Summary
Uma plataforma de biosensor microfluidic foi projetada e fabricado usando a tecnologia de fotorresiste de película seca de baixo custo para a quantificação rápida e sensível de vários analitos. Este sistema de uso único permite a leitura eletroquímica de ensaios de enzima-lig na-microplaqueta-imobilizado mediante a técnica de stop-fluxo.
Abstract
Nos últimos anos, o diagnóstico de biomarcador tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico de doenças humanas, especialmente para o diagnóstico point-of-care. Uma plataforma fácil de usar e de baixo custo sensor é altamente desejada para medir vários tipos de analitos (por exemplo, biomarcadores, hormônios e drogas) quantitativamente e especificamente. Por esta razão, tecnologia de película seca fotorresiste - permitindo barato, fabricação fácil e elevado-throughput - foi usada para fabricar o biosensor microfluidic aqui apresentado. Dependendo o bioensaio usado depois disso, a plataforma versátil é capaz de detectar vários tipos de biomoléculas. Para a fabricação do dispositivo, eléctrodos de platina são estruturados em uma folha de poliimida flexível (PI) na etapa de processo de sala limpa apenas. A folha PI serve como substrato para os eletrodos, que são isolados com uma fotorresiste baseada em epóxi. O canal microfluídicos é posteriormente gerado pelo desenvolvimento e laminação de folhas de fotorresiste (DFR) de película seca para a bolacha de PI. Usando uma barreira hidrofóbica parar no canal, o canal é separado em duas áreas específicas: uma seção de imobilização para o ensaio enzima-lig e uma célula eletroquímica de medição para a leitura de sinal amperométrico.
A imobilização de bioensaio em-microplaqueta é executada por adsorção das biomoléculas para a superfície do canal. Enzima glicose oxidase é usada como um transdutor para geração de sinal eletroquímico. Na presença do substrato, glicose, peróxido de hidrogênio é produzido, que é detectada ao eléctrodo de platina trabalho. A técnica de stop-fluxo é aplicada para obter amplificação de sinal junto com detecção rápida. Biomoléculas diferentes podem ser medidas quantitativamente por meio do sistema introduzido microfluídicos, dando uma indicação dos diferentes tipos de doenças, ou, em relação a drogas terapêuticas, monitoramento, facilitando uma terapia personalizada.
Introduction
Nas últimas duas décadas, aplicações diagnósticas tornaram-se fundamental para estudos aprofundados sobre o desenvolvimento da saúde pública global. Tradicionalmente, ferramentas de diagnóstico de laboratório são utilizadas para a detecção de doenças. Mesmo que eles ainda desempenham um papel chave no diagnóstico de doenças, teste point-of-care (bolso) executada perto do paciente ou pelo próprio paciente tornou-se mais e mais comuns nos últimos anos. Especialmente em tais casos que requerem tratamento imediato, tais como infarto agudo do miocárdio ou monitoramento de diabetes, a confirmação rápida de uma constatação clínica é essencial. Portanto, há uma necessidade crescente de dispositivos de bolso que pode ser operado por não-especialistas e que são simultaneamente capaz de realizar testes diagnósticos precisos em vitro em um curto espaço de tempo,1,2,3,4 .
Melhorias notáveis já foram alcançadas no domínio do bolso. No entanto, ainda existem muitos desafios a superar,5,6,7,8. Para uma plataforma de bolso para ser lançado com sucesso no mercado e ser competitivo com o diagnóstico de laboratório, o dispositivo estritamente deve cumprir os seguintes requisitos: (i) fornecer resultados de testes precisos e quantitativos que são consistentes com o laboratório conclusões; (ii) ter curto amostra para o resultado vezes, permitindo o tratamento imediato do paciente; (iii) apresentam descomplicado e fácil manuseio, mesmo quando operado por pessoas inexperientes e requer a intervenção do usuário minimizado; e (iv) são compostos por uma unidade de sensor de baixo custo projetada para aplicações de uso único. Além disso, livre de equipamentos diagnósticos são favoráveis, principalmente em ambientes de poucos recursos,3,4,6.
