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Biology

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析

doi: 10.3791/56096 Published: November 2, 2017
* These authors contributed equally

Summary

小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) ファミリー蛋白質は様々 な細胞プロセスを調整するターゲット蛋白質のリジン残基に抱合します。本稿では、rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の内因性と外因性の条件下での検出のためのプロトコルについて説明します。

Abstract

タンパク質の翻訳後修飾は、細胞内シグナル伝達の適切な規則のために重要です。これらの変更の間で小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) は様々 な遺伝子の転写、DNA 修復、タンパク質などの細胞プロセスを調整するターゲットたんぱく質のリジン残基に共有結合で結合されているユビキチン様タンパク質相互作用と低下、細胞内輸送、およびシグナル伝達。タンパク質 sumo 化を検出する最も一般的な方法は、体外で生化学的反応は、シンプルで機械的に対処するために適しているを可能にする、細菌の遺伝子組換えの付けられた蛋白質の浄化、表現に基づいてください。質問。しかし、生体内でsumo 化のプロセスの複雑さのためそれは検出細胞、特に内因性条件下で sumo 化阻害を分析してより困難です。この論文の著者らによる最近の研究では、内因性網膜芽細胞腫 (Rb) 蛋白質、細胞周期の進行の負の調節に不可欠である腫瘍のサプレッサーでは、G1 初期の特に SUMOylated を明らかにしました。本稿では、検出とひと細胞の内因性と外因性の条件下で Rb sumo 化の分析のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは多く他相撲ターゲット蛋白質、ヒトの細胞と同様に、Rb、SUMO 化の表現型および機能調査に適しています。

Introduction

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真核細胞の細胞周期の進行の正確な制御は、順序付けられた方法1,2で特定のイベントが起こることにより、タイトな規制のネットワークに基づいています。このネットワークの主要なプレーヤーの 1 つは、最初のクローンとして作られた腫瘍サプレッサー1,3(Rb) 網膜芽細胞腫タンパク質です。Rb タンパク質は、細胞周期の進行、特に S 相転移と腫瘍成長4,5に G0/G1 のための負の調節因子と考えられています。Rb 機能のエラーどちらかに直結する子供たちは、最も一般的な眼内悪性腫瘍、網膜芽細胞腫または癌5の他の多くのタイプの開発に貢献。また、Rb は、細胞の分化、クロマチン再構築、およびミトコンドリアを介したアポトーシス3,6,7を含む多くの携帯電話経路に関与しています。

ポスト翻訳の修正は、RB 関数8,9の調節に重要な役割を果たします。リン酸化はこのような 1 つの変更、それは通常 Rb 不活化につながります。Rb は、静止の G0 細胞低リン酸化レベルでアクティブ。G0/G1 期で細胞、Rb は順番にハイパー-リン酸化 Rb を不活性化し、細胞周期を抑制する能力を排除するサイクリン E/CDK2 とサイクリン D/CDK4/6 などのサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のシリーズで関連の遺伝子式4,10。Rb は、小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲)11,12,13で変更でした。

相撲は、様々 な標的タンパク質に共有されているユビキチン様タンパク質です。それは細胞周期制御を含む多様な細胞プロセスのために重大、転写、タンパク質局在と劣化、トランスポート、および DNA 修復14,15,16,17,18.、相撲活用経路から成っている二量体相撲 E1 活性化酵素 SAE1/UBA2、単一の E2 抱合酵素 Ubc9、複数の E3 リガーゼ、相撲特定プロテアーゼ。一般的に、成熟したフォームを生成する生初期の相撲の蛋白質を処理しなければなりません。成熟した相撲は E1 ヘテロダイマーによって活性化し、E2 酵素 Ubc9 に転送します。最後に、相撲の C 末端のグリシンは、基板ターゲット リジンに共役したし、このプロセスは通常 E3 リガーゼによって促進されます。SUMO タンパク質は、特定のプロテアーゼによって変更された基板から削除できます。本稿の著者による前の調査では、Rb の sumo 化に対して、G1 期は細胞周期進行13に必要なプロセスにおけるハイパー リン酸化につながる CDK2、バインディングを増加することを明らかにしました。我々 はまた、Rb sumo 化の損失が減少した細胞の増殖を引き起こすことを示した。また、最近 Rb sumo 化を保護すること Rb タンパク質プロテアソーム売り上げ高からこうして細胞19Rb 蛋白のレベルを上げることが示された.したがって、sumo 化は、様々 な細胞プロセスの Rb 機能に重要な役割を果たしています。Rb sumo 化の生理学的な関連性と機能的な結果の研究をするひと細胞または忍耐強いティッシュで Rb の相撲状態を分析する手法を開発することが重要です。

