Summary
Família proteínas pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO) são conjugadas aos resíduos de lisina das proteínas alvo regular de vários processos celulares. Este artigo descreve um protocolo para a detecção da proteína do retinoblastoma (Rb) SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas.
Abstract
As modificações pós-tradução de proteínas são essenciais para a regulação adequada da transdução do sinal intracelular. Entre estas modificações, pequeno modificador ubiquitin-relacionados (SUMO) é uma proteína de ubiquitina-como que é covalentemente ligada aos resíduos de lisina de uma variedade de proteínas do alvo para regular os processos celulares, tais como a transcrição do gene, reparo do DNA, proteínas interação e degradação, transporte subcelular e transdução de sinal. A abordagem mais comum para detectar proteínas SUMOylation baseia-se na expressão e purificação de proteínas recombinantes marcadas em bactérias, permitindo uma em vitro reação bioquímica que é simples e adequada para endereçamento mecanicista perguntas. No entanto, devido à complexidade do processo de SUMOylation na vivo, é mais difícil de detectar e analisar proteínas SUMOylation em células, especialmente quando sob condições endógenas. Um estudo recente dos autores deste trabalho revelou que a proteína endógena retinoblastoma (Rb), um supressor de tumor que é vital para a regulação negativa da progressão do ciclo celular, é especificamente SUMOylated na fase inicial do G1. Este artigo descreve um protocolo para a detecção e análise de Rb SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas. Este protocolo é apropriado para a investigação fenotípica e funcional da SUMO-modificação do Rb, bem como muitos outras sumô-alvo proteínas, nas células humanas.
Introduction
O controle exato da progressão do ciclo celular em células eucarióticas é baseado em uma rede reguladora apertada, que garante que determinados eventos ocorrem em uma forma ordenada1,2. Um dos principais intervenientes nesta rede é a proteína do retinoblastoma (Rb), o primeiro tumor clonado supressor1,3. A proteína Rb é pensada para ser um regulador negativo da progressão do ciclo celular, especialmente para o G0/G1 para transição de fase S e tumor crescimento4,5. Falha da função de Rb também diretamente leva à malignidade intraocular mais comum em crianças, retinoblastoma, ou contribui para o desenvolvimento de muitos outros tipos de câncer5. Além disso, Rb está envolvido em muitos caminhos celulares incluindo diferenciação celular, cromatina remodelação e apoptose mediada por mitocôndrias3,6,7.
Modificações borne-translational desempenham um papel crucial na regulação da função de RB8,9. A fosforilação é a uma tal modificação, e geralmente leva à inactivação de Rb. Nas células quiescentes de G0, Rb está ativo com um nível baixo de fosforilação. Como células de progresso por fase G0/G1 Rb é sequencialmente hiperfosforilada por uma série de quinases proteína cyclin-dependente (CDKs) e ciclinas, como ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, que inactivate Rb e eliminar sua capacidade de reprimir o ciclo celular relacionados ao gene expressão4,10. RB também pode ser modificado por pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO)11,12,13.
SUMÔ é uma proteína do ubiquitin-como que é covalentemente ligada a uma variedade de proteínas do alvo. É crucial para diversos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, transcrição, a localização da proteína celular e degradação, transporte e DNA reparo14,15,16, 17 , 18. caminho de conjugação o sumô consiste a enzima ativando dimérica sumô E1 SAE1/UBA2, a única enzima de conjugação E2 Ubc9, múltiplas E3 ligases e proteases específicas sumô. Em geral, proteínas de sumô nascentes devem ser processadas proteoliticamente para gerar a forma madura. O sumô maduro é ativado pelo heterodímero E1 e em seguida, transferido para a enzima E2 Ubc9. Finalmente, a glicina C-terminal do sumô é covalentemente conjugada com o lisina de destino de um substrato, e este processo é geralmente facilitado pela E3 ligases. A proteína de sumô pode ser removida do substrato modificado por proteases específicas. Um estudo anterior pelos autores deste trabalho revelou que SUMOylation de Rb aumenta sua ligação a CDK2, levando a hiperfosforilação na fase inicial do G1, um processo que é necessário para a progressão de ciclo celular13. Também demonstramos que a perda de Rb SUMOylation provoca uma proliferação de diminuição da célula. Além disso, recentemente foi demonstrado que o SUMOylation de Rb protege a proteína Rb proteasomal volume, aumentando assim o nível de proteína Rb em células19. Portanto, SUMOylation desempenha um papel importante na função de Rb em vários processos celulares. Para um estudo mais aprofundado a consequência funcional e relevância fisiológica do Rb SUMOylation, é importante desenvolver um método eficaz para analisar o status de sumô de Rb em células ou tecidos doentes.