Devido a estas exigências severas, apenas dois sistemas de bolso, baseados na deteção de eletroquímica (por exemplo, sangue teste tiras de glicose) e em imunoensaios de fluxo lateral (por exemplo, testes de gravidez) tem sido lançados com sucesso ao mercado tão até agora. No entanto, ambos os sistemas sofrem desvantagens como mau desempenho (ou seja, sangue glicose monitoramento tem resultados imprecisos e ensaios de fluxo lateral apenas fornecem resultados qualitativos (positivo ou negativo) medição)4, 6. Estas desvantagens dos sistemas convencionais de bolso têm levado a uma crescente demanda em explorar novas tecnologias que oferecem deteção rápida, baixo custo e quantitativa no ponto de cuidado4,5.
Para enfrentar estes desafios frente para dispositivos de bolso, DFR tecnologia tem sido recentemente empregada para a fabricação de biosensores descartável e de baixo custo9,10,11,12, 13 , 14. em comparação com materiais litográficas moles e líquidos, tais como PDMS ou SU-8, DFRs apresentam muitos benefícios: (i) estão disponíveis em uma variedade de composições e espessuras (a partir de alguns mícrons a vários milímetros); (ii) tem uma área de superfície muito áspera, o que facilita a adesão de vários materiais; (iii) uniformidade de espessura excelente recurso; (iv) oferecer fabricação barata, fácil e alta produtividade para a produção em massa; (v) são fáceis de cortar com várias ferramentas de baixo custo, como um simples par de tesouras; e (vi) permitem a criação de estruturas tridimensionais, tais como canais microfluídicos, empilhando camadas múltiplas de DFR em cima do outro.
Por outro lado, DFRs em geral têm uma resolução relativamente pobre em comparação com photoresists líquido, que é causada principalmente pela espessura do filme e pela maior distância entre a máscara e o DFR devido a película protectora, que além disso permite que a luz dispersão. Ainda, para a fabricação de biosensores microfluidic integrado, DFRs são altamente adequados para produção em massa de baixo custo.
Portanto, nós apresentamos neste trabalho a fabricação e aplicação de um biossensor microfluidic eletroquímica DFR-baseado. O protocolo detalhado descreve cada etapa de produção da plataforma de biosensor, a imobilização em-microplaqueta de um ensaio de modelo baseado em DNA e sua leitura eletroquímica, usando a técnica de stop-fluxo. Esta plataforma universal permite a detecção de vários tipos de biomoléculas, usando tecnologias de ensaio diferentes (por exemplo, genómica, cellomics e proteômica) ou formatos de ensaio (por exemplo, do competidor, sanduíche ou direta). Com base em tal uma plataforma DFR, nosso grupo anteriormente demonstrou com sucesso a quantificação rápida e sensível de vários analitos, incluindo antibióticos13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e ß-lactâmicos), troponina17e substância P18.
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Protocol
1. fabricação da tecnologia de DFR Microfluidic Biosensor usando
- bolachas de preparação da PI.
Substrato de corte um PI
- em 6 - em rodada bolachas. Colocar a bolacha de PI em um forno a 120 ° C por cerca de 1h para assar uma desidratação.
- Primeiro passo de fotolitos para o processo de decolagem.
- Programar a rotação-aplicador para um tempo de 30-s giro a 3.000 rpm, com uma aceleração de 2.000 rpm/s. lugar a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 2 mL de uma resist, permitindo que o processo de decolagem e iniciar o programa de centrifugação-aplicador. Retire a bolacha o spin-revestidor e macio-asse a bolacha de PI sobre uma chapa quente durante 2 minutos a 100 ° C.
- Ajustar a máscara desejada para padronização dos eléctrodos sobre a bolacha de PI a olho nu e expô-lo à luz de 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Lugar a hóstia em uma tigela cheia de um desenvolvedor de correspondência de resistir em um agitador orbital e deixá-lo agite ligeiramente durante 1 min.
- Após a resistir em excesso é removido, usar um chuveiro para enxaguar o wafer de PI com água deionizada (DI-água) num banco molhado e seque-o depois com ar comprimido.
- Deposição de platina para a formação dos eléctrodos.
- Use um processo de deposição de vapor físico padrão para depósito de 200 nm de platina para a bolacha 19.
- Coloque a bolacha em uma tigela. Adicionar o removedor correspondente para a tigela e retire o resistir de decolagem agitando ligeiramente a bolacha em um agitador orbital até todos platina em excesso é removida. Lave e seque a bolacha de PI, conforme descrito na etapa 1.2.3.
- Segunda etapa de fotolitografia: formando a camada de isolamento.
