C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Summary

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

Abstract

Vielzellige Röhren, Grundeinheiten der alle inneren Organe bestehen aus polarisierten epithelialen oder endothelialen Zellen mit apikalen Membranen Futter die Lumen und basolateralen Membranen Kontakt mit einander und/oder die extrazelluläre Matrix. Wie diese unverwechselbare Membran Asymmetrie ist eingerichtet und unterhalten während Orgel Morphogenese ist immer noch eine ungelöste Frage der Zellbiologie. Dieses Protokoll beschreibt den Darm C. Elegans als Modell für die Analyse von polarisierten Membran Biogenese während Rohr Morphogenese, mit Betonung der apikalen Membran und Lumen Biogenese. C. Elegans zwanzig-Zellen einschichtig Darmepithels ist in ein einfaches bilateral symmetrisch Rohr, schönem Analyse auf eine einzelne Zelle angeordnet. Polarisierung der Membran tritt begleitend mit polarisierten Zellteilung und Migration während der frühen Embryogenese, aber de Novo polarisiert Membran Biogenese während Larven Wachstums fortgesetzt wird, wenn die Zellen nicht mehr vermehren und bewegen. Diese Einstellung erlaubt es, subzelluläre Veränderungen zu trennen, die gleichzeitig diese verschiedenen polarisierende Prozesse, schwierig vermitteln, bei den meisten Modellen der Polarität zu unterscheiden. Apikalen-basolateralen Membran-, Knoten-, Zellskelett- und Endomembrane Komponenten können beschriftet und während der gesamten Entwicklung von Fusionsproteinen GFP verfolgt oder von in Situ Antikörper Färbung bewertet. Zusammen mit den Organismus genetische Vielseitigkeit bietet C. Elegans Darm somit eine einzigartige in Vivo Modell für die visuelle, Entwicklungs-, und molekulare genetische Analyse der polarisierten Membran und Rohr Biogenese. Die spezifische (alle standard) hier beschriebenen Methoden umfassen wie: beschriften Sie Darm subzelluläre Komponenten durch Antikörper Färbung; Gene, die im polarisierten Membran Biogenese Verlustfunktion-Studien, die in der Regel wesentlich Tubulogenesis Gene angepasst zu analysieren; Polarität Mängel während der verschiedenen Entwicklungsphasen zu beurteilen; Phänotypen durch Epifluoreszenz, differential Interferenz-Kontrast (DIC) und konfokalen Mikroskopie zu interpretieren; optische Mängel zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann jeder der Beteiligten oft hoch konservierte Moleküle zu analysieren in epithelialen Polarität, Membran Biogenese, Rohr- und Lumen Morphogenese angepasst werden.

Introduction

Die Generation zellulärer und subzellulärer Asymmetrien, z. B. die Bildung von polarisierten Membrandomänen ist entscheidend für die Morphogenese und Funktion von Zellen, Geweben und Organen¹. Studien über polarisierte Membran Biogenese in Epithelien bleiben eine technische Herausforderung, da mehrere aufeinander folgende und deckungsgleich extrazellulären und intrazellulären Signale Richtungsänderungen bei der Zuweisung von subzelluläre Komponenten abhängen, die schwer zu trennen, bei den meisten Modellen und stark abhängig von dem Modellsystem. Das Modell präsentiert hier - die einschichtige Caenorhabditis Elegans Darm - ist ein Gewebe von exquisite Einfachheit. Zusammen mit den einzelligen C. Elegans Ausscheidungsorgane canal (siehe begleitende Papier auf polarisierte Membran Biogenese in C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanals)², sondern bietet einige einzigartige Vorteile für die Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen für polarisierte Membran Biogenese erforderlich. Die Erhaltung der molekulare Polarität Hinweise aus Hefe Mann machen dieses einfache Wirbellosen Organ eine ausgezeichnete"in Vivo Gewebe Kammer" Fragen von epithelialen Polarität, die von unmittelbarer Relevanz für das menschliche System sind die immer noch viel zu Hotel gelangen die visuelle Zerlegung dieser Ereignisse an der einzigen Zelle Ebene in Vivo.

Obwohl mehrere erhaltene Polarität Hinweise aus (1) die Extracelluar Matrix, (2) die Plasmamembran und Kreuzungen und (3) intrazellulären vesikuläre Menschenhandel identifiziert³, die zugrunde liegenden Prinzipien ihrer Integration in den Prozess der wurden polarisierten epithelialen Membran und Gewebe Biogenese ist schlecht verstandene⁴. Die klassische einzellige in-Vivo -Modelle (e.g.S. Cerevisiae und C. Elegans Zygote) haben maßgeblich bei der Festlegung der Grundsätze der polarisierten Zellteilung und anterior-posterioren Polarität und identifizierten kritischen membranassoziierten Polarität Determinanten (die kleinen GTPasen/CDC-42, die Partitionierung defekt PARs)^5,6, aber sie hängen von einzigartiger Symmetrie brechen Cues (Knospe Narbe, Sperma-Eintrag) und keine Kreuzung gesichert Apicobasal Membrandomänen und vermutlich die entsprechende intrazelluläre Apicobasal Maschinen sortieren. Unsere aktuelle Kenntnisse über die Organisation des Handels mit polarisierten Epithelien, setzt jedoch in erster Linie auf Säugetier-2D Monokulturen⁷, fehlen die physiologischen extrazellulären und Entwicklungsstörungen Hinweise, die Positionen der Membran ändern können Domains und Richtungen der Menschenhandel Trajektorien (Umstellung von 2D auf 3D in-vitro- Kultur-Systeme allein genügt, um die Membran Polarität in MDCK (Madin Darby canine Kidney) Zellen zu invertieren)⁸. In Vivo Studien von epithelialen Polarität bei Wirbellosen Modellorganismen verliefen zunächst in flachen Epithelien, zum Beispiel in der Epidermis von Drosophila Melanogaster , wo sie die kritischen Beitrag identifiziert der Kreuzung Dynamik für polarisierte Zellwanderung und Zelle Blatt Satz⁹und endocytic Handel für Polarität Wartung¹⁰. 3D in Vitro und in Vivo Analyse der Lumen Morphogenese in röhrenförmigen Epithelien in MDCK-Zellen und im Darm C. Elegans haben bzw. vor kurzem das Erfordernis der intrazellulären Handel zum de identifiziert Novo (apikalen) Domäne und Lumen Biogenese und Positionierung^11,12,13. Die Dicke der röhrenförmigen (im Gegensatz zu flach) Epithelzellen ist ein Vorteil für die 3D Analyse der subzellulären Asymmetrien da es eine überragende visuelle Unterscheidung der apikalen lumenal Membran, Apico-seitliche Abzweigungen, die seitlichen Membran ermöglicht und die Positionen der intrazellulären Organellen. Um diese visuellen Vorteile das C. Elegans Modell fügt in Vivo Einstellung, Entwicklungs-Achse, Transparenz, Einfachheit der Körper Plan, invariante und definierten Zelle Abstammung, analytische (genetische) und zusätzliche Vorteile beschrieben.

C. Elegans selbst ist ein Fadenwurm röhrenförmige Struktur, deren Transparenz und einfache Architektur ihre ebenso röhrenförmigen inneren Organe für die visuelle Analyse von Rohr- und Lumen Morphogenese direkt zugänglich machen. Die zwanzig Zellen der seinen Darm (21 oder 22 Zellen gelegentlich)¹⁴ stammen aus einer einzigen Stammvater Zelle (E) und entwickeln sich aus einem zweischichtigen Epithel durch Interkalation schrittweise in eine bilateral symmetrisch Tube neun INT Ringe (vier Zellen in der ersten Ring; Abbildung 1 schematische)^14,15,16. Den Darm Abstammung und Gewebe Analyse, zunächst bestimmt durch Nomarski Optik über nukleare Identitäten¹⁷und anschließend durch Fluoreszenz-Mikroskopie über beschriftete Membranen, lieferte wichtige Einblicke in die Morphogenese, in insbesondere die Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Anforderungen für seine gerichtete Zellteilungen und Bewegungen (z.B.Interkalation, rechts-links-Asymmetrien, vordere und hintere Röhre Drehung)^14,18 . Frühe endodermische Zelle Spezifikation und Steuerung der Entwicklung dieses Organs klonalen Modell gen regulatorischen Netzwerk sind gut charakterisierten^19,20. Hier konzentriert sich jedoch auf die Analyse der polarisierten Membran und Lumen Biogenese in röhrenförmigen Einzelzellen und die intrazellulären Asymmetrien des Zytoskeletts Strukturen, Endomembranes und Organellen, die diesen Prozess begleiten. Die Analyse wird durch die Einfachheit dieses Rohres erleichtert, wo alle apikale Membranen (auf der Ultrastrukturforschung Ebene zeichnen sich durch Mikrovilli) Gesicht das Lumen und alle basalen Membranen stellen die äußeren Rohroberfläche mit seitlichen Membranen Kontakt mit einander, durch Kreuzungen von der apikalen Membran getrennt (Abbildung 1 Schaltplan; siehe Referenzen (^16,21) für C. Elegans-spezifische Organisation von engen und Adherens Junction Komponenten). Apikale Membran Biogenese ist also deckungsgleich mit Lumen Morphogenese. Darüber hinaus die Größe der Erwachsenen Darmzellen - die größten Zellen dieses kleinen Tieres (mit Ausnahme der Ausscheidungsorgane Zelle) - ungefähr die Größe einer Säugerzelle in Vivo visuelle Verfolgung der subzellulären Elemente, z. B. bei schönem Vesikel Bahnen, das ist in der Regel versucht in Vitro in der Kulturschale.

Für die Zwecke dieser Analyse zellulärer und subzellulärer ist eine entsprechende Kennzeichnung entscheidend. Intestinale Endo oder Plasmamembran Domänen, Kreuzungen, ZellskelettStrukturen, Kerne und andere subzellularen Organellen können visualisiert werden, indem Sie ihre spezifischen molekularen Komponenten beschriften. Viele dieser Komponenten wurden charakterisiert und entdeckt werden (Tabelle 1 zeigt ein paar Beispiele und bezieht sich auf Ressourcen). Beispielsweise wurden verschiedene Moleküle unterscheiden die röhrenförmigen und/oder vesikuläre Fächer des intestinalen Endomembrane Systems, von der ER, Golgi per Post-Golgi-Vesikel, die Plasmamembran identifizierten²². Die spezifische Proteine (sowie Lipide und Zucker) können entweder direkt oder indirekt beschriftet werden über verbindliche Proteine. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die in Situ Antikörper Färbung des festen Proben, einer der beiden standard-Kennzeichnung-Techniken (siehe begleitende Papier auf Ausscheidungsorgane Kanal Tubulogenesis für eine Beschreibung der anderen Technik² - Kennzeichnung in Vivo über fluoreszierende Protein Fusionen - die auf den Darm direkt anwendbar ist; Tabelle 2 enthält Beispiele für Darm-spezifische Promotoren, die verwendet werden können, Ausdruck von solchen Fusionsproteinen in den Darm zu fahren). Doppel- und mehrfache Beschriftung mit beiden Ansätzen oder mit einer Kombination aus beiden plus zusätzliche chemische Färbung, ermöglicht größere eingehende visuelle Auflösung und die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Veränderungen im Co Lokalisierung und Rekrutierung von spezifischen Moleküle oder subzelluläre Komponenten (Abbildung 2). Die Fixierung und Färbung in diesem Protokoll Unterstützung Erhaltung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Kennzeichnung während Immunostaining Verfahren beschriebene Verfahren. Für die Bildgebung, wichtige Punkte der Detektion und Charakterisierung von Phänotypen über mikroskopische Standardverfahren (sezierenden und konfokale Fluoreszenzmikroskopie) sind Tubulogenesis beschrieben ()Abbildung 3, 4). Dies können zu höheren Auflösung imaging Ansätze für Instanz Superresolution Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (hier nicht beschrieben) erweitert werden.

