי של התקדמות מחזור התא, במיוחד עבור ה-G0/G1 מעבר פאזה S ולאחר גידול צמיחה4,5. כישלון של פונקציה Rb גם ישירות מוביל גידול ממאיר תוך-עיני הנפוצות ביותר אצל ילדים, רטינובלסטומה, או תורם להתפתחות של סוגים רבים אחרים של סרטן5. יתר על כן, Rb מעורב משעולים הסלולר רבים כולל תאית התמיינות, כרומטין שיפוץ של אפופטוזיס המיטוכונדריה בתיווך3,6,7.
שינויים post-translational לשחק תפקיד מרכזי בוויסות RB פונקציה8,9. זרחון הוא אחד שינוי כזה, זה בדרך כלל מוביל Rb איון. בתאים G0 השבתה הדרגתית, Rb פעילה עם רמה נמוכה זירחון. כמו תאים התקדמות דרך שלב G0/G1, Rb הוא ברצף היפר-phosphorylated על ידי סדרה של חלבון cyclin תלוית kinases (CDKs), cyclins, כגון cyclin E/CDK2, cyclin D/CDK4/6, אשר בטל Rb ולחסל את יכולתו לדכא את מחזור התא הקשורים גנים ביטוי4,10. Rb יכול גם להיות שונה על-ידי צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו)11,12,13.
סומו הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently מגוון רחב של חלבונים היעד. . זה קריטי עבור תהליכים תאיים מגוונים, כולל תקנה מחזור התא, שעתוק, לוקליזציה הסלולר חלבון, השפלה, תחבורה ו DNA תיקון14,15,16, 17 , 18. סומו ההטיה מסלול מורכב dimeric סומו E1 הפעלת האנזים SAE1/UBA2, יחיד E2 conjugating האנזים Ubc9, ligases E3 מרובים, פרוטאזות סומו ספציפיים. באופן כללי, חלבונים סומו nascent יש לעבד proteolytically כדי ליצור את הטופס בוגרת. בגלל הסומו בוגרת מופעל על ידי heterodimer E1, הועבר לאחר מכן האנזים E2 Ubc9. בסופו של דבר, גליצין C-מסוף של סומו הוא covalently מצומדת על פי ליזין היעד של מצע, תהליך זה בדרך כלל בהנחייתם של E3 ligases. החלבון סומו ניתן להסיר את המצע ששונה על-ידי פרוטאזות ספציפיים. מחקר קודם על ידי מחברי המאמר חשף כי SUMOylation של Rb מגביר שלה מחייב CDK2, שמוביל hyper-זרחון בשלב G1 מוקדם, תהליך אשר יש צורך מחזור התא התקדמות13. גם להדגים כי האובדן של Rb SUMOylation גורמת שגשוג תאים ירד. יתר על כן, לאחרונה הוכח כי SUMOylation של Rb מגן על חלבון Rb תחלופת proteasomal, ובכך מגדילים את רמת חלבון Rb תאים19. לכן, SUMOylation ממלא תפקיד חשוב בתפקוד Rb בתהליכים הסלולר השונות. כדי להמשיך לחקור תוצאה פונקציונלית והרלוונטיות פיזיולוגיים של Rb SUMOylation, חשוב לפתח שיטה יעילה כדי לנתח את מצב סומו Rb תאים אנושיים או רקמות החולה.
SUMOylation הוא תהליך הפיך, דינמי מאוד. לכן בדרך כלל קשה לזהות את החלבונים סומו-השתנה בתנאים לחלוטין אנדוגני. מאמר זה מציג שיטה לגילוי SUMOylation Rb אנדוגני. יתר על כן, זה מראה איך מזהים SUMOylation Rb אקסוגני של פראי-סוג Rb והן המוטציה שלה לקויה סומו11. בפרט, ג'ייקובס. ואח תיאר שיטה להגדיל את השינוי סומו של מצע נתון במיוחד על ידי SUMOylation (UFDS) מכוון היתוך של Ubc920. מבוסס על שיטה זו, פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח SUMOylation כפויה של Rb והשלכותיה פונקציונלי. בהתחשב בכך מאות סומו סובסטרטים שתוארו קודם לכן, נוסף בשם דיאלקטריים סומו זוהו של מבחני רבים מבוססי פרוטיאומיה מבנית, פרוטוקול זה ניתן להחיל לנתח הסומו-השינוי של אלה חלבונים בתאים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-זיהוי של אנדוגני Rb SUMOylation בשלב G1 מוקדם
- תא סינכרון תרבות, מחזור התא.