Sumo 化リバーシブル、非常にダイナミックなプロセスであります。したがって、通常完全に内因性の条件下で相撲修正された蛋白質を検出することは困難です。内因性 Rb sumo 化を検出する手法を提案します。さらに、それは、その相撲欠損変異11および野生型 Rb の外因性の Rb sumo 化を検出する方法を示します。特に、ジェイコブスは Ubc9 融合監督 sumo 化 (UFD)20によって指定された基質の SUMO 化を増加させる方法を説明します。この方法に基づき、この議定書は Rb の強制 sumo 化とその機能の結果を分析する方法をについて説明します。相撲基板の何百もを以前に記載されているより多くの推定される相撲基板が多くプロテオミクスに基づく試金から識別されている、このプロトコルはひと細胞のこれらの蛋白質の SUMO 化を分析する適用できます。

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Protocol

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1 G1 期における内因性 Rb sumo 化の検出

  1. 細胞培養と細胞周期同期。
    1. ダルベッコを含んでいる成長媒体の維持 HEK293 細胞 ' s 修正イーグル培 (DMEM) 1% ペン連鎖球菌と 10% 牛胎児血清 (FBS) 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターで
    2. は、G0 段階で HEK293 細胞を同期します。
      1. 15 cm で、検定と種子 ~1.5 x 10 7 細胞を用いた HEK293 細胞治療前に、24 h の 25 ml の培地で皿数。媒体および洗浄 70%-80%、吸引の合流点に達した後、セル 2 回 5 ml prewarmed リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).
      2. 25 mL 1% を含む DMEM を追加しペニシリン-ストレプトマイシンと 72 h 洗浄を 3 mL の氷冷 PBS を使用するプレートからの 37 ° C でセルを孵化させなさい。新しい 5 mL チューブにセルを転送します
      3. フローサイトメトリー (ステップ 1.2) によって細胞周期解析細胞のごく一部の対象;、室温で 5 分間 200 × g で遠心分離によって細胞の残りの大半を収集し、分析まで超低温冷凍庫で保存Rb わかった
    3. G1 期を取得する G0 同期プロセスの終わりに、セル、DMEM を削除し、HEK293 細胞が細胞周期を再入力できるように戻って新鮮な培を追加。さまざまな G1 段階で細胞を収集 (早い G1: 30 分まで。G1: 2 h) 細胞周期の解析、さらに相撲アッセイします
    4. 二重チミジン ブロック法を用いた S 相 HEK293 細胞を同期します。
      1. 成長 HEK293 細胞を十分に洗うと 50% の confluency prewarmed PBS のセルです。18 h (最初のブロック) のための 2.5 mM のチミジン成長培を加えます
      2. は、チミジンを含む培地を取り除き、prewarmed PBS で 2 回細胞を洗います。セルを解放する 14 時間、新鮮な成長媒体を追加します
      3. ピペットで培地を除去し、細胞周期と Rb sumo 化の分析を行う前に別 18 h (第 2 ブロック) の 2.5 mM チミジンを添加した培を追加します
    5. G2/M の同期、24 h の 25 mL の培地で 15 cm 皿プレート ~1.5 × 10 7 HEK293 細胞。媒体に追加ノコダゾール 400 ng/mL の最終濃度が得られるまで。最後に、Rb sumo 化と細胞周期の分析を実施する前に 16 時間細胞をインキュベートします
  2. フローサイトメトリーを用いた細胞周期解析
    1. 、PBS に再同期 HEK293 を中断し、4 で 2 時間冷えた 70% エタノールを使用して細胞懸濁液を修正し、° C セルのクラスタ リングを最小限に抑えるの最終的な集中を取得し、冷えた 100% エタノールに細胞懸濁液を滴下し追加することに注意してください軽くボルテックス中 70% エタノール
    2. は、500 × g で 5 分間細胞を遠心し、慎重に上澄みを廃棄し、PBS で 2 回細胞を洗浄します。遠心分離機の手順を繰り返します
