C. elegans tarmen som en modell for intercellulære Lumen Morphogenesis og I Vivo polarisert membran Biogenesis på encellede nivå: merking av antistoff flekker, RNAi tap av funksjon analyse og bildebehandling

Summary

Den gjennomsiktige C. elegans tarmen kan tjene som en"i vivo vev chamber" for å studere apicobasal membran og lumen biogenesis på én celle og subcellular under flercellet tubulogenesis. Denne protokollen beskriver hvordan kombinere standard merking, tap av funksjon genetisk/RNAi og mikroskopiske tilnærminger å dissekere disse prosesser på molekylært nivå.

Abstract

Flercellet rør, grunnleggende enheter av alle indre organer, er sammensatt av polarisert epithelial eller endothelial celler, apikale membraner fôr lumen og basolateral membraner kontakter hverandre og/eller den ekstracellulære matrisen. Hvordan denne karakteristiske membran asymmetri er etablert og opprettholdt i organ morphogenesis er fortsatt en uløste spørsmål om cellebiologi. Denne protokollen beskriver C. elegans tarmen som modell for analyse av polarisert membran biogenesis under rør morphogenesis, med vekt på apikale membran og lumen biogenesis. C. elegans tjue-celle ett lag intestinal epitel er ordnet i en enkel bilateralt symmetrisk tube, tillater analyse på en enkeltcelle nivå. Membran polarisering oppstår samtidig med polarisert celledeling og migrasjon under tidlig embryogenesis, men de novo polarisert membran biogenesis fortsetter gjennom larver vekst, når cellene ikke spre og flytte. Den siste innstillingen gjør det mulig å skille subcellular endringer samtidig formidle disse ulike polariserende prosesser, vanskelig å skille de fleste polaritet modeller. Apikale-, basolateral membran-, junctional-, cellen cytoskjelett- og endomembrane komponenter kan være merket og spores gjennom utvikling av GFP fusion proteiner eller vurdert av i situ antistoff flekker. Sammen med den organismes genetisk allsidighet gir C. elegans tarmen dermed en unik i vivo modell for visuelle, utviklingsmessige, og molekylær genetisk analyse av polarisert membran og rør biogenesis. De bestemte metodene (alle standard) beskrevet her inkluderer slik: label intestinal subcellular komponenter av antistoff flekker; analysere gener involvert i polarisert membran biogenesis av tap-av-funksjon studier tilpasset vanligvis avgjørende tubulogenesis gener; vurdere polaritet feil under forskjellige utviklingsstadier; tolke fenotyper av epifluorescence, differensial forstyrrelser kontrast (DIC) og AC confocal mikroskopi; kvantifisere visuelle feil. Denne protokollen kan tilpasses til å analysere noen av de ofte svært konservert molekylene involvert i epithelial polaritet, membran biogenesis, rør og lumen morphogenesis.

Introduction

Generering av mobilnettet og subcellular asymmetrier, som dannelsen av polarisert membran domener, er avgjørende for morphogenesis og funksjon av celler, vev og organer¹. Studier på polarisert membran biogenesis i epithelia være en teknisk utfordring, siden retningsbestemt endringer i allokering av subcellular komponenter er avhengig av flere sammenhengende og sammenfallende ekstracellulære og intracellulære signaler som er vanskelig å skille i de fleste modeller og sterkt avhengig av modell systemet. Modellen presentert her - i ett lag Caenorhabditis elegans tarmen - er en vev av utsøkte enkelhet. Sammen med encellet C. elegans excretory canal (se medfølgende papir på polarisert membran biogenesis i C. elegans excretory kanalen)², har flere unike fordeler for identifikasjon og karakterisering av molekyler kreves for polarisert membran biogenesis. Bevaring av molekylære polaritet signaler fra gjær mann gjør denne enkle virvelløse organ en utmerket"i vivo vev chamber" å svare på spørsmål på epithelial polaritet som er direkte relevans for menneskelig system, som er fortsatt altfor komplekset vil tillate visual Disseksjon av singelen celle nivå i vivo.

Selv om flere bevarte polaritet signaler fra (1) extracelluar matrise, (2) plasma membranen og veikryss og (3) intracellulær vesicula menneskehandel har vært identifisert³, de underliggende prinsippene for deres integrering i prosessen med polarisert epithelial membran og vev biogenesis er dårlig forstått⁴. Klassisk enkeltceller i vivo modellene (e.g.S. cerevisiae og C. elegans zygoten) har vært medvirkende i å definere prinsippene om polarisert celledeling og anterior-posterior polaritet og har identifisert kritisk membran-assosiert polaritet determinanter (den lille GTPases/CDC-42, partisjonering defekt PARs)^5,6, men de avhengige unike symmetri bryte signaler (bud arr, sperm oppføring) og mangler krysset-sikret apicobasal membran domener og antagelig den tilsvarende intracellulær apicobasal sortering maskiner. Vår nåværende kunnskap om organiseringen av polarisert handel med epithelia, men avhengig primært av pattedyr 2D monokulturer⁷, som mangler fysiologiske ekstracellulære og utviklingsmessige signaler som kan endre plasseringen av membran domener og retninger av menneskehandel baner (en bryter fra 2D til 3D i vitro kultur systemer alene nok for å invertere membran polaritet i MDCK (Madin-Darby hjørnetann nyre) celler)⁸. I vivo utviklingsmessige studier på epithelial polaritet i virvelløse modell organismer ble opprinnelig utført i flat epithelia, for eksempel i Drosophila melanogaster overhuden, hvor de identifiserte viktige bidrag krysset dynamikk polarisert celle migrasjon og celle ark bevegelse⁹og endocytic handel for polaritet vedlikehold¹⁰. Den 3D i vitro og i vivo analyse av lumen morphogenesis i rørformede epithelia MDCK celler og C. elegans tarmen, henholdsvis har nylig identifisert kravet til intracellulær handel på de Novo (apikale) domene og lumen biogenesis og posisjonering^11,12,13. Tykkelsen av rørformede (i motsetning til flat) epitelceller er en fordel for 3D analyse av subcellular asymmetrier siden den gir en overlegen visuelle forskjellen apikale-lumenal membran, apico-lateral veikryss, lateral membranen, og plasseringen av intracellulær organeller. Til disse visuelle fordelene, C. elegans modellen legger i vivo innstillingen, utviklingsmessige aksen, gjennomsiktighet, enkelhet av kroppen plan, konstant og definert celle avstamning, analytiske (genetisk) og ekstra fordeler som beskrevet nedenfor.

C. elegans selv er en rundorm rørformet struktur med åpenhet og enkle arkitektur gjør dens likeledes rørformede indre organer direkte tilgjengelig for visuell analyse av rør og lumen morphogenesis. Tjue cellene sin tarmen (21 eller 22 celler til tider)¹⁴ er avledet fra en enkelt stamfar celle (E) og utvikle fra et dobbelt lag epitel med ett innskudd trinn inn i et bilateralt symmetrisk rør av ni INT ringer (fire celler i den første ring; Figur 1 skjematisk)^14,15,16. Tarmens avstamning og vev analyse, først bestemmes av Nomarski optikk via kjernefysiske identiteter¹⁷og senere fluorescens mikroskopi via merket membraner, har gitt kritisk innsikt i sin morphogenesis, i bestemt celle autonome og celle-ikke-autonome kravene for retningsbestemt celledelinger og bevegelser (f.eks, innskudd, høyre-venstre asymmetrier, fremre og bakre rotasjon)^14,18 . Tidlig endodermal celle spesifikasjon og gene regulatoriske nettverket kontrollerer utviklingen av denne klonal modell organ er også preget^19,20. Her, men er på analyse av polarisert membran og lumen biogenesis i rørformede enkeltceller og intracellulær asymmetrier endomembranes, cellen cytoskjelett strukturer og organelles som følger denne prosessen. Analysen er tilrettelagt av enkelhet av dette røret, der alle apikale membraner (på ultrastructural nivå atskilt av microvilli) møte i lumen og alle basale membraner ansiktet ytre røret overflaten, med lateral membraner kontakter hverandre, separert fra apikale membranen veikryss (figur 1 skjematisk; se referanser (^16,21) for C. elegans-spesifikk organisasjon på trange og adherens krysset komponenter). Apikale membran biogenesis er dermed samtidig med lumen morphogenesis. Videre størrelsen på voksen intestinal celler - største cellene i denne liten dyr (med unntak av excretory cellen) - omtrent på størrelse med en pattedyr celle, tillater i vivo visuell sporing av subcellular elementer, f.eks vesicle baner, som er typisk forsøkte i vitro i en kultur parabol.