- Colocar a bolacha de PI em um forno pré-aquecido a 120 ° C por 5 min desidratar lo
- Programa a primeira etapa de um giro-aplicador para 5 s de girando tempo a 500 rpm. Programa da segunda etapa por 30 s a 4.000 rpm, com uma aceleração de 700 rpm/s.
- Coloque a bolacha de PI sobre o spin-revestidor e corrigi-lo, a aplicação de um vácuo. Dispense a 4 mL de um apropriado com base em epóxi fotorresiste antes de iniciar o programa de centrifugação-revestidor.
- Soft-asse a bolacha revestida por 3 min a 95 ° C, em uma chapa quente.
- Ajustar a máscara para a camada de isolamento sobre a bolacha usando as marcas de alinhamento respectivo e uma lente ocular. Expor o wafer de luz de 2 UV 100 mJ/cm (365 nm).
- Para um Asse pós-exposição, coloque a bolacha em um prato quente pré-aquecido por 2 min em 95 ° C.
- Coloque a bolacha numa tigela e desenvolver a resistir com um desenvolvedor apropriado (por exemplo, 1-metoxi-2-propil-acetat por 2 min, no caso do SU-8) em um agitador orbital.
- Enxaguar a bolacha PI primeiro com isopropanol e depois enxaguar e secá-lo, conforme descrito na etapa 1.2.3.
- Hard-Asse o fotorresiste em um forno para 3h a 150 ° C.
- Assistido por plasma limpeza dos eletrodos.
- Para remover os resíduos de fotorresiste, use o plasma de oxigênio com uma unidade de plasma padrão. Iniciar o programa de limpeza, usando energia de baixa frequência de 200 W com fluxo 100% O 2, uma taxa de 250 sccm e um tempo total de 3 min.
- Coloque a bolacha de PI para a câmara de plasma, corrigir a bolacha na placa aterrada usando tampas de vidro e iniciar o processo de plasma.
- Prata e deposição de cloreto de prata: criando o eléctrodo de referência em-microplaqueta.
Almofadas de
- Passivate o contato de platina de wafer com fita adesiva sensíveis ao UV. Corte a folha 5 mm de largura e 11 cm de comprimento de listras e anexá-los para o wafer, protegendo as partes a não ser depositado com prata.
- Para a deposição de prata, colocou um banho sônico (35 kHz) uma hotte e introduza um recipiente de solução eletrolítica de prata (Ag, pH 12,5 100 g/L) para o banho. Definir o sonic banho à temperatura ambiente e o poder de 10%.
Atenção: Soluções de eletrólitos prata são altamente tóxicas e devem ser manuseadas com extremo cuidado. A fumaça nunca deve ser inalada. - Ligar o contato em massa dos eléctrodos de referência a uma fonte de corrente constante. Conecte o eletrodo contador, um fio de prata que está imersa na solução de Prata eletrolítica, a fonte de corrente usando cabos de conexão padrão.
- Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de-4.5 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de prata de aproximadamente 0,3 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar durante 10 min. Enxágue a bolacha com DI-água
- Para a cloração do eletrodo de referência, introduza um recipiente de solução 0,1 M de cloreto de potássio (KCl) banho de sonic. Ligar o contacto em massa de wafer e um eletrodo de platina que está imersa na solução de KCl com fonte de corrente constante.
- Definir a fonte de corrente DC e uma densidade de corrente de +0.6 mA/cm 2, resultando em uma taxa de deposição de aproximadamente 0,075 µm/min. Prepare o banho sônico e deixe a fonte atual executar 7,5 min.
- Enxagúe e seque o PI da bolacha, conforme descrito na etapa 1.2.3.
- Remova a fita de UV-sensíveis após um UV (365 nm) exposição de 300 mJ/cm 2 e enxagúe e seque a bolacha de PI, novamente como descrito no passo 1.2.3.
- Terceira etapa de fotolitografia: DFRs usando para criar os canais microfluídicos.
- Corta as camadas DFR necessárias para um tamanho semelhante do wafer (20 x 20 cm 2). Corrigir a máscara desejada para a unidade de exposição e alinhar a camada DFR para a máscara usando a olho nu. Iluminar a resistir com 250 luz de mJ/cm 2 UV (365 nm).
