Summary
Proteine della famiglia piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) sono coniugati ai residui di lisina delle proteine bersaglio per regolare i vari processi cellulari. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione della proteina del retinoblastoma (Rb) sumoilazione in condizioni endogene ed esogene in cellule umane.
Abstract
Le modificazioni post-traduzionali delle proteine sono fondamentali per la corretta regolazione della trasduzione del segnale intracellulare. Tra queste modifiche, piccolo ubiquitina-relativo modificatore (SUMO) è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente ai residui di lisina di una varietà di proteine bersaglio per regolare i processi cellulari, come la trascrizione del gene, riparazione del DNA, proteine interazione e degrado, trasporto subcellulare e trasduzione del segnale. L'approccio più comune al rilevamento della proteina sumoilazione si basa sull'espressione e purificazione delle proteine ricombinanti con tag nei batteri, consentendo un in vitro reazione biochimica che è semplice e adatto per l'indirizzamento meccanicistico domande. Tuttavia, a causa della complessità del processo di SUMOilazione in vivo, è più difficile rilevare e analizzare la proteina SUMOilazione nelle cellule, soprattutto quando si è in condizioni endogena. Uno studio recente dagli autori di questa carta ha rivelato che la proteina endogena retinoblastoma (Rb), un oncosoppressore che è essenziale per la regolazione negativa della progressione del ciclo cellulare, è specificamente SUMOilate alla fase G1 precoce. Questo articolo descrive un protocollo per la rilevazione e l'analisi di SUMOilazione Rb in condizioni sia endogene che esogene in cellule umane. Questo protocollo è appropriato per l'indagine fenotipica e funzionale di SUMO-modificazione del Rb, come pure molte altre proteine SUMO-mirati, in cellule umane.
Introduction
L'accurato controllo della progressione del ciclo cellulare nelle cellule eucariotiche si basa su una fitta rete di regolamentazione, che garantisce che determinati eventi si svolgono in un determinato ordine1,2. Uno dei giocatori chiave in questa rete è la proteina del retinoblastoma (Rb), il primo clonato tumore soppressore1,3. La proteina Rb è pensata per essere un regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare, soprattutto per il G0/G1 a transizione di fase S e tumore crescita4,5. Fallimento di funzione di Rb sia direttamente comporta la malignità intraoculare più comune nei bambini, retinoblastoma, o contribuisce allo sviluppo di molti altri tipi di cancro5. Rb è inoltre impegnato in molte vie cellulari tra cui la differenziazione delle cellule, di rimodellamento della cromatina e apoptosi mitocondrio-mediata3,6,7.
Modificazioni post-traduzionali giocano un ruolo fondamentale nella regolazione della funzione RB8,9. La fosforilazione è una tale modifica, e solitamente conduce all'inattivazione di Rb. In cellule quiescenti G0, Rb è attiva con un livello basso di fosforilazione. Come cellule progressi attraverso fase G0/G1, Rb è in sequenza iper-fosforilato da una serie di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) e cicline, ad esempio ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, che inattivano Rb ed eliminare la sua capacità di reprimere il ciclo cellulare correlate a gene espressione4,10. RB potrebbe essere modificata anche da piccole modificatore ubiquitina-correlate (SUMO)11,12,13.