For denne mobilnettet og subcellular analyse er riktig merking avgjørende. Intestinal endo - eller plasma-membran domener, veikryss, cellen cytoskjelettstrukturer, kjerner og andre subcellular organeller kan visualiseres ved merking deres bestemte molekylær komponenter. Mange slike komponenter har vært preget og fortsette å bli oppdaget (tabell 1 gir noen eksempler og henviser til ressurser). For eksempel er ulike molekyler skille rørformet og/eller vesicula seksjonene av intestinal endomembrane systemet, fra ER Golgi via post-Golgi blemmer til plasma membranen, identifisert²². Spesifikke proteiner (samt lipider og sukker) kan enten merkes direkte eller indirekte via bindende proteiner. Denne protokollen fokuserer på i situ antistoff farging av fast, en av to standard merking teknikk (se vedlagte på excretory kanalen tubulogenesis en beskrivelse av andre teknikk² - i vivo merking via fluorescerende protein fusjoner - som direkte gjelder tarmen; Tabell 2 gir eksempler på tarmen-spesifikke arrangører som kan brukes til å kjøre uttrykk for slike fusion proteiner til tarmen). Dobbel- eller flere merking med enten tilnærming eller en kombinasjon av begge pluss ekstra kjemisk flekker, tillater større grundig visuell oppløsning og undersøkelse av romlige og tidsmessige endringer i co lokalisering og rekruttering av molekyler eller subcellular komponenter (figur 2). Fiksering og flekker fremgangsmåtene i denne protokollen støtte bevaringen av grønne fluorescerende protein (GFP) merking under immunostai-prosedyrer. For bildebehandling, viktige punkter av gjenkjenning og karakterisering av tubulogenesis fenotyper via standard mikroskopiske prosedyrer (fluorescens dissecting og AC confocal mikroskopi) er beskrevet ()Figur 3, 4). Dette kan bli utvidet til høyere oppløsning imaging metoder, for eksempel superresolution mikroskopi og overføring elektronmikroskop (ikke beskrevet her).

En styrke på dette systemet er muligheten til å analysere polaritet i enkeltceller på ulike utviklingsmessige stadier, fra embryogenesis til voksen alder. For eksempel kan apikale membran domene og lumen biogenesis spores gjennom utvikling på encellede nivå via merking ERM-1, et høyt konservert membran-utgangen linker av Ezrin-Radixin-Moesin familien^23,24 . ERM-1 visualiserer apikale membran biogenesis (1) under embryonale rør morphogenesis, når det oppstår samtidig med polarisert celledeling og overføring (cellene flytte apically rundt lumen under innskudd)¹⁵; (2) under sent embryonale og larver utvidelse som fortsetter i fravær av cellen divisjon eller overføring; og (3) i voksen tarmen, der polarisert membran domener vedlikeholdes (figur 1). I voksende etter mitotisk larver epitel, de novo polarisert membran biogenesis kan dermed skilles fra polarisert vev morphogenesis, hvilke ikke er mulig i de fleste i vivo og i vitro epithelial polaritet modeller, inkludert de med encellede oppløsning (f.eks 3D MDCK cyste modell⁸). Med merking for andre komponenter, denne innstillingen gir muligheten (spesielt på L1 larvestadiet når celler har en høyere cytoplasma/kjernen ratio) å skille intracellular endringene gjelder polarisert membran biogenesis ( f.eks omleggingen av menneskehandel baner) fra de samtidig kreves for polarisert celledeling og overføring.

Genetisk allsidigheten C. elegans kjente²⁵og gjør det en kraftig modellsystem for molekylær analyse av biologiske spørsmål. En studie på morphogenesis, for eksempel kan starte med en vill-type belastning, en transgene stamme hvor strukturen av interesse (f.eks en membran) er merket med en fluorescerende markør eller en tap eller vinning-av-funksjon mutant med en defekt i denne struktur. En typisk omvendt genetisk studie kan generere en mutant der genet av interesse slettes i germline (f.eks av en målrettet sletting), modifisert av mutagenese (vanligvis produserer punkt mutasjoner med påfølgende tap, reduksjon eller gevinst i funksjonen av genet), eller der dens transkripsjon er redusert med RNAi. Enkelt RNAi av mate i C. elegans²⁶ egner seg også til utformingen av målrettet skjermer undersøke en større gruppe av gener av interesse. En genetisk modell organismes kanskje største styrke er evnen til å utføre i vivo frem skjermer (f.eks mutagenese, systematisk og genom hele RNAi skjermer) som tillater en objektiv undersøkelse en fenotypen av molekylære årsaken interesse. For eksempel en upartisk visual C. elegans RNAi tubulogenesis skjermen, starter med en transgene dyr med ERM-1-merket apikale membraner, oppdaget en spennende reversibel intestinal polaritet konvertering og ektopisk lumen fenotype, brukt her som et eksempel på denne typen analyse. Denne skjermen identifisert uttømming av glycosphingolipids (GSLs, forplikte membran lipider, identifisert via sine GLS-biosyntetiske enzymer) og komponenter i vesicle pels clathrin og dens AP-1-adapter som de spesifikke molekylær feilene forårsaker denne polaritet konvertering fenotype, dermed karakterisere disse smugling molekyler som i vivo pekepinner apikale membran polaritet og lumen posisjonering^12,13. Når du starter med en bestemt genetisk mutasjon/morphogenesis fenotype, kan slike skjermer (eller enkelt samhandling som genetiske/RNAi eksperimenter) også undersøke funksjonell samhandling mellom to eller flere gener rundt (se medfølgende papir på den excretory kanalen for et eksempel på slik analyse)². Denne protokollen fokuserer på RNAi som i tillegg til sin evne til å identifisere direkte genet som tap forårsaker fenotypen i fremover skjermer, gir spesielle fordeler for analyse av morphogenesis. Siden genet produkter regi morphogenesis ofte arbeider i en doseavhengig måte, er RNAi vanligvis vellykket generere et spekter av fenotyper. Muligheten til å generere informativ delvis tap av funksjon fenotyper bidrar også til å løse problemet at fleste viktige tubulogenesis gener er avgjørende og at deres tap føre til sterilitet og tidlig embryonale lethality. Denne protokollen inneholder betinget RNAi strategier for å overkomme dette problemet, og foreslår måter å optimalisere generering av et bredere spekter av fenotyper, for eksempel en allel serie produsert av mutagenese.

Protocol

1. Merking C. elegans tarmen

Merk: se medfølgende av forfatterne på analyse av excretory kanalen tubulogenesis ² for bygging av vevet bestemt fluorescerende markør plasmider og generering av transgene dyr, inkludert diskusjoner om transcriptional og translasjonsforskning fusion proteiner (sistnevnte kreves for den subcellular lokaliseringen av et molekyl av interesse). Disse prosedyrene kan tilpasses ved hjelp av bestemte arrangørene for å kjøre molekylet rundt til tarmen. Se tabell 1 for eksempler på molekyler vist seg nyttig for å visualisere C. elegans intestinal endo - og plasma membraner og deres veikryss, tabell 2 eksempler på arrangører for kjøring uttrykk til tarmen, og tabell 3 for ressurser for mer omfattende samlinger av intestinal markører og arrangører.

