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Biology

Vivo에서 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석

doi: 10.3791/56096 Published: November 2, 2017
* These authors contributed equally

Summary

작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 가족 단백질은 다양 한 세포질 과정을 규제 대상 단백질의 리 진 잔류물을 활용. 이 종이 (Rb) retinoblastoma 단백질 SUMOylation 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 검출을 위한 프로토콜을 설명합니다.

Abstract

포스트 번역 상 수정 단백질의 세포내 신호 변환의 적절 한 규제에 대 한 중요 하다. 이러한 수정 중 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모) 대상 단백질 유전자의 전사, DNA 수리, 단백질 세포질 과정 통제의 다양 한의 리 진 잔류물에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질은 상호 작용 저하, subcellular 전송 및 신호 변환. 표현과 재조합 태그 단백질 박테리아에는 체 외에서 생 화 확 적인 반응을 간단 하 고 기계적 주소 지정을 위해 적당 한 수의 정화를 기반으로 하는 단백질 SUMOylation 감지 하는 가장 일반적인 방법은 질문입니다. 그러나, vivo에서SUMOylation 과정의 복잡성 때문에 그것은 감지 하 고 분석 단백질 세포, 특히 생 조건에서 SUMOylation 더 도전. 이 문서의 저자에 의해 최근 연구 생 retinoblastoma (Rb) 단백질, 세포 주기 진행의 부정적인 규정 하는 중요 한 종양 억제기 초기 g 1 단계에서 특히 SUMOylated는 밝혔다. 이 종이 검출 및 인간 세포에서 내 인 성 및 외 인 조건 하에서 Rb SUMOylation의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 Rb, 뿐만 아니라 많은 다른 스모 타겟 단백질, 인간 세포에서의 스모 수정 phenotypical 및 기능 조사에 적합 합니다.

Introduction

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진 핵 세포에서 세포 주기 진행의 정확한 컨트롤을 특정 이벤트 정렬된 방식으로1,2자리 보장 꽉 규제 네트워크를 기반으로 합니다. 이 네트워크에서 핵심 선수 중 하나입니다 (Rb) retinoblastoma 단백질, 첫 번째 복제 종양 억제기1,3. Rb 단백질은 세포 주기 진행, 특히 S 단계 변화 및 종양 성장4,5G0/G1의 부정적인 레 귤 레이 터 라고 생각. Rb 함수 실패 하거나 직접 리드 어린이, 가장 일반적인 안구 내부 악성 retinoblastoma, 또는 많은 다른 유형의 암5의 개발에 기여 한다. 또한, Rb 세포 분화, chromatin 개장, 및 중재 하는 미토 콘 드리 아는 apoptosis3,,67를 포함 하 여 많은 세포질 통로에서 포함 된다.

포스트 번역 상 수정 RB 함수8,9의 규칙에 있는 중추적인 역할을 한다. 인 산화는 같은 한 수정, 그리고 그것은 일반적으로 Rb 비활성화 리드. 무부하 G0 셀에 Rb 인 산화 낮은 수준으로 활성화 됩니다. G0/G1 단계 진행 세포, Rb는 순차적으로 하이퍼-phosphorylated  종속 단백질 kinases (CDKs) 및 Rb를 비활성화 하 고 세포 주기를 억 누르기 위해 능력 제거   및 E/CDK2 D/CDK4/6, 같은 cyclins, 일련의에 의해 관련 유전자 식4,10. Rb 또한 작은 유비퀴틴 관련 한정자 (스모)11,,1213수정 될 수 있습니다.