SUMO è una proteina di ubiquitin-like che è legame covalente a una varietà di proteine bersaglio. È fondamentale per diversi processi cellulari, tra cui la regolazione del ciclo cellulare, trascrizione, localizzazione cellulare della proteina e degrado, trasporto ed il DNA riparazione14,15,16, 17 , 18. via di Coniugazione il SUMO è costituito dall'enzima d'attivazione di SUMO E1 dimerica SAE1/UBA2, l'unico enzima di coniugazione E2 Ubc9, multiple E3 ligasi e proteasi specifiche SUMO. Generalmente, il nascente proteine SUMO devono essere elaborati proteoliticamente per generare la forma matura. Il SUMO maturo è attivato dall'eterodimero E1 e quindi trasferita all'enzima E2 Ubc9. Infine, la glicina del C-terminale di SUMO covalenza è coniugata con la lisina di destinazione di un substrato, e questo processo è solitamente nei paraggi E3 ligasi. La proteina SUMO può essere rimosso dal substrato modificato da proteasi specifiche. Uno studio precedente dagli autori di questa carta ha rivelato che la sumoilazione di Rb aumenta suo legame con CDK2, che conduce alla fosforilazione di iper alla fase G1 precoce, un processo che è necessario per il ciclo cellulare progressione13. Inoltre abbiamo dimostrato che la perdita di Rb SUMOylation provoca una proliferazione delle cellule in diminuzione. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la sumoilazione di Rb protegge la proteina Rb da proteasomal fatturato, aumentando così il livello di proteina Rb in cellule19. Di conseguenza, sumolazione svolge un ruolo importante nella funzione di Rb in vari processi cellulari. Per studiare ulteriormente la conseguenza funzionale e rilevanza fisiologica di SUMOilazione Rb, è importante sviluppare un metodo efficace per analizzare lo stato SUMO di Rb in cellule o tessuti di pazienti umani.
Sumoilazione è un processo reversibile, altamente dinamico. Così, è solitamente difficile da rilevare le proteine SUMO-modificate in condizioni completamente endogene. Questo articolo presenta un metodo per rilevare endogeno Rb sumoilazione. Inoltre, viene illustrato come rilevare esogeno Rb sumoilazione di selvaggio-tipo Rb e sua mutazione di SUMO-carenti11. In particolare, Jacobs et al ha descritto un metodo per aumentare la modifica di SUMO di un substrato dato specificamente di Ubc9 fusion-regia SUMOylation (UFDS)20. Basato su questo metodo, questo protocollo viene descritto come analizzare la sumoilazione forzata di Rb e le sue conseguenze funzionali. Dato che centinaia di substrati SUMO è stati descritti precedentemente e più substrati putativi di SUMO sono stati identificati da molte analisi proteomica-based, questo protocollo può essere applicato per analizzare la SUMO-modifica di queste proteine in cellule umane.
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Protocol
1. rilevamento di SUMOilazione Rb endogeno alla fase G1 precoce
- Cell sincronizzazione del ciclo cellulare e di cultura.
- Cellule HEK293 mantenere nel terreno di coltura contenente Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) completate con 1% penna-Strep e 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore.
- Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase G0.
- Conteggio le cellule HEK293 utilizzando un emocitometro e seme ~1.5 x 10 7 cellule in un 15cm piatto con 25 ml di terreno di crescita per 24 h prima del trattamento. Dopo aver raggiunto una confluenza di 70-80%, aspirato il mezzo e lavare le cellule due volte con 5 mL Tampone fosfato salino (PBS) preriscaldata.
- Aggiungere 25 mL DMEM contenente 1% penicillina-streptomicina e incubare le cellule a 37 ° C per 72 h. lavare le cellule fuori la piastra con 3 mL di PBS ghiacciata. Trasferire le cellule in una nuova provetta da 5 mL.
- Soggetto una piccola porzione delle cellule per analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria (punto 1.2); raccolta la maggior parte restante delle cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente e quindi memorizzarli in un congelatore di ultra-bassa temperatura fino all'analisi di Rb sumoilazione.
- Ottenere G1-fase cellule, alla fine del processo di sincronizzazione di G0, rimuovere il DMEM e aggiungere mezzo di sviluppo torna fresco, così permettendo che le cellule HEK293 immettere nuovamente il ciclo cellulare. Quindi, raccogliere le cellule nelle diverse fasi G1 (G1 precoce: 30 min; G1: 2h) per ciclo cellulare analisi e SUMO ulteriore saggio.
- Sincronizzare le cellule HEK293 nella fase di S, utilizzando il metodo di blocco doppio-timidina.
Cellule
- cellule HEK293 crescere a una confluenza di 50% e lavaggio con PBS preriscaldata. Quindi aggiungere il medium di crescita completate con timidina 2,5 mM per 18 h (primo blocco).