1. Antistoff farging av C. elegans tarmen ^{27 , 28}
   1. fiksering
      1. ta en ren objektglass og bruke poly-L-lysine til generere en tynn film for ormer å holde seg på. Sted 30 µL 0.1-0,2% poly-L-lysine på lysbildet og plass enda ett lysbilde på poly-L-lysine miste å gjøre en " sandwich ". Deretter gni lysbildene forsiktig noen ganger våt hele overflater av både og la dem lufttørke for 30 min. etiketten frostet siden lysbildene med blyant.
         Merk: 0,2% poly-L-lysine dele 200 µL ble gjort ved å løse opp pulveret i dH ₂ O; Dette kan lagres på-20 ° C. Bruk molekylvekt poly-L-lysine for forbedret stikker av ormene. Konsentrasjonen av poly-L-lysine er også kritisk. For lave konsentrasjoner tillate ikke ormer å stikke, men for høye konsentrasjoner kan generere fluorescens bakgrunn signal. En for tykk film kan løsne opp i sin helhet.
      2. Plasserer en flat metall blokk fast på bunnen av en beholder (f.eks en polystyren beholder) fylt med flytende nitrogen.
         Merk: Man kan bruke tørris i stedet, men flytende nitrogen holder en metall blokk mer stabilt beholder nederst og frysninger godt.
      3. Samle ormer enten ved vask dem av sine plater med M9 ²⁹ eller plukke forskjellige scene ormer (enten egg, L1, L2, L3 og L4 larvestadiet ormer) på hvert lysbilde. Vanligvis velge ~ 100 larver og embryo eller ~ 20 voksne hvert lysbilde. Sted 10 µL vaskes av ormer på midten av lysbildet eller plukke egg/ormer i 10 µL M9 eller 10 µL 1 x PBS ²⁷ (fosfat bufret saltvann).
         1. Bruk en pipette å spre ut stort antall ormer å unngå klumper.
            Merk: Blandet av vasket av ormer, trengsel og ulike tykkelsen på etapper, ikke stikke godt og er mindre effektivt fryse-sprakk (se nedenfor), derfor plukking scenen-spesifikke ormer (eller synkronisert populasjoner) gir overlegne resultater. Larvene stikke bedre enn voksne og flere dyr kan plasseres per lysbilde.
         2. Før plukke ormer på lysbilder, overføre dem til en Rundormer vekst Medium (NGM) plate ²⁹ uten OP50 bakterier. Overflødig bakterier tilhenger til ormer kan også påvirke stikker. Pass på at ormer ikke tørr.
      4. Forsiktig sted (slipp) en 22 mm × 22 mm dekkglassvæske tvers av veier over de innsamlede ormer slik at kantene henge over på minst én side av lysbildet. Trykk rett ned forsiktig men bestemt med én eller to fingrer på dekkglassvæske. Unngå klipping det vil skade vev integritet.
      5. Umiddelbart og forsiktig overføre lysbildet til metall blokken i flytende nitrogen og la det sitte i ca 5 min fryse. Deretter " sveip av " dekkglassvæske i en rask flytte ved hjelp av overhengende kanten.
         Merk: Dette trinnet må gjøres besluttsomt og mens lysbildet er frosset for å oppnå " sprengning " av cuticle. Forsiktig: Følg PPE (personlig verneutstyr) retningslinjene når du arbeider med flytende nitrogen.
      6. Fordype fryse-sprakk lysbildene i en metanol-fylt Coplin glasskrukke i 5 min på 20 ° C. Deretter overføre til en aceton-fylt Coplin glasskrukke for en annen 5 min på -20 ° C.
         Merk: Metanol og aceton bør lagres på 20 ° C i minst 30 min før bruk. Etter fiksering, lysbilder kan lagres på -20 ° C. Advarsel: metanol og aceton er giftige.
      7. Fjern lysbilder fra glasset, og la dem lufttørke ved romtemperatur (RT) før bruk.
   2. Beising
      1. omgir området av fast med et tynt lag med vaselin på lysbildet. Tegne en sirkel rundt dette området på undersiden av lysbildet for å merke stedet.
         Merk: Det er viktig at gelé sirkelen forblir intakt gjennom flekker prosedyren for å forhindre lekkasje av flekker løsninger.
      2. Forberede en " våt chamber " i en plast kasse med lokk ved å plassere våt papirhåndklær inn i den. Sett lysbildet på en reol i dette " våt chamber " å hindre tørking lysbildene under fargingen.
         Merk: Lysbilder bør ikke være i kontakt med vann eller med hverandre.
      3. Pipetter forsiktig ca 50 µL 1 x PBS i gelé sirkelen, nok til å dekke området. Lukk den " våt chamber " med lokk. Ruge på RT for 5 min.
         Merk: For å unngå å miste ormer på dette trinnet, ikke Pipetter PBS direkte på ormer. Forsiktig plassere pipette tips på kanten av sirkelen og la væske jevnt spre over ormer.
      4. Tilt lysbildet og Sug opp sakte PBS med en pipette. Plasser lysbildet tilbake flat på brettet og legge til 50 µL (eller den nødvendige mengden å dekke stedet) blokkerer løsning nøye. Inkuber dette i våt kammer på RT i 15 min. Mens du venter, fortynne primære antistoffer i blokkering løsning (se Tabell for materiale for eksempler på primære antistoffer og konsentrasjoner).
         Merk: Fersk forberede blokkerer løsning 1 x PBS (10 mL), 10% tween (50 µL) og pulverisert melk (0.2 g). Mengden av vaskemiddel og konsentrasjonen av melk kan variere avhengig av antistoffer brukes og må bestemmes empirisk. Aspirasjon av væske fra lysbildet er et skritt å enkelt miste ormer. Sjekke fremdriften ved å undersøke lysbildet under dissecting omfanget, men pass på at lysbildet ikke tørke.
      5. Tilt lysbildet og Sug opp unna blokkerer løsningen, bruker de samme forholdsreglene som beskrevet ovenfor. Sted lysbildet tilbake flatt på rack og legger sakte 50 µL utvannet primære antistoff, bruker de samme forholdsreglene. Lukk den " våt chamber " og Inkuber på 4 ° C over natten eller i kortere perioder på RT.
         Merk: Inkubasjonstiden må bestemmes empirisk for et spesifikt antistoff.
      6. Leveringstanken av primære antistoff løsning som de andre løsningene. Deretter vaske lysbildene med blokkering løsning for 10 min, 3 ganger, legge til og fjerne løsningen på samme måte som beskrevet ovenfor.
      7. Legg til sekundære (fluorescently-merket) antistoff fortynnet i blokkering løsning, ruge på RT 1t. Se Tabellen for materiale for eksempler på sekundære antistoffer og konsentrasjoner.
      8. Fjern sekundær antistoff og vask, som ovenfor, med blokkering løsning 2 ganger og å helt av blokkering løsningen, med 1 x PBS, i 10 min.
      9. Sug opp unna PBS så mye som mulig uten tillater å tørke ut og fjern forsiktig gelé rundt prøven.
      10. Legge til en dråpe montering middels fast til prøveplaten, og plass en dekkglassvæske forsiktig på toppen. Forsegle kantene på dekkglassvæske med neglelakk. Plasser lysbilder i en mørk slide bevare flekker og lagre i 4 ° C.
          Merk: At lysbildene i mørket på grunn av lysfølsomhet (fluorescens kan falme med tid) og forhindre luften eksponering ved å holde dem forseglet, av samme grunn. Lysbilder kan oppbevares i lengre tid på 4 ° C eller -20 ° C.

2. Interferens med funksjonen av avgjørende tubulogenesis gener i C. elegans tarmen. Eksempel: RNAi.

Merk: C. elegans stammer er kultivert på OP50 bakterier seeded på NGM platene ifølge standardprotokoller ²⁹. For RNAi, C. elegans feed på HT115 RNAi bakterier på RNAi plater med 25 µg/mL carbenicillin og 2 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside) for induksjon av bakteriell arrangøren som genererer den dobbel strandet RNA (dsRNA) fra de introduserte C. elegans genet. Antibiotika og IPTG konsentrasjon varierer avhengig RNAi klone/bibliotek og ønsket RNAi styrke, ansv.senter bestemte RNAi kloner kan fås fra kommersielt tilgjengelige genomet hele RNAi fôring biblioteker (se ( ^{26 , 30 , 31}) i bakgrunnen på mate RNAi C. elegans og Tabell for materiale for materialer/reagenser og RNAi bibliotek).