Eine wesentliche Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, Polarität in einzelnen Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Embryogenese bis ins Erwachsenenalter zu analysieren. Zum Beispiel kann apikale Membran Domain und Lumen Biogenese während der Entwicklung auf der Ebene der einzelligen nachverfolgt werden, über Etikettierung mit ERM-1, einer hoch konservierten Membran-Aktin-Linker der Ezrin-Radixin-Moesin Familie^23,24 . ERM-1 visualisiert apikale Membran Biogenese (1) während der embryonalen Rohr Morphogenese, tritt es begleitend mit polarisierten Zellteilung und Migration (Zellen bewegen, apikal Lumen während Interkalation)¹⁵; (2) während der späten embryonale und larvale Rohrverlängerung, die in der Abwesenheit von Zellteilung oder Migration verläuft; (3) in den Erwachsenen Darm, wo polarisierte Membrandomänen (Abbildung 1 bestehen). In der expandierenden Post-mitotische Larven Epithel, de Novo Membran polarisiert Biogenese kann somit von polarisierten Gewebe Morphogenese, die nicht in den meisten in Vivo und in Vitro epithelialen Polarität Modellen möglich ist, getrennt werden einschließlich derjenigen mit einzelligen Auflösung (z. B. die 3D MDCK Zyste Modell⁸). Mit Kennzeichnung für andere Komponenten, diese Einstellung bietet die Möglichkeit (vor allem bei den L1 Larvenstadium wenn Zellen einen höheren Anteil von Zytoplasma/Kern haben), die intrazellulären Veränderungen zu unterscheiden, die speziell für polarisiert Membran Biogenese ( z.B. die Neuausrichtung der Menschenhandel Trajektorien) von denen begleitend für polarisierte Zellteilung und Migration erforderlich.

Die genetische Vielfalt von C. Elegans ist bekannt²⁵und macht es ein leistungsfähiges Modell-System für die molekulare Analyse von biologischen Fragen. Eine Studie über die Morphogenese, kann zum Beispiel mit einem Wildtyp Stamm, eine transgene Sorte beginnen wo die Struktur von Interesse (z.B. eine Membran) mit einem fluoreszierenden Marker oder einen Verlust oder Gewinn-of-Function-Mutanten mit einem Defekt in diesem gekennzeichnet ist Struktur. Eine typische reverse genetische Studie kann eine Mutante, wo das gen des Interesses gelöscht wird, in die Keimbahn (z.B. durch eine gezielte Löschung), geändert durch Mutagenese (in der Regel produzieren Punktmutationen mit Verlust, Minderung oder Gewinn an Funktion generieren des Gens) oder wo seine Abschrift von RNAi reduziert. Die Leichtigkeit der RNAi durch Fütterung in C. Elegans²⁶ eignet sich auch für die Gestaltung der gezielten Bildschirme, die eine größere Gruppe von Genen von Interesse zu untersuchen. Eine genetische Modellorganismus wohl größte Stärke ist die Fähigkeit, in Vivo vorwärts Bildschirme (z.B. Mutagenese, systematische oder genomweiten RNAi-Bildschirme) durchzuführen, die eine unvoreingenommene Untersuchung über die molekulare Ursache für ein Phänotyp der erlauben Interesse. Zum Beispiel eine unvoreingenommene visuelle C. Elegans RNAi Tubulogenesis Bildschirm, beginnend mit einer transgenen Tieres mit ERM-1 benannt apikalen Membranen, entdeckte eine faszinierende reversible Darm Polarität Konvertierung und ektopische Lumen Phänotyp, verwendet hier als Beispiel für diese Art der Analyse. Dieser Bildschirm identifiziert die Erschöpfung der Glykosphingolipide (GSLs; obligat Membranlipide, über ihre GLS-biosynthetischen Enzyme identifiziert) und Bestandteile des Vesikels Mantel Clathrin und die AP-1-Adapter als die spezifischen molekularen Defekte verursachen diese Polarität Konvertierung Phänotyp, Queues dadurch charakterisieren diesen Menschenhandel Moleküle als in Vivo für die apikale Membran Polarität und Lumen Positionierung^12,13. Beim Starten mit einer bestimmten genetischen Mutation/Morphogenese Phänotyp können solche Bildschirme (oder einzelne genetische/RNAi Interaktion Experimente) auch funktionelle Interaktion zwischen zwei oder mehreren Genen von Interesse (siehe begleitende Papier auf die Ausscheidungsorgane untersuchen Kanal für ein Beispiel einer solchen Analyse)². Dieses Protokoll konzentriert sich auf RNAi bietet, neben seiner Fähigkeit, das Gen direkt zu identifizieren, deren Verlust den Phänotyp in vorwärts-Bildschirme, verursacht, spezifische Vorteile für die Analyse der Morphogenese. Da Genprodukte Regie Morphogenese oft in einer Dosis-abhängigen Weise arbeiten, ist RNAi in der Regel erfolgreich bei der Generierung ein Spektrum von Phänotypen. Die Möglichkeit, informative teilweise Verlustfunktion Phänotypen erzeugen hilft auch zur Behebung des Problems, dass die Mehrheit der wichtigen Tubulogenesis Gene entscheidend sind und dass ihre Verluste Sterilität und frühen embryonalen Tödlichkeit verursachen. Dieses Protokoll enthält bedingte RNAi-Strategien, um diese Schwierigkeit zu überwinden und zeigt Wege zu einer Generation von einem breiteren Spektrum von Phänotypen, wie z. B. ein Allel Serie von Mutagenese zu optimieren.

Protocol

1. Kennzeichnung von C. Elegans Darm

Hinweis: finden Sie im begleitende Paper von den Autoren auf die Analyse der Ausscheidungsorgane Canal Tubulogenesis ² für den Bau von Gewebe spezifische fluoreszierenden Marker Plasmide und die Erzeugung gentechnisch veränderter Tiere, einschließlich Diskussionen über transkriptionelle und translationale Fusionsproteine (Letzteres für die subzelluläre Lokalisation der ein Molekül des Interesses erforderlich). Diese Verfahren können angepasst werden, mithilfe von spezifischen Promotoren, um das Molekül des Interesses an den Darm zu fahren. Siehe Tabelle 1 Beispiele für Moleküle bewährt zur Visualisierung von C. Elegans Darm Endo - und Plasmamembranen und deren Kreuzungen, Tabelle 2 Beispiele für Promotoren für Ausdruck in den Darm fahren, und Tabelle 3 Mittel für umfassende Sammlungen von intestinalen Marker und Promotoren.

