Summary
Proteínas familiares pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) se conjugan para los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Este papel describe un protocolo para la detección de la proteína retinoblastoma (Rb) la sumoilación condiciones endógenas y exógenas en células humanas.
Abstract
Las modificaciones post-traduccionales de las proteínas son esenciales para la adecuada regulación de la transducción de señales intracelulares. Entre estas modificaciones, pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) es una proteína ubiquitin-like que se une covalentemente a los residuos de lisina de una variedad de proteínas diana para regular procesos celulares, tales como la transcripción genética, la reparación del ADN, la proteína interacción y degradación, transporte subcelular y transducción de la señal. El enfoque más común para detectar la sumoilación de la proteína se basa en la expresión y purificación de proteínas recombinantes etiquetadas en bacterias, lo que permite una en vitro reacción bioquímica que es simple y conveniente para abordar los mecanismos preguntas. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de la sumoilación en vivo, es más difícil detectar y analizar proteína sumoilación en las células, especialmente bajo condiciones endógenas. Un estudio reciente realizado por los autores de este trabajo revelaron que la proteína endógena retinoblastoma (Rb), un supresor de tumor que es vital para la regulación negativa de la progresión del ciclo celular, es específicamente sumoiladas en la fase G1 temprana. Este papel describe un protocolo para la detección y análisis de la sumoilación Rb condiciones endógenas y exógenas en células humanas. Este protocolo es apropiado para la investigación fenotípica y funcional de la modificación SUMO de Rb, así como muchos otros dirigidos por el SUMO proteínas, las células humanas.
Introduction
El control preciso de la progresión del ciclo celular en células eucariotas se basa en una red reguladora apretada, que asegura que determinados eventos ocurren en una forma ordenada1,2. Uno de los principales protagonistas de esta red es la proteína del retinoblastoma (Rb), el primer clonado tumor supresor1,3. La proteína Rb se piensa para ser un regulador negativo de la progresión del ciclo celular, especialmente para el G0/G1 a la transición de la fase S y tumor crecimiento4,5. Falta de función de Rb o directamente conduce a la neoplasia intraocular más frecuente en niños, retinoblastoma, o contribuye al desarrollo de muchos otros tipos de cáncer5. Por otra parte, Rb participa en muchas vías celulares incluyendo la diferenciación celular, remodelación de la cromatina y apoptosis mediada por la mitocondria3,6,7.
Modificaciones post-traduccionales juegan un papel fundamental en la regulación de la función de RB8,9. La fosforilación es un tal modificación, y generalmente conduce a la inactivación de Rb. En células de reposo G0, Rb es activa con un nivel bajo de la fosforilación. Como células de progreso a través de la fase G0/G1, Rb es secuencialmente hyper-fosforilado por una serie de kinases de proteína cyclin-dependientes (CDKs) y ciclinas, como la ciclina E/CDK2 y ciclina D/CDK4/6, Rb de inactivar y eliminar su capacidad de reprimir el ciclo celular relacionados con la expresión de gene4,10. RB también podría ser modificado por pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO)11,12,13.
SUMO es una ubiquitina-como la proteína que se une covalentemente a una variedad de proteínas objetivo. Es fundamental para diversos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, transcripción, localización celular de la proteína y la degradación, transporte y ADN reparación14,15,16, 17 , 18. vía de conjugación el SUMO consiste en la enzima activadora de SUMO E1 dimérica SAE1/UBA2, la única enzima de E2 Conjugación Ubc9, múltiples E3 ligasas y proteasas específicas de SUMO. En general, nacientes proteínas SUMO deben ser proteolytically procesadas para generar la forma madura. El SUMO maduro es activado por el heterodímero E1 y luego transferido a la enzima E2 Ubc9. Finalmente, la glicina c-terminal de SUMO se conjuga covalentemente a la lisina de destino de un substrato, y este proceso es facilitado generalmente por E3 ligasas. La proteína SUMO puede extraerse el sustrato modificado por proteasas específicas. Un estudio previo de los autores de este trabajo reveló que la sumoilación de Rb aumenta su unión a CDK2, lleva a hiper-fosforilación en la fase G1 temprana, un proceso que es necesario para el ciclo de la célula progresión13. También hemos demostrado que la pérdida de Rb sumoilación provoca una proliferación celular disminuida. Por otra parte, recientemente se demostró que la sumoilación de Rb protege la proteína Rb proteasomal facturación, aumentando así el nivel de proteína Rb en células19. Por lo tanto, la sumoilación desempeña un papel importante en la función de Rb en varios procesos celulares. Para estudio adicional la consecuencia funcional y relevancia fisiológica de la sumoilación de la Rb, es importante desarrollar un método efectivo para analizar el estado SUMO de Rb en células humanas o tejidos del paciente.