- Remover a película protectora do fotorresiste e desenvolver a resistir por mais ou menos 2 min (dependendo das estruturas) em uma solução de carbonato de sódio (Na 2 CO 3) 1% usando um padrão banho sônico (35 kHz) pré-aquecido a 42 ° C e um poder sônico de 100%. Para parar a reação imediatamente, agite a resistir por 1 min em um banho de HCl 1% em um agitador orbital. Enxaguar e secar cada camada DFR, conforme descrito na etapa 1.2.3.
Nota: No total, quatro camadas DFR precisam ser processadas como mencionado na etapa 1.7: um canal camada, camada de cobertura de uma e duas camadas de traseiro (impedindo o biosensor de dobra no final).
- Camadas de laminação da DFR no substrato PI.
- Coloque a bolacha de PI em uma folha de aéreos de transparência e fixe-a com fita adesiva padrão. Ajustar a camada DFR canal sobre a bolacha PI sob um microscópio, usando as estruturas do respectivo alinhamento.
- Para a laminação, use um padrão quente rolo laminador e pré-aqueça o rolo superior a 100 ° C e o rolo inferior a 60 ° C. ajustar a pressão de 3 bar, com uma velocidade de 0,3 m/min. lugar a bolacha com a camada DFR fixa no meio do laminador e iniciá-lo; o DFR é empurrado através do Laminador. Repita a etapa após a bolacha de giro de 180°.
- Para evitar a dobra do biosensor, laminar as duas camadas de traseiro desenvolvidos sobre a bolacha seguindo passos 1.8.1-1.8.2.
- Empregando uma barreira hidrofóbica parando e selando o chip.
- Remover a camada protetora do lado da frente do canal DFR leigosEr, colocando fita adesiva padrão em uma extremidade da DFR e puxando para cima. Use um dispensador de mão com 0,004-em tubos para dispensar pequenas gotículas de politetrafluoroetileno dissolvido em poços da camada de isolamento. Para selar o chip microfluídicos, estratificação da camada de cobertura DFR para a camada de canal, conforme descrito na etapa 1.8.
- Rígido de cozer o biosensor microfluidic.
- Remover tudo protetora folhas na capa e parte traseira camadas DFR. Corte os biossensores em tiras usando um simples par de tesouras. Curar as fichas em um forno a 160 ° C por 3 h.
2. Procedimento de imobilização do ensaio no chip
- adsorção de avidina na área do canal de imobilização.
- Preparar uma solução de avidina 100 µ g/mL em 10 mM fosfato salino (PBS) a um pH de 7.4.
- Dispensar 2 µ l da solução para a entrada do biosensor avidina.
Nota: O canal é preenchido por forças capilares até que o líquido atinge a barreira hidrofóbica parar. - Para garantir que o fluídico continua parando na barreira durante o tempo de incubação inteira, dispensar 2 µ l de DI-água na saída do chip. Incubar o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado.
- Remover os reagentes em excesso através da entrada do chip pela aplicação de um vácuo. Lavar o canal com 50 µ l de tampão de lavagem (PBS com 0,05% Tween 20), dispensado na tomada enquanto o vácuo está sendo aplicado. Secar o canal por 30 s, enquanto que o vácuo está sendo aplicado.
- Bloqueando a superfície do canal para inibir a ligação inespecífica.
- Preparar uma solução de albumina de soro bovino (BSA) de 1% em PBS de 10mm a um pH de 7.4.
- Pipeta 2 µ l da solução de BSA de 1% sobre a entrada e 2 µ l de DI-água na saída do canal. Incube o chip a 25 ° C, durante 1 h em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.
- Oligos incubação do DNA marcados com biotina e 6-fam
- Preparar diferentes concentrações (0,001-5 µM) da solução de DNA em 10mm PBS a um pH de 7.4.
- Dispensar 2 µ l de uma concentração da solução de DNA na entrada e 2 µ l de DI-água na saída. Incubar o chip a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado.
- Repita o passo para as outras concentrações de DNA usando fichas adicionais biosensor 2.3.2.
- Remover os reagentes em excesso e secar o canal, conforme descrito na etapa 2.1.4.
- Imobilização de GOx-etiquetado anticorpos de 6-FAM.
- Formular uma concentração de 5 µ g/mL de anticorpos 6-FAM em 10mm PBS a um pH de 7.4.
- Introduzir 2 µ l da solução de anticorpo para a entrada e 2 µ l de DI-água para a saída do canal. Incube os anticorpos etiquetados a 25 ° C durante 15 minutos em um recipiente fechado. Remover os reagentes em excesso, conforme descrito na etapa 2.1.4.