스모 다양 한 대상 단백질에 연결 covalently 유비퀴틴-같은 단백질 이다. 그것은 세포 주기 규칙을 포함 하 여 다양 한 세포질 프로세스에 대 한 중요, 전사, 단백질 세포질 지 방화 및 저하, 전송, 및 DNA 복구14,,1516, 17 , 18.에 스모 활용 통로로 구성 되어 dimeric 스모 E1 활성화 효소 SAE1/UBA2 단일 E2 conjugating 효소 Ubc9, 여러 E3 ligases, 스모 관련 프로 테아 제. 일반적으로, 초기 스모 단백질 proteolytically 성숙한 형태를 생성 하기 위해 처리 되어야 합니다. 성숙한 스모 E1 heterodimer에 의해 활성화 하 고 Ubc9 E2 효소로. 마지막으로, 스모의 C-터미널 글리신 covalently, 기판의 대상 리에 활용 된 그리고이 과정은 일반적으로 E3 ligases에 의해 촉진 된다. 스모 단백질 특정 프로 테아 제에 의해 수정 된 기판에서 제거할 수 있습니다. 이 문서의 저자에 의해 이전 연구 Rb SUMOylation CDK2에 그것의 바인딩을 초기 g 1 단계, 세포 주기 진행13에 필요한 과정에서 인 산화 하이퍼로 이어지는 증가 밝혀. 우리는 또한 Rb SUMOylation의 손실 감소 셀 확산 원인 설명 했다. 또한, 그것은 최근에 Rb의 SUMOylation proteasomal 회전율에서 따라서 셀19Rb 단백질의 수준을 증가 Rb 단백질을 보호 시연 했다. 따라서, SUMOylation 다양 한 세포질 프로세스에서 Rb 기능에 중요 한 역할을 재생합니다. 추가 연구를 기능 결과 Rb SUMOylation의 생리 적인 관련성 그건 인간의 세포 또는 환자 조직에서 Rb의 스모 상태를 분석 하는 효과적인 방법을 개발 하는 것이 중요.

SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정 이다입니다. 따라서, 완전히 생 조건에서 스모 수정 단백질을 검출 하기 위하여 일반적으로 어렵습니다. 이 종이 생 Rb SUMOylation 검색 하는 메서드를 제공 합니다. 또한, 그것은 야생-타입 Rb와 그 스모 결핍 돌연변이11외 인 Rb SUMOylation 감지 하는 방법을 보여 줍니다. 특히, 제이콥스 외. 주어진된 기판의 스모 수정 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD)20특히 증가 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에 따라,이 프로토콜은 Rb의 강제 SUMOylation 그리고 그것의 기능적인 결과 분석 하는 방법을 설명 합니다. 스모 기판의 수백 설명한가지고 있고 더 많은 putative 스모 기판 많은 proteomic 기반 분석 실험에서 확인 되었습니다,이 프로토콜 분석 인간 세포에이 단백질의 SUMO 수정에 적용할 수 있습니다.

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Protocol

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1. 탐지의 내 생 Rb SUMOylation 초기 g 1 단계에서