    3. 追加 500 μ L の PBS 含む 50 μ G/ml 核酸染色 propidium ヨウ化、セルに 0.1% トリトン X-100 と 1 μ g/mL RNase A とよく混ぜます。37 で 15 分細胞をインキュベート ° C
    4. フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° c のサンプルを格納します
  3. Rb の内因性のタンパク質の免疫沈降
    1. 準備、HEK293 細胞溶解液。
      1. 優しく再冷たい免疫検定法 (RIPA) 換散バッファー (表 1) の 1 mL の新鮮なを含んでいるそれらを停止することによって同期 HEK293 細胞追加 20 mM が isopeptidase 阻害剤 N-エチルマレイミド Lyse相撲プロテアーゼをブロックし、相撲の抱合体を安定させる
      2. 。 さらに
      3. Dounce 均質化、超音波または単に通過を 10 回 2 mL 注射器に付いている 21 G 針による氷の細胞をホモジナイズしてください。その後、5 分間氷の上細胞をインキュベート
        注: 陰イオン洗剤ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) RIPA バッファーでは Rb タンパク質とその他の非共有結合相互作用から派生した非特異的相撲信号を除去できれば、Rb 相撲の後の決定のために重要非 Rb 相撲種
    2. 4 セル lysates 30 分 18,000 × g で遠心分離機 ° C が培養上清を新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します
      。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。タンパク質は、少なくとも 6 ヶ月間-80 ° c 格納できます
    3. 新しいチューブと-80 で店に上述した上澄みのごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C
    4. 上清にモノクローナル抗体の Rb 抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 20 μ L 1 μ g のマウスの非特異的免疫グロブリン G (IgG) の同じ種とアイソタイプを追加。その後、緩やかな回転で 4 ° C で 1 時間インキュベートします
    5. 4時 3 分 3,000 x g でサンプルを遠心分離機 ° c、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、それらを新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します。各サンプルに 5 μ L Rb 一次抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 40 μ L を追加します。その後、緩やかな回転で 4 ° C で一晩インキュベートします
    6. は、4 ° C で 3 分間 3,000 × g で遠心分離によってビーズを収集し、ピペットで上澄みを慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない
    7. 1 mL RIPA バッファーにビードを 4 回洗浄しなさい。各時間、回転 4 ° C 15 分でそれらを収集でよくビーズ 4 ° C で 3 分間 3,000 x g で低速遠心分離によってチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します
    8. 最終的な洗浄から培養上清を除去した後再ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 読み込みバッファー (表 1) x 30 μ L 1 でビーズを中断し、よく混ぜます。
      1. 加温熱で 100 ° c 管ブロック 10 分遠心ビーズをペレットに 1 分間、12,000 × g でサンプル。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、1.5 mL のマイクロ遠心チューブにそれらを転送します
    9. 4-20% 勾配 SDS-PAGE による試料のゲルの分析および西部のしみまたは後で使用のための-20 ° C で保存します