3. Amperométrico sinal deteção usando a técnica de Stop-fluxo
- preparação da solução de substrato para a deteção de eletroquímica.
- Formular uma solução de glicose 40mm em PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.
- Para o tratamento preliminar, preparar uma solução de PBS 0,1 M em pH de 7,4 na água ultra-pura.
- Tratamento preliminar dos eléctrodos trabalho.
- Utilize o suporte de microplaqueta feitos sob medida para permitir a fácil colocação de chip e uma conexão elétrica e fluídico.
- Conectar eletricamente o biosensor para a potentiostat. Garantir o contato fluídico do canal microfluidic numa bomba e o reservatório de reagente, usando o adaptador feitos sob medida e tubos. Iniciar o laptop que está conectado para o potentiostat e iniciar o controlador de bomba de seringa, controlando o fluxo fluídico através do chip.
- Ligue a bomba de seringa manualmente, com PBS 0,1 M, com um caudal de 20 µ l/min. Para o eletrodo de trabalho contra o eletrodo de referência em-microplaqueta, aplicar tensão alternada de 0,8 e-0.05 V para 5 s cada 30 ciclos. Em seguida, oxidar o eletrodo de trabalho aplicando uma tensão de 0,8 V por 60 s.
- Leitura do ensaio, usando a técnica de stop-fluxo.
- Para iniciar a leitura do sinal de ensaio, aguarde até que o sinal medido atual estabiliza. Parar a bomba de seringa e alternar o reagente de PBS 0,1 M, para a solução de glicose 40mm e iniciar o software para o controlador de bomba de seringa; Ele irá parar automaticamente o fluxo de 1, 2 ou 5 minutos e então irá reiniciar o fluxo novamente. Observar o pico de corrente resultante.
Nota: Para a análise dos dados, o pico de corrente ou a carga de pico pode ser considerada, conforme descrito no modelo de uma leitura de sinal eletroquímico ( Figura 2).
- Para iniciar a leitura do sinal de ensaio, aguarde até que o sinal medido atual estabiliza. Parar a bomba de seringa e alternar o reagente de PBS 0,1 M, para a solução de glicose 40mm e iniciar o software para o controlador de bomba de seringa; Ele irá parar automaticamente o fluxo de 1, 2 ou 5 minutos e então irá reiniciar o fluxo novamente. Observar o pico de corrente resultante.
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Representative Results
Projeto e fabricação da plataforma Microfluidic Biosensor:
A fabricação dos chips microfluídicos biosensor é realizada no nível do bolacha por técnicas padrão fotolitográfica, empregando várias camadas DFR. Esta estratégia de fabricação depende da laminação de camadas desenvolvidas de DFRs sobre um substrato de PI platina-modelados, formando os canais microfluídicos. Um breve resumo descrevendo as etapas de fabricação diferentes é dada na Figura 1. Uma único 6 - em bolacha é composto por 130 microfluidic biosensores, cada um com uma dimensão de 8 × 10 mm2.
Figura 1. Ilustração gráfica, as etapas de fabricação diferentes da plataforma microfluidic biosensor. a) corte o PI substrato em 6 - em rodada bolachas. b) a exposição de uma decolagem de rotação-revestido possível resistir usando a respectiva máscara de Patrocínio platina. c) substrato após exposição, pós-exposição de volta e desenvolvendo o fotorresiste. d) depósito de vapor física de platina no substrato. e) processo de decolagem para remover o excesso fotorresiste. f) spin-revestimento de SU-8, formando uma camada de isolamento. g) O2 plasma processo para remover resíduos de SU-8 sobre os eletrodos de Pt. h) galvânica deposição do eletrodo de referência Ag/AgCl. i) exposição e desenvolvimento de diferentes camadas da DFR. j) laminação das camadas DFR para a bolacha de PI. politetrafluoroetileno dispensadora resolvido de k), formando uma barreira hidrofóbica parar entre o capilar de imobilização e a célula eletroquímica. l) biosensor microfluidic eletroquímica final. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Cada biosensor consiste de um microfluidic canal, separado em duas áreas distintas, por uma barreira hidrofóbica parar: uma seção de imobilização e uma célula eletroquímica, marcado em vermelho e azul, respectivamente, na Figura 2. A parte de imobilização do microchannel tem um volume de superfície de 10,34 mm2 e um volume de 580 nL, resultando em uma alta superfície-a relação do volume de 155 cm-1. A célula eletroquímica inclui um eletrodo de referência no chip prata/cloreto de prata e um contador e eletrodo de platina de trabalho. Esta separação da área de imobilização e a eletroquímica leitura do ensaio evita qualquer contaminação dos eletrodos com biomoléculas e, portanto, inibe a incrustação de eletrodo. Além disso, permite a medição precisa dos reagentes imobilização de enchimento capilar.