- Rimuovere il mezzo contenente timidina e poi lavare le cellule due volte con PBS preriscaldata. Aggiungere il terreno di coltura fresco per 14 h a rilasciare le cellule di.
- Eliminare il terreno con una pipetta e aggiungere mezzo di sviluppo completato con timidina 2,5 mM per un altro 18 h (secondo blocco) prima di condurre un'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.
- Sincronizzazione per la G2/M, piastra ~1.5 × 10 7 HEK293 cellule ad un piatto di 15cm con 25 mL di terreno di crescita per 24 h. Quindi aggiungere nocodazole al mezzo fino ad ottenuta una concentrazione finale di 400 ng/mL. Infine, incubare le cellule per 16 h prima di condurre l'analisi del ciclo cellulare e Rb sumoilazione.
- Analisi del ciclo cellulare mediante citofluorimetria.
- Risospendere il HEK293 sincronizzato in PBS e quindi correggere la sospensione cellulare utilizzando ghiacciata etanolo al 70% per 2 h a 4 ° C. si noti che per ridurre al minimo il clustering di cella, aggiungere goccia a goccia la sospensione cellulare per l'etanolo 100% ghiacciata per ottenere una concentrazione finale di etanolo al 70% mentre delicatamente nel Vortex.
- Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g, poi accuratamente scartare il surnatante e lavare le cellule due volte con PBS. Ripetere il passaggio della centrifuga.
- Aggiungere 500 µ l di PBS contenente 50 µ g/mL dell'acido nucleico macchia ioduro di propidio, 0,1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNasi alle cellule e mescolare bene. Incubare le cellule per 15 min a 37 ° C.
- Conservare i campioni a 4 ° C fino all'analisi di citometria a flusso.
- Immunoprecipitazione della proteina endogena Rb.
- Preparare il HEK293 lisati cellulari.
- Lyse le cellule HEK293 sincronizzate sospendendo delicatamente ri-li, in 1 mL di tampone di lisi ghiacciata radio-immunoprecipitazione assay (RIPA) (tabella 1), che contiene appena aggiunto 20 mM N-Ethylmaleimide, un inibitore di isopeptidase che potrebbe bloccare le proteasi SUMO e stabilizzare SUMO coniugati.
- Ulteriormente omogeneizzare le cellule su ghiaccio lisata omogeneizzazione, sonicazione o semplicemente passando attraverso 10 volte attraverso un ago 21G attaccato su una siringa da 2 mL. Quindi, incubare le cellule in ghiaccio per 5 min.
Nota: L'anionici detergente sodio dodecil solfato (SDS) nel buffer RIPA è fondamentale per la successiva determinazione del Rb-SUMO, come si poteva eliminare il segnale SUMO aspecifiche che è derivato dall'interazione tra la proteina Rb e altro non-covalente SUMO-specie non-Rb.
- Centrifugare i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. trasferire i surnatanti in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le proteine possono essere conservate a-80 ° C per almeno 6 mesi. - Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione del surnatante sopra un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.
- Per i surnatanti sopra, aggiungere 1 µ g di immunoglobulina non specifico del mouse G (IgG) della stessa specie e isotype come l'anticorpo monoclonale di Rb e 20 µ l di impasto un/G-Sepharose della proteina al 50%. Quindi, incubare per 1 h a 4 ° C con rotazione dolce.
- Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C. attentamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in nuove provette di micro-centrifuga da 1,5 mL. A ciascuno dei campioni, aggiungere 5 µ l Rb anticorpo primario e 40 µ l di proteina 50% un/G-Sepharose della liquami. Quindi, incubare per una notte a 4 ° C con rotazione dolce.
- Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con cautela il surnatante pipettando. Si noti che al fine di evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.
- Lavare le perle quattro volte con 1 mL di tampone RIPA. Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione li a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle mediante centrifugazione a bassa velocità a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e poi scartare i surnatanti.
- Dopo aver rimosso i surnatanti dal lavaggio finale, risospendere le perline in 30 µ l 1 x buffer di sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) carico (tabella 1) e mescolare bene.
- Incubare le provette a 100 ° C in un calore bloccano per 10 min. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferirli in provette da 1,5 mL micro-centrifuga.