1. Antikörper Färbung von C. Elegans Darm ^{27 , 28}
   1. Fixierung
      1. nehmen Sie einen sauberen Objektträger und Poly-L-Lysin zu verwenden generieren Sie einen dünnen Film für Würmer zum Aufkleben auf. Platz 30 µL 0.1-0.2 % Poly-L-Lysin auf die Folie und den Ort einer zweiten Folie auf das Drop-Poly-L-Lysin zu machen ein " Sandwich ". Reiben Sie die Folien dann sanft ein paar Mal die gesamten Oberflächen beider nass und lassen sie an der Luft trocknen für 30 min. Label die mattierte Seite weist nach der Folien mit Bleistift.
         Hinweis: 0,2 % Poly-L-Lysin Aliquote von 200 µL wurden durch Auflösen des Pulvers in dH ₂ O; Dies kann bei-20 ° c Verwendung hochmolekularen Poly-L-Lysin gespeichert werden, zum besseren festhalten der Würmer. Die Konzentration von Poly-L-Lysin ist auch kritisch. Zu niedrige Konzentrationen werden nicht zulassen, dass Würmer, bleiben aber zu hohe Konzentration können Fluoreszenz Hintergrundsignal generieren. Eine zu dicke Folie kann in seiner Gesamtheit lockern.
      2. Legen Sie einen flachen Metall Block fest auf dem Boden eines Containers (z. B. Styropor-Container) mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
         Hinweis: Man kann Trockeneis stattdessen verwenden, aber flüssiger Stickstoff stabilisiert einen Metall-Block auf den Behälterboden und kühlt gut.
      3. Sammle Würmer entweder durch Waschen ihre Platten mit M9 ²⁹ bzw. Wählen Sie verschiedene Bühne Würmer (entweder Eiern, L1, L2, L3 oder L4 Larvenstadium Würmer) auf jeder Folie. Wählen Sie in der Regel ~ 100 Larven und Embryonen oder ~ 20 Erwachsene auf jeder Folie. Platz 10 µL abgewaschen Würmer auf der Mitte der Folie oder Pick Eiern/Würmer in 10 µL M9 oder 10 µL 1 X PBS ²⁷ (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung).
         1. Verwendung einer Pipette verteilt große Anzahl von Würmern um Klumpenbildung zu vermeiden.
            Hinweis: Gemischte Populationen von Würmern abgewaschen, durch Verdrängung und unterschiedlichen Dicke der Stufen, kleben nicht gut und sind weniger effektiv Einfrieren-geknackt (siehe unten), daher Kommissionierung Bühne-spezifische Würmer (oder synchronisierte Populationen) gibt bessere Ergebnisse. Larven haften besser als Erwachsene und mehr Tiere pro Folie platziert werden können.
         2. Vor Kommissionierung auf Folien, Würmer zu einem Fadenwurm Wachstum Medium (NGM) Platte ²⁹ ohne OP50 Bakterien übertragen. Überschüssige Bakterien Anhänger, die Würmer kann auch kleben stören. Achten Sie darauf, dass Würmer nicht austrocknen.
      4. Sanft Ort (Drop) 22 mm × 22 mm Deckglas Kreuz-weisen auf die gesammelten Würmern solche, die seine Ränder auf mindestens einer Seite der Folie hängen über. Drücken Sie gerade nach unten vorsichtig aber fest mit einem oder zwei Fingern auf das Deckglas. Vermeiden Sie Scheren, die Gewebe Integrität beschädigen wird.
      5. Sofort und sanft übertragen die Folie auf den Metall-Block in flüssigem Stickstoff und lassen Sie es für ca. 5 min zu frieren. Dann " flick aus " das Deckglas in einem Swift mit den überhängenden Rand bewegen.
         Hinweis: Dieser Schritt muss entschieden ausgeführt und während die Folie eingefroren ist, um zu erreichen " cracking " der Nagelhaut. Achtung: Befolgen Sie bitte die PSA (persönliche Schutzausrüstung) Richtlinien beim Arbeiten mit flüssigem Stickstoff.
      6. Tauchen die Freeze-geknackt Folien in einem Methanol-gefüllt Coplin Glas für 5 min bei-20 ° C. Übertragen Sie dann auf Aceton-gefüllt Coplin Glas für weitere 5 min bei-20 ° c
         Hinweis: Methanol und Aceton sollte bei-20 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch gespeichert werden. Nach der Fixierung, Folien können gespeichert werden, bei-20 ° c Achtung: Methanol und Aceton sind giftig.
      7. Folien aus Glas zu entfernen und lassen Sie sie an der Luft trocknen bei Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch.
   2. Färben
      1. umgeben von festen Würmer mit einer dünnen Schicht Vaseline auf der Folie. Zeichnen Sie einen Kreis in dieser Gegend auf der Unterseite der Folie an die Stelle markieren.
         Hinweis: Es ist wichtig, dass der Gelee-Kreis im gesamten Färbeverfahren verhindert Auslaufen der befleckenden Lösungen erhalten bleibt.
      2. Vorbereitung einer " feuchten Kammer " in einem Plastikeimer mit Deckel indem man nasse Papiertücher hinein. Legen Sie die Folie auf einem Gestell in diesem " feuchten Kammer ", verhindern das Austrocknen der Folien während der Färbung.
         Hinweis: Dias sollte nicht in Kontakt mit Wasser oder mit jedem anderen.
      3. Pipette vorsichtig etwa 50 µL 1 X PBS in den Gelee Kreis, genug um den Bereich abzudecken. Nahe der " feuchte Kammer " mit dem Deckel. 5 min. bei RT inkubieren
         Hinweis: Um zu vermeiden, Würmer bei diesem Schritt zu verlieren, nicht pipette PBS direkt auf die Würmer. Sanft legen Pipettenspitze am Rand des Kreises und Flüssigkeiten in das reibungslos über die Würmer zu zerstreuen.
      4. Die Folie kippen und langsam die PBS mit einer Pipette abzusaugen. Legen Sie die Folie wieder flach auf dem Rack und fügen Sie 50 µL (oder die benötigte Menge an der Stelle Decken) blockiert Lösung sorgfältig. Inkubieren Sie dies in der feuchten Kammer bei RT für 15 min. Während der Wartezeit die primären Antikörper blockieren Lösung verdünnen (siehe Tabelle der Materialien für Beispiele der primären Antikörper und Konzentrationen).
         Hinweis: Frisch bereiten Sie blockierende Lösung mit 1 X PBS (10 mL), 10 % Tween (50 µL) und Milchpulver (0,2 g zu). Die Menge an Waschmittel und Konzentration der Milch kann je nach verwendeten Antikörper und kann empirisch ermittelt werden müssen. Absaugen von Flüssigkeit aus der Folie ist ein weiterer Schritt, leicht Würmer zu verlieren. Fortschritte durch die Untersuchung der Folie im sezierenden Rahmen zu überprüfen, aber achten Sie darauf, dass die Folie nicht austrocknet.
      5. Die Folie kippen und aspirieren entfernt die blockierende Lösung verwenden die gleichen Vorsichtsmaßnahmen wie oben beschrieben. Legen Sie Folie wieder flach auf Rack und langsam 50 µL verdünnter Primärantikörper, verwenden die gleichen Vorsichtsmaßnahmen. Nahe der " feuchte Kammer " und bei 4 ° C inkubieren Sie über Nacht oder für kürzere Zeiträume bei RT
         Hinweis: Inkubationszeit müssen für einen spezifischen Antikörper empirisch bestimmt werden.
      6. Aspirat Primärantikörper Lösung wie für die anderen Lösungen. Dann waschen Sie die Folien mit blockierenden Lösung für 10 min, 3 Mal, hinzufügen und entfernen die Lösung auf die gleiche Weise wie oben beschrieben.
      7. Hinzufügen (Eindringmittel beschriftet) Sekundärantikörper in blockierende Lösung verdünnt hat 1 h bei RT inkubieren. Siehe Tabelle der Materialien für Beispiele für sekundäre Antikörper und Konzentrationen.
      8. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper und waschen, wie oben beschrieben, mit Lösung 2 Mal blockieren und löschen Sie die blockierenden Lösung mit 1 X PBS, 10 min.
      9. Aspirieren entfernt so viel PBS möglichst ohne die Probe zu trocknen und entfernen vorsichtig das Gelee auf die Probe bei schönem.
      10. Fügen Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die Probe und Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf. Versiegeln Sie die Schnittflächen des Deckglases mit Nagellack. Platzieren Sie Folien in einer dunklen Folie Box zu bewahren, Färbung und speichern in 4 ° C.
          Hinweis: Bewahren Sie Folien in der Dunkelheit wegen Lichtempfindlichkeit (Fluoreszenz kann mit der Zeit verblassen) und Luft Exposition zu verhindern, indem man sie versiegelt, aus dem gleichen Grund. Folien können gespeichert werden, für längere Zeit bei 4 ° C oder-20 ° c

2. Interferenz mit der Funktion der wesentlichen Tubulogenesis Gene in C. Elegans Darm. Beispiel: RNAi.

Hinweis: C. Elegans Stämme sind auf OP50 Bakterien ausgesät auf NGM Platten nach Standardprotokollen ²⁹ kultiviert. Für RNAi, C. Elegans ernähren sich von HT115 RNAi Bakterien auf RNAi-Platten mit 25 µg/mL Carbenicillin und 2 mM IPTG (Isopropyl Beta-D-1-Thiogalactopyranoside) für die Induktion von der bakteriellen Projektträger, die generiert ergänzt die doppelte gestrandet RNA (DsRNA) von den eingeführten C. Elegans gen. Antibiotika und IPTG Konzentration variieren je nach RNAi Klon/Bibliothek und gewünschte RNAi Kraft, bzw. bestimmte RNAi Klone von im Handel erhältlichen genomweiten RNAi Fütterung Bibliotheken erhalten (siehe ( ^{26 , 30 , 31}) Hintergrundinformationen über Fütterung RNAi in C. Elegans und Tabelle der Materialien für Materialien/Reagenzien und RNAi-Bibliotheken).

1. Standard RNAi durch die Fütterung von ^{26 , 31}
   1. herausnehmen RNAi-Bibliothek-Platte von-80 ° C und legte es auf Trockeneis. Nehmen Sie das Dichtband und sterilen Pipettenspitze anhaftende Bakterien Klon des Interesses auf Agarplatten LB (Luria Brühe) ²⁹ ergänzt mit 100 µg/mL Ampicillin und 15 µg/mL Tetracyclin übertragen. Streifen Sie Bakterien auf Nährbodenplatte. Dichtplatte der RNAi-Bibliothek mit einer neuen Dichtband. Wachsen die Bakterien über Nacht bei 37 ° c
      Hinweis: Diese Agarplatten können bei 4 ° C für mehrere Wochen gespeichert werden. Neue Bakterien können direkt von ihnen zum Schutz der ursprünglichen Bibliothek für RNAi kultivierten werden.
   2. Nächsten Tag impfen RNAi Bakterien von LB-Agar-Platte in 1 mL LB-Flüssigmedium ²⁹ enthält 50 µg/mL Ampicillin und schütteln für 14 h (8-18) oder über Nacht bei 37 ° c
      Hinweis: Für optimale Ergebnisse verwenden Sie frische Bakterien jedes Mal. Siehe Referenz ( ³⁰) zum Vergleich der verschiedenen Kulturbedingungen (z.B. Zeitpunkt der Kultur).
   3. Nächsten Tag Samen 200 µL pro Klon der kultivierten RNAi Bakterien auf separaten RNAi-Platten. Lassen Sie die Platten trocken und lassen Sie über Nacht bei RT für die Induktion des bakteriellen Promotors.
   4. Transfer 4-6 L4-Stadium Larven auf jede RNAi-Platte. 3-5 Tagen ausgesät RNAi-Platten bei RT oder 22 ° C inkubieren.
      Hinweis: Suchen Sie L4-Larven zunächst auf eine NGM Teller ohne Bakterien, anhaftende OP50 zu entfernen, die RNAi stören oder seriell übertragen Sie sie auf eine neue Platte der NGM ohne OP50 dreimal. Sicherstellen Sie, dass Belastungen nicht kontaminiert sind, als kontaminierende Bakterien - wie OP50 bevorzugte Futter für die Würmer - RNAi auch stören werden. Temperatur nach Bedarf anpassen: z.B. Entwicklung beschleunigt mit höherer Temperatur; Stämme können temperaturempfindlich sein.
   5. Für Studien, überprüfen Phänotypen der F1-Nachkommen ab Tag 2.
      Hinweis: Es ist entscheidend für die Tiere häufig, um zu vermeiden, fehlt das auftreten oder Fortschreiten eines Phänotyps (z.B. Marker Verschiebung) wenn überprüfen Bewertung polarisierte Membran Biogenese während der Entwicklung. Bereicherung der F2 Bevölkerung für starke Phänotypen (z. B. durch Auswählen von übergeordneten Hermaphroditen auf eine neue RNAi-Platte am Tag 2, wählen für die am stärksten stark Mitte Teil ihrer Nachkommen betroffenen) ist nur selten notwendig, da ein Spektrum von mild bis stark Phänotypen ist wünschenswert.
2. Bedingte RNAi
   Hinweis: RNAi Bedingungen können geändert werden, zu reduzieren stark oder milde Wirkung erhöhen oder Bühne speziell stören; Modifikationen sind hilfreich für die umfassende Bewertung der phänotypischen Auswirkungen von der oft tödliche Tubulogenesis Gene.
   1. Larven RNAi - Bewertung der RNAi Effekte in der gleichen Generation (mild, Bühne-spezifische RNAi)
      Hinweis: Sterilität oder embryonale Tödlichkeit zu überwinden oder Genfunktion in einer bestimmten Phase Post Embryogenese stören, RNAi in induziert wird Larven, post Hochkultur. Unbehandelte Eier (2.2.1.1), trächtige Erwachsene (2.2.1.2) oder synchronisiert L1 (oder, falls gewünscht, später zu inszenieren) Larven (2.2.1.3) auf RNAi Platten; Bewerten der RNAi-Effekte in der gleichen Generation, z. B. zwei Tage später und danach in Larven und/oder Erwachsene.
      1. Pick 30-50 trächtige Erwachsene zu einem Tropfen Bleichen Lösung (eine 1: 4-Lösung aus 10 M NaOH und Haushalt Natriumhypochlorit) an den Rand eines RNAi-Platte gelegt. Trocknen lassen und L1s zu schlüpfen und in den bakteriellen Rasen bewegen lassen.
         Hinweis: Bleaching Lösung, in der Regel verwendet für Dekontamination, wird alles andere als Embryonen in ihren Eierschalen zu töten. Daher stellen nicht auf oder in der Nähe der RNAi-Bakterien Bleichbad.
      2. Oder Samen ~ 20 trächtigen Jugendliche auf RNAi-Platte und ließ sie zu Eiern für 2-3 h legen, oder bis auf den Teller gibt es rund 300 Eiern dann auswählen aus der Erwachsenen.
         Hinweis: Diese Methode kann Kontamination der RNAi Bakterien durch OP50 verursachen. Um dieses Risiko zu verringern, zuerst übertragen Sie Erwachsene auf einen Teller NGM ohne Bakterien, OP50 Anhänger um die Würmer zu entfernen. Achten Sie darauf, dass Erwachsene nicht zu lange auf RNAi Platten RNAi Effekt an Embryonen zu verhindern bleiben.
      3. Wählen oder L1 Stadium Würmer RNAi-Platten direkt aufsetzen (siehe Referenz ( ²⁹)-für Synchronisation Protokolle).
         Hinweis: Man kann eine abgekürzte Synchronisierung Protokoll (z. B. für ein mäßig groß angelegte Setup) verwenden, durch Würmer aus dicht besiedelten Platten mit M9 für mehrmals waschen, bis nur Eiern bleiben. Nach 2-3h L1s schlüpfen dann in M9 von diesen Platten gesammelt werden können, durch zusätzliche Waschungen zu entfernen Bakterien (3 X in M9) gereinigt und auf RNAi Teller ausgesät.
   2. Verdünnung der RNAi Bakterien mit leerer Vektor RNAi Bakterien (milde RNAi)
      Hinweis: Herabsetzung DsRNA durch Verdünnung die Menge der RNAi-Bakterien kann ausreichen, um milder Wirkungen induzieren und kann auch embryonale Tödlichkeit verringern ohne die Abschaffung aller embryonalen Effekte. Verdünnung von RNAi Bakterien dient auch für doppelte RNAi-Experimente und titrieren Bedingungen für genetische Interaktion Experimente (z. B. mild für die Beurteilung der Verbesserung und starke Effekte für die Beurteilung der Unterdrückung zu generieren).
      1. Grow up RNAi und emPTY Vektor HT115 RNAi Bakterien in 1 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Ampicillin wie bei Standardbedingungen RNAi.
      2. Verdünnen die RNAi-Bakterien mit leerer Vektor RNAi Bakterien, eine Palette von unterschiedlichen Konzentrationen, zum Beispiel von 5 %, 15 %, 30 %, 50 %, 70 % zu erreichen. Mischen Sie die Bakterien auch durch Pipettieren rauf und runter. Pipette 200 µL gemischt Bakterien auf einem Teller RNAi.
      3. Wählen Sie 4-6 L4-Larven auf jeder RNAi-Platte. Überprüfen Sie den Phänotyp ab Tag 2 zurück.
   3. RNAi empfindliche Stämme (starke RNAi)
      1. verfügbaren RNAi-Sensitive Stämme, z. B. Eri-1 (mg366), gebo-3 (pk1426) oder Eri-1 (mg366) Lin-15 b (n744) (die letzteren überempfindlichen) verwenden, und folgen Sie RNAi Standardverfahren gemäß 2.1 ^{31 , 32 , 33}.
         Hinweis: RNAi empfindliche Stämme (z.B. Rrf-3 und Eri-1) können niedrigere Brut Größen als Wildtyp Tiere und steril bei 25 ° C. Sie haben auch einen niedrigen Hintergrund der eigenen Phänotypen, z.B. geringe Penetranz embryonale Letalität, die bei der Bewertung der spezifischen RNAi-Effekte berücksichtigt werden.