- HEK293 לשמור על תאים מדיום הגידול המכיל Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% עט-דלקת ו-10% עוברית שור סרום (FBS)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 בתוך אינקובטור.
- לסנכרן את התאים HEK293 בשלב G0.
- ספירת התאים HEK293 משתמש של hemocytometer וזרע ~1.5 x 10 7 תאים 15 ס מ צלחת עם 25 מ ל מדיום הגידול עבור 24 שעות לפני הטיפול. כשמגיעים זרימה של 70% - 80%, לשאוב את המדיום ואת שטיפת התאים פעמיים עם 5 מ"ל prewarmed באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
- להוסיף 25 מ ל DMEM המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין דגירה התאים ב 37 ° C עבור ה 72 לשטוף את התאים מהצלחת באמצעות 3 מ"ל PBS קר כקרח. להעביר את התאים לתוך צינור 5 מ ל.
- נושא חלק קטן של תאים ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה (שלב 1.2); איסוף רוב התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן אותם במקפיא טמפרטורה האולטרה-נמוך עד ניתוח של Rb SUMOylation.
- כדי להשיג שלב G1 תאים, בסופו של תהליך הסינכרון G0, להסיר את DMEM ולהוסיף מדיום הגידול חוזרים רעננים, ובכך מאפשר את התאים HEK293 להזין מחדש את מחזור התא. לאחר מכן, לאסוף את התאים ב G1 לויזה (G1 מוקדם: 30 דקות; G1: 2 h) עבור מחזור התא ניתוח וסומו נוספת assay.
- לסנכרן את התאים HEK293 בשלב S בשיטת כפול-תימידין בלוק.
תאים
- לתאים לגדול HEK293 confluency של 50%, לשטוף עם prewarmed PBS. לאחר מכן להוסיף את מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור 18 h (רחוב הראשונים).
- להסיר את המדיום המכיל תימידין, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם prewarmed PBS. הוסף את מדיום הגידול טריים עבור 14 h לשחרר את התאים.
- למחוק את המדיום עם פיפטה ולהוסיף מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור עוד 18 h (בלוק השני) לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.
- הסינכרון עבור ה G2/M, צלחת ~1.5 × 10 7 HEK293 לתאים מאכל 15 ס מ עם 25 מ ל מדיום הגידול במשך 24 שעות ביממה. לאחר מכן להוסיף nocodazole המדיום עד ריכוז סופי של 400 ננוגרם למ"ל, מתקבל. לבסוף, דגירה את התאים עבור 16 h לפני ביצוע הניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.
- ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה.
- מחדש להשעות את HEK293 מסונכרנות ב- PBS ולאחר מכן לתקן התליה תא באמצעות אתנול 70% קר כקרח עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס. שים לב כי כדי למזער תא קיבוץ באשכולות, להוסיף התליה תא dropwise קר כקרח האתנול 100% בריכוז סופי של 70% אתנול תוך בעדינות vortexing.
- Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 500 x g, ואז למחוק את תגובת שיקוע בקפידה-לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. חזור על השלב צנטריפוגה. 50 המכיל
- להוסיף 500 µL PBS µg/mL חומצת גרעין כתם propidium יודיד, 0.1% טריטון X-100 ו- 1 µg/mL RNase A לתאים ומערבבים היטב. דגירה התאים למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לאחסן את הדגימות ב 4 ° C עד ניתוח על ידי cytometry זרימה.
