Summary
Una piattaforma di biosensore microfluidica è stata progettata e fabbricato con tecnologia photoresist film asciutto low-cost per la quantificazione rapida e sensibile di vari analiti. Questo sistema monouso consente la lettura elettrochimica di on-chip-immobilizzata analisi enzima-collegata mediante la tecnica della stop-flow.
Abstract
Negli ultimi anni, la diagnostica di biomarcatore è diventato uno strumento indispensabile per la diagnosi della malattia umana, soprattutto per la diagnostica point-of-care. Una piattaforma facile da usare e a basso costo sensore altamente è voluta per misurare vari tipi di analiti (ad es., biomarcatori, ormoni e farmaci) quantitativamente e in particolare. Per questo motivo, film secco photoresist tecnologia - abilitazione a buon mercato, fabbricazione di alto-rendimento e facile - utilizzata per fabbricare il biosensore microfluidici presentato qui. A seconda l'analisi biologica utilizzata in seguito, la piattaforma versatile è in grado di rilevare vari tipi di biomolecole. Per la fabbricazione del dispositivo, elettrodi di platino sono strutturati su una lamina flessibile poliimmide (PI) nel passaggio processo solo pulito. La lamina di PI funge da substrato per gli elettrodi, che sono isolati con un photoresist a base epossidica. Il canale di microfluidica viene generato successivamente dallo sviluppo di laminazione di fogli di photoresist (DFR) di film secco sul wafer PI. Utilizzando una barriera idrofoba arresto nel canale, il canale è suddiviso in due aree specifiche: una sezione di immobilizzazione per l'analisi enzima-collegata e una cella di misura elettrochimica per la lettura del segnale amperometrico.
L'immobilizzazione di analisi biologica su chip viene eseguita per l'adsorbimento di biomolecole alla superficie del canale. L'enzima ossidasi di glucosio è usato come un trasduttore per la generazione di segnale elettrochimico. In presenza di substrato, glucosio, perossido di idrogeno è prodotto, che è stata rilevata all'elettrodo di lavoro platino. La tecnica stop-flow è applicata per ottenere amplificazione del segnale con rilevamento rapido. Biomolecole differenti può essere misurata quantitativamente mediante il sistema introdotto microfluidica, dà un'indicazione dei vari tipi di malattie, o, per quanto riguarda farmaci terapeutici monitoraggio, facilitando una terapia personalizzata.
Introduction
Durante le due decadi scorse, applicazioni diagnostiche sono diventati Elementare per studi approfonditi sullo sviluppo della salute pubblica globale. Tradizionalmente, strumenti di diagnostica di laboratorio sono utilizzati per la rilevazione di malattie. Anche se hanno ancora un ruolo chiave nella diagnosi di malattie, point-of-care testing (POCT) eseguita vicino al paziente o dal paziente stesso è diventato più facile e più comune negli ultimi anni. Soprattutto in questi casi che richiedono un trattamento immediato, come infarto miocardico o monitoraggio del diabete, la conferma veloce di un'individuazione clinica è essenziale. Quindi, c'è un crescente bisogno di dispositivi POCT che può essere azionato da non esperti e che sono contemporaneamente in grado di eseguire precisi in vitro test diagnostici in un breve periodo di tempo1,2,3,4 .
Notevoli miglioramenti sono già stati raggiunti nel campo della POCT. Tuttavia, ci sono ancora molte sfide da superare5,6,7,8. Per una piattaforma POCT per essere lanciato con successo sul mercato ed essere competitivi con diagnostica di laboratorio, il dispositivo deve rigorosamente rispettare i seguenti requisiti: (i) fornire risultati precisi e quantitativa che siano coerenti con laboratorio Risultati; (ii) avere breve esempio di risultato volte, consentendo il trattamento immediato del paziente; (iii) offrono la gestione semplice e facile, anche se operati da inesperte e richiedono l'intervento dell'utente ridotta a icona; e (iv) è composto da un'unità di sensori a basso costo progettata per applicazioni monouso. Inoltre, privo di attrezzatura diagnostica è favorevoli, soprattutto in ambienti poveri di risorse3,4,6.