1. Standard RNAi ved å fôre ^{26 , 31}
   1. ta ut RNAi biblioteket plate-80 ° C og satte den på tørris. Fjern tetting tape og bruke sterilt pipette tips for å overføre tilhenger bakterier av klone av interesse til LB (Luria buljong) agar plater ²⁹ supplert med 100 µg/mL ampicillin og 15 µg/mL tetracycline. Strek ut bakterier på agar tallerkenen. Forsegle RNAi biblioteket platen med en ny tetting tape. Vokse bakterier overnatting på 37 ° C.
      Merk: Disse agar platene kan lagres på 4 ° C i flere uker. Nye bakterier kan kultivert direkte fra dem å beskytte opprinnelige RNAi biblioteket.
   2. Dagen vaksinere RNAi bakterier fra LB agar plate i 1 mL LB flytende medium ²⁹ inneholder 50 µg/mL ampicillin hver og riste for 14 (8-18) h eller overnatting på 37 ° C.
      Merk: For optimale resultater bruke fersk bakterier hver gang. Se referanse ( ³⁰) for sammenligning av ulike kultur (f.eks timing kultur).
   3. Neste dag, frø 200 µL per klone av kultivert RNAi bakterier på separate RNAi plater. La tørke og la på RT over natten for induksjon av bakteriell Promotoren.
   4. Overføre 4-6 L4-trinns larver på hver RNAi plate. Inkuber seeded RNAi platene på RT eller 22 ° C i 3-5 dager.
      Merk: Velg L4 Larvene først på en NGM plate uten bakterier fjerne tilhenger OP50 som vil påvirke RNAi eller serielt Overfør dem til en ny NGM plate uten OP50 tre ganger. Kontroller at stammer ikke er forurenset, som skadelige bakterier - som OP50 foretrukket mat for ormer - vil også påvirke RNAi. Justere temperaturen etter behov: f.eks akselererer med høyere temperatur; stammer kan være ømfintlig.
   5. For utviklingsmessige studier, sjekk fenotyper av F1 avkommet fra dag 2 onwards.
      Merk: Det er viktig å sjekke dyr ofte for å unngå manglende utseende eller progresjon av en fenotypen (f.eks markør forskyvning) når vurdere polarisert membran biogenesis under utvikling. Anriking av befolkningen F2 for sterk fenotyper (f.eks ved å plukke overordnede hermafroditter til en ny RNAi plate på dag 2 for å velge for de sterkt påvirket midt delen av deres avkom) er sjelden nødvendig, siden et spekter fra mild sterke fenotyper er ønskelig.
2. Betinget RNAi
   Merk: RNAi betingelser kan endres redusere alvorlig, eller Øk mild effekter eller forstyrre scene-spesielt, modifikasjoner er nyttig for fullstendig vurdering av fenotypiske virkningene av den ofte dødelig tubulogenesis gener.
   1. Larver RNAi - evaluering av RNAi effekter i samme generasjon (mild, scenen-spesifikk RNAi)
      Merk: overvinne sterilitet eller embryonale dødelighet, eller forstyrre gen funksjon på et bestemt stadium innlegget embryogenesis, RNAi er indusert i Larvene, legge embryonically. Enten plassere ubehandlet egg (2.2.1.1), gravid voksne (2.2.1.2) eller synkroniseres L1 (eller eventuelt senere stadium) Larvene (2.2.1.3) på RNAi platene; evaluere RNAi effektene i samme generasjon, f.eks to dager senere og, i larver og/eller voksne.
      1. Plukke 30-50 gravid voksne i en slippe blekemidler løsning (en 1: 4 løsning 10 M NaOH og husholdningenes natriumhypokloritt) plassert på kanten av en RNAi plate. La tørke og tillate L1s å klekkes og flytte til bakteriell plenen.
         Merk: Bleking løsningen, vanligvis brukt for dekontaminering, vil drepe alt men embryo i egg skall. Derfor ikke plasser bleking løsningen på eller nær RNAi bakterier.
      2. Plukke frø ~ 20, unge voksne gravid på RNAi plate og la dem legge egg 2-3 h eller til det er rundt 300 egg på tallerkenen, deretter plukke av voksne.
         Merk: Denne metoden medfører forurensning av RNAi bakterier av OP50. For å redusere denne risikoen, må du først overføre voksne på en NGM plate uten bakterier å fjerne OP50 tilhenger til ormer. Pass på at voksne ikke holder lenge på RNAi plater å unngå RNAi effekt på embryoer.
      3. Plukke eller L1 scenen ormer direkte på RNAi plater (se referanse ( ²⁹)-for synkronisering protokoller).
         Merk: Man kan bruke en forkortet synkroniseringen protokollen (f.eks for et moderat storskala oppsett) ved å vaske ormer fra tett befolkede plater med M9 for flere ganger gjenstår bare egg. Etter 2-3h klekking L1s kan deretter hentes i M9 fra disse platene, renset av flere vasker fjerne bakterier (3 x i M9) og sådd på RNAi plater.
   2. Fortynning av RNAi bakterier med Tom vektor RNAi bakterier (mild RNAi)
      Merk: reduksjon i mengden dsRNA fortynne mengden RNAi bakterier kan nok til å indusere mildere effekter og kan også redusere embryonale dødelighet uten avskaffe alle embryonale effekter. Fortynning av RNAi bakterier brukes også for dobbel RNAi eksperimenter og å sjarmere betingelser for genetisk samhandling eksperimenter (f.eks å generere mild effekter for vurdering av ekstrautstyr og sterke effekter for vurdering av undertrykkelse).
      1. Vokser opp RNAi og emPty vektor HT115 RNAi bakterier i 1 mL LB medium med 50 µg/mL ampicillin, som RNAi standardvilkår.
      2. Fortynne RNAi bakterier med Tom vektor RNAi bakterier å oppnå et utvalg av ulike konsentrasjoner, for eksempel 5%, 15%, 30%, 50%, 70%. Bland bakterier godt av pipettering opp og ned. Pipetter 200 µL blandet bakterier på en RNAi plate.
      3. Plukke 4-6 L4 larver på hver RNAi plate. Sjekk fenotypen fra dag 2 videre.
   3. RNAi følsom stammer (sterk RNAi)
      1. bruke tilgjengelig RNAi-sensitive stammer, for eksempel eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) eller eri-1 (mg366) lin-15B (n744) (den sistnevnte supersensitive), og følg standard RNAi-prosedyrene som er beskrevet i 2.1 ^{31 , 32 , 33}.
         Merk: RNAi følsom stammer (f.eks rrf-3 og eri-1) har lavere Foreldreomsorg og yngelens størrelse enn vill-type dyr og bli steril på 25 ° C. De kan også ha lav bakgrunn av egne fenotyper, f.eks lav penetrant embryonale dødelighet, som må tas i betraktning når du vurderer spesifikke RNAi effekter.

3. I vivo avbilding av C. elegans tarmen av fluorescens dissekere mikroskopi

1. før visualisere dyr under fluorescens lys, sjekk RNAi plater under lys på noen dissecting mikroskop. Vurdere (og potensielt registrere) fenotyper synlig under lys som kan påvirke analysen, for eksempel dødelighet, sterilitet (lavere antall avkom), utviklingsmessige (f.eks larver arrestasjonen) og andre synlige fenotyper som kan hjelpe karakterisere funksjonen av et gen involvert i polarisert membran biogenesis og lumen morphogenesis.
   Merk: Bare score plater som har tilstrekkelig avkom for evaluering (minst 50), ellers prøve alternativ RNAi forhold. For kvantitativ vurdering sikre at plater ikke er forurenset eller vokse OP50 (som forstyrrer RNAi).
2. å visualisere dyr under fluorescerende lys, Fjern lokket og plasser RNAi platen direkte under dissecting fluorescens mikroskopet.
   Merk: For å oppdage subtile intestinal fenotyper må en dissecting mikroskop med en høyere makt stereo fluorescens vedlegg som gir mulighet for et tilstrekkelig utvalg av forstørrelse. Denne protokollen beskriver bruken av et område med en 1,5 og 10 x mål og en bratt stigning omfang fra 3,5 til 45.
3. Først finne dyr lys å fokusere. Deretter undersøke dyr under fluorescerende lys ved lav forstørrelse (f.eks 1,5 x mål) ved hjelp av riktig filter. Undersøke platen systematisk fra øvre venstre til nedre høyre skanne hele platen i fenotyper.
4. Velg dyr rundt og endre til 10 x målet. Fokus på tarmen og bruk zoom til å vurdere tubulogenesis/lumen morphogenesis fenotypen. Se delen 5 for scoring av fenotyper. Først, ta bilder ved lave forstørrelse. Deretter bytte til forstørring.
   Merk: Siden friske dyr flytte raskt, jobbe raskt, med én hånd på mus for bildeopptak mens fokus mikroskopet med den andre hånden. Bremse dyr (f.eks ved midlertidig plassering av platene til 4 ° C) kan ikke være nødvendig når arbeider med tubulogenesis fenotyper i det meste arrestert embryoer og tidlig larver. Bildene kan være fanget av et mikroskop-montert CCD kamera og image fange programvare.

4. Imaging C. elegans tarmen med høyere oppløsning ved bruk av laser AC confocal mikroskopi ^{34 , 35}

1. montering og immobiliseringsløsninger
   1. Bruk fingertuppen til tynt spredt en liten mengde fett eller petroleum gelé i en sirkel på et glass lysbilde (~ 6-8 mm i diameter).
      Merk: Tykkelse på fett sirkel er viktig for montering. Beste imaging resultater ved image en eller flere Larvene samtidig og bruke en supertynn fett sirkel med som liten væske som mulig slik at dyret er direkte fast mellom objektglass og cover slip (hvis gjort perfekt, dyr vil bli immobilisert uten bedøvelse). Montering av egg og eldre dyr krever en litt tykkere sirkel for å unngå ødeleggelse av prøve når cover slip.
   2. Legge til en dråpe vanligvis 3,5 µL 10 mM natrium azide løsning i midten av sirkelen og plukke ormer inn under dissecting mikroskopet.
      Merk: Forberede en 1 M natrium azide lager løsning ved å løse opp 65.01 mg NaN3 i 1 ml dH ₂ O; legge til 200 µL av 1M løsningen i 20 mL M9 buffer. Velg ormer raskt i dråpe natrium azide løsning å unngå løsning for å tørke ut. Velg stadier separat for optimal montering, sikte på 50 embryo per lysbilde og 20 Larvene når undersøke større bestander. Man kan bruke M9 i stedet for natrium azide løsning når plukke embryoer. Hvis bruker Natriumazid, dyr må avbildes innen 30 min å unngå skade på vev av denne giftige kjemiske.
      FORSIKTIG: Natriumazid er giftig.
   3. Forsiktig plassere en 22 mm × 22 mm dekkglassvæske på lysbildet. Vær forsiktig med å knuse ormer. Bruke mildt press og sjekke dissekere mikroskop sørge for ormer er løst bra mellom lysbilder og cover slip. Merk lysbildet.
      Merk: Riktig mengde trykk er avgjørende for å unngå skade prøven (for mye press) og ikke fikse det godt (for lite Press: dyr flyter i stedet for stikker i lysbildet). Flytende dyr egentlig utelukke riktig bildebehandling.
2. Imaging
   1. sted lysbildet under AC confocal mikroskop. Søk etter ormer med 10 x mål og fokusere.
      Merk: Bruk lys å fokusere der det er mulig å unngå photobleaching.
   2. Endre til 60 x eller 100 x mål og fokus på tarmen.
      Merk: Tarmen kan lett identifiseres under lys av sin lumen går gjennom midten av dyret, fra pharynx til anus nær spissen av halen. Vær forsiktig når du bruker olje for 60 x eller 100 x oljeobjektiv. Blande forskjellige typer oljer kan forstyrre videre imaging. Sted liten dråpe olje på lysbildet når du bruker en oppreist mikroskop eller på målet ved en invertert omfang, ta vare ikke for å forurense andre målsettinger eller deler av mikroskopet.
   3. Etablere Kohler DIC/Nomarski belysning for målsettingen som skal brukes for skanning ³⁶. Inspisere dyr under fluorescerende lys med riktig kanal du merking av tarmen og/eller kontrollere fenotype, for å velge passende prøven for bildebehandling. Arbeid raskt for å unngå bleking.
   4. Bytte til laser skanning for å begrense potensielle bildet til tarmen ved å angi skanning grenser på sin rygg- og ventral side.
      Merk: Bracketing tarmen på denne måten er kritiske hvis fluorophore også etiketter strukturer utenfor tarmen. Under denne piloten skanningen, arbeide med rask skanning forhold til avOID photobleaching.
   5. Stopp skanning å Velg skanning parametere for eksperimentet. Angi 6-20 deler for intestinal skanning langs z-aksen, f.eks på 0,2 µm alt, etter forespørsel, scenen av dyr og/eller tekniske betraktninger. Angi ramme gjennomsnitt per bilde avhengig av kompleksiteten til merking og nødvendig oppløsning for å redusere støy.
      Merk: Innstillingen detaljer varierer avhengig av mikroskopet og eksperimentere. En må redusere å unngå bleking hvis utfører sekvensiell skanning av tre forskjellige fluorophores. Justere antall rammer til antall avsnitt (bør være lavere enn antall avsnitt å unngå bildeforvrengning, også veie i økningen i photobleaching). 4-6 rammer er vanligvis tilstrekkelig.
   6. Tilbake til skanning med definitive (sakte) laserskanning forhold og justere: Lysstyrke (bruk minimum gevinst redusere bakgrunn), laser makt (så høyt som nødvendig, så lavt som mulig - øker photobleaching, vanligvis minimumsinnstilling er tilstrekkelig); pinhole (unngå åpningen om ikke nødvendig, for å opprettholde oppløsning).
      Merk: Skanning betingelser avhenger av prøven og må bestemmes empirisk begynnelsen av skanning økten. Kontroller at lysstyrke ikke overstiger metning (vil begrense muligheten til å endre bildet senere av bildebehandlingsprogrammer). Når skanning forhold, også vurdere at identiske betingelser må brukes for alle bildebehandling eksperimenter som sammenligner forsøksdyr med kontroller.
   7. Fange bildet serien. Flette bilder i en enkelt projektor bilde.
      Merk: Må lagre projeksjon bilder og/eller overlegg separat avhengig av mikroskopet.
   8. Når du tar flere bilder Bruk sekvensiell skanning for å unngå gjennomslag mellom kanaler (kritisk for co lokalisering studier).
      Merk: Bildeinnstillinger må endres gitt økt photobleaching koblet til lenger skannetid.
   9. Alltid kjøpe tilsvarende DIC/Nomarski bilder (inndelinger) for landemerker og generelle tilstanden til morfologi av skannede dyr.