3. In-Vivo Bildgebung des Darms durch Fluoreszenz-Mikroskopie sezieren C. Elegans

1. vor Tiere unter dem Fluoreszenzlicht visualisieren, RNAi Platten unter hellem Licht auf jedes sezierenden Mikroskop zu überprüfen. Beurteilen (und potenziell aufzeichnen) Phänotypen sichtbar unter hellem Licht, die die Analyse, wie Letalität, Sterilität (geringere Anzahl der Nachkommen), beeinträchtigen können Entwicklungsstörungen (z. B. Larven Verhaftung) und andere sichtbaren Phänotypen, die helfen können charakterisieren die Funktion eines Gens beteiligt polarisierte Membran Biogenese und Lumen Morphogenese.
   Hinweis: Nur Partitur Platten, die ausreichende Nachkommen zur Auswertung (mindestens 50), sonst versuchen Sie alternative RNAi-Bedingungen. Für die quantitative Bewertung stellen sicher, dass die Platten nicht kontaminiert sind oder wachsen OP50 (die RNAi beeinträchtigen).
2. Tiere unter fluoreszierendem Licht visualisieren den Deckel abnehmen und die RNAi Platte direkt unter dem sezierenden Fluoreszenzmikroskop.
   Hinweis: Um subtile Darm Phänotypen erkennen einen sezierenden Mikroskop mit einer höheren Leistung Stereo-Fluoreszenz Anlage benötigen eine, die für eine ausreichende Palette von Vergrößerung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Bereichs mit einem 1,5 und 10 x Objektiv und einen Zoombereich von 3,5 bis 45.
3. Finden erste Tiere unter hellem Licht zu konzentrieren. Als nächstes untersuchen Tiere unter fluoreszierendem Licht bei geringer Vergrößerung (z.B. im Rahmen des Ziels 1,5 X) mit dem entsprechenden Filter. Untersuchen Sie Platte systematisch von oben links nach unten rechts, ganze Platte für Phänotypen zu scannen.
4. Tier von Interesse auswählen und ändern, 10 X-Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf den Darm und verwenden Sie Zoom, um Tubulogenesis/Lumen Morphogenese Phänotyp beurteilen. Siehe Abschnitt 5 für die Wertung der Phänotypen. Zuerst nehmen Sie Bilder bei kleiner Vergrößerung. Wechseln Sie dann in starker Vergrößerung.
   Hinweis: Da sich gesunde Tiere schnell bewegen, arbeiten Sie schnell, mit einer Hand am Computer-Maus für die Bildaufnahme während der Fokussierung des Mikroskops mit der anderen Hand. Verlangsamung der Tiere (z. B. durch vorübergehende Platzierung der Platten bis 4 ° C) möglicherweise nicht erforderlich, wenn arbeiten meist mit Tubulogenesis Phänotypen in Embryonen und frühen Larven verhaftet. Die Bilder können von einem Mikroskop montierte CCD-Kamera erfasst und image-Capture-Software.

4. Imaging C. Elegans Darm mit höherer Auflösung durch Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie ^{34 , 35}

1. Montage und Immobilisierung
   1. Verwendung Fingerspitze, eine kleine Menge Fett oder Vaseline in einem Kreis auf einem Objektträger (ca. 6-8 mm im Durchmesser) dünn gestreut.
      Hinweis: Dicke Fett Kreises ist wichtig für die Montage. Für beste Ergebnisse imaging, Bild nur einen oder mehrere Larven in einer Zeit und einen ultradünnen Fett Kreis mit als wenig Flüssigkeit wie möglich verwenden, so dass das Tier direkt zwischen Objektträger und Deckglas steckt (wenn perfekt gemacht, Tier wird immobilisiert werden ohne Betäubung). Montage von Eiern und der älteren Tiere erfordern einen etwas dickeren Kreis zur Zerstörung der Probe zu vermeiden, beim Hinzufügen von Deckglas.
   2. Einen Tropfen in der Regel 3,5 µL 10 mM Natrium-Azid-Lösung in die Mitte des Kreises und wählen Sie Würmer hinein unter dem sezierenden Mikroskop.
      Hinweis: Bereiten Sie eine 1 M Natrium-Azid Stammlösung durch auflösen 65,01 mg NaN3 in 1 ml dH ₂ O; Fügen Sie 200 µL dieser 1M Lösung in 20 mL M9 Puffer. Wählen Sie Würmer schnell in Tropfen Natrium-Azid Lösung, Lösung, um Austrocknen zu vermeiden. Wählen Sie Stufen separat für die optimale Montage, etwa 50 Embryonen pro Folie und etwa 20 Larven abzielt, wenn größere Populationen untersucht. Man kann M9 statt Natrium-Azid Lösung verwenden, wenn Embryonen auswählen. Wenn Natriumazid, Tiere müssen innerhalb von 30 min zu Gewebeschäden dieser giftigen Chemikalie abgebildet werden.
      Achtung: Natriumazid ist giftig.
   3. Legen Sie vorsichtig ein 22 mm × 22 mm Deckglas auf Folie. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Würmer zu vernichten. Wenden Sie leichten Druck an, und überprüfen Sie unter sezieren Mikroskop um sicherzustellen, dass die Würmer auch zwischen Folie und Deckglas fixiert sind. Beschriften Sie das Dia.
      Hinweis: Die korrekte Menge des Drucks ist wichtig zur Vermeidung von Beschädigung der Probe (zuviel Druck) und es nicht gut zu reparieren (zu wenig Druck: Tiere schweben anstatt an der Folie kleben). Schwimmende Tiere schließt im wesentlichen entsprechende Bildgebung.
2. Imaging
   1. Ort Folie unter dem konfokalen Mikroskop. Suche nach Schnecken mit 10 x Ziel und Fokus.
      Hinweis: Verwenden helles Licht zu konzentrieren, wo möglich, vermeiden Immunofluoreszenz.
   2. Änderung, 60 X oder 100 X Objektiv und Fokus auf den Darm.
      Hinweis: Der Darm kann unter hellem Licht durch seine Lumen läuft mitten durch das Tier vom Pharynx bis zum Anus nahe der Spitze der Rute leicht identifiziert werden. Seien Sie vorsichtig bei der Anwendung von Öl für die 60 X oder 100 X Öl Ziel. Verschiedene Arten von Ölen mischen kann mit weiteren bildgebenden beeinträchtigen. Ort kleiner Tropfen Öl auf Folie, wenn Sie eine aufrechte Mikroskop verwenden oder auf das Ziel bei Verwendung einen invertierten Bereich, kümmert sich nicht um andere Ziele oder Teile des Mikroskops verunreinigen.
   3. Etablieren Kohler DIC/Nomarski Beleuchtung für das Ziel verwendet werden, für das Scannen von ³⁶. Tier unter fluoreszierendem Licht mit entsprechenden Kanal überprüfen, Kennzeichnung des Darms und/oder Phänotyp, zu überprüfen, um wählen geeignete Probe für die Bildgebung zu inspizieren. Rasch zu bleichen zu vermeiden.
   4. Schalter, um zukünftigen Bild auf den Darm zu beschränken, durch die Festlegung der Grenzen an der dorsalen und ventralen Seite Scannen Laserscanning.
      Hinweis: Belichtungsreihen Darm auf diese Weise ist kritisch, wenn Fluorophor auch Strukturen außerhalb des Darms Etiketten. Während dieser pilot Scan arbeiten Sie mit schnellen Scan Bedingungen auf avOID Immunofluoreszenz.
   5. Suchlauf um Scanparameter für das Experiment auszuwählen. 6-20 Abschnitte für intestinale Scannen entlang der Z-Achse, z. B. in 0,2 µm Abständen, je nach Anfrage, Stufe der tierischen und/oder technischen Überlegungen festgelegt. Set Frame im Durchschnitt pro Bild je nach Komplexität der Beschriftung und erforderliche Auflösung zur Lärmminderung.
      Hinweis: Einzelheiten variieren Sie je nach Mikroskop und experimentieren. Man müssen die Abschnitte zu vermeiden, wenn durchführen, sequentielle Scannen von drei verschiedenen Fluorophore bleichen zu reduzieren. Passen Sie die Anzahl der Frames, um die Anzahl der Abschnitte (sollte niedriger als die Anzahl der Abschnitte um Bildverzerrungen zu vermeiden, auch in der Zunahme Immunofluoreszenz wiegen). 4-6 Frames sind in der Regel ausreichend.
   6. Zurück zum Scannen mit definitiven (langsam) Laser-scanning-Bedingungen und anpassen: Helligkeit (Verwendung minimaler Gewinn Hintergrund reduzieren); Laserleistung (so hoch wie erforderlich, so niedrig wie möglich - Erhöhungen Immunofluoreszenz; in der Regel Mindesteinstellung ist ausreichend); Lochkamera (Öffnung, wenn nicht erforderlich, um die Auflösung zu erhalten).
      Hinweis: Scannen Bedingungen Probe abhängig und müssen zu Beginn der Scan Sitzung empirisch bestimmt werden. Stellen Sie sicher, dass Helligkeit nicht mehr Sättigung (wird an Bild nachträglich ändern, indem die imaging-Software einschränken). Beim Scannen von Bedingungen, auch Bedenken, dass die gleiche Bedingungen für alle Bildgebung in Experimenten verwendet werden müssen, bei denen Versuchstiere mit Kontrollen verglichen.
   7. Capture Bildserien. Ein einzelnes Projektionsbild Bilder verschmelzen.
      Hinweis: Möglicherweise müssen Sie Projektion von Bildern und/oder Überlagerungen separat je nach Mikroskop sparen.
   8. Bei der Einnahme von Multi-Channel-Bilder verwenden sequentielle scannen, um durchbluten zwischen Kanälen (kritisch für Co Lokalisierungs-Arbeiten) zu vermeiden.
      Hinweis: Bildeinstellungen müssen geändert werden, da erhöhte Immunofluoreszenz verbunden mit mehr Scan-Zeit.
   9. Immer entsprechende DIC/Nomarski Bilder (Abschnitte) für Sehenswürdigkeiten und Gesamtzustand der Morphologie der gescannten Tier erwerben.