SUMOylation é um processo reversível, altamente dinâmico. Assim, é geralmente difícil de detectar as proteínas modificadas de sumô em condições completamente endógenas. Este trabalho apresenta um método para detectar endógena Rb SUMOylation. Além disso, ele mostra como detectar exógena Rb SUMOylation do selvagem-tipo Rb e sua mutação de sumô-deficientes11. Em particular, Jacobs et al descreveram um método para aumentar a modificação de sumô de um determinado substrato especificamente por fusão-dirigido Ubc9 SUMOylation (UFDS)20. Com base neste método, este protocolo descreve como analisar o SUMOylation forçada de Rb e suas consequências funcionais. Tendo em conta que centenas de substratos de sumô têm sido descritas anteriormente e foram identificados mais substratos de sumô putativos de muitos ensaios baseados em proteômica, este protocolo pode ser aplicado para analisar a sumô-modificação destas proteínas em células humanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. deteção de Rb endógena SUMOylation na fase inicial do G1
- celular sincronização entre cultura e ciclo celular.
- HEK293 manter as células em um meio contendo Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 1% caneta-Strep e 10% fetal de soro bovino (FBS) a 37 ° C e 5% CO 2 em uma incubadora.
- Sincronizar as células HEK293 na fase G0.
- a contagem das células HEK293 usando um hemocytometer e sementes ~1.5 x 10 7 células em um 15 cm do prato com 25 ml de meio de crescimento por 24 h antes do tratamento. Depois de atingir uma confluência de aspirado de 70-80%, a médio e a lavagem das células duas vezes com 5 mL pré-aquecido tampão fosfato salino (PBS).
- Adicionar 25 mL DMEM contendo 1% penicilina-estreptomicina e incube as celulas a 37 ° C por 72 h. lavar as células no prato usando 3 mL PBS gelado. As células de transferência para um novo tubo de 5 mL.
- Assunto uma pequena porção de células para análise de ciclo celular por citometria de fluxo (etapa 1.2); recolher a maioria remanescente das células por centrifugação a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida, armazene-os em um freezer de ultra baixa temperatura até análise de Rb SUMOylation.
- Para obter a fase G1 células, no final do processo de sincronização de G0, remover o DMEM e adicionar meio de crescimento volta fresca, permitindo assim que as células HEK293 para re-introduzir o ciclo celular. Em seguida, recolher as células em diferentes fases do G1 (G1 início: 30 min; G1: 2 h) para o ciclo celular, análise e sumô mais ensaio.
- Sincronizar as células HEK293 na fase S, usando o método de bloco duplo-timidina.
Células
- células HEK293 crescer para uma confluência de 50% e lavagem com PBS escaldadas. Em seguida, adicione o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para 18 h (primeiro bloco).
- Remover o meio contendo timidina e depois lavar as células duas vezes com PBS escaldadas. Adicionar o meio de cultura fresco para 14 h liberar as células.
- Descartar o meio com uma pipeta e adicionar o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para outro 18 h (segundo bloco) antes de realizar uma análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.