  1. 문화 및 세포 주기 동기화 셀.
    1. 유지 HEK293 세포 성장 매체를 포함 하는 Dulbecco에서 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 1% 펜 Strep 및 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO 2 보충.
    2. G0 단계에서 HEK293 세포를 동기화합니다.
    3. HEK293 세포 15 cm에서 hemocytometer와 씨 ~1.5 x 10 7 셀을 사용 하 여 치료 전에 24 h에 대 한 25 ml 성장 매체와 접시 수
        . 70%-80%, aspirate의 합류에 도달 세척 매체 후 셀 두 번 5 mL와 함께 prewarmed 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS).
      1. 추가 25 mL 1% 포함 된 DMEM 페니실린-스와 72 h. 씻어 3 mL 얼음 처럼 차가운 PBS를 사용 하 여 접시에서 셀에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. 새로운 5 mL 튜브로 셀 전송.
      2. Cytometry (1.2 단계)에 의해 세포 주기 분석에 셀의 작은 부분을 주제; 실 온에서 5 분 동안 200 x g에서 원심 분리 하 여 셀의 나머지 대부분을 수집 하 고 분석까지 울트라-낮은 온도 냉동 고에 저장 하 Rb SUMOylation.
    4. G1 단계를 셀, G0 동기화 프로세스의 끝에는 DMEM를 제거 하 고 다시 신선한 성장 매체, 세포 주기를 재입력 하 HEK293 세포 되므로 추가. 그런 다음, 다른 g 1 단계에서 세포를 수집 (초기 g 1: 30 분; G1: 2 h) 세포 주기 분석 및 추가 스모 시험.
    5. 더블 티 미 딘 블록 메서드를 사용 하 여 S 단계에서 HEK293 세포를 동기화 합니다.
    6. 성장 HEK293 세포 50% 및 세척의 confluency
        prewarmed PBS 가진 셀입니다. 2.5 m m 티 미 딘 18 h (첫 번째 블록)에 대 한 보충 성장 매체를 추가 합니다.
      1. 티 미 딘을 포함 하는 매체를 제거 하 고 셀 prewarmed PBS로 두번 세척. 14 h 셀 출시를 위한 신선한 성장 매체 추가.
      2. 는 피 펫과 매체를 삭제 하 고 2.5 m m 티 미 딘 다른 18 h (2 블록)에 대 한 보충 성장 매체는 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 추가.
    7. G 2은 / M에 대 한 동기화, 25 mL 24 h에 대 한 성장 매체와 15cm 접시 접시 ~1.5 × 10 7 HEK293 세포. 다음 400 ng/mL의 최종 농도 얻을 때까지 매체에 nocodazole을 추가 합니다. 마지막으로, 세포 주기 및 Rb SUMOylation의 분석을 수행 하기 전에 16 h에 대 한 셀을 품 어.
  2. Cytometry에 의해 세포 주기 분석.
    1. 다시 PBS에 동기화 HEK293를 일시 중단 하 고 다음 2 h 4에서 차가운 70% 에탄올을 사용 하 여 셀 서 스 펜 션 수정 ° C. 셀 클러스터링 최소화, 세포 현 탁 액의 최종 농도를 얼음 처럼 차가운 100% 에탄올 dropwise 추가할 유의 부드럽게 vortexing 동안 70% 에탄올.
    2. X 500g에 5 분에 대 한 셀을 원심 다음 신중 하 게 하 게 삭제는 상쾌한 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어. 원심 분리기 단계를 반복 합니다.
    3. 추가 500 µ L PBS 포함 50 µ g/mL 핵 산 얼룩 propidium 요오드 화물, 셀에 0.1% 트라이 톤 X-100 그리고 1 µ g/mL RNase A와 섞어 잘. 15 분 37에 대 한 셀을 품 어 ° c.
    4. Cytometry 분석까지 4 ° C에서 샘플 저장.
  3. 생 Rb 단백질의 Immunoprecipitation.
    1. 준비는 HEK293 세포 lysates입니다.
      1. Lyse 부드럽게 다시 차가운 라디오-immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (표 1)의 1 mL에 갓 포함 하는 그들을 중단 하 여 동기화 HEK293 세포 추가 20 mM N-Ethylmaleimide, 수 있는 isopeptidase 억제제 스모 프로 테아 제를 차단 하 고 안정화 스모 어원이 같은 말.
      2. 더 균질 Dounce 균질, 쥡니다 또는 단순히 통과 10 배 2 mL 주사기에 21 G 바늘을 통해 얼음에 셀. 그런 다음, 5 분 ice에 셀을 품 어
        참고: 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) RIPA 버퍼에는 Rb 스모의 최신 결정에 대 한 중요 한으로 Rb 단백질 및 기타 비 공유 상호작용에서 파생 된 불특정 스모 신호를 제거할 수 있습니다. 비-Rb 스모 종.
    2. 4 시 30 분에 대 한 18000 x g에서 세포 lysates 원심 ° C. 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 튜브는 supernatants 전송.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 단백질-80 ° C에 6 개월 이상 저장할 수 있습니다.
    3. 나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비 하 저장 위의 설명 상쾌한의 작은 부분 새로운 튜브와 스토어-80 ° c.
    4. 위의 supernatants Rb 항 체 단일 클로 널 및 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 20 µ L 1 µ g의 일반적인 마우스 면역 글로불린 G (IgG) 같은 종과 isotype의 추가. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 1 시간에 품 어.
    5. 원심 3 분 3000 x g에서 샘플 4 ° C. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송. 각 샘플에 5 µ L Rb 1 차적인 항 체와 50% 단백질 A/G-sepharose 슬러리의 40 µ L를 추가 합니다. 그런 다음, 부드러운 회전 4 ° C에서 밤새 품 어.
    6. 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 상쾌한을 제거 합니다. 비드 손실을 방지 하기 위해 유의 구슬 드라이 발음 하지 않습니다.
    7. 씻어 4 번 RIPA 버퍼의 1 mL와 구슬. 각각, 혼합 튜브 15 분에 4 ° C에서 수집 하는 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 낮은 속도 원심 분리에 의해 시간과 다음 삭제는 supernatants.
    8. Supernatants 최종 세척에서 제거 후 다시 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 로드 버퍼 (표 1) x 30 µ L 1에에서 비즈를 일시 중단 하 고 잘 혼합.
      1. 품 튜브는 열에 100 ° C에서 10 분 원심 작은 구슬에 1 분 동안 12000 x g에서 샘플에 대 한 차단. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 mL 마이크로 원심 관에 그들을 전송.
    9. 샘플 4%-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤 분석 및 서양 오 점 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장.