- Analizza i campioni da 4-20% pendenza SDS-PAGE gel e Western blot oppure conservarli a-20 ° C per un uso successivo.
- Preparare il HEK293 lisati cellulari.
2. Analisi di 6XHis-etichetta sumoilazione di Rb esogeno in cellule umane
- cultura e transfezione delle cellule.
- Seme ~ 6 × 10 6 HEK293 cellule in un 10 cm piatto e incubare per 24 h nel mezzo di crescita in condizioni di coltura delle cellule normali di acquisire 75% - 85% di cellule confluenti. Prima di transfezione, rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 6 mL di terreno preriscaldati riduttori del siero (Vedi Tabella materiali) e quindi posizionare i piatti nuovamente dentro l'incubatrice.
- Saggio di SUMOilazione costitutiva per il Rb, aggiungere 15 µ g di 6XHis-etichetta Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmidi Ubc9-C93S in mezzo di riduttore del siero 500 µ l in provette da 1,5 mL micro-centrifuga, rispettivamente.
- Per analizzare la coniugazione di SUMO di tipo selvaggio Rb e suo mutante di SUMOilazione-difettoso, mescolare 10 µ g di entrambi plasmide Rb-WT o Rb-K720R 6XHis-tag insieme con GFP-SUMO1 (10 µ g) in 500 µ l ridotto medio del siero in 1,5 mL micro-centrifuga tubi 13.
- Nel frattempo, in un tubo separato, mescolare 50 µ l di reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali) in 500 µ l ridotto medio del siero e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Completamente combinare i due tubi separati sopra descritti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti Aggiungi la transfezione complessi reagente/plasmide alle cellule e continuano a cultura per 8 h 5% CO 2 e 37 ° C.
- Sostituire medio riduttori del siero con il mezzo di crescita e incubare le cellule in condizioni di normale coltura per 48 ore dopo la trasfezione.
- Nichel affinità pull-down della proteina Rb 6XHis-taggati.
- Lisare le cellule HEK293 transfettate ed estrarre le proteine totali come descritto sezione 1.3.1.
- Centrifuga i lisati cellulari a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C. accuratamente raccogliere i supernatanti e trasferirli tubi puliti.
Nota: La proteina può essere congelata a questo punto per più di 6 mesi a -80 ° C. - Per preparare il controllo di input di ogni campione per il successivo Western blot, salvare una piccola porzione dei surnatanti descritto in precedenza per un nuovo tubo e conservare a -80 ° C.
- Wash 25 µ l di 50% di nichel nitrilotriacetico acidi perle di agarosio (Ni-NTA) con buffer di RIPA due volte in una provetta da 1,5 mL micro-centrifuga per ciascun campione. Raccogliere le perle mediante centrifugazione a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C.
- Add 1 M imidazolo per ciascun campione per ottenere una concentrazione finale di 10 mM. Quindi, aggiungere ciascun campione nella provetta contenente il preparato perline di agarosio Ni-NTA.
- Incubare le perline e i lisati per 2 h a 4 ° C con una leggera rotazione. Ruotate le perline a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere con attenzione i sovranatante pipettando. Per evitare la perdita di tallone, non aspirare l'asciutto di perline.
- Lavare le perline con 1 mL di tampone di lavaggio contenenti imidazolo 20mm (tabella 1). Ogni volta, mescolare i tubi anche di rotazione a 4 ° C per 15 min. raccogliere le perle di filatura a 3.000 x g per 3 min a 4 ° C e scartare i surnatanti.
- Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 µ l di eluizione tampone imidazolo di contenente 250 mM (tabella 1) per ogni campione e flick per mescolare. Quindi, incubare per 20 min a 4 ° C per eluire le proteine.
- Mescolare ogni campione con tampone di caricamento 6 × SDS-PAGE (tabella 1). Quindi, incubare le provette a 100 ° C in un blocco di calore per 10 min.
- Centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto agglomerare le perline. Accuratamente raccogliere i surnatanti senza disturbare le perline e trasferire i campioni per provette da 1,5 ml micro-centrifuga. I campioni possono essere analizzati mediante Western blot o conservati a-20 ° C per un uso successivo.