- Sincronização para o G2/M, placa ~1.5 × 10 7 HEK293 as células para um prato de 15 cm com 25 mL de meio de crescimento por 24 h. Em seguida, adicione nocodazole ao meio, até à obtenção de uma concentração final de 400 ng/mL. Finalmente, Incube as celulas para 16 h antes de realizar a análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.
- Análise de ciclo celular por citometria de fluxo.
- Re-suspender o HEK293 sincronizado em PBS e então consertar a suspensão de células usando etanol a 70% gelado por 2 h em 4 ° C. Observe que para minimizar a célula de clustering, a suspensão de célula Adicionar gota a gota o etanol 100% gelada para obter uma concentração final de etanol a 70% enquanto suavemente num Vortex.
- Centrifugar as células por 5 min a 500 x g, então, cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com PBS. Repita a etapa centrifuga.
- Adicionar 500 µ l de PBS contendo 50 µ g/mL ácido nucleico mancha iodeto de propidium, 0.1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNase A para as células e misture bem. Incubar as células durante 15 minutos a 37 ° C.
- Armazenar as amostras em 4 ° C até análise por citometria de fluxo.
- Imunoprecipitação da proteína endógena Rb.
Lisados celulares de
- preparar a HEK293.
- Lyse as células HEK293 sincronizadas, gentilmente re-suspendendo-os em 1 mL de tampão de lise de ensaio (RIPA) rádio-imunoprecipitação gelada (tabela 1) contendo recém adicionado 20 mM N-proteÃ, um inibidor de isopeptidase que poderia bloquear proteases de sumô e estabilizar o cojugado sumô.
- Mais homogeneizar as células no gelo por homogenizacao homogeneização, sonication ou simplesmente passando por 10 vezes através de uma agulha 21G anexada em uma seringa de 2 mL. Incubar em seguida, as células no gelo por 5 min.
Nota: O aniônico detergente Dodecil sulfato de sódio (SDS) no buffer de RIPA é crucial para a posterior determinação do Rb-sumô, como ele poderia eliminar o sinal de sumô inespecíficos que é derivado da interação entre a proteína Rb e outros não-covalente SUMÔ-espécie de não-Rb.
- Centrifugar os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferir os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As proteínas podem ser armazenadas a-80 ° C durante pelo menos 6 meses. - Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção do líquido sobrenadante descritas acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.
- Para os sobrenadantes acima, adicionar 1 µ g de rato específico da imunoglobulina G (IgG) da mesma espécie e isotype como o anticorpo monoclonal de Rb e 20 µ l de pasta de um/G-sepharose 50% proteína. Em seguida, incubar durante 1 h a 4 ° C, com rotação suave.
- Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Para cada uma das amostras, adicione 5 anticorpo primário da Rb µ l e 40 µ l de 50% de proteína um/G-sepharose chorume. Em seguida, incubar durante uma noite a 4 ° C, com rotação suave.
- Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g, durante 3 min a 4 ° C e remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Observe que, para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.
- Lave os grânulos quatro vezes com 1 mL de tampão de RIPA. Sempre, misturar os tubos bem pela rotação-los a 4 ° C, durante 15 min. recolher os grânulos por centrifugação de baixa velocidade a 3.000 x g durante 3 minutos a 4 ° C e em seguida, descartar os sobrenadantes.
- Após retirar sobrenadantes da lavagem final, re-suspender as contas em 30 µ l 1 x amortecedor do carregamento do sódio Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel de eletroforese (SDS-PAGE) (tabela 1) e misture bem.
- Incubar os tubos a 100 ° C, em um calor bloqueiam por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Analisar as amostras por 4% - 20% gradiente SDS-PAGE gel e Western blot ou armazená-los em-20 ° C para uso posterior.
- preparar a HEK293.
2. Análise de 6XHis-tag exógena Rb SUMOylation em células humanas
- cultura e transfecção celular.