2. 인간 세포에 외 인 Rb SUMOylation 6XHis 태그의 분석

  1. 세포 문화 및 transfection.
    1. 씨 ~ 6 × 10 6 HEK293 세포 10 cm에 요리 하 고 75%-85 %confluent 셀을 얻으려고 정상 세포 문화 조건 하에서 성장 매체에 24 h에 대 한 품 어. Transfection, 전에 성장 매체를 제거 하 고 prewarmed 감소 된 혈 청 매체의 6 mL을 추가 (재료의 표 참조) 하 고 다음 요리 다시 인큐베이터.
    2. Rb에 대 한 제정 SUMOylation 분석 결과, 각각 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 500 µ L 감소 된 혈 청 매체에 15 µ g 각 6XHis 태그 Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT 및 Ubc9 C93S 플라스 미드의 추가.
      1. 야생 타입 Rb의 스모 활용 및 그것의 SUMOylation 결함 돌연변이 분석, 10 µ g 어느 6XHis 태그 Rb-WT 또는 Rb K720R 플라스 미드 GFP SUMO1와의 혼합 (10 µ g) 500 µ L 감소 1.5 mL 마이크로 원심 분리기에서 혈 청 매체 13 관.
    3. 한편, 별도 튜브에서 50 µ L transfection 시 약을 혼합 500 µ L 감소, 혈 청 매체 (재료의 표 참조) 및 5 분에 대 한 실 온에서 품 어
    4. 완벽 하 게, 위에서 설명한 두 개의 별도 튜브를 결합 하 여 세포 시 약/플라스 미드 단지 15 분 추가 transfection에 대 한 실 온에서 품 어 고 8에 대 한 문화를 계속 5% CO 2와 37 ° C에서 h
    5. Transfection 후 48 h에 대 한 정상적인 문화 조건 하에서 세포를 품 어 고 성장 매체, 감소 된 혈 청 매체.
  2. 선호도 풀 다운 6XHis 태그 Rb 단백질의 니켈.
    1. Transfected HEK293 세포를 lyse 고 설명된 섹션 1.3.1로 총 단백질 추출.
    2. 원심 분리기는 세포 lysates 18000 x g에서 4 시 30 분에 대 한 ° C. 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 깨끗 한 튜브에 그들을 전송.
      참고: 단백질 얼 수 있다이 시점에서 6 개월 이상-80 ° c.
    3. 나중 서쪽 오 점을 위해 각 샘플의 입력된 컨트롤을 준비, 새로운 관을-80에 게 위에서 설명한 supernatants의 작은 부분 저장 ° c.
    4. 워시 25 µ L 50%의 니켈 각 샘플에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브에 두 번 RIPA 버퍼 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) agarose 구슬. 4 시 3 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 비즈를 수집 ° c.
    5. 10 m m의 최종 농도 얻기 위해 각 샘플에 추가 1 M 이미. 그런 다음 준비 된 Ni NTA agarose 구슬 포함 된 튜브에 각 샘플 추가.
    6. 구슬과 부드러운 회전 4 ° C에서 2 h lysates 품 어. 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 구슬 회전 하 고 조심 스럽게 pipetting으로 supernatants를 제거 합니다. 손실을 방지 하기 위해 구슬, 구슬 드라이 발음 하지 마십시오.
    7. 이미 20 m m (표 1)를 포함 하는 워시 버퍼의 1 mL와 구슬 세척. 각 시간, 혼합 튜브 15 분 수집 4 ° C에서 회전에 의해 잘 구슬 4 ° C에서 3 분 동안 3000 x g에서 회전 및 삭제는 supernatants.
    8. 최종 세척 후 각 샘플을 차입의 30 µ L 버퍼 포함 250 m m 이미 (표 1)를 추가 하 고 혼합 영화. 그런 다음, 단백질을 elute 하 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.
    9. 혼합 각 샘플 6 × SDS 페이지 로딩 버퍼 (표 1). 그런 다음, 10 분에 대 한 열 블록에 100 ° C에서 튜브를 품 어
    10. 원심 분리기에서 12000 x g 작은 구슬 1 분. 신중 하 게 구슬, 방해 하지 않고는 supernatants를 수집 하 고 1.5 ml 마이크로 원심 관에 샘플을 전송. 샘플을 서쪽 오 점 분석 또는 나중에 사용-20 ° C에서 저장 수 있습니다.