3. Western Blot
- caricare l'immunoprecipitazione o tirare giù i campioni ottenuti dai passaggi precedenti sul gradiente gel di SDS-PAGE 4-20%. Condurre l'elettroforesi a 120 V per 90 min separare le proteine.
- Trasferire le proteine dal gel ad una membrana di polivinilidene (PVDF) Il difluoruro di electroblotting a 300 mA per 90 min a 4 ° C, utilizzando il metodo di trasferimento del serbatoio. Bloccare la membrana PVDF in mattoncino buffer contenente 5% di latte scremato (tabella 1) per 1 h a temperatura ambiente.
- Incubare la membrana con l'anticorpo primario in tampone di diluizione di anticorpo contenente 3% albumina di siero bovino (BSA) (tabella 1) durante la notte a 4 ° C. Per gli anticorpi primari, utilizzare una concentrazione di lavoro 0,5 µ g/ml (anticorpo anti-SUMO1), o una diluizione di 1: 2000 (anticorpi anti-Rb e anti-tubulina), o 1:5,000 (anti-GFP e la anti-sua anticorpo).
- Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 x soluzione fisiologica tamponata con buffer di Tween (TBST) (tabella 1). Incubare la membrana con specie specifici anticorpi secondari coniugati HRP perossidasi di rafano 1:5,000 diluito in tampone di blocco contenente 5% di latte scremato (tabella 1). Lavare la membrana 3 x per 10 min ogni volta utilizzando 1 buffer di x TBST.
- Incubare la membrana con chemiluminescenza (ECL) soluzione di lavoro. Coprire la membrana con involucro di plastica ed esporlo alla pellicola di raggi x a seconda della forza segnale.
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Representative Results
Per rilevare endogeno Rb sumoilazione durante la progressione del ciclo cellulare, questo studio sincronizzato prima cellule HEK293 in cinque diverse fasi del ciclo cellulare (G0, primi G1, G1, S e G2/M), come descritto nella sezione protocollo di questa carta. La qualità di sincronizzazione è stata confermata usando la macchia di acido nucleico con ioduro di propidio seguito dall'analisi di citometria a flusso (Figura 1). Successivamente, le cellule sono stati raccolti e lisate denaturando buffer di RIPA. L'inibitore di proteasi SUMO, N-Ethylmaleimide, è stato aggiunto a una concentrazione finale di 20 mM per preservare il segnale SUMO nativo durante gli esperimenti. Dopo immunoprecipitazione delle specie endogene Rb sotto condizioni di bloccare l'interazione aspecifica non-covalente e il seguente western blot con anticorpi anti-SUMO1 di denaturazione, la presenza del segnale SUMO è stata rilevata in particolare presso il Inizio fase G1 (Figura 2). Anche se la sumoilazione globale è stato migliorato nella fase S/G2/M, al punto di tempo di Rb sumoilazione, non fosse cambiato (Figura 2, Pannello input penna). Questa scoperta suggerisce che la sumoilazione di Rb non è semplicemente la conseguenza dell'attività globale alterata coniugazione di SUMO. Così, questi risultati indicano che la proteina immunoprecipitazione e Western blot analisi descritti in questa carta consentono la rilevazione di SUMOilazione della proteina Rb endogena.