- Semente ~ 6 × 10 6 HEK293 células em um de 10 cm do prato e incubam por 24 h no meio de crescimento sob condições de cultura celular normal para adquirir 75% - 85% confluentes. Antes de transfeccao, remover o meio de crescimento e adicionar 6 mL de meio de escaldadas soro reduzida (ver Tabela de materiais) e, em seguida, coloque os pratos para a incubadora.
- Ensaio de SUMOylation constitutivo para o Rb, adicione µ g 15 cada do 6XHis-tag Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmídeos Ubc9-C93S 500 médio / µ l soro reduzida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, respectivamente.
- Para analisar a sumô-conjugação de tipo selvagem Rb e seu mutante SUMOylation com defeito, misture 10 µ g de qualquer plasmídeo com tag 6XHis Rb-WT ou Rb-K720R juntamente com GFP-SUMO1 (10 µ g) em 500 µ l reduzida média de soro em microcentrífuga de 1,5 mL tubos de 13.
- Enquanto isso, em um tubo separado, misturar o reagente de Transfeccao de 50 µ l (veja a Tabela de materiais) em 500 µ l reduzida média de soro e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Totalmente combinar os dois tubos separados descritos acima e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Adicionar o transfeccao complexos de reagente/plasmídeo para as células e continuar a cultura para 8 h em 5% de CO 2 e 37 ° C.
- Substituir soro reduzida medium com meio de cultura e incube as células sob condições normais de cultura durante 48 h depois do transfection.
- Níquel afinidade puxa para baixo da proteína Rb com tag 6XHis.
- Lisar as células HEK293 transfectadas e extrair as proteínas totais como descrita seção 1.3.1.
- Centrífuga os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min à 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes e transferi-los para limpos tubos.
Nota: A proteína pode ser congelada neste momento por mais de 6 meses a -80 ° C. - Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção dos sobrenadantes descrito acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.
- Lavagem de 25 µ l de 50% de níquel nitrilotriacético ácidos grânulos de agarose (Ni-NTA) com buffer de RIPA duas vezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada amostra. Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C.
- Imidazol adicionar 1 M para cada amostra para obter uma concentração final de 10 mM. Em seguida, adicione cada amostra para o tubo contendo os grânulos de agarose preparados Ni-NTA.
- Incubar os grânulos e os lysates durante 2 h a 4 ° C, com rotação suave. Girar os grânulos a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e Retire cuidadosamente os sobrenadantes pipetando. Para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.
- Lave os grânulos com 1 mL de tampão de lavagem contendo imidazole 20mm (tabela 1). Cada vez, misturar os tubos bem pela rotação a 4 ° C, durante 15 min. coletar os grânulos girando a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.
- Após a lavagem final, adicionar 30 µ l de eluição do buffer contendo imidazole 250 mM (tabela 1) para cada amostra e agite para misturar. Em seguida, incubar por 20 min a 4 ° C para eluir as proteínas.
- Misturar cada amostra com tampão de carregamento 6 × SDS-PAGE (tabela 1). Em seguida, incubar os tubos a 100 ° C, em um bloco de calor durante 10 min.
- Centrifugar a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferir as amostras para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. As amostras podem ser analisadas por Western blot ou armazenadas a-20 ° C para uso posterior.
3. Western Blot
- carregar a imunoprecipitação ou puxar para baixo as amostras obtidas das etapas anteriores para gradientes geles de SDS-PAGE 4-20%. Realizar a eletroforese em 120 V para 90 min separar as proteínas.
- Transferir as proteínas do gel para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno por eletroblotting a 300 mA para 90 min a 4 ° C, usando o método de transferência do tanque. Bloquear a membrana PVDF no buffer do bloco que contém leite desnatado 5% (tabela 1) por 1h à temperatura ambiente.
- Incubar a membrana com anticorpo primário em tampão de diluição de anticorpo contendo 3% albumina de soro bovino (BSA) (tabela 1) durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma concentração de trabalho de 0,5 µ g/mL (anticorpo anti-SUMO1), ou uma diluição de 1: 2000 (anticorpos anti-Rb e antitubulina) ou 1:5,000 (anti-GFP e anticorpo antisua).