3. 서쪽 오 점

  1. 로드는 immunoprecipitation 또는 풀 다운 4-20% 그라데이션 SDS 페이지 젤에 이전 단계에서 얻은 샘플. 단백질 분리를 90 분 동안 120 V에서 전기 이동 법 실시.
  2. 전송 단백질 젤에서 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 300에서 electroblotting에 의해 탱크 전송 방법을 사용 하 여 4 ° C에서 90 분 동안 mA. 5%의 저지방 우유 (표 1) 실 온에서 1 h를 포함 하는 블록 버퍼에 PVDF 막 차단.
  3. 품 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (표 1)를 포함 하는 항 체 희석 버퍼에 1 차 항 체로 막 4 ° c.에서 하룻밤 1 차 항 체에 대 한 작동 농도 0.5 µ g/mL (안티-SUMO1 항 체), 또는 1: 2000 (안티-Rb 및 안티 Tubulin 항 체), 또는 1:5,000 (안티-GFP와 반대로 그의 항 체)의 희석 사용.
  4. 씻고 막 3 x 10 분 트윈 (TBST) 버퍼 (표 1) tris 버퍼 염 분 x 1을 사용 하 여 각 시간에 대 한. 5% 탈지 우유 (표 1)를 포함 하는 블록 버퍼에 종 특정 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용 된 이차 항 체 희석된 1:5,000와 막 품 어. 3 막 씻고 10 분 1 x TBST 버퍼를 사용 하 여 각 시간에 대 한 x.
  5. 는 솔루션 작업 향상 된 화학 (ECL)와 막 품 어. 커버 플라스틱 포장을 가진 막 및 신호 강도 따라 x 선 필름에 노출.

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Representative Results

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세포 주기 진행 하는 동안 내 생 Rb SUMOylation 감지,이 연구 처음 동기화 HEK293 세포 세포 주기 (G0, 초기 G1, G1, S, 및 G2/M)의 5 개의 다른 단계에서이 문서의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로. 동기화의 품질 propidium 요오드 화물 흐름 cytometry 분석 (그림 1) 다음으로 핵 산 얼룩을 사용 하 여 확인 되었다. 다음으로, 셀 수집 되었고 RIPA 버퍼를 변성 시키기 의해 lysed. 스모 프로 테아 제 억제제, N-Ethylmaleimide, 실험 기간 동안 네이티브 스모 신호를 보존 하기 위해 20 mM의 최종 농도에 추가 되었습니다. 비 공유 난다 상호 작용, 그리고 안티-SUMO1 항 체를 사용 하 여 다음 서쪽 오 점 차단 조건을 변성 시키기 아래 생 Rb 종의 immunoprecipitation, 후 스모 신호의 존재 특히 감지에 초기 g 1 단계 (그림 2). 비록 글로벌 SUMOylation S/G2/M 단계에 있는 시간 포인트의 Rb SUMOylation, 강화 되었다 (그림 2, 입력된 패널)는 변경 되지 않습니다 했다. 이 찾는 Rb의 SUMOylation 단순히 변경 된 글로벌 스모 활용 활동의 결과가 아니다는 것을 건의 한다. 따라서, 단백질 immunoprecipitation 및 서양 오 점 분석이이 문서에 설명 된 이러한 결과 보기 생 Rb 단백질의 SUMOylation의 검출에 대 한 수 있습니다.

생성 된이 연구 Rb 단백질의 강제 SUMOylation 감지 하려면 제정 SUMOylated Rb Ubc9, 효율적이 고 선택적 SUMOylation의 Rb(그림 3)에 대 한 수 있도록 그것의 C-터미널 단독 스모 E2 리가 융합 하 여 생성 합니다. Ubc9, C93S의 손실의 기능 돌연변이 컨트롤 (그림 3A)으로 Rb의 C-터미널 또한 융합 된다. 스모-Rb 신호의 특이성 강화, 하 비 융합 Ubc9 혼자는 또한 건설 되었다. 그들은 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed 했다 전에 그의 태그 플라스 미드의 모든 4 48 h HEK293 세포로 페 했다. 모든 단백질이이 종이의 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 다음 풀 분석 결과, 다운 받게 했다. 서쪽 오 점에 의해 eluted Rb 단백질 분석 되었다. Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation Rb Ubc9 결함이 있는 돌연변이, C93S,이 신호를 생성 하는 데 실패 반면 안티-SUMO1 항 체 (그림 3B, SUMO1 패널)를 사용 하 여 발견 되었다. 도 수 높은 분자량 밴드 Ubc9-퓨전 리드도 인해 고효율 스모 수정 Rb 항 체를 사용 하 여 직접 검색할 수 및 스모 신호 (그림 3B, Rb 패널)에 해당. 또한, Ubc9 혼자 일으키지 않았습니다 어떤 스모 활용 Rb-특정 SUMOylation (그림 3B)를 추가 확인.