Figura 2. Ilustração do princípio do funcionamento da plataforma microfluidic eletroquímico. a) planta de um ensaio de modelo baseado no avidina. b) fotografia do biosensor microfluidic mostrando seus elementos principais, incluindo o contador elétrodo (CE), o eléctrodo de referência (RE), o trabalho (nós) e a barreira de paragem (SB). A área de imobilização é realçada em vermelho, e a célula eletroquímica é marcada em azul. c) esquemática reação de oxidação do peróxido de hidrogênio produzido no eletrodo de trabalho Pt para a deteção de amperométrico dentro da célula eletroquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Empregando o DFRs para a fabricação do sensor, o processo de fabricação permite alta produtividade em nível de bolacha. Portanto, os custos podem ser mantidos para baixo a um mínimo. O desenvolvimento de todas as camadas DFR é feito usando máscaras de folha simples e de baixo custo e uma unidade de exposição vácuo, ao invés de caro cromo máscaras e um alinhador de máscara. Além disso, a redução das etapas para um mínimo necessário processo de sala limpa corta os custos para a fabricação ainda mais. No total, o procedimento de fabricação leva uma carga de trabalho de cerca de 10 h, excluindo os tempos de cozimento e a deposição física de vapor da platina.
Ensaio de incubação no chip:
A incubação de ensaio em-microplaqueta é feita apenas por forças capilares. Por gotas de pipetagem de reagentes diferentes para a entrada do canal microfluídicos, os fluidos são conduzidos através do canal pela ação de capilaridade até atingir a barreira hidrofóbica parar. Sob condições de estado estacionário, os reagentes são depois incubados durante um tempo distinto. Este sistema passivo permite o enchimento capilar do canal, sem a necessidade de qualquer instrumentação externa como uma bomba de seringa e permite a precisão de medição dos reagentes, como o fluido automaticamente para na barreira de parar. Além disso, o fluxo de trabalho é consistente com aquela de um ELISA convencional e funciona com alta viscosidade líquidos como soro ou sangue.
Para efeitos desta experiência, a operação de microplaqueta é demonstrada por um ensaio de teste simples empregando a interação de avidina-biotina, como mostrado na Figura 2. O ensaio em-microplaqueta incubação começa com a adsorção da avidina à superfície capilar para 1 h, seguido por uma etapa de bloqueio com BSA para outro 1h. Posteriormente, 6-FAM/biotina-etiquetada do ADN é incubado no capilar por 15 min, onde se liga às moléculas avidina a imobilização. Entre cada etapa de incubação, qualquer desacopladas biomoléculas são removidas por uma etapa de lavagem. O tampão de lavagem é aplicado através da saída de canal usando um adaptador de vácuo sob medido. Na última etapa, glicose oxidase-rotulado antifluorescein os anticorpos são introduzidos para o canal por 15 min. Depois disso, o biosensor está pronto para a leitura da eletroquímica, utilizando uma solução de 40mm glicose como substrato.
Leitura de sinal amperométrico usando a técnica de Stop-fluxo:
Para a leitura do sinal do ensaio do imobilizado, o produto de enzimas (aqui, H2O2), produzido na presença de seu substrato, glicose, pode ser detectado eletroquimicamente com o eletrodo de trabalho na célula eletroquímica. Para atingir a deteção rápida juntamente com amplificação de sinal, a chamada técnica de paragem-fluxo é usado13. Neste método, o fluxo do substrato for interrompido, o que leva a um acúmulo do produto dentro do capilar. A quantidade de produzida H2O2 , portanto, depende da quantidade de limite glicose oxidase e depende a quantidade de limite biotinilado DNA. Reiniciando o fluxo, a maior concentração H2O2 é posteriormente liberada através da célula eletroquímica de medição, resultando em um sinal de pico atual, conforme ilustrado na Figura 3.