2。タグ付きの 6XHis sumo 化 Rb 外因性ひと細胞の解析

  1. 細胞培養とトランスフェクション
    1. 〜 6 種 × 10 6 HEK293 細胞 10 cm 皿し、75-85% コンフルエントの細胞を取得する正常な細胞培養条件下での培地に 24 時間孵化させなさい。トランスフェクション効率を促進する前に成長培地を削除し、prewarmed の減らされた血清中の 6 mL を追加 (材料の表 を参照) し、インキュベーターに料理を配置
    2. 、Rb の構成の sumo 化アッセイは、それぞれ 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 500 μ L 減少血清培地で 6XHis タグ Rb Ubc9 WT、Rb Ubc9 C93S、Ubc9 WT Ubc9 C93S プラスミドの各 15 μ を追加します。
      1. 野生型 Rb の相撲抱合とその sumo 化欠損株を分析、どちらか 6XHis タグ Rb WT や Rb K720R プラスミドの GFP SUMO1 と共に 10 μ g をミックス (10 μ g) 500 μ L に減少 1.5 mL マイクロ遠心分離機で血清中 13 を管します
    3. 一方、別々 のチューブで 50 μ L のトランスフェクション試薬を混ぜる (材料表 参照) 500 μ L に減少、血清中、5 分間室温でインキュベート
    4. 完全に上記で説明した 2 つの個別のチューブを結合セルに試薬/プラスミド錯体 15 分追加、トランスフェクションの室温でインキュベートし続けて 8 の文化h 5% CO 2 と 37 ° C で
    5. 成長媒体、低血清培地を交換し、トランスフェクション後 48 時間の通常の培養条件下で細胞をインキュベートします
  2. タグ付きの 6XHis の Rb タンパク質の親和性のプルダウンをニッケルします
    1. Transfected HEK293 細胞を溶解し、説明セクション 1.3.1 として総蛋白を抽出します
    2. 4 で 30 分のセル lysates 18,000 × g で遠心分離機 ° c 培養上清を収集し、クリーン チューブにそれらを転送します
      。 注: タンパク質を固定できるこの時点で-80 で 6 ヶ月以上 ° C
    3. 上清を新しいチューブと-80 で店に上記のごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C
    4. 洗浄 25 μ L 50% のニッケル ニトリロ三酸 (Ni 国税庁) アガロース ビーズ各サンプルに対して 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 2 回 RIPA バッファーです。4 での 3 分間 3,000 × g で遠心分離してビーズを収集 ° C
    5. 10 mM の最終的な集中を取得するには、各サンプルに追加 1 M イミダゾール。各サンプルを準備された Ni NTA アガロース ビーズを含むチューブに追加します
    6. では、ビーズと緩やかな回転で 4 ° C で 2 h の lysates を孵化させなさい。4 ° C で 3 分間 3,000 x g でビーズをスピン、ピペッティングにより培養上清を慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない
    7. は、1 mL の 20 mM のイミダゾール (表 1) を含む洗浄バッファーでビーズを洗います。各時間、4 ° C で 3 分間 3,000 x g で回してビーズ 15 分収集のための 4 ° C で回転でよくチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します
    8. 最終的な洗浄後各サンプルに 30 μ L の溶出バッファー含む 250 mM のイミダゾール (表 1) を追加し、ミックスにフリックします。その後、タンパク質を溶出に 4 ° C で 20 分間インキュベートします
    9. は、6 × SDS ページ読み込みバッファー (表 1) と各サンプルをミックスします。次に、100 ° c で 10 分間熱ブロックでチューブをインキュベート
    10. ビーズをペレットに 1 分間、12,000 x
    11. 遠心 g。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、サンプルを 1.5 ml マイクロ遠心チューブに転送します。サンプルをウエスタンブロット分析または後で使用するための-20 ° C で保存することができます

3。西部のしみの

  1. 、免疫沈降をロードまたは 4-20% 勾配の SDS ページのゲルの上に前ステップから得られた試料をプルダウンします。120 V、90 分のタンパク質を分離する電気泳動を実施します
  2. が 300 で電気的ブロッティング法による蛋白質をゲルから (PVDF) ブロッティングに転送 4 ° c タンク転写法による 90 分の mA。室温で 1 時間 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファーで PVDF 膜をブロックします
  3. 加温 3% ウシ血清アルブミン (BSA) (表 1) を含む抗体希釈バッファーで一次抗体と膜が 4 ° C で一晩します。一次抗体は、0.5 μ g/mL (反 SUMO1 抗体) の作業濃度または配分 (反 Rb と抗チューブリン抗体)、または 1:5,000 (抗 GFP と反彼の抗体) の希釈を使用します
  4. 洗う膜 3 x 10 分たびにトゥイーン (TBST) バッファー (表 1) をもつ含有トリス緩衝生理食塩水 x 1 を使ってします。種特定の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体希釈 1:5,000 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファー内で膜を孵化させなさい。膜 3 を洗って 10 分 1 x TBST バッファーを使用するたびに x.
  5. は、強化された化学発光 (ECL) 作業ソリューションと膜を孵化させなさい。プラスチック製のラップと膜をカバーし、信号の強さに応じて x 線フィルム公開します