La sumoilación es un proceso reversible, altamente dinámico. Así, es generalmente difícil de detectar las proteínas SUMO modificado bajo condiciones completamente endógenas. Este artículo presenta un método para detectar endógeno la sumoilación de la Rb. Además, muestra cómo detectar exógeno sumoilación Rb Rb de tipo salvaje y su SUMO deficiente mutación11. En particular, Jacobs et al describieron un método para aumentar la modificación SUMO un sustrato determinado específicamente por Ubc9 dirigido por fusión sumoilación (UFDS)20. Basado en este método, este protocolo describe cómo analizar la sumoilación forzada de Rb y sus consecuencias funcionales. Dado que anteriormente se han descrito cientos de sustratos SUMO y más sustratos putativos de SUMO se han identificado de muchos ensayos de proteómica, este protocolo se puede aplicar para analizar la modificación SUMO de estas proteínas en las células humanas.
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Protocol
1. detección de endógeno Rb la sumoilación en la fase G1 temprana
- sincronización de la cultura y el ciclo celular de la célula.
- Las células HEK293 mantener en un medio que contiene Dulbecco ' s Modified Eagle medio (DMEM) suplementado con 1% Pen-Strep y 10% suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C y 5% de CO 2 en una incubadora.
- Sincronizar las células HEK293 en la fase G0.
- Cuenta las células HEK293 utilizando un hemocitómetro y semilla de ~1.5 x 10 7 células en 15 cm plato con medio de cultivo de 25 ml por 24 h antes del tratamiento. Después de alcanzar una confluencia de 70% - 80%, aspirado de la media y lavado las células dos veces con 5 mL precalentado con tampón fosfato salino (PBS).
- Añadir 25 mL DMEM que contenía 1% penicilina-estreptomicina e incubar las células a 37 ° C por 72 h. lavar las células de la placa con PBS helado 3 mL. Transferir las células a un nuevo tubo de 5 mL.
- Tema una pequeña porción de células para análisis de ciclo celular por citometría de flujo (paso 1.2), recogiendo la mayoría restante de las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y almacenarlas en un congelador de ultra baja temperatura hasta su análisis de Rb sumoilación.
- Para obtener la fase G1 las células, al final del proceso de sincronización de G0, quitar el DMEM y agregar medio de cultivo nuevo fresco, permitiendo así que las células HEK293 volver a entrar en el ciclo celular. Luego, recogen las células en diferentes fases de G1 (G1 temprana: 30 min; G1: 2 h) para ciclo celular ensayo análisis y SUMO más.
- Sincronizar las células HEK293 en la fase S mediante el método de bloque doble-timidina.
Células
- células HEK293 crecen a una confluencia de 50% y lavado con PBS precalentadas. Luego agregar medio de cultivo suplementado con timidina 2,5 mM por 18 h (primer bloque).
- Quitarlo del medio que contenía timidina y entonces lavan las células dos veces con PBS precalentadas. Agregar medio de cultivo fresco de 14 h a las células.