- Lavar a membrana 3 x por 10 min cada tempo usando 1x tris salino com buffer Tween (TBST) (tabela 1). Incube a membrana com espécie específica de anticorpos secundarios conjugados a HRP Peroxidase de rábano 1:5,000 diluído em tampão de bloco contendo leite desnatado 5% (tabela 1). Lavar a membrana 3 x por 10 min cada vez usando 1 buffer x TBST.
- Incubar a membrana com quimioluminescência reforçada (ECL) solução de trabalho. Cobrir a membrana com o envoltório plástico e expô-la a película de raio x, dependendo da força do sinal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para detectar endógena Rb SUMOylation durante a progressão do ciclo celular, este estudo primeiro sincronizado células HEK293 em cinco diferentes fases do ciclo celular (G0, cedo G1, G1, S e G2/M) conforme descrito na seção de protocolo deste documento. A qualidade de sincronização foi confirmada usando a mancha de ácido nucleico com iodeto de propidium seguido por análise de citometria de fluxo (Figura 1). Em seguida, as células foram coletadas e lysed por desnaturação amortecedor de RIPA. O inibidor de proteases do sumô, N-proteÃ, foi adicionado a uma concentração final de 20 mM para preservar o sinal nativo de sumô durante os experimentos. Depois da imunoprecipitação da espécie endógena Rb sob condições de bloquear a interação não-covalente inespecíficas e seguir western blot utilizando um anticorpo anti-SUMO1 de desnaturação, especificamente foi detectada a presença do sinal de sumô na fase inicial do G1 (Figura 2). Embora o SUMOylation global foi aprimorado na fase S/G2/M, no ponto a tempo de Rb SUMOylation, ele não tinha alterado (Figura 2, painel de entrada). Este achado sugere que a SUMOylation de Rb não é simplesmente a consequência da atividade de conjugação de sumô global alterada. Assim, estes resultados mostram que a proteína imunoprecipitação e Western borre análise descrita neste trabalho permitem a detecção de SUMOylation da proteína endógena Rb.
Para detectar o SUMOylation forçada da proteína Rb, este estudo gerou um SUMOylated Rb constitutiva construir pela fusão de Ubc9, o único ligase do sumô E2, para seu C-terminal permitindo eficiente e seletiva SUMOylation de Rb(Figura 3). A mutação de perda-de-função de Ubc9, C93S, também está fundida ao C-terminal de Rb para servir como um controle(Figura 3). Para reforçar ainda mais a especificidade do sinal do sumô-Rb, Ubc9 não-fundido sozinho foi construído também. Os quatro os plasmideos com sua tag foram transfectados em células HEK293 por 48 h antes eles eram lysed no buffer RIPA suplementado com 20 mM N-proteÃ. Todas as proteínas então foram submetidas a um pull down do ensaio, conforme descrito na seção de protocolo deste documento. As proteínas Rb eluted foram analisadas por Western blot. O Ubc9 fusão-dirigido que sumoylation de Rb foi detectada usando um anticorpo anti-SUMO1 (Figura 3B, SUMO1 painel), Considerando que a mutação defeituosa Ubc9, C93S, conseguiu produzir este sinal. Observe que o sumô altamente eficiente-modificação causada por pistas de Ubc9-fusão para uma banda de peso molecular maior que poderia até mesmo ser detectado diretamente usando o anticorpo Rb, e corresponde ao sinal de sumô (Figura 3B, painel Rb). Além disso, Ubc9 sozinho não causou qualquer conjugação de sumô, confirmando ainda mais o SUMOylation Rb-específicos (Figura 3B).