SUMO1 Rb 단백질11리 720 활용은, 때문에 더 Rb SUMOylation 분석이 연구 생성 스모 불충분 한 돌연변이 아르기닌 (K720R)와이 리 진 잔류물을 대체 하 여. 두 개의 뚜렷이 표현된 Rb 단백질의 SUMO 활용의 탐지를 촉진 하기 위하여 GFP SUMO1 구문 세포내 스모 신호를 향상 시키기 위해 추가 되었습니다. 그의 태그 야생 타입 또는 돌연변이 Rb 공동 transfected GFP-SUMO1, 풀 다운 분석 결과 및 Rb-SUMO1 활용 능력의 분석 이어서 함께 HEK293 세포로 했다. 관찰, K720R 돌연변이 Rb, Rb SUMOylation (그림 4)를 검색 하는 제안된 된 방법의 기능 강화의 스모 수정 완전히 폐지.

Figure 1
그림 1 : Cytometry에 의해 세포 주기 동기화 분석 결과의 유효성 검사. HEK293 세포 배양 되었고이 프로토콜에서 설명으로 세포 주기 G1, S, G2/M 단계 G0, 초기 g 1에서 동기화. 세포 주기 분포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 결정 되었다. 대표 데이터 FACS 분석 결과의 정량 분석의 예를 보여 줍니다 (n = 1). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : Rb 초기 g 1 단계에서 SUMOylated입니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 HEK293 세포 세포 주기의 다른 단계에 동기화 했다. 셀 수집 되었고 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed. 입력된 컨트롤 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤에 적재 했다, 전송, 그리고 안티-SUMO1와 반대로 Tubulin 얼룩이 표시. 나머지 세포 lysates 다음 1: 200의 희석에 안티-Rb 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitation를 받게 했다. 결과 eluents 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤 및 안티-SUMO1 항 체와 안티-Rb 항 체를 사용 하 여 immunoblotted로 구분 했다. 이 실험은 동일한 결과를 두 번 반복 했다. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . Rb Ubc9 융합 단백질의 SUMO 수정. (A)의 Rb. (B) 제정 SUMOylation의 Rb UFD로 인 한의 Ubc9 퓨전 감독 SUMOylation (UFD) 구문 다이어그램. HEK293 세포 뚜렷이 그의 태그 UFD 구문 페 20 m N Ethylmaleimide RIPA 버퍼에서 lysed 했다. 각 샘플의 lysate 총 풀 태그 그의 Rb Ubc9 융합 단백질 또는 Ubc9 (부정적인 제어로 사용), 각각 다운 Ni NTA agarose 구슬 incubated 했다. 순화 된 단백질은 4%-20 %SDS 페이지 그라데이션 젤과 immunoblotted 안티-SUMO1와 반대로 그의 항 체에 의해 분리 되었다. 그의-Rb: 6XHis 태그 Rb Ubc9 융합 단백질; Ubc9: 그의 6XHis만 Ubc9 태그. Rb-Ubc9: 수정 되지 않은 Rb-Ubc9; -Ubc9 s: Rb-Ubc9 SUMOylated Rb; 하이퍼-pRb-Ubc9: 하이퍼 phosphorylated Rb-Ubc9. 그림에 표시 된 결과 3 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 스모-불충분 한 K720R 돌연변이 감소 Rb의 SUMOylation. HEK293 세포 GFP SUMO1 함께 야생 유형 또는 돌연변이 Rb-그의 구문으로 공동 transfected 뚜렷이 했다. 셀 수집 되었고 20 m N Ethylmaleimide 보충 RIPA 버퍼에서 lysed. lysates의 작은 부분 서쪽에 의해 분석 직접 입력 컨트롤로 오 점. 나머지는 lysates의 Ni NTA agarose 구슬 풀 태그 그의 Rb 단백질이이 프로토콜에서 설명 된 대로 다운 incubated 했다 그리고 그들은 안티-SUMO1와 반대로 그의 항 체 immunoblotted. Rb의 720에서 라이 신-아르기닌 돌연변이 더하다 note동맹 말살이 단백질의 SUMO 수정. 실험 실시 했다 한 번으로 그 비슷한 결과 이전 보고11. 이 그림은 권한을13수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