- Deseche el medio con una pipeta y agregar medio de cultivo suplementado con timidina de 2,5 mM para otro 18 h (segundo bloque) antes de realizar un análisis del ciclo celular y la sumoilación Rb.
- Sincronización para el G2/M, placa ~1.5 × 10 7 HEK293 las células a un plato de 15 cm con medio de cultivo de 25 mL por 24 h. Luego añadir nocodazole al medio hasta obtener una concentración final de 400 ng/mL. Por último, incubar las células durante 16 horas antes de realizar el análisis del ciclo celular y la sumoilación Rb.
- Análisis de ciclo celular por citometría de flujo.
- Vuelva a suspender las HEK293 sincronizado en PBS y luego fijar la suspensión de células con helada etanol al 70% durante 2 h a 4 ° C. tenga en cuenta que al minimizar el agrupamiento celular, añadir gota a gota la suspensión de células a la helada 100% etanol para obtener una concentración final de etanol al 70% mientras que suavemente Vortex.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g, luego descartar el sobrenadante cuidadosamente y lavan las células dos veces con PBS. Repita el paso centrífuga.
- Añadir 500 μl PBS que contenga la 50 μg/mL ácido nucleico mancha yoduro de propidio, 0,1% Tritón X-100 y 1 μg/mL Rnasa A para las células y mezclar bien. Incube las células durante 15 min a 37 ° C.
- Almacenar las muestras a 4 ° C hasta su análisis por citometría de flujo.
- Inmunoprecipitación de la proteína Rb endógena.
- Preparar el HEK293 lysates de la célula.
- Lyse las células HEK293 sincronizadas suspendiendo suavemente volver a ellos en 1 mL de tampón de lisis helada radio-inmunoprecipitación ensayo (RIPA) (tabla 1) que contiene recién agregan 20 mM N-etilmaleimida, un inhibidor de la isopeptidase que podría bloquear proteasas SUMO y SUMO conjugados se estabilizan.
- Además homogeneizar las células en hielo por Dounce homogeneización, sonicación o simplemente pasando por 10 veces a través de una aguja de 21 G en una jeringa de 2 mL. Luego, incubar las células en hielo por 5 min
Nota: El dodecil sulfato de sodio detergente aniónico (SDS) en el almacenador intermediario RIPA es crucial para la posterior determinación de la Rb-SUMO, como podría eliminar la señal inespecífica de SUMO que se deriva de la interacción no covalente entre la proteína Rb y otros SUMO-especies no Rb.
- Centrifugue los lysates de la célula a 18.000 x g por 30 min a 4 ° C. transferir el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las proteínas pueden almacenarse a-80 ° C durante al menos 6 meses. - Para preparar el control de entrada de cada muestra para el posterior inmunoblot, guardar una pequeña porción del sobrenadante antes descrita en un nuevo tubo y conservar a -80 ° C.
- a los sobrenadantes anteriores, añadir 1 μg de inmunoglobulina G de ratón no específica (IgG) de la misma especie e isotipo como el anticuerpo monoclonal de la Rb, 20 μl de la mezcla de 50% proteína A/G-sepharose. A continuación, incubar durante 1 h a 4 ° C con rotación suave.
- Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C. cuidadosamente recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferirlos a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. A cada una de las muestras, añadir 5 μl Rb primaria del anticuerpo y 40 μl de proteína 50% de la mezcla A/G-sepharose. A continuación, incubar durante una noche a 4 ° C con rotación suave.
- Recoger los granos por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo. Tenga en cuenta que para evitar la pérdida de grano, no aspirar seco granos.
- Lave los granos cuatro veces con 1 mL de la solución RIPA. Cada vez, mezcle los tubos bien por rotación a 4 ° C por 15 minutos recogen los granos por centrifugación a baja velocidad a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y luego descartar los sobrenadantes.
- Después de quitar sobrenadante del último lavado, vuelva a suspender las cuentas en 30 μL 1 x de tampón de carga de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) (tabla 1) y mezclar bien.