- Immunoprecipitation של חלבון Rb אנדוגני.
Lysates תא
- להכין HEK293.
- Lyse התאים HEK293 מסונכרן על ידי בעדינות השעיית אותם מחדש ב 1 מ"ל של רדיו כקרח-immunoprecipitation assay (ריפה) פירוק מאגר (טבלה 1) המכיל טרי הוסיף 20 מ מ N-Ethylmaleimide, מעכב isopeptidase יכול לחסום סומו פרוטאזות ולייצב את הסומו conjugates.
- עוד homogenize את התאים על הקרח על ידי דאונס המגון, sonication או פשוט עובר עשר פעמים דרך מחט 21 G המחובר מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, דגירה התאים על קרח 5 דק
הערה: anionic דטרגנט נתרן dodecyl גופרתי (מרחביות) במאגר ריפה הוא קריטי עבור קביעת מאוחר יותר Rb-הסומו, כמו זה יכול לחסל את האות סומו לא ספציפי זה נגזרת מהאינטראקציה הלא-קוולנטיות בין חלבון Rb לבין השני סומו-מינים שאינם Rb.
- Centrifuge את lysates תא ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס להעביר supernatants את צינורות חדשים של מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL-
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את החלבונים ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים. - להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לשמור חלק קטן תגובת שיקוע שתוארו לעיל שפופרת חדשה בעלת החנות ב-80 מעלות צלזיוס
- כדי supernatants הנ ל, להוסיף µg 1 של העכבר לא ספציפית אימונוגלובולין G (IgG) של מינים, isotype אותו כמו הנוגדן monoclonal Rb ו 20 µL של 50% חלבון A/G-sepharose slurry. לאחר מכן, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C עם סיבוב עדין.
- Centrifuge הדגימות ב 3000 g x במשך 3 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ומעבירים אותם אל צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL החדש. לכל אחד הדגימות, מוסיפים נוגדן ראשוני Rb µL 5 µL 40 50% חלבון slurry A/G-sepharose. לאחר מכן, דגירה בין לילה ב 4 ° C עם סיבוב עדין.
- לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. שימו לב כי על מנת למנוע אובדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.
- לרחוץ את החרוזים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של המאגר ריפה. כל הזמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה מהירות נמוכה ב x 3000 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את supernatants.
- לאחר הסרת supernatants בכביסה הסופי, מחדש להשעות את החרוזים ב 30 µL 1 x נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) טעינת מאגר (טבלה 1) ומערבבים היטב.
- Incubate הצינורות ב 100 ° C בחום לחסום עבור 10 דקות Centrifuge את הדגימות-g x 12,000 עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר אותם ל 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות.
- נתח הדגימות מאת 4-20% הדרגתיות מרחביות-דף ג'ל ומערביות כתם או לאחסן אותם ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
- להכין HEK293.
2. ניתוח של מתויג 6XHis SUMOylation Rb אקסוגני בתאי אדם
- תא תרבות, תרביות תאים.
6 HEK293
- זרע ~ 6 × 10 בתאים 10 ס מ צלחת, תקופת דגירה של 24 שעות ביממה במדיום הגידול בתנאים התרבות תאים נורמליים לרכוש תאים confluent 75-85%. לפני תרביות תאים, הסר את מדיום הגידול ולהוסיף 6 מ של מדיום מופחת סרום prewarmed (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן מקם את הכלים בחזרה לתוך החממה.
- עבור Rb קונסטיטוטיביות SUMOylation assay, להוסיף 15 µg כל 6XHis מתויג Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT, Ubc9-C93S פלסמידים במדיום מופחת סרום µL 500 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות, בהתאמה.
- כדי לנתח את הסומו-ההטיה של פראי סוג Rb ואת המוטציה שלה תקינה SUMOylation, לערבב µg 10 של גם מתויג 6XHis Rb-WT או Rb-K720R פלסמיד יחד עם GFP-SUMO1 (10 µg) ב- 500 µL מופחת סרום במדיום 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות 13.