5. Quantifizierung der polarisierten Membran Biogenese Defekte in C. Elegans Darm

Hinweis: Beispiel: basolateralen Verschiebung der apikalen ERM-1::GFP und ektopische seitliche Lumen Bildung induziert durch lassen-767 und APS-1 RNAi.

1. 1. Definieren Kategorien zur Bewertung von scoring Phänotypen unter dem sezierenden Mikroskop ( Abb. 5 A, D, E). Beispiel: (i)-Wildtyp (WT), (Ii) basolateralen Verschiebung der ERM-1::GFP (Polarität defekt) und (Iii) ektopische Lumen-Formation (entwickelt im Anschluss an basolateralen Verschiebung).
      Hinweis: Eine visuelle Analyse geringer Vergrößerung eignet sich für erzielte Anzahl von Tieren mit oder ohne einen bestimmten Phänotyp. Hier haben wir ein Beispiel für drei qualitativ unterschiedliche phänotypische Kategorien, die sind in der gleichen Zeit bezeichnend für eine Verschlechterung des Polarität-Phänotyps, der analysiert wird. Jedoch eine Vielzahl von verschiedenen qualitativen und quantitativen Phänotypen kann erzielt werden, z. B. Lumen Morphogenese Mängel, Abwesenheit/Anwesenheit (oder Zahlen) der GFP positive zytoplasmatischen Vakuolen, Lumen Durchmesser und Größe oder Anzahl von Intralumenal Zysten (siehe < starke Klasse = "Xfig" > Abbildung 3 für Beispiele).
   2. Je nach Ausmaß der erwarteten Unterschiede erzielen rund 100 live Würmer auf den Agarplatten unter dem sezierenden Mikroskop in doppelter oder dreifacher Reihe von Experimenten.
      Hinweis: Muss man schießen, jedes Tier, das in Sicht beim Scannen von Platten systematisch, z. B. von links oben kommt nach rechts von der Platte zu senken (Vergewissern Sie Würmer haben Platten gleichmäßig aufgefüllt).
   3. Wiederholen Sie dies für 3 unabhängige Sätze von Experimenten. Balkendiagramm zu generieren und auszuwerten Bedeutung Ergebnisse.
2. Scoring Phänotypen unter confocal Mikroskop ( Abb. 5 B)
   1. definieren Sie Kategorien für das scoring, z. B. Anzahl der ektopische Lumen pro Tier
      Hinweis: eine höhere Vergrößerung visueller Analyse eignet sich für scoring eine quantifizierbare Marker oder Phänotyp pro Tier und ermöglicht die Bewertung der subzellulären Marker, die nicht erkennbar sein können, durch sezieren Mikroskopie. Vorliegende Beispiel des Zählens ektopische Lumen pro Tier in eine Teilmenge der Würmer des gleichen Experiments zuvor bewertet durch sezieren Mikroskopie (5.1.1, Kategorie 3) verfeinert die Auswertung des sich verschärfenden Polarität Phänotyps, die hier untersucht wird. Jedoch eine Vielzahl von anderen Phänotypen oder Parameter erzielt werden können, z. B. Anzahl der Bläschen, Anwesenheit/Abwesenheit oder Anzahl der subzelluläre Komponenten, die lokalisieren, Fluoreszenzintensität Co (letzteres durch ImageJ quantifiziert; siehe begleitende Papier auf die Ausscheidungsorgane Canal) ².
   2. Je nach Größe der erwarteten Unterschiede, quantifizieren phänotypischer Marker (hier, ektopische Lumen) in ca. 20 Tiere in ein doppelter oder dreifacher Reihe von Experimenten unter confocal Mikroskop.
   3. Wiederholung für 3 unabhängige Sätze von Experimenten. Balkendiagramme erzeugen und Bedeutung der Ergebnisse zu bewerten.

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Molekular Analyse und Visualisierung von polarisierten Membran Biogenese und Lumen Morphogenese in C. Elegans Darm, auf die einzelne Zelle und subzellulärer Ebene. Die zwanzig-Zellen einschichtig C. Elegans Darm wird durch gezielte Zellteilung und Migration in der Mitte Embryogenese gebildet. In dieser Zeit, polarisierte Membran, die Domänen etabliert, doch de Novo polarisierte Membran Biogenese setzt sich in den Reifen aber Ausbau Epithel in vier Larvenstadien bis zum Erwachsenenalter, polarisiert ermöglichen die Analyse auf konzentrieren Membran Biogenese (Abbildung 1A).

C. Elegans zelluläre und subzelluläre Komponenten visualisieren, sind zwei Strategien gebräuchlich: Immunfluoreszenz (ausführlich in diesem Protokoll, Abschnitt 1; Abbildung 2 , Abbildung 4 -F) und der Ausdruck von Fluoreszenz Fusionsproteinen (ausführlich in dem zugehörigen Dokument über Ausscheidungsorgane Kanal polarisiert Membran Biogenese²; Abbildung 1 b, Abbildung 2, Abbildung 4, Abbildung 5). Doppel- und mehrfache Beschriftung, Kombination von verschiedenen Labels jede oder beide Methoden lösen Membran Asymmetrien wie apikalen und basolateralen Membrandomänen und das Verhältnis der verschiedenen subzelluläre Komponenten zueinander (Abbildung 2, Abbildung 4-E). Der Membran-Cytoskelett Linker ERM-1::GFP erscheint hier als Indikator für die apikale Membran Biogenese, die mit Lumen Morphogenese in dieser einschichtige Epithel übereinstimmt. Mithilfe dieser Marker ein Array der apikalen Membran/Darmlumen Biogenese Mängel und deren ursächliche Gen-Defekte erkennen Sie an der Verlustfunktion Studien, zum Beispiel durch unvoreingenommene genomweite Bildschirme mit RNAi (RNAi Ansätze angenommen die Generation von solchen Phänotypen sind beschrieben in Abschnitt 2 dieses Protokolls). Abb. 3 und Abb. 4 zeigen Beispiele für niedrige bis mittlere Vergrößerung Bilder der apikalen Membran/Lumen Biogenese Phänotypen, die durch einen sezierenden Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem high-Power-Ziel erworben; und der höheren Vergrößerung Bilder erworben mit einem konfokalen Laser scanning Mikroskop (diese mikroskopische Ansätze sind in den Abschnitten 3 und 4 beschrieben). Als Beispiel zur Quantifizierung der polarisierten Membran Biogenese Mängeln, die Auswirkungen der RNAi mit lassen-767 (Kodierung eine Steroid-Dehydrogenase/3-Ketoacyl-CoA-Reduktase) und Aps-1 (Codierung der Sigma-Untereinheit der Clathrin AP-1 Adapter) auf ERM–1::GFP Lokalisierung und Lumen Positionierung sind in Abbildung 5gezeigt.