5. Kvantifisering av polarisert membran biogenesis mangler i C. elegans tarmen

Merk: eksempel: Basolateral forskyvning av apikale ERM-1::GFP og ektopisk lateral lumen dannelse forårsaket av La-767 og APS-1 RNAi.

1. Scoring fenotyper under dissecting mikroskopet ( figur 5 A, D, E)
   1. definere kategorier for scoring. Eksempel: (i) vill-type (WT), (ii) basolateral forskyvning av ERM-1::GFP (polaritet defekt), og (iii) ektopisk lumen dannelse (utvikler etter basolateral forskyvning).
      Merk: En lav forstørrelse visuell analyse egner seg til scoring antall dyr med eller uten en bestemt fenotypen. Her har vi valgt et eksempel på tre kvalitativt annerledes fenotypiske kategorier som er på samme tid indikativ av en forverring av polaritet fenotypen som analysert. Men en rekke kvalitative og kvantitative Norge kan være scoret, som lumen morphogenesis defekter, fravær/tilstedeværelse eller tall GFP positive cytoplasmatiske vacuoles, lumen diameter og størrelse eller antall intralumenal cyster (se < sterk class = "xfig" > figur 3 eksempler).
   2. Avhengig av på omfanget av forventet forskjeller, score ca 100 live ormer på sine agar plater under dissecting mikroskopet i et to og tre eksemplarer eksperimenter.
      Merk: En må score hvert dyr som kommer til syne når skanning plater systematisk, f.eks fra øvre venstre til nedre høyre av platen (Kontroller at ormer har fylt ut plater jevnt).
   3. Gjenta dette for 3 uavhengige sett av eksperimenter. Generere stolpediagram og vurdere betydningen av resultater.
2. Scoring fenotyper under AC confocal mikroskopet ( figur 5 B)
   1. definere kategorier for scoring, f.eks antall ektopisk lumen per dyr
      Merk: en høyere forstørrelse visuell analyse gir seg til scoring en kvantifiserbare markør eller fenotypen per dyr og lar scoring av subcellular markører som ikke kanskje er merkbar av dissecting mikroskopi. Nåværende eksempel telle ektopisk lumen per dyr i et delsett av ormer av samme eksperimentet tidligere vurdert av dissecting mikroskopi (5.1.1, kategorien 3) foredler evalueringen av forverring polaritet fenotypen som er undersøkt her. Men en rekke andre fenotyper eller parametere kan være scoret, f.eks antall blemmer, tilstedeværelse/fravær eller antall subcellular komponenter som co lokalisere, fluorescens intensitet (sistnevnte kvantifisert ved ImageJ, se følger papir på den excretory kanalen) ².
   2. Avhengig av omfanget av forventet forskjeller, kvantifisere fenotypiske markør (her ektopisk lumen) i ca 20 dyr i et to og tre eksemplarer eksperimenter under AC confocal mikroskop.
   3. Gjenta for 3 uavhengige sett av eksperimenter. Generere stolpediagrammer og vurdere betydningen av resultater.

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan molecularly analysere og visualisere polarisert membran biogenesis og lumen morphogenesis i C. elegans tarmen, enkelt celle og subcellular nivå. Tyve-celle ett lag C. elegans tarmen er dannet av regissert celledeling og migrasjon ved midten av embryogenesis. På denne tid, polariserte membranen domener etablert, men de novo polarisert membran biogenesis fortsetter i den eldre men utvide epitel gjennom fire larver stadier til voksen alder, slik at å fokusere analyse på polarisert membran biogenesis (figur 1A).

For å visualisere C. elegans mobilnettet og subcellular komponenter, brukes vanligvis to strategier: immunofluorescence (beskrevet i denne protokollen, del 1. Figur 2 , Figur 4 d -F) og uttrykk for fluorescens fusion proteiner (detaljert i tilhørende papir på excretory kanalen polarisert membran biogenesis²; Figur 1B, figur 2, Figur 4, figur 5C). Dobbeltrom og flere merking, kombinere ulike etiketter av hver eller begge metoder, kan løse membran asymmetrier som apikale og basolateral membran domener og for forskjellige subcellular komponenter til hverandre (figur 2, Figur 4 d-E). Membranen-cytoskjelett linker ERM-1::GFP vises her som en indikator på apikale membran biogenesis sammenfaller med lumen morphogenesis i dette ett lag epitel. Ved hjelp av denne indikatoren, en rekke intestinal apikale membran/lumen biogenesis feil og sine forårsaker gen mangler kan identifiseres ved tap av funksjon studier, for eksempel av upartiske genomet hele skjermer bruker RNAi (RNAi tilnærminger vedtatt å den generasjon av slike fenotyper er beskrevet i del 2 av denne protokollen). Figur 3 og Figur 4 viser eksempler på lav til moderat forstørrelse bilder av apikale membran/lumen biogenesis fenotyper kjøpt av dissecting fluorescens mikroskop utstyrt med en høy makt-målsetting; og av høyere forstørrelse bilder av en AC confocal laser skanning mikroskopet (disse mikroskopiske tilnærminger er beskrevet i avsnitt 3 og 4). Som et eksempel på kvantifisere polarisert membran biogenesis defekter, effekten av RNAi med La-767 (koding en steroid dehydrogenase/3-ketoacyl-CoA-reduktase) og aps-1 (koding sigma delenhet i clathrin AP-1 adapter) på ERM-1::GFP lokalisering og lumen posisjonering er vist i figur 5.