- בינתיים, בשפופרת נפרדת, מערבבים 50 ריאגנט תרביות תאים µL (ראה טבלה של חומרים) ב- 500 µL מופחת סרום בינוני, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק
- לשלב את שני הצינורות נפרד שתוארה לעיל, ואת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוספה תרביות תאים מתחמי ריאגנט/פלסמיד לתאים באופן מלא להמשיך תרבות 8 h ב- 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס.
- להחליף מופחת סרום בינוני עם צמיחה בינוני ולאחר דגירה את התאים בתנאים נורמליים תרבות במשך 48 שעות לאחר תרביות תאים.
- ניקל זיקה לנתץ חלבון Rb מתויג 6XHis.
- Lyse התאים HEK293 transfected ולחלץ את החלבונים הכולל המתואר בסעיף 1.3.1.
- צנטריפוגה lysates תא ב g 18,000 x למשך 30 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים.
הערה: החלבון שיכול להיות קפוא בנקודה זו במשך יותר מ-6 חודשים ב-80 מעלות צלזיוס - להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לחסוך חלק קטן supernatants המתואר לעיל צינור חדש ו החנות ב-80 מעלות צלזיוס
- שטיפת 25 µL של 50% ניקל nitrilotriacetic חומצה agarose (Ni-נ) חרוזים עם מאגר ריפה פעמיים ב שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 1.5 mL עבור כל דגימה. לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס
- Imidazole להוסיף 1 מ' כל מדגם בריכוז הסופי של 10 מ מ. לאחר מכן, להוסיף כל מדגם הצינור המכיל את החרוזים agarose מוכן Ni-נ. ת.
- דגירה החרוזים, את lysates עבור 2 h ב 4 ° C עם סיבוב עדין. לסובב את החרוזים ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את supernatants על ידי pipetting. כדי להימנע מאבדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.
- לרחוץ את החרוזים עם 1 מ"ל של שטיפת מאגר המכיל 20 מ מ imidazole (טבלה 1). כל זמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי ספינינג ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, ולמחוק את supernatants.
- לאחר השטיפה הסופית להוסיף 30 µL של • תנאי מאגר המכיל 250 מ מ imidazole (טבלה 1) כל דגימה, קפיצי לערבב. לאחר מכן, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C כדי elute את החלבונים.
- מערבבים כל דגימה עם × מרחביות-דף 6 טעינת מאגר (טבלה 1). לאחר מכן, דגירה הצינורות ב 100 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום במשך 10 דקות
- צנטריפוגה-12,000 x g עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר את הדגימות 1.5 ml מיקרו-צנטריפוגה צינורות. הדגימות ניתן נותחו על ידי תספיג או המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
3. כתם המערבי
- טען את immunoprecipitation או להוריד דוגמאות המתקבל השלבים הקודמים על גבי 4-20% ג'ל מרחביות-דף הדרגתיים. אלקטרופורזה-120 V במשך 90 דקות להפריד את החלבונים לנהל.
- להעביר את החלבונים בג'ל קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על ידי electroblotting 300 אמא במשך 90 דקות ב 4 ° C באמצעות שיטת ההעברה טנק. לחסום את הקרום PVDF במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1) לשעה בטמפרטורת החדר.
- Incubate הקרום עם נוגדן ראשוני נוגדן דילול מאגר המכיל 3% אלבומין שור (BSA) (טבלה 1) לילה ב 4 º C. נוגדנים העיקרי, להשתמש ריכוז העבודה של 0.5 µg/mL (נוגדן anti-SUMO1), או לדילול 1:2000 (נוגדנים anti-Rb וטובולין נגד), או 1:5,000 (anti-GFP, נוגדן אנטי שלו).