Abbildung 1 : Zellulärer und subzellulärer Strukturen und Morphogenese von Wildtyp- C. Elegans Darm. (A) Darm Entwicklung von C. Elegans , zelluläre Zusammensetzung und Endo - und Plasmamembranen schematische. C. Elegans Darm wird aus der E-Blastomere geboren im 8-Zell-Stadium klonal generiert. Nach vier Runden der Zellteilung Zellen 16 (E16 Bühne) bilden eine radial symmetrisch verdoppelt-geschichtete Epithel¹⁵. In diesem Stadium polarisiert das Zytoplasma der einzelnen Zellen mit Kernen zu den zukünftigen apikalen und zytoplasmatischen im Gegenteil in Richtung bewegt (Zukunft basale), Membrandomänen. In einem Interkalation Schritt verschieben nach links und rechts ventrale Zellen (parallel) in der dorsalen Zellschicht, die bilateral symmetrische Rohr 9 INT Ringe zu bilden. Jede Zelle steht und baut das Lumen mit seiner apikalen/lumenal Membran (grüne, strukturell zeichnen sich durch spezielle Membran Microdomains, Mikrovilli) und benachbarten Zellen oder die Körperhöhle mit seiner basolateralen Membranen (blau), mit Ausnahme der Ersteres Kontakte INT-Ring, der von vier Zellen gebildet wird. Apikale Kreuzungen (rot) trennen die apikale und basolateralen Membrandomänen. Nach Interkalation weiterhin de Novo Membran Biogenese zusammen mit dem Wachstum des Darms während späten Embryogenese und die vier Larvenstadien bis ins Erwachsenenalter, wo tritt nur minimales weiteres Wachstum (Phase der polarisierten Membran Wartung ). Die vergrößerte einzelne Zelle kennzeichnet das Endomembrane System mit ER und Golgi über dem Zellkern (N) und Endosomal Vesikel. (B) DIC/Nomarski und konfokale Überlappung Mikrographen des entwickelnden C. Elegans Darms mit der apikalen Membran-Cytoskelett Marker ERM-1::GFP beschriftet. Der Darm bei der Komma wird beschrieben durch eine weiße Linie (ERM-1::GFP drückt sich bereits schwach an der apikalen Membran zu Jahresbeginn Interkalation aber kann nicht geschätzt werden, in diesem Bild). Tiere unten hier und sind mit vorderen (Kopf) links gezeigt, posterior (Tail) rechts, dorsal Up, Ventral. Maßstab: 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Beispiele für Doppel- und Dreibettzimmer Kennzeichnung des sich entwickelnden Wildtyp C. Elegans Darm mit Antikörpern und Fusionsproteinen. (A, B) Embryonen. (A) Komma-Bühne. PAR-6::GFP (grün, Bestandteil der apikalen PAR Polarität Komplex), PAR-3-Antikörper (rot/TRITC (Tetramethyl Rhodamin erfolgt), ein weiterer Bestandteil der apikalen PAR Polarität Komplex) und MH33 (blau/Cy5 (Cyanine5), Anti-IFB-2/Intermediate Filament). PAR-6::GFP und der PAR-3-Antikörper kennzeichnen die apikale Membran von C. Elegans Darm (in Klammern). IFB-2, ein weiterer apikalen Marker in einem späteren Stadium ist lokalisiert in diesem frühen Stadium Panmembraneously. PAR-6::GFP und anti-PAR-3 kennzeichnen auch den Pharynx (links); im Darmlumen wird durch ihre Überlappung mit IFB-2 (türkis) und das Darmrohr wird durch blaue Anti-IFB-2 (rechts) erläutert. (B) 2-fold Bühne. AJM-1::GFP (grün, Kreuzung Komponente), ICB4 Antikörper (rot/Alexa ICB4 erkennt unbekannte membraneous Darm Antigen). AJM-1::GFP Etiketten der apikalen Kreuzungen von C. Elegans Darm, als Peri-lumenal Leiter Muster sichtbar (es Etiketten auch hypodermal Kreuzungen nicht sichtbar seit Bild konzentriert sich auf den Darm; siehe Abschnitt 4, konfokale Bildgebung). ICB4 Flecken alle Membranen des Darms C. Elegans . Pfeile zeigen auf basolateralen Membranen von Anti-ICB4 befleckt. (C, D) L2-Larven. (C) LET-413::GFP (grün), Phalloidin (rot/Texas-, eine Phallotoxin Bindung an F-Actin) und MH33 (blau/Cyanine5, Anti-IFB-2). LET-413/Scribble ist eine Komponente der basalen Polarität komplexe und basolateralen Membranen von C. Elegans Darm (in Klammern) lokalisiert. Phalloidin und der IFB-2 Antikörper Beschriften der apikalen Submembraneous Zytoskelett des Darms C. Elegans (lila). Phalloidin Flecken auch stark Körperwand Muskeln, überwältigend die intestinale Färbung. Sehen Sie höheren Vergrößerung der Box Bereich. (E) L3 Larve. SLCF-1::GFP (grüne; integraler MembRane Komponente/Zucker Transporter), ERM-1::mCherry (rot) und MH27 Antikörper (blau/Cyanine5, Anti-AJM-1). SLCF-1::GFP Etiketten die basolateralen Membran, während ERM-1::mCherry Etiketten die apikale Membran von C. Elegans Darm (in Klammern); AJM-1 kennzeichnet die apikalen Kreuzungen. (F-F''') L2-Larve. (F, F') Einfarbige Bilder. SLCF-1::GFP (grün) kennzeichnet die basolateralen Membran (seitliche Membranen durch dünne weiße Pfeile angedeutet). MH27 (blau/Cyanine5) Etiketten apikalen Kreuzungen (kurze gelbe Pfeile). (F"F''') Überlagern Sie Bilder mit und ohne Aktin. Kartenausschnitte zeigen höheren Vergrößerung der geschachtelte Bereiche. Hinweis klare Unterscheidung der Apicolateral Winkel der Darmzellen durch diese verschiedenen Membran/Kreuzung Marker, die oberflächlich ähnlich in einzelnen Farbbilder (F, F') angezeigt werden. Dicke weiße Pfeile in F'''verweisen auf die apikale/lumenal Aktin Zellskelett von Phalloidin (sonst überwältigt von Muskel Aktin) beschriftet. Alle Bilder sind konfokale Projektionen (Z-Stapel von 0,2 µm), erworben durch sequentielle Scannen um durchbluten zwischen den Kanälen zu vermeiden. Skalieren von Bars (für A-E, F-F'' ' und alle Einsätze): 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Beispiele für C. Elegans Darm polarisierte Membran und Lumen Morphogenese Mängel bei niedrigen bis mäßigen Vergrößerung (sezieren Fluoreszenz Mikrographen). Alle Bilder sind von dem sezierenden fluoreszierende Mikroskop verfügt über eine maßgeschneiderte Hochleistungs-Stereo-Fluoreszenz-Anlage (Table of Materials) erworben. Verschiedene Vergrößerungen werden angezeigt. Alle Phänotypen wurden mit verschiedenen Genen in einem Stamm mit ERM-1::GFP (bei Darm- und Ausscheidungsorgane Kanal apikalen/lumenal Membranen an embryonalen und frühen Larvenstadien, die hier gezeigte lokalisiert) gekennzeichnet durch RNAi erzielt. Die intestinalen Lumen und Polarität Phänotypen sind: (A, B) Wildtyp-Embryo (A) und Larve (B); (C, D) basolateralen Verschiebung der ERM-1::GFP; Darmzellen sind vergrößert und aufgebläht erscheinen in dieser Embryo (C, Pfeile zeigen auf einzelne Darmzellen), sind aber von Wildtyp Größe und Anordnung in dieser Larven (D, Pfeil auf seitlichen Membranen zwischen INT II und III); (E) verbreitert und gewundenen Lumen in drei Embryonen; (F) ERM-1::GFP Erweiterung in seitliche Verzweigung Bereich (Zick-Zack-Lumen) und Darm Zytoplasma, die enthält GFP-Negative Vakuolen (Pfeile); (G) lumenal Zysten dazwischen intralumenal Verwachsungen (Pfeile zeigen auf zwei Zysten). (H) Cytoplasmic und basolateralen ERM-1::GFP Verschiebung mit ektopische Lumen (Pfeile); (ich) ERM-1::GFP Verschiebung, GFP-positiven Puncta (Pfeile) im Zytoplasma. Ausscheidungsorgane Kanäle und Ausscheidungsorgane Kanal Phänotypen werden hier nicht beschrieben (Kanal ist an der linken, Darm auf der rechten Seite in allen Bildern gezeigt). Skalieren Sie Bars: 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Beispiele für C. Elegans Darm polarisiert Membran und Lumen Morphogenese Mängel bei höherer Vergrößerung (konfokale Bilder). (A, C, E, G, I, K) Embryonen. (B, D, F, H, J, L) Larven. Alle Phänotypen wurden mit verschiedenen Genen in einem Stamm mit ERM-1::GFP (grün in allen Bildern) gekennzeichnet durch RNAi erzielt. Bildgebung konzentriert sich auf den Darm. Bilder von Embryonen zeigen auch Ausscheidungsorgane Kanäle (linke Seite des Bildes), einschließlich Kanal Phänotypen (nicht beschrieben). (A, B) Wildtyp-Embryo (A) und Larve (B). (C) basolateralen Verschiebung der apikalen ERM-1::GFP (Komma Bühne; späten Interkalation). (D) Polarität Konvertierung: basolateralen Verschiebung der apikalen ERM-1::GFP und apikalen Anhäufung von basolateralen ICB4, durch doppelte Kennzeichnung enthüllt. F-Aktin (gekennzeichnet durch Phalloidin-TRITC) beschreibt die Tiere durch Färbung längs Muskelbündel (Tier ist dreifach beschriftet). (E) basolateralen Verschiebung der ERM-1::GFP in spät 3-fold Embryo. Der apikale IFB-2-Antikörper (blau/Cyanine5) zeigt intakt Lumen und Peri-lumenal mittleren Fäden. (F) ektopische Lumen gekennzeichnet durch Anti-IFB-2 (blau/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negative Vakuolen im Darm Zytoplasma. (H) ERM-1::GFP positive Vakuolen im Darm Zytoplasma. (I, J) Abwesenheit von Lumen im Embryo und Larven, beziehungsweise. (K) große Darm. (L) Mukoviszidose und gewundenen Darm. (A, D, H, I, J, K, L) sind konfokale Projektionen. (B, C, E, F) konfokale Abschnitte. Helligkeit war in G zytoplasmatischen Vakuolen der GFP-negativ hervorzuheben. Skalieren Sie Bars: 10 µm (das gleiche gilt für alle Embryonen und Larven, beziehungsweise). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Darm Polarität Bekehrung und Umkehr: ein Beispiel für die Quantifizierung von polarisierten Membran und Lumen Biogenese Mängel. (A, B, C) lassen Sie-767und Aps-1RNAi beide verursachen ERM-1::GFP basolateralen Verschiebung (BL) und ektopische Lumen Bildung (EL), aber in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. (A) Quantifizierung durch sezieren Mikroskop: Zählung der Embryonen (Links) und Larven (rechts) mit Polarität Phänotypen 2 Tage nach der Aussaat Würmer auf RNAi-Platten. Hinweis: alle Mock und let-767(RNAi) Tiere haben zu diesem Zeitpunkt geschlüpft (so gibt es keine Embryonen, die jedoch alle Wildtyp Polarität; hatte gebrochene Linie Spalten). APS-1 RNAi induziert Polarität Mängel bereits im Embryo, während sie lassen-767RNAi in Larven hervorruft. Der höhere Anteil der ektopische Lumen (Vs basolateralen Verschiebung) in Aps-1RNAi Embryonen gegen Larven ist durch Verhaftung von Embryonen mit ektopische Lumen. (B) Quantifizierung von konfokalen Mikroskopie: Zählung der ektopische Lumen pro Tier zu Beginn der Entwicklung ektopische Lumen in Larven. lassen Sie-767 RNAi induziert mehr ektopische Lumen in Larven als Aps-1RNAi (Aps-1RNAi Larven sind "fliehenden", die nicht arresTed als Embryonen). (C) konfokale Bilder für Wildtyp Larven und die Larven mit ERM-1::GFP basolateralen Hubraum (BL) und ektopische Lumen (EL); Maßstabsleiste: 5µm. (D, E) Polarität Rückfall in lassen-767RNAi Tiere (Zählung der Tiere mit und ohne Polarität defekt [BL/EL] durch sezieren Mikroskop). 20 let-767(RNAi) Tiere mit milden ektopische Lumen Phänotypen wurden von einer RNAi-Platte auf eine OP50-Platte am 4. Tag übertragen und nach 40 Stunden ausgewertet. (D) mehr als 50 % Larven zu Wildtyp Polarität (ERM-1 an der apikalen Membran) rückgängig gemacht haben. (E) 20 % der Tiere werden über das Larvenstadium L1 (let-767(RNAi) Ergebnisse in L1 Verhaftung) erwachsen. Alle Daten werden angezeigt als Mittelwert +/-SEM, n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Beispiele von Markern für die C. Elegans Larven und Erwachsenen Darm Membransystem1.
Proteinnamen	Subzelluläre Lokalisation	Protein-Struktur/Funktion	Handelsübliche C. Elegans spezifische Antikörper (DSHB2)	Beispiele der Stämme auf den CGC
OPT-2/PEPT-1	apikalen transmembranen protein	Oligopeptid transporter		KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412):: GFP) + pha-1(+)])
AQP-4	apikalen transmembranen protein	Wasserkanal
ERM-1	apikalen brushborder	Membran-Cytoskelett linker	ERM1
ACT-5	apikalen brushborder	zytoplasmatischen Aktin	(3)
IFB-2	apikalen brushborder	Intermediate Filament-Komponente	MH33
EPS-8	apikalen brushborder	Human-Epidermal-Growth-Factor-receptor-Kinase-Substrate-8 ortholog
PAR-6	apikale Membran	apikalen Polarität komplexes Bauteil
SLCF-1	basolateralen transmembranen protein	Monocarboxylate transporter
AQP-1	basolateralen transmembranen protein	Wasserkanal
LASSEN SIE-413	basolateralen Membran	Kritzeln Sie homolog, Adapter und Polarität Determinante	LET413
HMP-1	apikalen Kreuzung (CCC4)	Α-Catenin, Cadherin-Catenin komplexes Bauteil		FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [Hmp-1p::hmp-1:: GLP + unc-119(+)])
HMR-1	apikalen Kreuzung (CCC)	E-Cadherin, Cadherin-Catenin komplexes Bauteil	HMR1
AJM-1	apikalen Kreuzung (DAC-5)	Kreuzung Integrität Molekül, DLG-1/AJM-1complex Komponente	MH27	SU159 (jcEx44 [Ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1	apikalen Kreuzung (DAC)	Scheiben-große homolog, MAGUK Protein, DLG-1/AJM-1complex Komponente	DLG1
RAB-11	Endosomal Vesikel	Menschenhandel-6		RT311 (Unc-119 (ed3) III; pwIs69 [Vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5	Endosomal Vesikel	Menschenhandel		RT327 (Unc-119 (ed3) III; pwIs72 [Pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7	Endosomal Vesikel	Menschenhandel		RT476 (Unc-119 (ed3) III; pwIs170 [Vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10	Endosomal Vesikel	Menschenhandel		RT525 (Unc-119 (ed3) III; pwIs206 [Pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS	Golgi	Α-Mannosidase II		RT1315 (Unc-119 (ed3) III; pwIs503 [Pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Beispiele sind ausgewählt aus Ressourcen in Tabelle3 aufgeführt.
2 Entwicklungsbiologie Studien Hybridom-Bank.
3 Antikörper gegen Wirbeltiere Aktin Kreuzreaktion.
4 CCC: Cadherin-Catenin Komplex; lokalisiert in den apikalen Teil der apikalen Kreuzung; Adherens Junction (AJ) entspricht.
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; lokalisiert in den basalen Teil der apikalen Kreuzung; tight Junction (TJ) entspricht.
6 Sehen Sie für zusätzliche Vesikel-assoziierter Moleküle ausgedrückt in den Darm Ref (22).
Hinweis: nicht alle Moleküle wurden als Fusionsproteine unter eigene Promotoren oder durch Antikörper getestet.