A causa di questi requisiti severi, solo due sistemi POCT basate sulla rilevazione elettrochimica (ad es., strisce reattive per glicemia) e il test immunologici di flusso laterale (ad es., prove di gravidanza domestiche) sono stati lanciati con successo sul mercato così lontano. Tuttavia, entrambi i sistemi soffrono di svantaggi quali la riduzione delle prestazioni (cioè, monitoraggio della glicemia ha risultati di prova inaccurati e flusso laterale saggi forniscono solo risultati di misurazione qualitativa (positiva o negativa))4, 6. Questi inconvenienti dei sistemi convenzionali di POCT hanno portato ad una crescente domanda di esplorare nuove tecnologie che offrono funzionalità di rilevamento veloce, basso costo e quantitativa nel punto di cura4,5.
Per soddisfare queste sfide dispositivi POCT, tecnologia DFR è stato recentemente impiegata per la fabbricazione di biosensori monouso e basso costo9,10,11,12, 13 , 14. rispetto ai materiali litografici morbidi e liquidi, ad esempio PDMS o SU-8, DFRs presentano molti vantaggi: (i) sono disponibili in una varietà di composizioni e spessori (da pochi micron ad alcuni millimetri); (ii) hanno una superficie molto ruvida, che facilita l'adesione ai vari materiali; (iii) uniformità di spessore eccellente caratteristica; (iv) offrono la fabbricazione a basso costo, facile e ad alta produttività per la produzione di massa; (v) sono facili da tagliare con vari strumenti di basso costo, come un semplice paio di forbici; e (vi) consentono la creazione di strutture tridimensionali, quali canali microfluidici, impilando strati multipli di DFR in cima a vicenda.
D'altra parte, DFRs in generale hanno una risoluzione relativamente povera rispetto i photoresists liquidi, che è principalmente causati dallo spessore del film e l'aumento della distanza tra la maschera e il DFR dovuto la pellicola protettiva, che consente inoltre di luce scattering. Ancora, per la produzione di biosensori di microfluidica integrata, DFRs sono particolarmente adatte per la produzione di massa di basso costo.
Pertanto, vi presentiamo in questo lavoro la fabbricazione e l'applicazione di un biosensore DFR-based microfluidic elettrochimica. Il protocollo dettagliato descrive ogni fase di produzione della piattaforma biosensore, l'immobilizzazione su chip di un saggio del modello basati sul DNA e sua lettura elettrochimica usando la tecnica stop-flow. Questa piattaforma universale consente il rilevamento di numerosi tipi di biomolecole, utilizzando tecnologie diverse analisi (ad es., genomica, cellomics e proteomica) o formati di dosaggio (ad es., competitivo, panino o diretta). Basato su una piattaforma di DFR, il nostro gruppo precedentemente dimostrato con successo la quantificazione rapida e sensibile di analiti vari, tra cui antibiotici13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina e gli antibiotici ß-lattamici), troponina I17e18di sostanza P.
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Protocol
1. fabbricazione della tecnologia microfluidica biosensore utilizzando DFR
- cialde di preparazione della PI.
- Taglio una PI substrato nella 6 - in cialde tonde. Mettere la cialda di PI in un forno a 120 ° C per circa 1 h per cuocere una disidratazione.
- Primo passo fotolitografia per il processo di Lift-off.
- Programma spin-spalmatrice a un tempo di 30 s filatura a 3.000 giri/min, con un'accelerazione di 2.000 giri/min/s. posto il wafer di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Pipettare 2 mL di un resist, consentendo il processo di Lift-off e avviare il programma di spin coater. Rimuovere la cialda da spin-coater e soft-cuocia il wafer di PI su una piastra calda per 2 min a 100 ° C.
- Regolare la maschera desiderata per patterning gli elettrodi sul wafer PI con l'occhio nudo ed esporlo alla luce di 2 UV 400 mJ/cm (365 nm). Posto la cialda in una ciotola riempita con uno sviluppatore di resistere di corrispondenza su agitatore orbitale e lasciarlo agitare leggermente per 1 min.