Figur 1 : Mobilnettet og subcellular struktur og morphogenesis av vill-type C. elegans tarmen. (A) Skjematisk av C. elegans intestinal utvikling, mobilnettet komposisjon, og endo- og plasma membraner. C. elegans tarmen genereres clonally fra E-blastomere født på 8-cellers scenen. Etter fire runder av cellen divisjon, dens 16 celler (E16 scenen) form en radially symmetrisk doblet lag epitel¹⁵. På dette stadiet cytoplasm i hver celle polarizes, med kjerner flytte til fremtidige apikale og cytoplasmatiske komponentene går mot motsatt (fremtidige basale), membran domener. Innskudd samtidig flytte venstre og høyre ventrale celler (parallelt) til dorsal celle laget til bilateralt symmetrisk tube 9 INT ringer. Hver celle ansikter og bygger lumen med sine apikale/lumenal membran (grønn, strukturelt atskilt av bestemte membran microdomains, microvilli) og kontakter omkringliggende celler og kroppens hulrom med sin basolateral membraner (blå), unntatt først INT ring som er dannet av fire celler. Apikale veikryss (rød) skille apikale og basolateral membran domener. Etter innskudd fortsetter de novo membran biogenesis med veksten av tarmen sent embryogenesis og de fire larver stadiene i voksen, der minimalt videre vekst skjer (fase polarisert membran vedlikehold ). Forstørret enkelt cellen angir endomembrane systemet ER og Golgi over kjernen (N) og endosomal blemmer. (B) DIC/Nomarski og AC confocal overlapper micrographs i utviklingsland C. elegans tarmen merket med apikale membran-cytoskjelett markøren ERM-1::GFP. Tarmen på komma scenen, omgitt av en hvit strek (ERM-1::GFP er allerede svakt uttrykt på apikale membranen i begynnelsen av innskudd, men kan ikke skrives i dette bildet). Dyrene ned her og nedenfor er vist med fremre (leder) venstre, bakre (halen) rett, dorsal opp, ventrale. Skala bar: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Eksempler på dobbel og trippel merking av utvikle vill-type C. elegans intestine bruke antistoffer og fusion proteiner. (A, B) Embryo. (A) Comma scenen. PAR-6::GFP (grønn, komponent apikale PAR polariteten komplekse), anti-PAR-3 antistoff (rød/TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate), en annen del av apikale PAR polariteten komplekse) og MH33 (blå/Cy5 (Cyanine5), anti-IFB-2/middels filament). PAR-6::GFP og PAR-3 antistoffer plateselskapet apikale membran av C. elegans tarmen (klammen). Ledige og opptatte tidspunkt-2, en annen apikale markør ved senere stadier, er panmembraneously lokalisert på dette tidlige stadiet. PAR-6::GFP og anti-PAR-3 også merke pharynx (venstre); den intestinal lumen angis av deres overlapper med IFB-2 (turkis) og intestinal røret markeres med blå anti-IFB-2 (høyre). (B) 2-fold scenen. AJM-1::GFP (grønn, krysset komponent), ICB4 antistoff (rød/Alexa, ICB4 oppdager et ukjent membraneous intestinal antigen). AJM-1::GFP etiketter de apikale knutepunktene i C. elegans tarmen, synlig som peri-lumenal stige mønster (det også merker hypodermal veikryss, ikke synlig siden bildet er fokusert på tarmen, se Seksjon 4, AC confocal imaging). ICB4 flekker alle membraner av C. elegans tarmen. Piler peker til basolateral membraner farget av anti-ICB4. (C, D) L2 larver. (C) la-413::GFP (grønn), phalloidin (rød/Texas-rød, en phallotoxin binding til F-utgangen) og MH33 (blå/Cyanine5, anti-IFB-2). La-413/Frihånd er en komponent av basale polariteten komplekse og regionaliserer å basolateral membraner av C. elegans tarmen (klammen). Phalloidin og IFB-2 antistoffer plateselskapet apikale submembraneous cytoskeleton av C. elegans tarmen (lilla). Phalloidin flekker også sterkt kroppen veggen muskler, overveldende den intestinal flekker. Innfelt viser høyere forstørrelsen av innrammet område. (E) L3 larve. SLCF-1::GFP (grønn, integrert membrane komponent/sukker transporter), ERM-1::mCherry (rød) og MH27 antistoff (blå/Cyanine5, anti-AJM-1). SLCF-1::GFP etiketter basolateral membran, mens ERM-1::mCherry etiketter apikale membran av C. elegans tarmen (klammen); AJM-1 etiketter sine apikale veikryss. (F-F''') L2 larve. (F, F') Én fargebilder. SLCF-1::GFP (grønn) merker basolateral membranen (lateral membraner angitt av tynne hvite piler). MH27 (blå/Cyanine5) etiketter apikale veikryss (kort gule piler). (F"F''') Overleggsbilder med og uten utgangen. Insets viser høyere forstørrelsen av boksområdene. Merk klart skille for apicolateral vinkel intestinal celleområde ved disse forskjellige membran/krysset som overfladisk ligner i én fargebilder (F, F'). Tykke hvite pilene i F'''Velg apikale/lumenal utgangen cytoskeleton merket av phalloidin (ellers overveldet av muskel utgangen). Alle bilder er AC confocal anslag (z-stabler på 0,2 µm), kjøpt av sekvensiell skanning for å unngå gjennomslag mellom kanaler. Skalere barer (for AE, F-F'' ' og alle insets): 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : Eksempler på C. elegans intestinal polarisert membran og lumen morphogenesis mangler på lav til moderat forstørrelse (dissekere fluorescens micrographs). Alle bilder er kjøpt av dissecting fluorescerende mikroskop utstyrt med et skreddersydd høyeffekts stereo fluorescens vedlegg (Tabell for materiale). Ulike forstørrelser vises. Alle fenotyper ble innhentet av RNAi med ulike gener i en belastning merket med ERM-1::GFP (lokalisert på tarmen og excretory kanalen apikale/lumenal membraner på embryonale og tidlig larver stadier, vist her). Av intestinal lumen og polaritet fenotyper er: (A, B) Wild type embryo (A) og Larven (B); (C, D) basolateral forskyvning av ERM-1::GFP; intestinal celler blir forstørret og vises oppsvulmet i denne embryo (C, piler peker til intestinal enkeltceller), men er vill-type størrelse og arrangement i disse Larvene (D, pilen peker mot lateral membraner mellom INT II og III); (E) utvidet og convoluted lumen i tre embryoer; (F) ERM-1::GFP utvide i laterale krysset området (sikksakk lumen) og i intestinal cytoplasma som inneholder GFP-negativ vacuoles (piler); (G) lumenal cyster innimellom intralumenal adhesjon (piler peker til to cyster). (H) Cytoplasmic og basolateral ERM-1::GFP forskyvning med ektopisk lumen (piler); (jeg) ERM-1::GFP bevegelse til GFP-positive puncta (piler) i cytoplasma. Excretory kanaler og excretory kanalen fenotyper er ikke beskrevet her (kanalen vises til venstre, tarmen til høyre i alle bildene). Skalere barer: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 : Eksempler på C. elegans intestinal polarisert membran og lumen morphogenesis-feil ved høyere forstørrelse (AC confocal bilder). (A, C, E, G, I, K) Embryo. (B, D, F, H, J, L) Larvene. Alle fenotyper ble innhentet av RNAi med ulike gener i en belastning merket med ERM-1::GFP (grønn i alle bildene). Imaging er fokusert på tarmen. Bilder av embryo også vise excretory kanaler (venstre side av bildet), inkludert kanalen fenotyper (ikke beskrevet). (A, B) Wild type embryo (A) og Larven (B). (C) Basolateral forskyvning av apikale ERM-1::GFP (komma scenen, sent innskudd). (D) polaritet konvertering: basolateral forskyvning av apikale ERM-1::GFP og apikale akkumulering av basolateral ICB4, avslørt av dobbel merking. F-utgangen (merket av phalloidin-TRITC) skisserer dyrene av flekker langsgående muskel bunter (dyr er trippel merket). (E) Basolateral forskyvning av ERM-1::GFP i sent 3-fold fosteret. Det apikale IFB-2 antistoffet (blå/Cyanine5) angir intakt lumen og peri-lumenal intermediære filamenter. (F) ektopisk lumen merket av anti-IFB-2 (blå/Cyanine5). (G) ERM-1::GFP negativ vacuoles i intestinal cytoplasma. (H) ERM-1::GFP positive vacuoles i intestinal cytoplasma. (Jeg, J) Fravær av lumen i fosteret og larver, henholdsvis. (K) bredt gut. (L) cystisk og convoluted gut. (A, D, H, I, J, K, L) er AC confocal anslag. (B, C, E, F) er AC confocal deler. Lysstyrke økt G å markere cytoplasmatiske GFP-negativ vacuoles. Skalere barer: 10 µm (samme for alle embryoer og larvene, henholdsvis). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5 : Intestinal polaritet konvertering og hjemfall: et eksempel for kvantifisering av polarisert membran og lumen biogenesis defekter. (A, B, C) La-767og aps-1RNAi både føre ERM-1::GFP basolateral forskyvning (BL) og ektopisk lumen dannelse (EL), men på forskjellige utviklingsstadier. (A) kvantifisering av dissecting mikroskop: telling av embryo (venstre) og larver (høyre) med polaritet fenotyper 2 dager etter seeding ormer på RNAi plater. Merk: alle mock og let-767(RNAi) dyr er klekket samtidig (dermed finnes det ingen embryoer, som hadde, men alle vill-type polaritet; ødelagt line kolonner). APS-1 RNAi induserer polaritet feil allerede i embryo, mens La-767RNAi induserer dem i larver. Den høyere prosentandelen av ektopisk lumen (vs basolateral forskyvning) i aps-1RNAi embryoer versus Larvene er arrestasjonen av embryo med ektopisk lumen. (B) kvantifisering av AC confocal mikroskopi: telling av ektopisk lumen per dyr i starten av ektopisk lumen utvikling i larver. La-767 RNAi induserer mer ektopisk lumen i Larvene enn aps-1RNAi (aps-1RNAi Larvene er "escapers" som har ikke arresTed som embryo). (C) AC Confocal bilder for vill-type larver og larver ERM-1::GFP basolateral forskyvning (BL) og ektopisk lumen (EL); skala bar: 5µm. (D, E) polaritet hjemfall i La-767RNAi dyr (teller dyr med og uten polaritet defekt [BL/EL] av dissecting mikroskopet). 20 let-767(RNAi) dyr med mild ektopisk lumen fenotyper ble overført fra en RNAi plate til en OP50 plate på dag 4 og evalueres etter 40 timer. (D) mer enn 50% Larvene har gått til vill-type polaritet (ERM-1 på apikale membranen). (E) 20% av dyr vokser opp utenfor L1 larvestadiet (let-767(RNAi) resultater i L1 arrestasjon). Alle dataene vises som betyr +/-SEM, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Eksempler på dataindikatorer for C. elegans larver og voksne intestinal membran systemet1.
Protein navn	Subcellular lokalisering	Protein struktur/funksjon	Kommersielt tilgjengelige C. elegans spesifikke antistoffer (DSHB2)	Eksempler på stammer tilgjengelig på CGC
VELGE-2/PEPT-1	apikale transmembrane protein	oligopeptide transporter		KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412):: GFP) + pha-1(+)])
AQP-4	apikale transmembrane protein	vannet kanalen
ERM-1	apikale brushborder	membranen-cytoskjelett koblingsfunksjonalitet	ERM1
ACT-5	apikale brushborder	cytoplasmatiske utgangen	(3)
LEDIGE OG OPPTATTE TIDSPUNKT-2	apikale brushborder	Derfor komponent	MH33
EPS-8	apikale brushborder	Human-epidermal-Growth-Factor-receptor-kinase-substrate-8 ortholog
PARI-6	apikale membran	apikale polaritet kompleks komponent
SLCF-1	basolateral transmembrane protein	monocarboxylate transporter
AQP-1	basolateral transmembrane protein	vannet kanalen
LA-413	basolateral membran	Frihånd homologue, adapter og polaritet determinant	LET413
HMP-1	apikale krysset (CCC4)	Α-catenin, cadherin-catenin kompleks komponent		FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1:: GFP + unc-119(+)])
HMR-1	apikale krysset (CCC)	E-cadherin, cadherin-catenin kompleks komponent	HMR1
AJM-1	apikale krysset (DAC5)	krysset integritet molekyl, DLG-1/AJM-1complex komponent	MH27	SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
DLG-1	apikale krysset (DAC)	Plater stor homologue, MAGUK proteiner, DLG-1/AJM-1complex komponent	DLG1
RAB-11	endosomal blemmer	menneskehandel6		RT311 (unc-119 (ed3) III, pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
RAB-5	endosomal blemmer	menneskehandel		RT327 (unc-119 (ed3) III, pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
RAB-7	endosomal blemmer	menneskehandel		RT476 (unc-119 (ed3) III, pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
RAB-10	endosomal blemmer	menneskehandel		RT525 (unc-119 (ed3) III, pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
MANS	Golgi	Α-mannosidase II		RT1315 (unc-119 (ed3) III, pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
1 Eksempler er valgt fra ressursene som er oppført i Tabell3.
2 Utviklingsmessige studier Hybridoma Bank.
3 Antistoffer mot virveldyr begrepsordbok cross-react.
4 CCC: cadherin-catenin komplekset; regionaliserer til den apikale delen av apikale krysset; tilsvarer adherens krysset (AJ).
5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; regionaliserer til den basale delen av apikale krysset; tilsvarer tett krysset (TJ).
6 For ekstra vesicle-assosiert molekyler i tarmen ser ref (22).
Merk: ikke alle molekyler har testet som fusion proteiner av antistoffer eller under egne arrangører.