- לרחוץ את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות 1 x באגירה טריס תמיסת מלח עם מאגר Tween (TBST) (טבלה 1). דגירה הקרום עם 1:5,000 מדולל נוגדנים ספציפיים מצומדת חזרת Peroxidase HRP משני המינים במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1). לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות מאגר x TBST 1-
- דגירה הקרום עם chemiluminescence משופרת (ECL) עובד פתרון. מכסה את הקרום בניילון נצמד, לחשוף אותם בפני לסרטי רנטגן תלוי בכח אות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לזיהוי SUMOylation Rb אנדוגני במהלך מחזור התא התקדמות, מחקר זה קודם מסונכרנים תאים HEK293-חמישה שלבים שונים של מחזור התא (G0, מוקדם G1, G1, S ו- G2/M) כמתואר בסעיף פרוטוקול של מאמר זה. האיכות של סינכרון אושר באמצעות חומצות גרעין הכתם עם יודיד propidium שלאחריה יבוא ניתוח cytometry זרימה (איור 1). בשלב הבא, התאים שנאספו, lysed על ידי denaturing ריפה מאגר. מעכבי פרוטאזות סומו, N-Ethylmaleimide, נוספה ריכוז סופי של 20 מ מ כדי לשמר את האות סומו יליד במהלך הניסויים. לאחר immunoprecipitation של המין Rb אנדוגני תחת denaturing תנאים כדי לחסום את האינטראקציה לא ספציפי-קשרי ערכיות, את תספיג הבאים באמצעות נוגדן anti-SUMO1, הנוכחות של האות סומו זוהה באופן ספציפי בתחילת שלב G1 (איור 2). למרות SUMOylation הכללית הועצמה בשלב G2/S/M,-הזמן הצבע של Rb SUMOylation, זה לא השתנתה (איור 2, לוח קלט). ממצא זה מצביע על כי SUMOylation של Rb אינה רק התוצאה של פעילות ההטיה סומו הכללית שינו. לכן, אלה מראים תוצאות כי החלבון immunoprecipitation ומערביות כתם ניתוח המתוארים במאמר זה לאפשר הגילוי של SUMOylation של החלבון Rb אנדוגני.
כדי לזהות את SUMOylation כפויה של החלבון Rb, מחקר זה נוצר SUMOylated Rb המכונן לבנות על ידי מיזוג Ubc9, ליגאז סומו E2 הבלעדית, שלה C-מסוף המאפשר יעיל ו סלקטיבית SUMOylation של Rb (איור 3א). המוטציה אובדן-של-פונקציה של Ubc9, C93S, גם דבוקה על C-הטרמינל Rb לשמש פקד (איור 3א). כדי לחזק עוד יותר את ייחודה של האות סומו-Rb, נבנתה גם שאינם התמזגו Ubc9 לבד. כל ארבעת פלסמידים מתויג שלו היו transfected לתוך התאים HEK293 במשך 48 שעות לפני שהם היו lysed במאגר ריפה בתוספת 20 מ מ N-Ethylmaleimide. כל החלבונים היו אז נתון למשוך למטה assay, כמתואר בסעיף פרוטוקול של מאמר זה. החלבונים Rb eluted נותחו על ידי תספיג חלבון. Ubc9 פיוז'ן מכוון ש-sumoylation של Rb זוהה באמצעות נוגדן anti-SUMO1 (איור 3B, החלונית ' SUMO1 '), ואילו המוטציה פגומה Ubc9, C93S, לא הצליחה לייצר את האות. הערה הסומו-השינוי יעילים ביותר הנגרמת על ידי מוביל Ubc9-fusion להקה משקל מולקולרי גבוה יותר יכול אפילו ישירות יזוהו באמצעות נוגדן Rb, הוא מתאים האות סומו (איור 3B, לוח Rb). יתר על כן, Ubc9 לבד לא גרמה שום נטיה סומו, עוד יותר מאשר את SUMOylation ספציפיים Rb (איור 3ב).