Per rilevare la sumoilazione forzata della proteina Rb, questo studio generato una costitutiva Rb SUMOilate costruire fondendo Ubc9, la suola ligasi E2 SUMO, al relativo C-terminale consentendo efficienti e selettivi sumoilazione di Rb (Figura 3A). La mutazione di perdita-de-funzione di Ubc9, C93S, inoltre si fonde al C-terminale della Rb per servire come controllo (Figura 3A). Per rafforzare ulteriormente la specificità del segnale SUMO-Rb, senza fusibile Ubc9 da solo è stato costruito come bene. Tutti e quattro i plasmidi di His-Tag transfected nelle cellule HEK293 per 48 h prima sono state lisate in tampone RIPA completati con 20 mM N-Ethylmaleimide. Tutte le proteine sono stati quindi sottoposti a un pull verso il basso dosaggio, come descritto nella sezione protocollo di questa carta. Le proteine eluite di Rb sono state analizzate mediante Western blot. Il Ubc9 fusion-regia che sumoilazione di Rb è stato rilevato usando un anticorpo anti-SUMO1 (Figura 3B, pannello di SUMO1), mentre la mutazione difettosa Ubc9, C93S, non è riuscito a produrre questo segnale. Si noti che l'altamente efficiente SUMO-modifica causata dalla porta di Ubc9-fusione a una banda di peso molecolare più elevata che potrebbe anche essere rilevato direttamente utilizzando l'anticorpo di Rb, e corrisponde al segnale di SUMO (Figura 3B, Rb pannello). Inoltre, Ubc9 da solo non ha causato alcuna coniugazione di SUMO, confermando ulteriormente la sumoilazione di Rb-specifiche (Figura 3B).
Poiché SUMO1 è coniugato a lisina 720 di proteina Rb11, per analizzare ulteriormente la sumoilazione di Rb, questo studio generato una mutazione di SUMO-carenti sostituendo questo residuo di lisina con un'arginina (K720R). Per facilitare il rilevamento di SUMO-coniugazione delle due proteine Rb transitoriamente espresse, un costrutto di GFP-SUMO1 è stato aggiunto per migliorare il segnale intracellulare di SUMO. Sua etichetta wild type o mutanti Rb è stato co-trasfettate in cellule HEK293 insieme a GFP-SUMO1, seguita da analisi e analisi della capacità di coniugazione di Rb-SUMO1 a discesa. Come osservato, il mutante di K720R totalmente abolita la SUMO-modifica di Rb, rafforzando ulteriormente la capacità del metodo proposto di rilevare la sumoilazione di Rb (Figura 4).
Figura 1 : Convalida del dosaggio ciclo cellulare sincronizzazione tramite flusso cytometry. Cellule HEK293 erano coltivate e sincronizzate con il G0, G1 precoce, fasi G1, S e G2/M del ciclo cellulare come descritto in questo protocollo. Distribuzioni del ciclo cellulare sono stati determinati mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS). I dati rappresentati viene illustrato un esempio dell'analisi quantitativa del dosaggio FACS (n = 1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rb è SUMOilate alla fase G1 precoce. Cellule HEK293 sono state sincronizzate alle diverse fasi del ciclo cellulare, come descritto in questo protocollo. Le cellule sono stati raccolti e lisate in tampone RIPA completati con 20 mM N-Ethylmaleimide. I controlli di input sono stati caricati su un gel di pendenza di SDS-PAGE 4-20%, trasferiti e cancellati con anti-SUMO1 e anti-tubulina, come indicato. I lisati cellulari rimanenti sono stati poi sottoposti ad immunoprecipitazione utilizzando anticorpi anti-Rb ad una diluizione di 1: 200. La risultante eluenti erano separate da 4-20% SDS-PAGE gel gradiente e immunoblotted utilizzando l'anticorpo anti-SUMO1 e dell'anticorpo anti-Rb. Questo esperimento è stato ripetuto due volte con lo stesso risultato. Questa figura è stata modificata con autorizzazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Rilevamento della SUMO-modificazione della proteina di fusione di Rb-Ubc9. (A) diagramma dei costrutti di SUMOilazione (UFDS) regia di fusione Ubc9 di Rb. (B) costitutiva sumoilazione di Rb causato da UFDS. Cellule