- Incubar los tubos a 100 ° C en un calor bloquean por 10min Centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 1 min para que sedimenten los granos. Cuidadosamente y recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Analizar las muestras por gradiente de 4% - 20% SDS-PAGE gel y Western blot o almacenar a-20 ° C para su posterior uso.
- Preparar el HEK293 lysates de la célula.
2. Análisis de la etiqueta 6XHis exógeno Rb la sumoilación en células humanas
- cultura y transfección de la célula.
- Semilla ~ 6 × 10 6 HEK293 células en 10 cm plato e incuban durante 24 h en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo de células normales para adquirir células confluentes 75% - 85%. Antes de la transfección, retire el medio de crecimiento y agregar 6 mL de suero reducido precalentado medio (véase Tabla de materiales) y luego coloque los platos en la incubadora.
- Ensayo de sumoilación constitutiva para la Rb, añadir 15 μg de etiqueta 6XHis Ubc9 WT, Rb, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT y Ubc9-C93S plásmidos en 500 μl de medio de suero reducido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, respectivamente.
- Para analizar la conjugación de SUMO del tipo salvaje Rb y sus mutantes defectuosos de la sumoilación, mezclar 10 μg de cada plásmido WT Rb o Rb-K720R etiqueta 6XHis junto con GFP SUMO1 (10 μg) en 500 μl reduce medio suero de microcentrífuga de 1,5 mL tubos de 13.
- Mientras tanto, en un tubo separado, mezcle 50 μl de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) en 500 μl reducido medio de suero e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos
- Completamente combinan los dos tubos separados que se describe anteriormente, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos agregar el transfection complejos reactivo/plásmido a las células y continúan cultura 8 h 5% CO 2 y 37 ° C.
- Sustituir medio reducido suero con medio de cultivo e Incube las células bajo condiciones de cultivo normales durante 48 h después de la transfección.
- Níquel tire de la afinidad de la proteína Rb etiqueta 6XHis.
- Lyse las células HEK293 transfected y extraer las proteínas totales como descrito sección 1.3.1.
- Centrífuga los lysates de la célula a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C. cuidadosamente recoger el sobrenadante y transferir a tubos limpios.
Nota: La proteína puede ser congelada en este momento más de 6 meses a -80 ° C. - Para preparar el control de entrada de cada muestra para el posterior inmunoblot, guardar una pequeña porción de los sobrenadantes descrito anteriormente a un nuevo tubo y conservar a -80 ° C.
- Lavado 25 μl 50% níquel perlas de agarosa (Ni-NTA) ácidos nitrilotriacético con el almacenador intermediario RIPA dos veces en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada muestra. Recoger los granos por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
- Imidazol agregue 1 M a cada muestra para obtener una concentración final de 10 mM. Luego, agregar cada muestra al tubo que contiene las perlas de agarosa preparadas de Ni-NTA.
- Incubar los granos y los lisados por 2 h a 4 ° C con rotación suave. Hacer girar los granos a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y retire cuidadosamente los sobrenadantes mediante pipeteo. Para evitar pérdida de grano, no aspirar seco granos.
- Lavar los granos con 1 mL de tampón de lavado que contiene imidazol 20 mM (tabla 1). Cada vez, mezcle los tubos bien por rotación a 4 ° C durante 15 minutos recoge los granos girando a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y descartar los sobrenadantes.
- Después del último lavado, Añadir 30 μl de elución Tampón Imidazol que contiene de 250 mM (tabla 1) a cada muestra y película para mezclar. A continuación, incubar durante 20 min a 4 ° C para eluir las proteínas.
- Mezclar cada muestra con el tampón de carga de 6 × SDS-PAGE (tabla 1). Luego, incubar los tubos a 100 ° C en un bloque de calor durante 10 minutos
- Centrifugar a 12.000 x g durante 1 min para que sedimenten los granos. Cuidadosamente y recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferir las muestras a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras pueden ser analizadas por Western blot o almacenadas a-20 ° C para su posterior uso.