Tabelle 2 : Beispiele für C. Elegans Darm-spezifische Promotoren und die Uhrzeit des Ausdrucks1.
Promotoren	Ausdruck-Bühne
Elt-2	Ausdruck während der 2 E-Zell-Stadium beginnt und bis ins Erwachsenenalter bestehen bleibt
VHA-6	Ausdruck in der späten Embryo beginnt und bis ins Erwachsenenalter bestehen bleibt
Ges-1	Ausdruck im etwa die 4E-Zell-Stadium beginnt und bis ins Erwachsenenalter bestehen bleibt
Ende-1	Ausdruck nach 1E-Zell-Stadium beginnt und in der späteren Embryogenese sinkt
1 Beispiele sind in Tabelle 3 aufgeführten Ressourcen entnommen.

Tabelle 3: Ressourcen zu finden C. Elegans Darm-spezifische Moleküle, Kennzeichnung Reagenzien/Stämme und Antikörpern.

(1) Caenorhabditis Genetik Center (CGC)42 verfügbar Reagenzien und Stämme

(2) Wormbase43 Informationen zum Darm-spezifische Moleküle, Zerrungen und Antikörper

(3) Informa

mationen zum Darm-spezifische Moleküle^20,44 (4) Transgeneome Webseite⁴⁵ für Translationale GFP Fusion Konstrukte 5. C. Elegans Ausdruck Muster⁴⁶ für transkriptionelle GFP Fusion Konstrukte 6. nationale BioResource Projekt (NBRP)::C.elegans⁴⁷ Informationen zur Darm-spezifische Promotoren 7. Entwicklung Studien Hybridoma Bank (DSHB)⁴⁸ C. Elegans -Antikörper (8) sekundäre Antikörper und Farbstoffe finden Sie unter Referenz^27,28

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie standard der Verlustfunktion genetische/RNAi und (Kennzeichnung und mikroskopische) Ansätze um die Vorteile des Darmepithels C. Elegans als Modell für die visuelle und molekulare Zerlegung des in-vivo imaging kombinieren polarisierte Membran und Lumen Biogenese.

Kennzeichnung

Dieses Protokoll konzentriert sich auf Antikörper Färbung. In Situ durch Antikörper labeling ist eine hochspezifische alternativer Ansatz zur Kennzeichnung durch fluoreszierende Fusion Proteine (beschrieben in dem begleitenden Papier auf Ausscheidungsorgane Kanal Membran Biogenese)². Obwohl Antikörper Färbung live Bildgebung nicht zulässt, kann Bestätigung für die Lokalisierung eines Proteins des Interesses (keine Kennzeichnung Methode ist unbedingt) vorgesehen werden. Darüber hinaus können Fragen der Morphogenese und/oder die subzelluläre Lokalisation eines Proteins oft in festen Tiere beurteilt werden. Immunostaining eignet sich für Doppel- und mehrfache Beschriftung und es ist kombinierbar mit Kennzeichnung durch fluoreszierende Fusionsproteine, wenn diese durch die erforderlichen Befestigungen und Permeabilisierung Verfahren beibehalten werden können. Die hier beschriebenen Protokoll erlaubt in der Regel (Abbildung 2). In Situ Kennzeichnung von festen Tiere durch Antikörper oder chemische Flecken kann auch Vorteile für hochauflösendes mikroskopische Techniken wie Sturm (stochastische optische Rekonstruktion Microscopy) vorsehen. Immunfluoreszenz erkennt das endogene Antigen und angepasst werden kann, zum Beispiel um spezifische Protein posttranslationale Modifikationen zu unterscheiden. Es kann schnell Ergebnisse produzieren wenn Antikörper, einmal vorliegen in Situ befleckenden Techniken - nicht so einfach in C. Elegans Exemplare wie in Zellkultur - etabliert.

Die Generierung eines neuen Antikörpers (hier nicht beschrieben) ist allerdings zeitaufwändig. Leider, die Auswahl der im Handel erhältlichen C. Elegans Primärantikörper bleibt eher klein, und nicht alle sind in der Lage, das Antigen in Situ zu erkennen (siehe Tabelle 1 für Beispiele von Antikörpern nachgewiesen erkennen Sie intestinale Antigene in Situund Tabelle 3 für zusätzliche Ressourcen). Die meisten Antikörper gegen Wirbeltiere Antigene generiert werden nicht mit ihren C. Elegans homologe Kreuzreaktion. Die Auswahl der Sekundärantikörper berücksichtigen Gattung der erste Antikörper (siehe allgemeine Immunfluoreszenz Protokolle^27,28). Große Auswahl sind im Handel erhältlich, mit Fluoreszenz-Farbstoffen (z.B. Alexa Fluor Farbstoffe) kontinuierlich zu verbessern. Für optimierte Färbung, Farbstoffe ist wählbar für ihre Fähigkeit, das Mikroskop verwendet für bildgebende Verfahren, z.B. der Laser in der konfokalen Mikroskopie, übereinstimmen oder wenn Superresolution Mikroskopie auch geplant ist, für ihre Fähigkeit,^"37blink". Direkt beschriftete Primärantikörper oder chemische Flecken (z. B. Eindringmittel beschriftet Phalloidin) sind ebenfalls erhältlich und eignen sich besonders für doppelte Färbung.

Die Schwierigkeit für in Situ Antikörper Färbung in C. Elegans ist die Dichtheit der Eierschale des Embryos und die Larven/Erwachsene Kutikula, dass beide chemischen und/oder mechanischen Störung des Antikörpers an das Gewebe Zugriff benötigen. Obwohl Komplex flüssig Antikörper Färbung Protokolle entwickelt wurden, um dieses Problem^27,28zu überwinden, gehören die meisten Kollagenase für Permeabilisierung, die dazu neigt, das Zielgewebe zu beschädigen. Im Gegensatz dazu ist die hier beschriebene Einfrieren-Crack-Methode eine einfache Möglichkeit, des Wurms Nagelhaut oder Eierschalen zu öffnen. Es erfolgt direkt auf das Glas schieben, wo die Proben gesammelt werden (und wo der Rest der Färbung auch durchgeführt wird), und eignet sich besonders gut für Eiern und Larven, die halten Sie sich am besten an Glas-Objektträger (d. h. die Verfahrensabschnitte überwiegend zu, in untersuchen Tubulogenesis Studien). Es stört mich auch nicht mit der Erhaltung von Fusionsproteinen Fluorophore beschriftet. Die Technik erfordert etwas handwerkliches Geschick, als der richtige Druck auf das Deckglas (vor flicking) und die Vermeidung von Scherkräften Druck sind entscheidend für den Erhalt der Probekörpers (wie schonende Behandlung und während der gesamten Färbeverfahren Pipettieren).