כי SUMO1 היא מצומדת ל ליזין 720 מ חלבון Rb11, לנתח עוד יותר את SUMOylation Rb, מחקר זה נוצר מוטציה סומו לקויה על-ידי החלפת את שאריות ליזין ארגינין (K720R). כדי להקל על זיהוי סומו-ההטיה של שני החלבונים Rb ביטוי transiently, מבנה GFP-SUMO1 נוספה כדי להגביר את האות סומו תאיים. מתויג שלו פראי סוג או מוטציה Rb היה שותף transfected לתאים HEK293 יחד עם GFP-SUMO1, ואחריו לנתץ assay וניתוח של יכולת ההטיה Rb-SUMO1. כפי שנצפו, המוטציה K720R ביטל לגמרי הסומו-השינוי של Rb, חיזוקה של השיטה המוצעת היכולת לזהות את SUMOylation Rb (איור 4).
איור 1 : אימות של וזמינותו סינכרון מחזור התא על ידי cytometry זרימה. HEK293 התאים היו תרבותי, מסונכרן-G0, G1 מוקדם, שלבים G1, S ו- G2/M של מחזור התא כפי שמתואר פרוטוקול זה. מחזור התא הפצות נקבעו על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS). הנתונים מייצגים מראה דוגמה של ניתוח כמותי של וזמינותו FACS (n = 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Rb הוא SUMOylated בשלב G1 מוקדם. HEK293 תאים סונכרנו ב שלבים שונים של מחזור התא, כפי שמתואר פרוטוקול זה. התאים היו נאספים, lysed במאגר ריפה בתוספת 20 מ מ N-Ethylmaleimide. הפקדים קלט היו טעון על מרחביות-דף 4-20% ג'ל הדרגתיות, הועבר, מחק עם אנטי-SUMO1, אנטי-טובולין, כמצוין. Lysates תא הנותרים היו אז נתון immunoprecipitation באמצעות נוגדן anti-Rb לדילול 1:200. Eluents וכתוצאה מכך היו מופרדים על ידי ג'ל הדרגתיות מרחביות-דף 4-20% ו- immunoblotted באמצעות נוגדן anti-SUMO1 ונוגדן anti-Rb. הניסוי הזה חזר על עצמו פעמיים עם תוצאה זהה. איור זה השתנה עם הרשאה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . זיהוי של הסומו-השינוי של חלבון כימרי Rb-Ubc9. (א) דיאגרמה של Ubc9 מכוון פיוז'ן SUMOylation (UFDS) המבנה של Rb-(B) קונסטיטוטיביות SUMOylation של Rb נגרם על-ידי UFDS. תאים HEK293 transiently transfected עם UFDS שלו מתויג בונה היו lysed במאגר ריפה עם 20 מ מ N-Ethylmaleimide. סה כ lysate של כל דגימה, נדגרה עם חרוזים Ni-נ agarose להוריד את שלו מתויג Rb-Ubc9 פיוז'ן חלבונים או Ubc9 (בשימוש של הפקד שלילי), בהתאמה. החלבונים מטוהרים היו מופרדים על ידי ג'ל הדרגתיות מרחביות-דף 4-20% ו- immunoblotted עם אנטי-SUMO1, נוגדנים אנטי-שלו. שלו-Rb: 6XHis מתויג Rb-Ubc9 פיוז'ן חלבונים; שלו-Ubc9: 6XHis מתויגות Ubc9 בלבד. Rb-Ubc9: שלא שונתה Rb-Ubc9; Rb-Ubc9-s: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: היפר-phosphorylated Rb-Ubc9. התוצאות באיור הן נציג של שלושה