- Dopo il resist in eccesso viene rimosso, è possibile utilizzare una doccia per sciacquare il wafer di PI con acqua deionizzata (acqua deionizzata) su una panchina umida e asciugarlo in seguito usando aria compressa.
- Deposizione di platino per la formazione degli elettrodi.
- Utilizzare un processo di deposizione di vapore fisico standard al deposito 200 nm di platino sul wafer 19.
- Mettere la cialda in una ciotola. Aggiungere il remover corrispondente nella ciotola e rimuovere il fotoresist sganciabile agitando leggermente la cialda su agitatore orbitale fino tutti platinum in eccesso viene rimosso. Sciacquare e asciugare la cialda di PI come descritto al punto 1.2.3.
- Seconda fase Fotolitografia: formando lo strato dell'isolamento.
- Mettere la cialda di PI in forno preriscaldato a 120 ° C per 5 min disidratare it.
- Programma il primo passo di una spin coater per 5 s di filatura tempo a 500 giri/min. Programmare il secondo passo per 30 s a 4.000 giri/min, con un'accelerazione di 700 giri/min/s.
- Posizionare la cialda di PI su spin-coater e risolvere il problema, applicare il vuoto. Dispensare 4 mL di un'appropriata base epossidica photoresist prima di iniziare il programma di spin coater.
- Soft-cuocia il wafer rivestito per 3 min a 95 ° C su una piastra calda.
- Regolare la maschera per il livello di isolamento sul wafer utilizzando gli indicatori di allineamento rispettivi e una lente oculare. Esporre la cialda a 100 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).
- Per cuocere un post-esposizione, posizionare la cialda su un piatto caldo preriscaldato per 2 min a 95 ° C.
- Inserire la cialda in una ciotola e sviluppare la resistenza con uno sviluppatore adatto (ad es., 1-metossi-2-propil-acetat per 2 min, nel caso di SU-8) su agitatore orbitale.
- Prima sciacquare la cialda di PI con isopropanolo e poi risciacquare e asciugare come descritto al punto 1.2.3.
- Rigido-cuocia il photoresist in forno per 3 ore a 150 ° C.
- Assistita da plasma pulizia degli elettrodi.
- Per rimuovere i residui di photoresist, utilizzare il plasma ad ossigeno con un'unità di plasma standard. Avviare il programma di lavaggio, alimentato a bassa frequenza 200-W con il 100% O 2 flusso, un tasso di sccm 250 e un tempo totale di 3 min.
- Inserire la cialda PI camera plasma, difficoltà la cialda sulla piastra con messa a terra con coperchi in vetro e avviare il processo al plasma.
- Argento e deposizione di cloruro d'argento: creazione dell'elettrodo di riferimento su chip a.
- Passivazione il contatto platino pastiglie del wafer con un nastro adesivo UV sensibili. Tagliare il foglio a strisce lunghe cm 5 mm di larghezza e 11 e allegarli al wafer, proteggendo le parti di non essere depositato con argento.
- Per la deposizione di argento, mettere un bagno ad ultrasuoni (35 kHz) in una cappa e un contenitore di soluzione elettrolitica argento (100 g/L Ag, pH 12,5) inserire la vasca. Impostare il bagno a ultrasuoni a temperatura ambiente e il potere di 10%.
Attenzione: Soluzioni di elettroliti d'argento sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura. I fumi non devono mai essere inalati. - Collegare il contatto di massa degli elettrodi di riferimento a una fonte di corrente costante. Collegare l'elettrodo contatore, un filo d'argento che è immerso nella soluzione dell'elettrolito d'argento, all'origine corrente utilizzando cavi di collegamento standard.
- Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di -4,5 mA/cm 2, con un tasso di deposizione d'argento di circa 0,3 µm/min iniziare il bagno ad ultrasuoni e lasciate in origine corrente per 10 minuti la cialda di risciacquo con acqua DI
- Per la clorazione dell'elettrodo di riferimento, inserire un vaso di soluzione di cloruro di potassio (KCl) 0,1 M nel bagno ad ultrasuoni. Collegare il contatto di massa di un elettrodo di platino che è immersa nella soluzione KCl con la fonte di corrente costante e il wafer.