Fixierung-Bedingungen müssen empirisch ermittelt und angepasst für die Struktur/Antigen, das (diskutiert in²⁷) gefärbt werden soll. Mildere (z. B. Formaldehyd-basierte) Fixierung Techniken können Antigenität, besser erhalten bleibt, auch wenn dies mit der Notwendigkeit, Gewebe Morphologie, entscheidend für die Analyse der Morphogenese ausgeglichen werden muss. Milder Fixierung Bedingungen auch Hilfe, fluoreszierende Fusionsproteine in doppelte Kennzeichnung Experimente zu bewahren. Ebenso erfordert die Sperrung Agent (z. B. Milch oder bovine Serum Albumin/BSA) und Waschmittel in die Waschlösung empirische Anpassung an Hintergrund mit spezifischen Färbung zu balancieren. Informationen zu allgemeinen Aspekten der Immunfluoreszenz-Techniken, z. B. Diskussion der verschiedenen befleckenden Techniken, Gestaltung der entsprechenden Kontrollen und Tipps für die Optimierung dieser Verfahren für Wurm Darm (z. B. Darm zu minimieren Autofluoreszenz) finden Sie im allgemeinen und C. Elegans spezifische Immunfluoreszenz-Protokolle, wie in der gesamten referenziert.

Störungen mit Genfunktion und Auswertung der Tubulogenesis Phänotypen

Dieses Protokoll zeigt spezifische RNAi-Ansätze, die hilfreich sind bei der Bewertung Gene mit frühen, essentiell und allgegenwärtigen Funktionen, deren partielle (anstatt komplette) Verlust informativste, ist wie bei den meisten Tubulogenesis Gene (unsere genomweite Bildschirm auf ERM-1::GFP-beschrifteten Darm schlug dieses Eingriffs mit solchen Genen Ursachen > 90 % der alle informativen Tubulogenesis Phänotypen in diesem besonderen Rahmen-¹²). Den vielen Vorteilen, C. Elegans für genetische Manipulationen bietet (z.B. seine kurze Generationszeit) und die verschiedenen Ansätze zur Radardetektoren Genfunktion durch (beginnend mit der Funktion/Phänotyp) vorwärts und rückwärts (beginnend mit der gen) gentechnische Ansätze werden diskutiert, in den allgemeinen C. Elegans Literatur^31,38. Die Verfügbarkeit von im Handel erhältlichen genomweiten RNAi Bibliotheken auch füttern erlaubt es, diese reverse genetische Technik als vorwärts genetisches Screening-Tool zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien für Ressourcen). Die spezifischen Vorteile der RNAi zur Analyse von Tubulogenesis zählen seine Fähigkeit: erzeugen eine Reihe von Phänotypen gleichbedeutend mit einer mutierten Allelen Reihe (in der Regel funktioniert gut für dosisabhängige Morphogenese Gene); Entfernen der mütterlichen RNAs (in der Regel beteiligt frühen Morphogenese/Tubulogenesis); Bühne-spezifisch (nützlich für die Bewertung der Auswirkungen auf die polarisierte Membran Biogenese während postmitotischen Larven Wachstums) stören.

Informationen zu allgemeinen Aspekten der RNAi-Verfahren werden in Refs (^26, diskutiert.s = "Xref" > 31). Schlüssel für die Analyse von tödlichen Tubulogenesis Phänotypen ist die Fähigkeit zu modulieren, RNAi Bedingungen um das Spektrum der Phänotypen zu erhöhen. Informative Tubulogenesis Phänotypen können in der Regel in einem Wild-Typ Hintergrund ohne die Notwendigkeit für Darm-spezifische RNAi Stämme³⁹generiert werden. Jedoch dieser Stämme sind verfügbar, wenn es fehlschlägt und können auch zur Zelle unabhängig von nichtautonomen Effekte zu unterscheiden. Unterschiedliche Ansätze für die Modulation der Stärke der RNAi gemeldet wurden, z.B. die Titration IPTG Konzentrationen für die Induktion von DsRNA, ein Ansatz, der die meisten reproduzierbare Ergebnisse³⁰produzieren kann. Jedoch kann quantitativ genaue Titrierung nicht erforderlich, wenn mit dem Ziel ein Spektrum von verschiedenen Phänotypen erzeugen. Insgesamt ist der Erfolg dieser Analyse nicht so stark abhängig von der RNAi-Effekt zu maximieren, wie es ist auf die Bestimmung der RNAi-Bedingungen, die eine informativere Spektrum von Phänotypen erzeugen (die möglicherweise oft das Ergebnis von suboptimalen (z.B. milder) RNAi (Bedingungen).

Für die visuelle Beurteilung der Tubulogenesis Phänotypen induziert durch RNAi ist es wichtig, das optimale Fenster für phänotypische Beurteilung zu bestimmen. Es ist am besten mit der Auswertung der Platten früh (z. B. zwei Tage nach dem pflücken die Tiere ihre RNAi-Platten unter Standardbedingungen RNAi) beginnen und ihnen lange genug, um mögliche Spätfolgen zu folgen. Ein Entwicklungsstörung zeitlichen Verlauf eines sich verschärfenden Polarität Mangels sollte z. B. 3-7 Tage in in der Regel verhafteten Larven abdecken. Bedingungen für die Analyse von polarisierten Membran Biogenese in postmitotischen nicht teilenden Zellen des Larven Darmes können weiter verbessert werden, bei Verwendung von Mutanten oder RNAi Tiere mit einem verlangsamten Wachstum (wie zum Beispiel let-767(RNAi) oder mutierte Tiere ¹², Abbildung 5). Zeitlichen Verlauf muss abgebrochen werden, wenn F2 Tiere erscheinen (entfernen können L4s in Experimenten, wo die meisten aber nicht alle Tiere als Larven verhaften). Jedes Experiment erfordert die gleichzeitige Beurteilung geeigneter positive und negative Kontrollen (z. B. bakterielle RNAi Klone, die einen definierten Tubulogenesis Phänotyp zu induzieren und leeren Vektor oder Rührei RNAi Klone bzw.). Eine weitere Voraussetzung für die Bewertung ist eine Brut groß genug (mindestens 50). Wenn nicht erfüllt, können andere (z. B. bedingte) RNAi Bedingungen ausprobiert werden. Schließlich einige besonders interessante Tubulogenesis Phänotypen treten bei geringen Penetranz, muss daher eine ausreichende Anzahl von Tieren ausgewertet werden.

Mikroskopie

Niedrige bis mittlere Vergrößerung sezieren Fluoreszenz-Mikroskopie und hoher Vergrößerung konfokalen Mikroskopie, die zwei standard bildgebenden Verfahren, die hier beschrieben wird, sind in der Regel ausreichend, um die grundlegenden Aspekte eines Rohres oder Lumen Phänotyps in charakterisieren die C.elegans Darm und kann auch optisch größere Mengen von Tieren in der vorwärts-Bildschirme Bildschirm verwendet werden. Sezieren Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht: in-Vivo Bildgebung der Tiere auf dem Teller (jedoch lebende Tiere, vorübergehend durch Anästhetika, immobilisiert auch zurückgewonnen werden Reittiere nach konfokale oder DIC Bildgebung); Screening-große Mengen von Tieren; Entwicklungs-Tracking-Ereignisse (z. B. die Verschiebung und Ersatz einer polarisierten Markierung bei Membran-Erweiterung); Verfolgung von bestimmten Expressionsmuster (einige Muster und Asymmetrien besser bei niedriger Vergrößerung unterscheiden); Auswahl und Kommissionierung geeignet für weitere Analysen (z.B. konfokalen Mikroskopie) oder Wartung von extrachromosomale transgenen fluoreszierende Würmer. Visualisierung bei hoher Vergrößerung durch konfokale Mikroskopie ermöglicht es, den Phänotyp auf einzelne Zelle und subzellulärer Ebene charakterisieren. Dieses Protokoll beschreibt Bildgebung mit einem Laser-scanning-confocal Mikroskop, das die besten Confocality über Alternativen wie eine drehende Scheibe confocal Mikroskop bietet. Eine rotierende Scheibe confocal Mikroskop ist jedoch das Mikroskop Wahl für dynamische und Zeitraffer-Studien, da es weniger Phototoxizität induziert (siehe Refs (^34,35) für die weitere Diskussion der niedrigen und hohen Vergrößerung Mikroskopie in C. Elegans). Roman, sowie konventionellen mikroskopischen Techniken bieten zusätzliche Vorteile und Bildgebung bei höheren Auflösung in den nanoskaligen Bereich (z.B. Transmissions-Elektronen- und super-Resolution-Mikroskopie, diskutierten in^{37, erlauben 40}).

Bei C. Elegans Darm unter einem confocal Mikroskop imaging, ist Montage und Immobilisierung entscheidend. Unter den verschiedenen Chemikalien für Immobilisierung arbeitet Natriumazid - obwohl giftig - die meisten zuverlässig wenn Scannen sofort erfolgt. Levamisol, produziert zwar nicht giftig, Hypercontraction, die manchmal bei der Auswertung der Morphogenese Phänotypen stört. Einige Anästhetika können membranassoziierten fluoreszierende Proteine stören und produzieren Artefakte, die Polarität Defekte aussehen können. C. Elegans ist ein dickes Exemplar und somit 3D Analyse (Schnitt) ist wichtig, die besondere Stärke des röhrenförmigen Darmepithels nutzen, die ausgezeichnete Visualisierung der apikalen Kreuzungen und die seitlichen Membran (nicht ohne weiteres ermöglicht in flachen Epithelien zugänglich). Konfokale Einstellungen müssen für jede Folie und Ziel, gute Bildqualität, einschließlich Parameter wie Belichtungsreihen, Mittelwertbildung, Laserleistung, Gain, Lochkamera und Helligkeit zu erhalten. Ein besonderes Problem der intestinalen Bildgebung ist dieses Organ Inhalt der grün/gelbe Autofluorescent Granulat (Lysosomen bezogen Organellen (LROs)), die stören bei der Interpretation der Ergebnisse, insbesondere bei Verschiebung des GFP-Label Endo und Plasmamembran zugehörigen Komponenten. Dieses Problem wird im Feld gut erkannt und kann durch verschiedene Ansätze (je nach Mikroskop), einschließlich DAPI Ausgrenzung spektralen Fingerabdruck und empirische Scanner-Einstellungen^13,41in Angriff genommen werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Powdered milk	Sigma	MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse)			Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse)			Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit)			Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit)			Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit)	ABCam	AB175471	Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse)	Life technologies	A10524	Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit)	Invitrogen	T2769	Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse)	Sigma	F9006	Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin			Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	335148
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans related			see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates			see reference29 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
Ampicillin	Sigma	A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912
M9 Medium			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO4	Sigma	M2773
NGM plates			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi plates			see reference30 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)	Source BioScience
Imaging related
Sodium azide	Fisher Scientific	BP9221-500
Equipment
dissecting microscope	Nikon	SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)	Olympus	SZX12
Laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystem	TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope	Nikon	C2