מחקרים עצמאיים. איור זה השתנה עם הרשאה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . המוטציה K720R סומו לקויה מפחיתה את SUMOylation של Rb. תאים HEK293 היו transiently משותפת transfected עם המבנה Rb-הוד פראי סוג או מוטציה יחד עם GFP-SUMO1. התאים היו נאספים, lysed במאגר ריפה בתוספת 20 מ מ N-Ethylmaleimide. חלק קטן lysates נותחה ישירות על ידי המערב כתם של הפקד קלט. שאר lysates היו מודגרות עם חרוזים Ni-נ agarose כדי להוריד את החלבונים שלו מתויג Rb כפי שמתואר פרוטוקול זה, והן היו immunoblotted עם אנטי-SUMO1, נוגדנים אנטי-שלו. שימו לב כי המוטציה ליזין-לארגינין-720 של Rb עדברית מבטל את השינוי סומו של חלבון זה. הניסוי נערך פעם עם תוצאה דומה לזה דיווח בעבר11. איור זה השתנה עם הרשאה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון | רכיבים | הערות |
| מאגר פירוק ריפה | 50 מ מ טריס, pH = 8.0; 150 מ מ NaCl; 1% NP-40; 1% נתרן deoxycholate; 0.1% מרחביות | להוסיף מעכב פרוטאז קוקטיילים ו N-ethylmaleimide מיד לפני השימוש. |
| לשטוף את מאגר | 50 מ מ2PO NaH4 pH = 8.0; 300 מ"מ NaCl; imidazole 20 מ מ | משמש למשוך למטה וזמינותו בלבד |
| • תנאי מאגר | 50 מ מ2PO NaH4 pH = 8.0; 300 מ"מ NaCl; imidazole 250 מ מ | משמש למשוך למטה וזמינותו בלבד |
| 6 x טעינת מאגר | 0.5 טריס מ', pH = 6.8; גליצרול 30%; 10% מרחביות; 5% β-mercaptoethanol; 0.1% bromphenol כחול | חנות ב-20 ° C |
| 10 x הפעלת מאגר | 0.25 M טריס, pH 8.6; 1.9 גליצין מ'; 1% מרחביות | כדי להפוך 1 x מאגר ריצה: לערבב 100 מ ל 10 x מאגר ריצה עם 900 מל ddH2O |
| 10 x מאגר העברה | 0.25 M טריס, pH 8.3, 1.9 מ' גליצין | כדי להפוך 1 x מאגר העברה: לערבב 100 מ ל 10-מאגר העברה עם 200 מ ל מתנול ו- 700 מ"ל ddH2O |
| מאגר 10 x TBS | ב- 1 ליטר של ddH2g o: 24.08 טריס pH 7.4; 80 גר' NaCl | כדי להפוך 1 x TBST מאגר: לערבב 100 מ ל 10 x TBS מאגר עם 900 מל ddH2O ו- 1 מ"ל של רצף-20 |
| חסימת מאגר | 1 x TBST עם 5% שומן חלב יבש | הכנת המאגר מיד לפני השימוש |
| מאגר דילול נוגדן | 1 x TBST עם אזיד הנתרן BSA ו- 0.02% 3% | מאגר זה עשויה להיות מאוחסנת ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 6 חודש |
טבלה 1: פתרונות, מאגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר פרוטוקול לזהות ולנתח SUMOylation אנדוגני של Rb בתאים אנושיים. כפי בשיטה זו מתמקדת באופן ספציפי חלבון Rb אנדוגני ללא כל ההתחלפות של האות הגלובלית הקשורות סומו, זה כלי חשוב עבור חוקרים Rb-סומו שינוי בנסיבות הפיזיולוגיות טבעי לחלוטין.