3. Western Blot
- cargar la inmunoprecipitación o tire hacia abajo de las muestras obtenidas de los pasos anteriores en gradiente geles de SDS-PAGE 4-20%. Realizar la electroforesis a 120 V durante 90 minutos separar las proteínas.
- Transferir las proteínas desde el gel a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno electroblotting a 300 mA durante 90 minutos a 4 ° C utilizando el método de transferencia del tanque. Bloquear la membrana PVDF en tampón de bloque que contiene 5% de leche descremada (tabla 1) por 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar la membrana con el anticuerpo primario en tampón de dilución del anticuerpo que contiene 3% albúmina de suero bovino (BSA) (tabla 1) durante la noche a 4 ° C. Para anticuerpos primarios, utilizar una concentración de trabajo de 0,5 μg/mL (anticuerpo anti-SUMO1), o una dilución de 1: 2000 (anticuerpos anti-Rb y anti-Tubulino) y 1:5,000 (anti-GFP y anticuerpo anti-su).
- Lavar la membrana 3 x 10 min cada tiempo con 1 x solución salina tamponada con tris buffer de interpolación (TBST) (tabla 1). Incubar la membrana con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa HRP específicos de especies 1:5,000 diluido en tampón de bloque que contiene 5% de leche descremada (tabla 1). Lavar la membrana 3 x 10 min cada vez usando buffer de x TBST 1.
- Incubar la membrana con solución de la quimioluminescencia realzada (ECL). Cubrir la membrana con envoltura de plástico y exponer a la película de rayos x dependiendo de la fuerza de la señal.
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Representative Results
Para detectar la sumoilación Rb endógena durante la progresión del ciclo celular, este estudio sincronizado primero las células HEK293 en cinco diferentes etapas del ciclo celular (G0, temprana G1, G1, S y G2/M) como se describe en la sección de protocolo de este trabajo. La calidad de la sincronización fue confirmada mediante el uso de la tinción de ácido nucleico con yoduro de propidio seguido por análisis de citometría de flujo (figura 1). A continuación, las células fueron recogidas y lisis desnaturalizando el almacenador intermediario RIPA. El inhibidor de proteasas SUMO, N-etilmaleimida, fue añadido a una concentración final de 20 mM para preservar la señal nativa de SUMO durante los experimentos. Después de la inmunoprecipitación de la especie endógena de Rb bajo desnaturalizar condiciones para bloquear la interacción inespecífica no covalentes y el siguiente mancha blanca /negra occidental usando un anticuerpo anti-SUMO1, específicamente se detectó la presencia de la señal SUMO en el fase G1 temprana (figura 2). Aunque la sumoilación global mejoró en la fase S, G2/M, a la vez punto de Rb la sumoilación, no había cambiado (figura 2, panel de entrada). Este hallazgo sugiere que la sumoilación de Rb no es simplemente la consecuencia de la alteración global actividad verbal de SUMO. Por lo tanto, estos resultados muestran que la inmunoprecipitación de la proteína y el Western blot análisis descritos en este documento permiten la detección de la sumoilación de la proteína Rb endógena.