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Representative Results

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細胞周期の進行中に、sumo 化 Rb 内因性を検出するため本研究最初同期 HEK293 細胞細胞周期 (G0 初期 G1 G1、S、G2/M) の 5 つの段階で本論のプロトコル セクションで説明したよう。Propidium ヨウ化フロー フローサイトメトリー解析 (図 1) に続いて核酸染色を用いた同期の品質が確認されました。次に、セルは、収集、RIPA バッファーの変化によって分離されました。N-エチルマレイミド相撲プロテアーゼ阻害剤は、実験中にネイティブの相撲信号を保持する 20 mM の最終的な集中に追加されました。非共有結合の非特異的相互作用および抗 SUMO1 抗体を用いた次の西部のしみをブロックする条件の変化の下で内因性の Rb 種の免疫沈降後、相撲信号の存在は具体的で検出されました、初期 G1 期 (図 2)。時間 Rb わかったポイントで S/G2/M 段階でグローバルの sumo 化を高めた (図 2、入力パネル) は変わらない。Rb の sumo 化が変更された世界相撲活用活動の結果単にではないことが示唆された.したがって、タンパク質の免疫沈降法とウエスタン ブロット分析本稿で説明しているこれらの結果は、内因性の Rb 蛋白質の sumo 化の検出を実現します。

Rb タンパク質生成この研究の強制 sumo 化を検出するには、構成 SUMOylated Rb は Ubc9 の C ターミナルの効率的かつ選択的の Rb の sumo 化 (図 3A) を可能にする、唯一の相撲 E2 リガーゼを融合することで構築します。C93S、Ubc9 の損失の機能突然変異はまたコントロール (図 3A) として機能する Rb の C 末端に融合されます。相撲 Rb 信号の特異性をさらに強化するには、だけで非融合 Ubc9 が同様に建設されました。彼の付けられたプラスミドのすべての 4 つは、前に彼らを 20 mm N-エチルマレイミド補完 RIPA バッファーに溶解し、48 h を HEK293 細胞に導入させた。すべての蛋白質は、本稿のプロトコル セクションで説明するよう、アッセイ、プルダウンに服従しました。溶出の Rb タンパク質は、西部のしみによって分析されました。Ubc9 フュージョン向け Rb sumo 化は Ubc9 の欠陥のある突然変異、C93S、この信号を生成する失敗に対し反 SUMO1 抗体 (図 3B、SUMO1 パネル) を使用して検出されました。Ubc9 融合つながる可能性も高い分子量バンドによる高効率の SUMO 化が Rb 抗体を用いて、直接検出することに注意してくださいし、相撲信号 (図 3B、Rb パネル) に対応します。また、Ubc9 だけで発生していない任意の相撲共役さらに Rb 固有 sumo 化 (図 3B) を確認します。

SUMO1 の Rb タンパク質の11のリジン 720 に共役は、ので Rb sumo 化をさらに分析する本研究によって生成された相撲欠損突然変異、アルギニン (K720R) このリジン残基に置き換えます。相撲共役 2 一過性発現 Rb 蛋白の検出を容易にするために、GFP SUMO1 コンストラクト相撲内情を強化されました。野生型の彼の付けられたまたは変異 Rb だった cotransfected GFP SUMO1、プルダウン分析、Rb SUMO1 活用能力の分析に続いてと一緒に HEK293 細胞に。観察、K720R 変異体は完全に Rb、Rb sumo 化 (図 4) を検出する手法の能力の更なる強化の SUMO 化を廃止しました。