솔루션 구성 요소 코멘트
RIPA 세포의 용 해 버퍼 50 mM Tris, pH = 8.0; 150 mM NaCl; 1 %NP-40; 1% 나트륨 deoxycholate; 0.1% SDS 즉시 사용 하기 전에 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 N-ethylmaleimide를 추가 합니다.
워시 버퍼 50mm NaH24 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM 이미 분석 결과 다운 풀 사용
차입 버퍼 50mm NaH24 pH = 8.0; 300 mM NaCl; 250 m m 이미 분석 결과 다운 풀 사용
버퍼를 로드 x 6 0.5 트리 스 M, pH 6.8; = 30% 글리세롤; 10 %SDS; 5% β-mercaptoethanol; 0.1 %bromphenol 블루 -20 ° C에서 저장소
버퍼를 실행 x 10 0.25 M Tris, pH 8.6; 1.9 M 글리신; 1% SDS 실행 버퍼 x 1을: 900 mL ddH2O 실행 버퍼 x 10 100 ml를 혼합
전송 버퍼 x 10 0.25 M Tris, pH 8.3 1.9 M 글리신 전송 버퍼 x 1을: x 200 ml 메탄올에 대 한 전송 버퍼와 700 mL ddH2O 10 100 mL를 혼합
10 x TBS 버퍼 DdH2소개할 24.08 g 트리 스 pH 7.4; 1 리터에 80 g NaCl TBST 버퍼 x 1을: 900 mL ddH2O와 트윈-20의 1 mL 100 mL 10 x TBS 버퍼를 혼합
버퍼를 차단 1 5% 무 지방 건조 우유와 함께 x TBST 즉시 사용 하기 전에 버퍼를 준비
항 체 희석 버퍼 1 3 %BSA 0.02% 나트륨 아 지 드와 x TBST 이 버퍼는 4 ° C에 적어도 6 달 동안 저장 될 수 있었다

표 1: 솔루션 및 버퍼

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Discussion

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이 종이 감지 하 여 인간의 세포에 Rb 생 SUMOylation 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 특히 글로벌 스모 관련 신호의 어떤 교체 없이 생 Rb 단백질에 초점이, Rb 스모 수정 완전히 자연 생리 상황 조사를 위한 중요 한 도구입니다.

이 목표를 달성 하기 위해, 그것은 마음에 유지 하는 것이 중요 하는: 1) 스모는 ubiquitination에 비해 4 개의 isoforms (SUMO1-4, 각각 서로 다른 유전자에 의해 부호화)으로 구성, 모든 스모 종은 훨씬 풍부한; 2) 대부분의 스모 대상 단백질에 대 한 스모 활용에 관련 된 효소 사이 지속적인 경쟁의 결과 이며14,21; deconjugation는 안정 된 상태에서 SUMOylated는 주어진된 단백질의 단지 작은 부분 그리고 3) 스모 목표 SUMOylation 및 deSUMOylation의 급속 한 주기를 받을 수 있습니다. 예를 들어 현재이 논문의 저자에 의해 얻은 최근 데이터 Rb SUMO1 SUMOylation 가역, 매우 역동적인 과정13는 개념와 일치 초기 g 1 단계에서 시간이 매우 짧은 창에 대해서만 존재 입증 . 이러한 모든 사실을 직접 주어진된 단백질의 생 SUMOylation 감지를 도전 합니다. 따라서, 성공적으로이 감지,이 수정이 발생 하는 정확한 조건을 식별 하기 위해 생명 이다. 예를 들어,이 제안 된 프로토콜에서 세포 주기 동기화의 타이밍은 Rb SUMOylation의 검출에 대 한 중요 합니다. 최적화 된 실험 절차 또한 주어진된 단백질의 낮은 수준의 스모 수정 종의 성공적인 탐지를 위해 중요 하다. 예를 들어 적절 한 쥡니다 또는 바늘 통과 통해 끈 적 하 고 점성 구성 요소 때문에 genomic DNA의 형성을 막을 수, 따라서 적절 한 쥡니다 총 단백질 추출을 촉진할 수 있다. 또한, 대상 단백질에 높은 선호도와 좋은 단일 클론 항 체 수량 및 immunoprecipitation의 특이성을 향상 도움이 될 수 있습니다. 요약, 제안된 된 방법에서는 더는 내 생 Rb 이다 SUMOylated, 다음 overexpression 기반 기능 분석 결과의 전제 생리 조건 탐험을 위한 중요 한입니다.