Para detectar la forzada la sumoilación de la proteína Rb, este estudio genera una constitutiva Rb sumoiladas construir fundiendo Ubc9, el único SUMO E2 ligasa, a su terminal C permitiendo la sumoilación eficiente y selectiva de Rb (figura 3A). La mutación de la pérdida de función de Ubc9, C93S, también está fusionada a la terminal C de Rb para servir como un control (figura 3A). Para reforzar la especificidad de la señal de SUMO-Rb, Ubc9 fusionados con el no solo fue construido así. Los cuatro de lo plásmidos su etiquetado fueron transfected en las células HEK293 durante 48 h antes de que eran lisis en RIPA buffer suplementado con 20 mM N-etilmaleimida. Todas las proteínas fueron sometidas luego a un desplegable de análisis, como se describe en la sección de protocolo de este trabajo. Las proteínas Rb eluídas se analizaron por Western blot. El Ubc9 fusión dirigida por que sumoilación de Rb se detectó con un anticuerpo anti-SUMO1 (figura 3B, panel de SUMO1), mientras que la mutación defectuosa Ubc9, C93S, no pudo producir esta señal. Tenga en cuenta que la modificación SUMO altamente eficiente causada por conductores Ubc9-fusión a una banda de peso molecular más alto que podría incluso detectarse directamente usando el anticuerpo de Rb, y corresponde a la señal SUMO (figura 3B, panel de Rb). Por otra parte, Ubc9 solamente no causó cualquier Conjugación de SUMO, confirmando aún más la sumoilación de la Rb-específicas (figura 3B).
Porque SUMO1 se conjuga a 720 de lisina de la proteína Rb del11, para analizar la sumoilación de la Rb, este estudio genera una mutación de SUMO-deficiente sustituyendo este residuo de lisina por una arginina (K720R). Para facilitar la detección de SUMO-Conjugación de las dos proteínas Rb expresadas transitoriamente, una construcción de GFP-SUMO1 fue añadida para mejorar la señal intracelular de SUMO. Tipo salvaje de su etiquetado o mutante Rb fue co transfected en las células HEK293 junto con GFP-SUMO1, seguido del desplegable de ensayo y análisis de la capacidad verbal de SUMO1 Rb. Como se observa, el mutante de K720R suprimió totalmente la modificación SUMO de Rb, reforzando aún más la capacidad del método propuesto para detectar la sumoilación de Rb (figura 4).
Figura 1 : Validación de la prueba de sincronización de ciclo celular por citometría de flujo. Las células HEK293 fueron cultivadas y sincronizadas en el G0, G1 temprana, las fases G1, S y G2/M del ciclo celular como se describen en este protocolo. Ciclo celular distribuciones fueron determinadas por celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación. Los datos mentionados aquí muestran un ejemplo de los análisis cuantitativos del análisis FACS (n = 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Rb es sumoiladas en la fase G1 temprana. Las células HEK293 fueron sincronizadas en diferentes fases del ciclo celular, como se describe en este protocolo. Las células fueron recogidas y lisis en RIPA buffer suplementado con 20 mM N-etilmaleimida. Los controles de entrada se cargan en un gel gradiente de 4% - 20% SDS-PAGE, transferidos y borrados con anti-SUMO1 y anti-tubulina, como se indica. Los lisados de células restantes entonces fueron sometidos a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-Rb a la dilución de 1: 200. Los eluyentes resultantes fueron separados por gel de la SDS-PAGE del 4% - 20% de gradiente y immunoblotted utilizando anti-Rb y el anticuerpo anti-SUMO1. Este experimento fue repetido dos veces con el mismo resultado. Esta figura se ha modificado con permiso13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Detección, de la SUMO-modificación de la proteína de la fusión de Rb-Ubc9. (A) diagrama de las construcciones de la sumoilación (UFDS) dirigido por fusión de Ubc9 de Rb. (B) constitutiva sumoilación de Rb por UFDS. Las células HEK293 transfectadas