HEK293 transfettate transitoriamente con le costruzioni di His-Tag UFDS sono state lisate in tampone RIPA con 20 mM N-Ethylmaleimide. Il totale lisato di ogni campione è stato incubato con i branelli di agarosio Ni-NTA a tirare giù le proteine di fusione di His-Tag Rb-Ubc9 o Ubc9 (usata come controllo negativo), rispettivamente. Le proteine purificate sono state separate da 4-20% SDS-PAGE gel gradiente e immunoblotted con anti-SUMO1 e gli anticorpi anti-suoi. Sua-Rb: 6XHis etichetta Rb-Ubc9 proteine di fusione; Sua-Ubc9: 6XHis etichetta solo Ubc9. RB-Ubc9: non modificate Rb-Ubc9; RB-Ubc9-s: SUMOilate Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: Iper-fosforilata Rb-Ubc9. I risultati mostrati in figura sono rappresentativi di tre prove indipendenti. Questa figura è stata modificata con autorizzazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . La mutazione di SUMO-carenti K720R riduce la sumoilazione di Rb. Cellule HEK293 erano transitoriamente co-trasfettate con i costrutti di Rb-His wild type o mutanti insieme a GFP-SUMO1. Le cellule sono stati raccolti e lisate in tampone RIPA completati con 20 mM N-Ethylmaleimide. Una piccola porzione dei lisati direttamente è stata analizzata mediante Western blot come il controllo di input. Il resto dei lisati sono stati incubati con i branelli di agarosio Ni-NTA a tirare giù le proteine Rb His-tag, come descritto in questo protocollo, ed erano immunoblotted con anti-SUMO1 e gli anticorpi anti-suoi. Si noti che la mutazione di lisina--arginina a 720 di Rb totalleato abolisce la modifica di SUMO di questa proteina. L'esperimento è stato condotto una volta con un risultato simile a quello precedentemente segnalato11. Questa figura è stata modificata con autorizzazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Componenti | Commenti |
| Buffer di lisi RIPA | 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; 1% sodio desossicolato; 0,1% SDS | Aggiungere inibitore della proteasi cocktail e N-ethylmaleimide immediatamente prima dell'uso. |
| Tampone di lavaggio | 50 millimetri NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; imidazolo 20 mM | Utilizzato per tirare verso il basso dosaggio solo |
| Tampone di eluizione | 50 millimetri NaH2PO4 pH = 8.0; 300 mM NaCl; imidazolo 250 mM | Utilizzato per tirare verso il basso dosaggio solo |
| 6 x Buffer di caricamento | 0.5 Tris M, pH = 6.8; 30% glicerolo; 10% SDS; 5% β-mercaptoetanolo; 0.1 blu di bromofenolo % | Conservare a-20 ° C |
| 10X tampone di corsa | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1.9 glicina M; 1% SDS | Per rendere 1 x Running Buffer: mescolare 100 ml 10 x Running Buffer con 900 mL ddH2O |
| 10X tampone di trasferimento | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1,9 M glicina | Per rendere 1x Buffer di trasferimento: miscelare 100 mL 10 x Buffer di trasferimento con 200 ml di metanolo e 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS Buffer | In 1 L di ddH2o: 24.08 g Tris pH 7.4; 80 g di NaCl | Per rendere 1x TBST Buffer: miscelare 100 mL 10 x TBS Buffer con 900 mL ddH2O e 1 mL di Tween-20 |
| Blocco Buffer | 1 x TBST con 5% senza grassi del latte secco | Preparare il tampone immediatamente prima dell'uso |
| Tampone di diluizione di anticorpo | 1 x TBST con 3% BSA e 0,02% di sodio azide | Questo Buffer poteva essere conservato a 4 ° C per almeno 6 mesi |
Tabella 1: Soluzioni e buffer.
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Discussion
Questo articolo descrive un protocollo per rilevare e analizzare la sumolazione endogeno di Rb in cellule umane. Mentre questo metodo è specificamente incentrato sulla proteina Rb endogena senza qualsiasi alternanza di segnale correlate a SUMO globale, è un importante strumento per lo studio di modificazione di Rb-SUMO in circostanze fisiologiche completamente naturali.