Figure 1
図 1: フローサイトメトリーを用いた細胞周期同期アッセイの検証します。HEK293 細胞培養, このプロトコルで説明として細胞周期の G1、S、G2/M 段階 G0、早い G1 で同期.蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えにより細胞周期の分布を求めた。表されるデータは、FACS アッセイの定量分析の例を示します (n = 1)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: Rb は、G1 初期 SUMOylated.このプロトコルで説明するよう、HEK293 細胞は細胞周期の異なるフェーズで同期でした。セルは、収集され、20 mm N-エチルマレイミド補完 RIPA バッファーで分離します。入力コントロールが 4%-20 %sds ページの勾配ゲルにロードされて、転送され、示されているように、アンチ SUMO1 と抗チューブリン, 消されました。残りのセル lysates は 1: 200 の希釈でアンチ Rb 抗体を用いた免疫沈降に、服従しました。結果溶離液 4%-20 %sds ページ勾配ゲルとアンチ SUMO1 抗体抗 Rb 抗体を用いたエスディーエスによって引き離されてしまいます。この実験は、同じ結果で 2 回繰り返されました。この図は、アクセス許可13で変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.Rb Ubc9 融合蛋白質の SUMO 化の検出。(A) 図 Rb。 (B) 構成 sumo 化の Rb の UFD による Ubc9 融合監督 sumo 化 (UFD) 構造。UFD の彼の付けられた構造一過性発現 HEK293 細胞を 20 mm N-エチルマレイミド RIPA バッファーに溶解し。各サンプルの lysate の合計は彼の付けられた Rb Ubc9 融合蛋白質または Ubc9 (ネガティブ コントロールとして使用)、時それぞれをプルダウンする Ni NTA アガロース ビーズと孵化します。浄化された蛋白質は 4%-20 %sds ページ勾配ゲルと反彼の抗体と抗 SUMO1 エスディーエスで分かれていた。彼-Rb: 6XHis タグ Rb Ubc9 融合蛋白質;彼-Ubc9: 6XHis タグのみ Ubc9 の。Rb Ubc9: 変更されていない Rb-Ubc9;Rb Ubc9: SUMOylated Rb-Ubc9;ハイパー-[prb]-Ubc9: ハイパー リン酸化 Rb-Ubc9。図に示す結果は、3 つの独立した試験の代表です。この図は、アクセス許可13で変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4.相撲欠損 K720R 変異 Rb sumo 化を軽減します。HEK293 細胞が GFP SUMO1 と共に野生型または変異 Rb 彼の構造と一過性 cotransfected。セルは、収集され、20 mm N-エチルマレイミド補完 RIPA バッファーで分離します。Lysates の小さな部分を西で直接行った入力コントロールとしてのしみ。このプロトコルで記述されている Rb の彼の付けられた蛋白質をプルダウンする Ni NTA アガロース ビーズを添加して、溶解液の残りの部分、彼ら反彼の抗体と抗 SUMO1 エスディーエス。Rb の 720 でリジン ・ アルギニンの変異が tot に注意してください。同盟国は、この蛋白質の SUMO 化を廃止します。実験を行った一度と同様の結果を報告した11。この図は、アクセス許可13で変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

ソリューション コンポーネント コメント
RIPA 溶解バッファー 50 mM トリス、pH = 8.0;150 mM の NaCl;1 %NP-40;1% デオキシ コール酸ナトリウム;0.1% SDS プロテアーゼ阻害剤カクテルと N-エチルマレイミドを使用の直前に追加します。
洗浄バッファー 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0;300 mM の NaCl;20 mM のイミダゾール プルのアッセイのみ使用
溶出バッファー 50 mM NaH2PO4 pH = 8.0;300 mM の NaCl;250 mM のイミダゾール プルのアッセイのみ使用
バッファー x 6 0.5 M トリス、pH = 6.8;30% のグリセロール;10 %SDS;5% β-メルカプトエタノール;0.1 %bromphenol ブルー -20 ° C でストア
バッファーを実行する x 10 0.25 M トリス、pH 8.6;1.9 M のグリシン。1% SDS 実行バッファー x 1: 100 ml 10 x 実行バッファーを混ぜて 900 mL ddH2O
転送バッファー x 10 0.25 M トリス、pH 8.3、1.9 M グリシン 転送バッファー x 1: 100 mL 10 倍の 200 ml のメタノールを転送バッファーと 700 mL ddH2O をミックス
10 x TBS バッファー 1 L の ddH2o: 24.08 g トリス pH 7.4;塩化ナトリウム 80 g X TBST バッファー 1: 900 mL ddH2O とトゥイーン 20 の 1 mL と 100 mL の 10 x TBS バッファーをミックス
バッファーをブロック 1 5% 脱脂乾燥したミルクと x TBST 使用直前にバッファーを準備します。
抗体希釈バッファー 1 3 %bsa と 0.02% アジ化ナトリウムと x TBST このバッファーは、少なくとも 6 ヶ月間 4 ° C で保存できます。

表 1: 解決およびバッファー。

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Discussion

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本稿では、検出し、人間の細胞の Rb 内因性 sumo 化を分析するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、グローバル相撲関連信号の任意の交替なしの内因性の Rb タンパク質に重点を完全に自然な生理学的な状況下で Rb SUMO 化を調査するための重要なツールです。