transitoriamente con su etiquetado UFDS construcciones fueron lisis en almacenador intermediario RIPA con 20 mM N-etilmaleimida. El total de lisado de cada muestra se incubó con perlas de agarosa de Ni-NTA para tirar abajo las proteínas de la fusión de su etiquetado Rb-Ubc9 o Ubc9 (utilizado como control negativo), respectivamente. Las proteínas purificadas fueron separadas por gel de la SDS-PAGE del 4% - 20% de gradiente y immunoblotted con anti-SUMO1 y anticuerpos anti-sus. Rb: su 6XHis tagged Rb-Ubc9 proteínas de fusión; Su-Ubc9: 6XHis tagged Ubc9 solamente. RB-Ubc9: sin modificar Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: sumoiladas Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hyper-fosforila Rb-Ubc9. Los resultados que se muestran en la figura son representativos de tres experimentos independientes. Esta figura se ha modificado con permiso13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . La mutación K720R de SUMO-deficiente reduce la sumoilación de Rb. Las células HEK293 fueron transitoriamente Co transfected con el tipo salvaje o mutante Rb su construcciones junto con GFP SUMO1. Las células fueron recogidas y lisis en RIPA buffer suplementado con 20 mM N-etilmaleimida. Una pequeña porción de los lisados se analizó directamente por Western blot como el control de entrada. El resto de los lisados fueron incubados con perlas de agarosa de Ni-NTA para tirar abajo las proteínas Rb su etiqueta como se describe en este protocolo, y se immunoblotted con anti-SUMO1 y anticuerpos anti-sus. Tenga en cuenta que la mutación de la lisina a arginina en 720 de Rb totaliado suprime la modificación SUMO de esta proteína. El experimento se llevó a cabo una vez con un resultado similar a ése había divulgado previamente11. Esta figura se ha modificado con permiso13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución | Componentes | Comentarios |
| Tampón de lisis RIPA | 50 mM Tris, pH = 8,0; 150 mM de NaCl; 1% NP-40; desoxicolato de sodio 1%; 0.1% SDS | Añadir cocktail del inhibidor de la proteasa y la N-etilmaleimida inmediatamente antes del uso. |
| Tampón de lavado | 50 mM NaH2PO4 de pH = 8,0; 300 mM de NaCl; imidazol de 20 mM | Utilizado para tirar abajo el análisis sólo |
| Tampón de elución | 50 mM NaH2PO4 de pH = 8,0; 300 mM de NaCl; imidazol de 250 mM | Utilizado para tirar abajo el análisis sólo |
| 6 x de Buffer de carga | 0,5 Tris M, pH = 6.8; 30% de glicerol; SDS 10%; 5% β-mercaptoetanol; 0.1% bromofenol azul | Conservar a-20 ° C |
| 10 x Buffer de ejecución | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1.9 M de glicina; SDS 1% | Para hacer 1 x Buffer de corriente: mezclar 100 ml 10 x Buffer de corriente con 900 mL ddH2O |
| 10 x Buffer de transferencia | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1,9 M glicina | Para hacer 1 x de tampón de transferencia: mezclar 100 mL 10 x Buffer de transferencia con 200 ml de metanol y 700 mL ddH2O |
| Buffer de 10 x TBS | En 1 L de ddH2O: 24.08 g Tris, pH 7.4; 80 g de NaCl | Para hacer 1 x Buffer TBST: mezclar 100 mL 10 x TBS Buffer con 900 mL ddH2O y 1 mL de Tween-20 |
| Tampón de bloqueo | 1 x TBST con leche descremada en polvo 5% | Preparar el tampón inmediatamente antes del uso |
| Tampón de dilución de anticuerpo | 1 x TBST con 3% de BSA y 0,02% de azida sódica | Este búfer podría almacenarse a 4 ° C durante al menos 6 mes |
Tabla 1: Soluciones y buffers.
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Discussion
Este papel describe un protocolo para detectar y analizar la sumoilación endógena de Rb en células humanas. Como este método se centra específicamente en la proteína endógena de la Rb sin cualquier alternancia de señal relacionadas con SUMO mundial, es una herramienta importante para la investigación de modificación de la Rb-SUMO bajo circunstancias fisiológicas totalmente naturales.