Porque SUMO1 é conjugado a 720 de lisina da proteína Rb11, para analisar mais o Rb SUMOylation, este estudo gerou uma mutação de sumô-deficiente substituindo este resíduo de lisina por uma arginina (K720R). Para facilitar a detecção de sumô-conjugação das duas proteínas Rb transitoriamente expressas, uma construção de GFP-SUMO1 foi adicionada para aumentar o sinal intracelular de sumô. Tipo de selvagem com sua tag ou mutante Rb foi co transfectada em células HEK293 juntamente com GFP-SUMO1, seguido por puxar para baixo o ensaio e análise da capacidade de conjugação de Rb-SUMO1. Como observado, o mutante K720R totalmente abolido a sumô-modificação de Rb, reforçar ainda mais a capacidade do método proposto para detectar o Rb SUMOylation (Figura 4).
Figura 1 : Validação do ensaio de sincronização do ciclo celular por citometria de fluxo. Células HEK293 foram cultivadas e sincronizadas com o G0, G1 início, fases G1, S e G2/M do ciclo celular como descrito no presente protocolo. Distribuições de ciclo celular foram determinadas por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação. Os dados representados mostram um exemplo de análise quantitativa do ensaio FACS (n = 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Rb é SUMOylated na fase inicial do G1. Células HEK293 foram sincronizadas em diferentes fases do ciclo celular, conforme descrito no presente protocolo. As células foram coletadas e lysed no buffer RIPA suplementado com 20 mM N-proteÃ. Os controles de entrada eram carregados em um gel de gradiente de SDS-PAGE 4-20%, transferidos e apagados com anti-SUMO1 e antitubulina, conforme indicado. Os lisados celulares restantes foram então sujeitos a imunoprecipitação usando anticorpo anti-Rb a uma diluição de 1: 200. Os eluentes resultantes foram separados por 4% - 20% gel de SDS-PAGE gradiente e immunoblotted usando anticorpo anti-SUMO1 e anticorpo anti-Rb. Este experimento foi repetido duas vezes com o mesmo resultado. Esta figura foi modificada com a permissão de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Deteção da SUMO-modificação da proteína de fusão de Rb-Ubc9. (A) diagrama das Ubc9 fusão-dirigido SUMOylation (UFDS) construções de Rb. (B) constitutiva SUMOylation de Rb causada por UFDS. Células HEK293 transitoriamente transfectadas com sua tag UFDS construções foram lysed no buffer RIPA com 20 mM N-proteÃ. O total de lisado de cada amostra foi incubado com grânulos de agarose Ni-NTA a puxar para baixo as proteínas da fusão com sua tag Rb-Ubc9 ou Ubc9 (usado como controlo negativo), respectivamente. As proteínas purificadas foram separadas por 4% - 20% gel de SDS-PAGE gradiente e immunoblotted com os anticorpos antisua e anti-SUMO1. Sua-Rb: 6XHis marcados Rb-Ubc9 proteínas da fusão; Sua-Ubc9: 6XHis marcados Ubc9 apenas. RB-Ubc9: sem modificações Rb-Ubc9; RB-Ubc9-s: SUMOylated Rb-Ubc9; Hyper-pRb-Ubc9: hiperfosforilada Rb-Ubc9. Os resultados mostrados na figura são representativos de três ensaios independentes. Esta figura foi modificada com a permissão de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . A mutação de sumô-deficiente K720R reduz o SUMOylation de Rb. Células HEK293 foram transitoriamente co transfectadas com as construções de tipo selvagem ou mutante Rb-His juntamente com GFP-SUMO1. As células foram coletadas e lysed no buffer RIPA suplementado com 20 mM N-proteÃ. Uma pequena porção dos lysates diretamente foi analisada por Western blot como o controle de entrada. O resto dos lysates foram incubados com grânulos de agarose Ni-NTA a puxar para baixo as proteínas Rb com sua Tag, conforme descrito no presente protocolo, e eles eram immunoblotted com anti-SUMO1 e anticorpos antisua. Observe que a mutação para-lisina arginina em 720 de Rb totaliado abole a modificação de sumô desta proteína. O experimento foi conduzido uma vez com um resultado semelhante àquela anteriormente relatados11. Esta figura foi modificada com a permissão de13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Componentes | Comentários |