주어진된 단백질의 스모 신호 증폭, 공동-overexpress 다른 스모 관련 단백질 (일반적으로 Ubc9와 스모 단백질) 셀에 뿐만 아니라이 단백질에 일반적입니다. 기판에 대 한 항 체를 사용 하 여 간단한 서쪽 오 점 높은 분자량,이 단백질의 SUMOylated 형태로 찾을 수 있는 쉬운 방법 이지만, 우리는이 방법으로 스모-Rb 신호를 감지 하지 못했습니다. 따라서,이 종이 침전 된 외 인 Rb 단백질의 SUMO 수정 감지 하는 방법에만 집중. 또한,이 방법은 인위적으로 향상 또는 Rb의 스모 활용을 제거 하는 방법을 설명 합니다. 유일한 E2 리가로 Ubc9 직접 특정 대상22에 스모를 전송 발견 되었습니다. 따라서, Rb의 C 맨끝에 융합 하 여 Ubc9 크게 촉진 Rb.이 방법을 사용 하 여 스모 수정,이 종이의 저자 성공적으로 시연는 Rb SUMOylation 충분히 추진 자체 인 산화 증가 하는 그것의 바인딩 CDK213 또한, Rb SUMOylation의 손실의 기능적 결과 공부, 저자 이전에 보고 된11로 스모 불충분 한 Rb 구문 생성. 현재이 문서에 제안 된 메서드를 사용 하 여 스모-Rb는 정상적인 세포 주기 진행 및 셀 확산13필요한 보였다.

SUMO1, 외 SUMO2 및 SUMO3 또한 중요 한 역할에서에서 재생할 단백질 SUMOylation14,17. SUMO2와 SUMO3는 종종 라고 합니다 SUMO2/3 그들은 밀접 하 게 관련 되어 있기 때문에 97% 정체성을 공유. SUMO1은 SUMO2/3와 50%의 유사성을 공유 한다. 그것은 널리 허용 스모-2/3는 주로 셀 스트레스 응답15,,1723, 에 참여 하는 반면 SUMO1 정상 세포 생리 기능 및 유지 관리에 대 한 책임은 24. Rb 수 SUMO2/3 SUMOylated 알 수 없는 함수12, 그에 주어진이 연구에서 제안 된 방법은 여전히 검색 및 Rb의이 수정이의 분석에 적합. Rb, 뿐만 아니라 여기에 설명 된 방법은 널리 검색 및 다양 한 표적 단백질의 SUMOylation의 기능 분석에 적용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 과학 및 기술 위원회 상하이 (보조금 번호 14411961800)와 국가 자연 과학 재단의 중국 (보조금 번호 81300805)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995065
Opti-MEM  Thermo Fisher Scientific 31985070
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 26140079
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010023
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
Thymidine Sigma T9250
Nocodazole Sigma M1404
propidium iodide Thermo Fisher Scientific P3566
Triton X-100  AMRESCO 694
RNase A  Thermo Fisher Scientific EN0531
N-Ethylmaleimide Sigma E3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) AMRESCO M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40) AMRESCO M158
protease inhibitor Roche 5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-2025
Rb antibody Cell Signaling Technology #9309
Protein A/G-Sepharose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
Lipofectamine-2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads Qiagen 30230
Imidazole Sigma I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel BIO-RAD 4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane Millipore IPVH00010
Tween-20 AMRESCO M147
Tubulin antibody Abmart M30109
SUMO1 antibody Thermo Fisher Scientific 33-2044
GFP antibody Abmart M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories 715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit Thermo Fisher Scientific 32106

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References

  1. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, (8), 518-528 (2013).
  2. Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432, (7015), 298-306 (2004).
  3. Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81, (3), 323-330 (1995).
  4. Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25, (38), 5220-5227 (2006).
  5. Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8, (9), 671-682 (2008).
  6. Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20, (24), 3128-3133 (2001).
  7. Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27, (9), 1003-1015 (2013).
  8. Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31, (40), 4343-4352 (2012).
  9. Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3, (11-12), 619-633 (2012).
  10. Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (20), 10699-10704 (1997).
  11. Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24, (23), 3810-3818 (2005).
  12. Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281, (47), 36221-36227 (2006).
  13. Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15, (13), 1724-1732 (2016).
  14. Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, (12), 947-956 (2007).
  15. Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
  16. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40, (12), 779-793 (2015).
  17. Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428, (2), 133-145 (2010).
  18. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18, (17), 2046-2059 (2004).
  19. Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35, (50), 6429-6438 (2016).
  20. Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4, (3), 245-250 (2007).
  21. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (12), 861-871 (2010).
  22. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108, (3), 345-356 (2002).
  23. Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275, (9), 6252-6258 (2000).
  24. Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15, (12), 5208-5218 (2004).
<em>Vivo에서</em> 검색 및 Rb 단백질 SUMOylation 인간 세포에서의 분석
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Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).More

Meng, F., Li, X., Ren, H., Qian, J. In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells. J. Vis. Exp. (129), e56096, doi:10.3791/56096 (2017).

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