Para lograr este objetivo, es importante tener en cuenta que: 1) aunque SUMO comprende cuatro isoformas (SUMO1-4, cada una codificada por diferentes genes) en comparación con la ubiquitinación, todas las especies SUMO son mucho menos abundantes; 2) para la mayoría de las proteínas SUMO para destino, sólo una pequeña porción de una proteína dada es sumoiladas en estado estacionario, que es el resultado de la constante competencia entre las enzimas involucradas en la conjugación de SUMO y deconjugation de14,21; y 3) objetivos SUMO pueden someterse a ciclos rápidos de sumoilación y deSUMOylation. Por ejemplo, datos recientes obtenidos por los autores de este trabajo actual demuestran que Rb SUMO1 existe solamente para un muy corto período de tiempo en la fase G1 temprana, que es coherente con la concepción que la sumoilación es un proceso dinámico, reversible13 . Todos estos hechos hacen que sea difícil de detectar directamente la sumoilación endógena de una proteína determinada. Por ello, para detectar con éxito esto, es vital para identificar las condiciones exactas bajo las cuales se produce esta modificación. Por ejemplo, en este protocolo propuesto, el momento de la sincronización del ciclo celular es crucial para la detección de la sumoilación de la Rb. Un procedimiento experimental optimizado también es importante para la detección exitosa de la especie bajo nivel modificado de SUMO de una proteína determinada. Por ejemplo, adecuada sonicación o pasar a través de agujas podrían prevenir la formación de componentes pegajosos y viscosos debido a la extracción de ADN genómico, sonicación adecuado puede facilitar así la extracción de proteínas totales. Por otra parte, un buen anticuerpo monoclonal con alta afinidad a la proteína diana podría ser útil para mejorar la cantidad y especificidad de la inmunoprecipitación. En Resumen, el método propuesto es importante para explorar aún más las condiciones fisiológicas bajo las cuales Rb endógena es sumoiladas, que es la premisa del siguiente ensayo funcional basada en la sobreexpresión.
Para amplificar la señal SUMO de una proteína dada, es común co-sobrexpresan esta proteína, así como otras proteínas relacionadas con SUMO (generalmente proteína Ubc9 y SUMO) en las células. Aunque un simple Western blot utilizando un anticuerpo contra el sustrato es la forma más fácil para encontrar el peso molecular más alto, sumoiladas forma de esta proteína, no pudimos detectar la señal de SUMO-Rb con este método. Así, este papel sólo se centra en un método para detectar la modificación SUMO de la proteína de Rb exógena precipitada. Además, este método describe cómo para artificialmente aumentar o eliminar el SUMO-Conjugación de Rb. Como el único ligase de la E2, Ubc9 se ha encontrado para transferir directamente SUMO a objetivos específicos22. Así, mediante la fusión de la terminal C de Rb, Ubc9 promueve significativamente la modificación SUMO de Rb. utilizando este método, los autores de este trabajo ha demostrado con éxito que la sumoilación de Rb suficientemente promovido su propia fosforilación incrementando su unión a CDK213. Por otra parte, para estudiar las consecuencias funcionales de la pérdida de Rb la sumoilación, los autores generan una construcción deficiente SUMO Rb, como previamente divulgados11. Utilizando el método propuesto en este trabajo actual, fue demostrado que SUMO-Rb es necesario para el ciclo normal de la célula progresión y célula proliferación13.
Además de SUMO1, SUMO2 y SUMO3 también desempeñan papeles importantes en la proteína sumoilación14,17. SUMO2 y SUMO3 se refieren a menudo como SUMO2/3 porque están estrechamente relacionados y comparten identidad del 97%. SUMO1 comparte una similitud del 50% con SUMO2/3. Es ampliamente aceptado que SUMO1 es responsable de las funciones fisiológicas normales de la célula y mantenimiento, mientras que el SUMO-2/3 participa predominante en células estrés respuestas15,17,23, 24. dado que Rb también podría ser sumoiladas por SUMO2/3 con función desconocida12, el método propuesto en este estudio es aún adecuado para la detección y análisis de esta modificación del Rb. Además de Rb, los métodos descritos aquí pueden ser ampliamente aplicados a la detección y el análisis funcional de la sumoilación de una variedad de proteínas objetivo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la ciencia y tecnología Comisión de Shangai (Grant no. 14411961800) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