Tabell 2 : Eksempler på C. elegans tarmen-spesifikke arrangører og tid uttrykksformer1.
Arrangører	Uttrykket scenen
Elt-2	uttrykket begynner under 2 E celle scenen og fortsetter inn i voksen alder
vha-6	begynner i slutten embryo og fortsetter inn i voksen alder
ges-1	begynner på omtrent 4E celle scenen og fortsetter inn i voksen alder
slutten-1	etter 1E celle scenen og synker under senere embryogenesis
1 Eksempler er valgt fra ressursene som er oppført i tabell 3.

Tabell 3: Ressurser for å finne C. elegans tarmen-spesifikke molekyler, merking reagenser/stammer og antistoffer.

1. Caenorhabditis genetikk Center (CGC)42 tilgjengelig reagenser og stammer

2. Wormbase43 informasjon om tarmen-spesifikke molekyler, stammer og antistoffer

3. informasjon

sjon om tarmen-spesifikke molekyler^20,44 4. Transgeneome nettstedet⁴⁵ for translasjonsforskning GFP fusion konstruksjoner 5. C. elegans uttrykk mønster⁴⁶ for transcriptional GFP fusion konstruksjoner 6. national BioResource Project (NBRP)::C.elegans⁴⁷ for informasjon om tarmen-spesifikke arrangører 7. utviklingsmessige studier Hybridoma Bank (DSHB)⁴⁸ for C. elegans antistoffer 8. for sekundær antistoffer og fargestoffer se referanse^27,28

Discussion

Denne protokollen beskriver hvordan kombinere standard genetisk tap-av-funksjon/RNAi og imaging (merking og mikroskopisk) tilnærminger for å utnytte C. elegans intestinal epitel som modell for den visuelle og molekylære Disseksjon av i vivo polarisert membran og lumen biogenesis.

Merking

Denne protokollen fokuserer på antistoff flekker. In situ merking av antistoffer er en svært spesifikke alternativ tilnærming til merking av fluorescerende fusion proteiner (beskrevet i den medfølgende på excretory kanalen membran biogenesis)². Selv om antistoff flekker ikke tillater live bildebehandling, kan det gi bekreftelse lokalisering av et protein av interesse (verken merking metoden er uten fail). Spørsmål om morphogenesis og/eller den subcellular lokaliseringen av et protein kan dessuten ofte vurderes i fast dyr. Immunostaining er nyttig for dobbel og flere merking og den kan kombineres med merking av fluorescerende fusion proteiner Hvis dette kan bevares gjennom nødvendige fiksering og permeabilization prosedyrer. Her skissert protokollen tillater vanligvis denne (figur 2). In situ merking av fast dyr av antistoffer eller kjemiske flekker kan også gi fordeler for superresolution mikroskopiske teknikker som STORM (Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi). Immunofluorescence oppdager endogene antigen, og kan tilpasses, for eksempel skille bestemt posttranslational protein modifikasjoner. Det kan få raske resultater hvis antistoffer er tilgjengelig, en gang i situ flekker teknikker - ikke så enkel i C. elegans eksemplarer i cellekultur - har blitt etablert.

Generering av en ny antistoff (ikke beskrevet her) er imidlertid tidkrevende. Dessverre, valg av kommersielt tilgjengelig C. elegans primære antistoffer er fortsatt ganske liten, og ikke alle er kjøpedyktig merker antigen i situ (se tabell 1 for eksempler av antistoffer viste til oppdage intestinal antigener i situog tabell 3 tilleggsressurser). De fleste antistoffer generert mot virveldyr antigener vil ikke cross-react med deres C. elegans homologs. Valg av sekundær antistoffer må ta hensyn arten av det første antistoffet (omtalt i de generelle immunofluorescence protokoller^27,28). Store valg er kommersielt tilgjengelig med kontinuerlig forbedre fluorescerende fargestoffer (f.eks Alexa-Fluor fargestoffer). For optimalisert flekker, fargestoffer kan bli valgt for sin evne til å matche mikroskopet brukes til bildebehandling, f.eks laser av AC confocal mikroskop, eller hvis super-oppløsning mikroskopi er også planlagt, for sin evne til å "blinke"³⁷. Direkte merket primære antistoffer eller kjemiske flekker (f.eks fluorescently merket phalloidin) er også tilgjengelig og er spesielt nyttig for dobbel flekker.

Vanskeligheten for i situ antistoff farging i C. elegans er ugjennomtrengelig for fosterets egg skall og larver/voksen cuticle at begge krever kjemiske og/eller mekanisk avbrudd tillate tilgang av antistoffer til vev. Selv om komplekse flytende antistoff flekker protokollene er utviklet for å overvinne dette problemet^27,28, har de fleste collagenase for permeabilization, som pleier å skade vevet. I kontrast, er fryse-sprekk metoden beskrevet her en enkel måte å åpne ormen neglebåndene eller eggshells. Det utføres direkte på glasset Skyv der de er samlet (og der resten av den flekker er også utført) og fungerer spesielt godt for egg og larver som stikker best på glass lysbilder (i.e. stadier undersøkte hovedsakelig i tubulogenesis studier). Det også forstyrrer ikke bevaring av fluorophore-merket fusion proteiner. Teknikken krever litt fingerferdighet, riktig trykk på dekkglassvæske (før flicking) og unngå skjær press er kritiske for å bevare prøven (som er skånsom og pipettering under hele flekker prosedyren).

Fiksering betingelser må være empirisk bestemt og justert for struktur/antigen som skal bli farget (drøftet i²⁷). Mildere (f.eks formaldehyd-basert) fiksering teknikker kan bedre bevare antigenicity, men dette må være balansert med behovet for å opprettholde vev morfologi, kritisk for analyse av morphogenesis. Mildere fiksering forhold også bidra til å bevare fluorescerende fusion proteiner i dobbel merking eksperimenter. Tilsvarende krever mengden blokkerer agent (f.eks melk eller storfe serum albumin/BSA) og vaskemiddel i vaskeløsning empirisk justering å balansere bakgrunn med spesifikk farging. Detaljer om generelle aspektene ved immunofluorescence teknikker, f.eks diskusjon av ulike flekker teknikker, design av egnede kontroller og tips for å optimalisere disse prosedyrene for ormen tarmen (f.eks minimere intestinal autofluorescence) finner generelt og C. elegans bestemte immunofluorescence protokoller, som refererte gjennom.