כדי להשיג מטרה זו, חשוב לזכור כי: 1) למרות סומו כוללת ארבעה איזופורמים (SUMO1-4, אחד מקודד על ידי גנים שונים) בהשוואה ubiquitination, כל המינים סומו נפוצים הרבה פחות; 2) עבור רוב חלבונים היעד סומו, רק חלק קטן של חלבון נתון הוא SUMOylated על מצב יציב, אשר הוא תולדה של תחרות מתמדת בין אנזימים המעורבים ההטיה סומו, deconjugation14,21; ו 3) סומו מטרות יכולות לעבור מחזורים המהירה של SUMOylation ושל deSUMOylation. לדוגמה, נתונים עדכניים מתקבל על ידי מחברי המאמר הנוכחי להדגים כי Rb-SUMO1 קיים רק עבור חלון קצר מאוד של זמן בשלב G1 מוקדם, אשר עולה בקנה אחד עם התפיסה כי SUMOylation הוא תהליך הפיך, דינמי מאוד13 . כל העובדות הללו לעשות את זה מאתגר ישירות לאתר את SUMOylation אנדוגני של חלבון נתון. לפיכך, כדי בהצלחה לאתר זה, זה חיוני כדי לזהות בדיוק את אותם התנאים שבהם מתרחש שינוי זה. למשל, בהפרוטוקול המוצע, העיתוי של הסינכרון של מחזור התא הוא קריטי עבור זיהוי Rb SUMOylation. ניתוח ניסיוני ממוטבת חשוב גם איתור מוצלח של המין סומו-השתנה ברמה נמוכה של חלבון נתון. לדוגמה, sonication נכונה או מחטים שעובר דרך יכול למנוע היווצרות של דביק ורכיבים צמיגה עקב הדנ א, ובכך sonication נכונה יכול להקל על מיצוי חלבונים הכולל. יתר על כן, נוגדן חד שבטי טוב עם זיקה גבוהה חלבון המטרה יכול להיות מועיל עבור לשפר את כמות וספציפיות של immunoprecipitation. לסיכום, השיטה המוצעת חשובה נוספת לחקור את התנאים הפיזיולוגיים שתחתיו Rb אנדוגני הוא SUMOylated, שהוא היסוד של וזמינותו הבאים תפקודי מבוסס-ביטוי.
כדי להיקלט סומו של חלבון נתון, מקובל co-overexpress חלבון זה, כמו גם אחרים סומו חלבונים הקשורים (בדרך כלל חלבון Ubc9, סומו) בתאים. למרות תספיג פשוטה באמצעות נוגדן נגד המצע היא הדרך הקלה ביותר למצוא את משקל מולקולרי גבוה יותר, SUMOylated צורת החלבון הזה, אנחנו נכשלה לזהות את האות סומו-Rb בשיטה זו. לפיכך, הנייר הזה התמקד רק שיטה לגילוי הסומו-השינוי של החלבון Rb אקסוגני precipitated. יתר על כן, שיטה זו תיאר כיצד לשפר באופן מלאכותי או לחסל את הסומו-ההטיה של Rb. כמו ליגאז הבלעדית E2, נמצאה Ubc9 להעביר ישירות סומו מטרות מוגדרות22. לפיכך, על ידי מיזוג למסוף C של Rb, Ubc9 משמעותית ומקדמת הסומו-השינוי של Rb. בשיטה זו, מחברי המאמר הפגינו בהצלחה כי SUMOylation של Rb קידום מספיק משלו זרחון על ידי הגדלת שלה מחייב CDK213. יתר על כן, ללמוד את ההשלכות פונקציונלי של אובדן Rb SUMOylation, המחברים שנוצר מבנה Rb חשוכת-סומו, כפי שדווחה בעבר11. באמצעות השיטה המוצעת במאמר זה הנוכחי, זה הוצג כי סומו-Rb הכרחי עבור מחזור תא נורמלי התקדמות ותא התפשטות13.
בנוסף SUMO1, SUMO2, SUMO3 גם לשחק תפקידים חשובים חלבון14,SUMOylation17. SUMO2, SUMO3 לעיתים קרובות מכונים SUMO2/3 כי הם קשורים קשר הדוק ולשתף 97% זהות. SUMO1 מניות דמיון 50% עם SUMO2/3. מקובל כי SUMO1 הוא אחראי על פונקציות פיזיולוגיים תאים נורמליים ותחזוקה, ואילו סומו-2/3 עוסקת בעיקר תא הלחץ תגובות15,17,23, 24. לאור העובדה Rb יכול גם להיות SUMOylated על ידי SUMO2/3 עם פונקציה לא מוכרות12, השיטה המוצעת במחקר זה הוא עדיין מתאים זיהוי וניתוח של שינוי זה של Rb. בנוסף Rb, בשיטות המתוארות כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב זיהוי ו אנליזה פונקציונלית של SUMOylation מגוון רחב של חלבונים היעד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי (מענק מס 14411961800) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