Per raggiungere questo obiettivo, è importante tenere a mente che: 1) anche se SUMO comprende quattro isoforme (SUMO1-4, ciascuna codificate da geni) in confronto di ubiquitinazione, tutte le specie SUMO sono molto meno abbondanti; 2) per la maggior parte delle proteine bersaglio SUMO, solo una piccola parte di una data proteina è SUMOilate allo steady state, che è il risultato della costante competizione tra gli enzimi implicati nella coniugazione di SUMO e deconjugation14,21; e 3) obiettivi SUMO possono subire rapidi cicli di SUMOilazione e deSUMOylation. Per esempio, dati recenti ottenuti dagli autori di questa carta corrente dimostrano che la Rb-SUMO1 esiste solo per una finestra molto breve di tempo nella fase G1 precoce, che è coerenza con la concezione che la sumolazione è un processo reversibile, altamente dinamico13 . Tutti questi fatti rendono difficile da rilevare direttamente la sumoilazione endogeno di una data proteina. Così, per rilevare correttamente questo, è fondamentale per identificare le esatte condizioni in cui si verifica questa modifica. Per esempio, in questa proposta di protocollo, i tempi di sincronizzazione del ciclo cellulare sono fondamentali per la rilevazione di SUMOilazione Rb. Una procedura sperimentale ottimizzata è anche importante per l'individuazione delle specie SUMO-modificato a basso livello di una data proteina. Ad esempio, passaggio-attraverso aghi o sonicazione corretta potrebbero impedire la formazione di appiccicosi e viscosi componenti a causa di DNA genomico, quindi corretto sonicazione può facilitare estrazione della proteina totale. Inoltre, un buon anticorpo monoclonale con alta affinità alla proteina bersaglio potrebbe essere utile per migliorare la quantità e la specificità di immunoprecipitazione. In sintesi, il metodo proposto è importante per esplorare ulteriormente le condizioni fisiologiche in cui Rb endogeno è SUMOilate, che è la premessa del seguente test funzionali basati su sovraespressione.
Per amplificare il segnale SUMO di una data proteina, è comune a co-iperesprimere questa proteina così come altre proteine correlate a SUMO (solitamente Ubc9 e SUMO proteina) nelle cellule. Anche se un semplice Western blot usando un anticorpo contro il substrato è il modo più semplice per trovare il più alto peso molecolare, forma SUMOilate di questa proteina, non siamo riusciti a rilevare il segnale di SUMO-Rb con questo metodo. Così, questa carta si è concentrato unicamente su un metodo per rilevare la SUMO-modifica della proteina Rb esogena precipitata. Inoltre, questo metodo descritto come artificialmente che permettono di migliorare o eliminare la coniugazione di SUMO di Rb. Come il sole-ligasi E2 Ubc9 è stato trovato per trasferire direttamente SUMO a target specifici22. Così, fondendo al terminale C del Rb, Ubc9 significativamente promuove la SUMO-modifica di Rb. utilizzando questo metodo, gli autori di questa carta ha dimostrato con successo che sumoilazione di Rb sufficientemente promosso proprio fosforilazione aumentando la sua associazione a CDK213. Inoltre, per studiare le conseguenze funzionali della perdita di sumoilazione di Rb, gli autori hanno generato un costrutto di SUMO-carenti Rb, come precedentemente segnalati11. Utilizzando il metodo proposto in questa carta attuale, è stato indicato che SUMO-Rb è necessaria per il normale ciclo cellulare delle cellule e progressione proliferazione13.
Oltre al SUMO1, SUMO2 e SUMO3 anche giocare ruoli importanti nella proteina sumoilazione14,17. SUMO2 e SUMO3 riferiscono a spesso come SUMO2/3 perché sono strettamente correlati e condividere identità di 97%. SUMO1 condivide una somiglianza di 50% con SUMO2/3. È ampiamente accettato che SUMO1 è responsabile di funzioni fisiologiche normali delle cellule e manutenzione, mentre SUMO-2/3 è principalmente implicato nella cella stress responses15,17,23, 24. dato che Rb può anche essere SUMOilate da SUMO2/3 con funzione sconosciuta12, il metodo proposto in questo studio è ancora adatto per la rilevazione e l'analisi di questa modifica del Rb. Oltre a Rb, i metodi descritti qui possono essere ampiamente applicati alla rilevazione e all'analisi funzionale di sumoilazione di una varietà di proteine bersaglio.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dalla scienza e la tecnologia Commissione di Shanghai (Grant No. 14411961800) e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (Grant No. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