Interferens med gen funksjon og evaluering av tubulogenesis fenotyper

Denne protokollen fremhever bestemte RNAi tilnærminger som er nyttig når du vurderer gener med tidlig og allestedsnærværende og avgjørende funksjoner, som delvis (i stedet for fullstendige) tap er mest informative, som er tilfelle for de fleste tubulogenesis gener (vår genomet hele skjermen på ERM-1::GFP-merket tarmen foreslo at forstyrrelser med slike gener årsaker > 90% av alle informativ tubulogenesis fenotyper i denne bestemt innstilling¹²). De mange fordelene som C. elegans tilbyr for genetisk manipulasjon (f.eks sin korte generasjonstid) og de ulike tilnærmingene til å forurolige gen funksjon av fremover (starter med funksjonen/fenotypen) og reversere (starter med den Gen) genetiske metoder diskuteres i generelt C. elegans litteratur^31,38. Tilgjengeligheten av kommersielt tilgjengelig genomet hele RNAi fôring biblioteker også gjør det mulig å bruke denne omvendt genetisk teknikken som frem genetisk screening verktøyet (se Tabell for materiale for ressurser). De spesifikke fordelene av RNAi for analyse av tubulogenesis inkluderer evnen: generere en rekke fenotyper tilsvarer en mutant allel serie (dette vanligvis fungerer godt for doseavhengig morphogenesis gener); fjerne mors RNAs (vanligvis involvert i tidlig morphogenesis/tubulogenesis); å forstyrre scene-spesielt (nyttig for å vurdere effekten på polarisert membran biogenesis under postmitotic larver vekst).

Detaljer om generelle aspektene ved RNAi prosedyrer er omtalt i refs (^26,s = "xref" > 31). Nøkkelen for analyse av dødelige tubulogenesis fenotyper er muligheten til å modulate RNAi forhold til å øke spekteret av fenotyper. Informativ tubulogenesis fenotyper kan vanligvis genereres i en vill-type bakgrunn uten behov for tarmen-spesifikke RNAi stammer³⁹. Men slike stammer er tilgjengelig hvis dette mislykkes, og kan også brukes til å skille celle autonome fra ikke autonome effekter. Fremgangsmåter for modulerende styrken på RNAi er rapportert, f.eks Serine IPTG konsentrasjoner for induksjon av dsRNA, en tilnærming som kan produsere mest reproduserbar resultater³⁰. Kvantitativt nøyaktig titrering er imidlertid ikke være nødvendig når sikter til å generere et spekter av Norge. Samlet suksessen til denne analysen er ikke så mye avhengig maksimere RNAi effekten som på bestemme RNAi forhold som genererer en informativ spekteret av fenotyper (som ofte kan være et resultat av suboptimal (f.eks mildere) RNAi betingelser).

For visuell vurdering av tubulogenesis fenotyper indusert av RNAi er det viktig å bestemme optimale vinduet for fenotypiske evaluering. Det er best å starte vurderer platene tidlig (f.eks to dager etter plukke av dyr til sine RNAi plater under standard RNAi forhold) og følge dem lenge nok for mulig sent effekter. Utviklingsmessige tid kurs forverring polaritet kunden, for eksempel skal dekke 3-7 dager vanligvis arrestert larver. Vilkårene for analyse av polarisert membran biogenesis i postmitotic ikke-delte cellene i larver tarmen kan forbedres ytterligere, når du bruker mutanter eller RNAi dyr med redusert vekst (som, for eksempel let-767(RNAi) eller mutant dyr ¹², figur 5). Noen gang løpet har blir avbrutt hvis F2 dyr vises (kan fjerne L4s eksperimenter der de fleste, men ikke alle dyr arrestere Larvene). Hvert eksperiment krever samtidig evaluering av aktuelle positive og negative kontroller (f.eks bakteriell RNAi kloner som induserer en definert tubulogenesis fenotypen og tomme vektor eller kryptert RNAi kloner, henholdsvis). En annen forutsetning for evaluering er en tilstrekkelig Foreldreomsorg og yngelens størrelse (minst 50). Hvis ikke oppfylles, kan andre (f.eks kondisjonalis) RNAi forhold bli forsøkt. Endelig noen spesielt interessant tubulogenesis fenotyper oppstår ved lav penetrance, dermed et tilstrekkelig antall dyr må evalueres.

Mikroskopi

Lav til moderat forstørrelse dissekere fluorescerende mikroskopi og forstørring AC confocal mikroskopi, to standard tenkelig prosedyrene som er beskrevet her, er vanligvis tilstrekkelig som karakteriserer de grunnleggende aspektene av et rør eller lumen fenotypen i den C.elegans tarmen og kan også brukes til visuelt skjermen større sett med dyr i fremover skjermer. Dissekere fluorescens mikroskopi tillater: i vivo avbilding av dyr på sine plater (men levende dyr, transiently immobilisert av anestesi, kan også gjenopprettes fra monterer etter AC confocal eller DIC imaging); screening stort sett dyr. sporing utviklingsmessige hendelser (f.eks forskyvning og utskifting av en polarisert markør under membranen utvidelse); sporing av spesifikke uttrykk mønstre (noen mønstre og asymmetrier bedre kjennetegnes ved lavere forstørrelse); valg og plukke fluorescerende ormer passer for videre analyse (f.eks AC confocal mikroskopi) eller vedlikehold av extrachromosomal effekter av transgener. Visualisering på forstørring av AC confocal mikroskopi tillater for å karakterisere fenotypen enkelt celle og subcellular nivå. Denne protokollen beskriver bildebehandling med en laserskanning AC confocal mikroskop som tilbyr den beste confocality over alternativer som en roterende plate AC confocal mikroskop. En roterende plate AC confocal mikroskop er imidlertid mikroskopet valgfrihet for dynamisk og time-lapse studier siden medfører mindre Phototoksisitet (se refs (^34,35) for nærmere omtale av lav og høy forstørrelse mikroskopi i C. elegans). Romanen som konvensjonelle mikroskopiske teknikker har noen ekstra fordeler og tillate bildebehandling med høyere oppløsning i nanoskala rekkevidde (f.eks transmission elektron og super-oppløsning mikroskopi, omtalt i^{37, 40}).

Når imaging C. elegans tarmen under AC confocal mikroskop, er montering og immobiliseringsløsninger avgjørende. Blant ulike kjemikalier til immobilisering, Natriumazid - selv om giftig - fungerer mest pålitelig hvis skanning er gjort umiddelbart. Levamisole, produserer selv om det er ikke giftig, hypercontraction som noen ganger griper inn i evalueringen av morphogenesis fenotyper. Noen bedøvelse kan forstyrre membran-assosiert fluorescerende proteiner og kan produsere gjenstander som kanskje ligne polaritet defekter. C. elegans er en tykk prøven og dermed 3D Analyser (snitting) er avgjørende for å dra nytte av bestemte styrke rørformede intestinal epitel som gir utmerket visualisering av apikale veikryss og lateral membranen (ikke lett tilgjengelig i flat epithelia). AC confocal innstillinger må justeres for hvert lysbilde og målet å få bilder med god kvalitet, inkludert parametere som bracketing, gjennomsnitt, laser makt, gevinst, pinhole og lysstyrke. Et bestemt problem av intestinal imaging er denne organ innholdet i grønne/gule autofluorescent granulater (lysosome relatert organeller (LROs)) som kan forstyrre tolkning av resultatene, spesielt når du vurderer forskyvning av GFP-merket endo og plasma membranen tilknyttede komponenter. Problemet er godt anerkjent i feltet og kan håndteres av ulike tilnærminger (avhengig av mikroskopet), inkludert DAPI utelukkelse spectral fingeravtrykk og empirisk skanner innstillingene^13,41.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody staining
poly-L-lysine	Sigma	P5899
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Acetone	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Powdered milk	Sigma	MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse)			Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse)			Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit)			Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit)			Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit)	ABCam	AB175471	Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse)	Life technologies	A10524	Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit)	Invitrogen	T2769	Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse)	Sigma	F9006	Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin			Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	335148
Microscope slides	Fisher Scientific	4448
Microscope coverslips (22x22-1)	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans related			see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates			see reference29 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
Ampicillin	Sigma	A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	BP912
M9 Medium			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO4	Sigma	M2773
NGM plates			see reference29 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi plates			see reference30 for protocols.
NaCl	Sigma	S7653
Peptone	BD Biosciences	211677
Tryptone	Acros Organics	611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	214040
MgSO4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
Cholesterol	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)	Source BioScience
Imaging related
Sodium azide	Fisher Scientific	BP9221-500
Equipment
dissecting microscope	Nikon	SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions)	Olympus	SZX12
Laser-scanning confocal microscope	Leica Microsystem	TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope	Nikon	C2