この目的を達成するため、留意することが重要です、: 1) 相撲ユビキチン化と比較して 4 つのアイソ フォーム (SUMO1-4、別の遺伝子によって符号化されるそれぞれ) で構成され、すべての種は、相撲が大いにより少なく豊富な;2) ほとんどの相撲ターゲット蛋白質の特定の蛋白質の小さい部分だけは SUMOylated 定常相撲抱合に関与する酵素の間一定の競争の結果であり deconjugation14,21;・ 3) 相撲のターゲットは、sumo 化と deSUMOylation の急速なサイクルを受けることができます。たとえば、現在の本の著者によって得られた最新のデータを示す Rb SUMO1 は sumo 化リバーシブル、非常にダイナミックなプロセス13 であることの概念と一貫性のある初期の G1 期での時間の非常に短いウィンドウのみ存在.これらすべての事実は、それを直接検出する特定の蛋白質の内因性 sumo 化に挑戦します。したがって、正常にこれを検出、この変更が発生する正確な条件を識別するために重要です。例えば、この提案で細胞周期の同期のタイミングは、Rb sumo 化を検出するため重要です。最適化された実験も成功した特定の蛋白質の低レベルの相撲変更種検出のため重要です。たとえば、適切な超音波処理または通過針はゲノム DNA のための粘着性と粘性部品の形成を防ぐことができる、従って適切な超音波処理は総蛋白質の抽出を促進できます。また、標的タンパク質に親和性が高いと良いモノクローナル抗体は、数量と免疫沈降法の特異性を向上させるために有用かもしれない。要約すると、提案の手法はされる内因性 Rb は SUMOylated、次の過剰発現に基づく機能アッセイの前提である生理学的な条件のさらなる探究のため重要です。

特定の蛋白質の相撲信号を増幅するには、co 歴その他相撲関連 (通常 Ubc9 および相撲蛋白質) セルの蛋白質と同様、このタンパク質に共通です。基板に対して抗体を用いた単純な西部のしみは分子量の高い、この蛋白質の SUMOylated フォームを見つける簡単な方法が、この方法で相撲 Rb 信号を検出できませんでした。したがって、本稿では、のみ沈殿した外因性 Rb 蛋白質の SUMO 化を検出する方法に焦点を当てた。また、このメソッドは、人工的に強化したり、Rb の相撲共役を削除する方法を説明します。唯一の E2 リガーゼとしては、特定のターゲット22に相撲を直接転送する Ubc9 が見つかりました。したがって、Rb の C 末端に融合した Ubc9 大幅 Rb。 このメソッドを使用しての SUMO 化を促進する、この論文の著者は実証 Rb の sumo 化は十分にその結合を増やすことによって独自のリン酸化を促進CDK213。また、Rb sumo 化の損失の機能的意義を研究する著者は以前に報告した11として相撲欠損 Rb コンストラクトを生成されます。現在本提案方式により, 相撲 Rb は正常な細胞周期の進行と細胞増殖13に必要なことを示した。

SUMO1、に加えては、SUMO2 と SUMO3 タンパク質 sumo 化14,17でも重要な役割を再生しています。SUMO2 と SUMO3 と呼ば SUMO2/3、密接に関連している 97 %id を共有します。SUMO1 は、SUMO2/3 50% の類似性と共有します。相撲-2/3 は主に細胞ストレス応答15,17,23,に関与するのに対し、SUMO1、正常な細胞の生理機能とメンテナンスを担当するを広く受け入れられています。24. 本研究で提案する手法は検出および Rb のこの変更の解析にも適している Rb では、未知の関数12SUMO2/3 SUMOylated 可能性があります、ことを考える。Rb、に加えてここで説明する方法は、検出とさまざまなターゲット蛋白質の sumo 化の機能解析に広く適用できます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

本研究は、科学と技術委員会の上海 (許可番号 14411961800) 国家自然科学基金、中国の (許可番号 81300805) からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM  Thermo Fisher Scientific 31985070
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Thymidine Sigma T9250
Nocodazole Sigma M1404
propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Triton X-100  AMRESCO 694
RNase A  Thermo Fisher Scientific EN0531
N-Ethylmaleimide Sigma E3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) AMRESCO M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40) AMRESCO M158
protease inhibitor Roche 5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Rb antibody Cell Signaling Technology #9309
Protein A/G-Sepharose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
Lipofectamine-2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads Qiagen 30230
Imidazole Sigma I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel BIO-RAD 4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Millipore IPVH00010
Tween-20 AMRESCO M147
Tubulin antibody Abmart M30109
SUMO1 antibody Thermo Fisher Scientific 33-2044
GFP antibody Abmart M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit Thermo Fisher Scientific 32106

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References

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<em>生体内で</em>Rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析
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Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).More

Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).

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