| Tampão de Lise RIPA | 50 mM Tris, pH = 8,0; 150 mM NaCl; 1% NP-40; Deoxycholate do sódio de 1%; 0,1% SDS | Adicione inibidor da protease cocktail e N-proteà imediatamente antes do uso. |
| Tampão de lavagem | pH 50 mM NaH2PO4 = 8.0; 300 mM de NaCl; imidazol 20mm | Usado para puxar para baixo ensaio somente |
| Tampão de eluição | pH 50 mM NaH2PO4 = 8.0; 300 mM de NaCl; imidazol 250 mM | Usado para puxar para baixo ensaio somente |
| 6 x carregando Buffer | 0,5 Tris M, pH = 6,8; 30% de glicerol; SDS 10%; 5% β-Mercaptoetanol; 0,1 bromofenol % azul | Loja a-20 ° C |
| 10x Buffer em execução | 0,25 M Tris, pH 8,6; 1.9 glicina de M; 1% SDS | Para fazer o tampão de corrida 1x: misturar 100 ml 10 x Running Buffer com 900 mL ddH2O |
| 10x Buffer de transferência | 0,25 M Tris, pH 8.3, 1,9 M de glicina | Fazer 1 x Buffer de transferência: misturar 100 mL 10 x Buffer de transferência com 200 ml de metanol e 700 mL ddH2O |
| 10 x TBS Buffer | Em 1 L de DDQ2g o: 24.08 Tris pH 7,4; 80 g de NaCl | Fazer 1 x Buffer TBST: misturar 100 mL 10 x TBS Buffer com 900 mL ddH2O e 1 mL de Tween-20 |
| Bloqueio de Buffer | 1 x TBST com leite seco desnatado 5% | Preparar o tampão imediatamente antes da utilização |
| Tampão de diluição de anticorpo | 1 x TBST com 3% BSA e 0,02% de azida de sódio | Esse Buffer pode ser armazenado a 4 ° C pelo menos 6 meses |
Tabela 1: Soluções e buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este artigo descreve um protocolo para detectar e analisar as SUMOylation endógena de Rb em células humanas. Como esse método é especificamente orientado para a proteína endógena Rb sem qualquer alternância de sinal global de sumô-relacionados, é uma importante ferramenta para a investigação de modificação de Rb-sumô sob circunstâncias fisiológicas completamente naturais.
Para atingir este objectivo, é importante ter em mente que: 1) apesar de sumô compreende quatro isoformas (SUMO1-4, cada um codificado por genes diferentes) em comparação com ubiquitination, todas as espécies de sumô são muito menos abundantes; 2) para a maioria das proteínas alvo de sumô, apenas uma pequena porção de uma determinada proteína é SUMOylated em estado estacionário, que é o resultado da constante competição entre enzimas envolvidas na conjugação de sumô e deconjugation14,21; e 3) alvos de sumô podem sofrer ciclos rápidos de SUMOylation e deSUMOylation. Por exemplo, dados recentes obtidos pelos autores deste trabalho atual demonstram que Rb-SUMO1 existe apenas para uma janela muito curto de tempo, na fase inicial de G1, que é coerente com a concepção de que o SUMOylation é um processo reversível, altamente dinâmico13 . Todos estes factos torná-lo desafiador para detectar diretamente o SUMOylation endógena de uma determinada proteína. Assim, para com êxito detectar isto, é vital para identificar as condições sob as quais ocorre esta modificação. Por exemplo, neste protocolo proposto, a temporização da sincronização do ciclo celular é fundamental para a detecção de Rb SUMOylation. Um procedimento experimental otimizado também é importante para a detecção bem sucedida da espécie de sumô-modificado de baixo nível de uma determinada proteína. Por exemplo, sonication adequada ou passagem-por meio de agulhas podem prevenir a formação de componentes pegajosos e viscosos devido ao DNA genômico, assim sonication adequada pode facilitar a extração de proteínas totais. Além disso, um bom anticorpo monoclonal com alta afinidade à proteína alvo poderia ser útil para melhorar a quantidade e a especificidade da imunoprecipitação. Em resumo, o método proposto é importante para explorar ainda mais sob a qual Rb endógena é SUMOylated, que é a premissa do ensaio funcional baseada em superexpressão seguinte condições fisiológicas.