Para análise de dados, a técnica de stop-fluxo oferece dois parâmetros diferentes: a altura máxima e a carga (ou seja, a integral) do sinal de pico. Ambos os parâmetros são diretamente proporcionais ao tempo de paradae, portanto, pode ser usado para analisar os dados. Considerando a avaliação de dados, quando usando a altura, a altura do sinal depende a concentraçao de2 H2O e, assim, seu coeficiente de difusão e a hora aplicada. Quanto mais o tempo de parar, quanto maior a resposta do sinal medido. Por esta razão, a altura do pico milimétrico mantém-se constante, até um comprimento mínimo de capilar a imobilização. Esta característica especial da técnica stop-fluxo permite uma drástica redução nas dimensões de microplaqueta, particularmente no comprimento capilar, preservando a sensibilidade do sensor.
Figura 3. Modelo de uma leitura de sinal eletroquímico normalmente obtidos de um ensaio enzima-lig, usando a técnica de stop-fluxo. um) foi aplicado um fluxo de solução de 40mm glicose a uma taxa de 20 µ l/min. Durante a fase de parada (1, 2 ou 5 min), a produção de enzima de H2O2 continua. Reiniciando o fluxo, a acumulada H2O2 é liberado através da célula eletroquímica, onde o peróxido de hidrogênio é eletroquimicamente detectado. Repetindo a medição várias vezes (barras de erro; SEM), uma calibração em-microplaqueta curva b) é obtido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui apresentado para a fabricação de um biossensor electroquímico microfluidic permite o desenvolvimento de uma plataforma de baixo custo, compacto e fácil de usar para a detecção de biomoléculas. Dependendo o ensaio usado mais tarde no biosensor, vários biomarcadores diferentes podem ser detectados. Isto torna a plataforma muito versátil e fornece acesso aos vários domínios de aplicativos, de testes de diagnóstico padrão (por exemplo, determinar a presença de doenças específicas no consultório do médico) para aplicações de point-of-care (por exemplo, o monitoramento de drogas terapêuticas de um paciente para individualizado terapia medicamentosa). Especialmente em diagnóstico point-of-care, biosensores miniaturizados têm muitas vantagens sobre os métodos convencionais, que geralmente requerem equipamento extensivos, funcionários especializados e grande reagente e volumes de amostra e tem longa reviravolta vezes.
Fabricação deste biosensor requer estritamente seguindo o protocolo; caso contrário, problemas de fabricação pode ocorrer. Uma das questões mais frequentemente observadas é o desalinhamento das diferentes camadas. Isto pode ser facilmente resolvido com o uso de um aparelho mais avançado para o processo de fabricação, o que permite o alinhamento mais fácil e mais preciso das diferentes camadas.
A tecnologia DFR oferece a possibilidade de fabricação rápida e baixo custo. Por outro lado, a tecnologia é limitada em termos de resolução. Por exemplo, canais microfluídicos de estruturas muito pequenas (menos de 100 µm) não podem ser realizados usando o protocolo aqui apresentado. Nesse caso, a fotolitografia deve ser realizada por um alinhador de máscara de alta precisão com máscaras de vidro. Além disso, um canal muito largo também pode ser problemático, uma vez que o canal poderia dobrar para baixo, reduzindo a altura do canal e influenciando o comportamento de microfluidic do chip.
Acreditamos que tecnologia DFR estará mais presente em aplicações futuras, porque isso pode facilmente ser ampliado para uso comercial. A produção em massa de sensores baseados em DFR microfluidic não será nenhum obstáculo quando ela atinge o mercado, porque a técnica é bem estabelecida em outros campos de aplicação (por exemplo, eletrônica flexível).
Em termos de reduzir a complexidade de todo o sistema, o nosso futuro trabalho incidirá sobre a concepção e implementação de um cartucho descartável microfluidic que inclui o chip biosensor; um reservatório de resíduos; e reagentes pré-carregados, como o tampão de lavagem e outros componentes de ensaio. Para a medição de amperométrico, a entrega da amostra e outros reagentes pode ser fornecida por acionamento pneumático. Isto será realizado pelo leitor portátil e moverá pelo chip microfluidic biosensor para um reservatório de resíduos.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de agradecer o alemão Research Foundation (DFG) para financiamento parcialmente este trabalho sob Grant números UR 70/10-01 e UR 70/12-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
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