Para amplificar o sinal do SUMO de uma determinada proteína, é comum para co-overexpress esta proteína, bem como outras proteínas relacionadas com SUMO (geralmente proteína Ubc9 e sumô) nas células. Embora um simples borrão ocidental, usando um anticorpo contra o substrato é a maneira mais fácil de encontrar o mais alto peso molecular, SUMOylated forma desta proteína, não conseguimos detectar o sinal de sumô-Rb com este método. Assim, este papel somente focada em um método para detectar a sumô-modificação da proteína Rb exógena precipitada. Além disso, esse método descrito como artificialmente aumentar ou eliminar a sumô-conjugação de Rb. Como o único ligase E2, Ubc9 foi encontrado diretamente transferir o sumô para alvos específicos,22. Assim, fundindo-se ao terminal C do Rb, Ubc9 significativamente promove a sumô-modificação de Rb. usando esse método, os autores deste trabalho demonstraram com sucesso que SUMOylation de Rb promovido suficientemente sua própria fosforilação, aumentando a sua ligação a CDK213. Além disso, para estudar as consequências funcionais da perda de Rb SUMOylation, os autores gerado um constructo de sumô-deficiente Rb, como relatado anteriormente11. Usando o método proposto neste trabalho atual, foi mostrado que sumô-Rb é necessária para o ciclo celular normal progressão e célula proliferação13.
Além de SUMO1, SUMO2 e SUMO3 também desempenham papéis importantes em proteínas SUMOylation14,17. SUMO2 e SUMO3 são muitas vezes referidos como SUMO2/3 porque eles estão intimamente relacionados e compartilham a identidade de 97%. SUMO1 compartilha uma semelhança de 50% com SUMO2/3. É amplamente aceito que SUMO1 é responsável por funções fisiológicas normais da célula e manutenção, Considerando que o sumô-2/3 é predominantemente envolvidos no nível stress respostas15,17,23, 24. dado que Rb também poderia ser SUMOylated por SUMO2/3, com função desconhecida12, o método proposto neste estudo é ainda adequado para a detecção e análise da modificação de Rb. Além do Rb, os métodos descritos aqui podem ser amplamente aplicados para a detecção e análise funcional do SUMOylation de uma variedade de proteínas do alvo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado por doações da ciência e tecnologia Comissão de Xangai (Grant no. 14411961800) e Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81300805).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Thymidine | Sigma | T9250 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| propidium iodide | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| Triton X-100 | AMRESCO | 694 | |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| N-Ethylmaleimide | Sigma | E3876 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | AMRESCO | M107 | |
| Nonidet P-40 Substitute (NP-40) | AMRESCO | M158 | |
| protease inhibitor | Roche | 5892970001 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Rb antibody | Cell Signaling Technology | #9309 | |
| Protein A/G-Sepharose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 | |
| Lipofectamine-2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads | Qiagen | 30230 | |
| Imidazole | Sigma | I0250 | |
| 4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel | BIO-RAD | 4561096 | |
| Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| Tween-20 | AMRESCO | M147 | |
| Tubulin antibody | Abmart | M30109 | |
| SUMO1 antibody | Thermo Fisher Scientific | 33-2044 | |
| GFP antibody | Abmart | M20004 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| enhanced chemiluminescence (ECL) Kit | Thermo Fisher Scientific | 32106 |
References
- Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
- Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
- Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
- Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
- Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
- Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
- Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
- Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
- Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
- Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
- Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
- Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
- Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
- Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
- Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
- Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
- Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
- Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
- Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
- Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).