- Impostare la sorgente di corrente a DC e una densità di corrente di + 0,6 mA/cm 2, con un tasso di deposizione di circa 0.075 µm/min avviare il bagno ad ultrasuoni e lasciate che la sorgente di corrente per un minimo di 7,5
- Sciacquare e asciugare il PI di wafer, come descritto al punto 1.2.3.
- Rimuovere il nastro UV sensibili dopo un UV (365 nm) esposizione di 300 mJ/cm 2 e risciacquare ed asciugare la cialda di PI, nuovamente come descritto nel passo 1.2.3.
- Terzo passo di fotolitografia: utilizzando DFRs per creare i canali microfluidici.
- Tagliare gli strati DFR necessari a una dimensione simile a quella del wafer (20 x 20 cm 2). Fissare la maschera desiderata sull'unità di esposizione e allineare lo strato DFR sulla maschera utilizzando l'occhio nudo. Illuminare il resistere con 250 mJ/cm 2 UV luce (365 nm).
- Rimuovere la pellicola protettiva del photoresist e sviluppare il resistere per circa 2 min (a seconda delle strutture) in una soluzione di carbonato di sodio (Na 2 CO 3) 1% mediante un bagno ad ultrasuoni standard (35 kHz) preriscaldato a 42 ° C e una potenza sonora del 100%. Per interrompere immediatamente la reazione, agitare il resist per 1 min in un bagno di HCl 1% su agitatore orbitale. Sciacquare e asciugare ogni strato DFR, come descritto al punto 1.2.3.
Nota: In totale, quattro strati DFR devono essere elaborati come indicato al punto 1.7: strato di un canale, un rivestimento protettivo e due strati di retro (impedendo il biosensore di piegatura alla fine).
- Strati di laminazione del DFR sul substrato PI.
- Posizionare la cialda di PI su una lamina di overhead di trasparenza e fissarlo con nastro adesivo standard. Regolare il livello del DFR canale sul wafer PI sotto un microscopio, utilizzando le strutture di allineamento rispettivi.
- Per la laminazione, utilizzare una plastificatrice a caldo standard del rotolo e preriscaldare il rullo superiore a 100 ° C e la bobina inferiore a 60 ° C. impostare la pressione a 3 bar, con una velocità di avanzamento di 0,3 m/min posto la cialda con lo strato DFR fisso al centro la plastificatrice e avviarlo; Il DFR viene spinto attraverso la plastificatrice. Ripetere il passaggio dopo aver ruotato la cialda di 180°.
- Per evitare la flessione del biosensore, laminato due strati retro sviluppati su wafer seguendo passaggi 1.8.1-1.8.2.
- Impiegando una barriera idrofoba fermarsi e il chip di sigillamento.
- Rimuovi lo strato protettivo dal lato anteriore del canale DFR laicier posizionando il nastro adesivo standard ad una estremità del DFR e tirandolo verso l'alto. Utilizzare un mano dispenser con tubi di 0,004 per versare piccole goccioline di politetrafluoroetilene disciolto nei pozzetti dello strato isolante. Per sigillare il chip microfluidici, laminato lo strato di copertura DFR sul livello di canale, come descritto al punto 1.8.
- Hard-cottura biosensore microfluidici.
- Rimuovi tutto protettivo sventa sulla copertina e retro strati DFR. I biosensori tagliate a strisce utilizzando un normale paio di forbici. Curare le patatine in forno a 160 ° C per 3 h.
2. Procedura di dosaggio immobilizzazione su chip
- adsorbimento dell'avidina nella zona del canale immobilizzazione.
- Preparare una soluzione di avidina 100 µ g/mL in soluzione tampone fosfato 10 mM (PBS) ad un pH di 7,4.
- Erogare 2 µ l della soluzione avidina sull'ingresso del biosensore.
Nota: Il canale è riempito da forze capillari fino a quando il fluido raggiunge la barriera di arresto idrofobo. - Per garantire che la fluidica continua a fermarsi alla barriera durante il tempo di incubazione intero, dispensare 2 µ l di acqua DI sull'uscita del chip. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso.
- Rimuovere i reagenti in eccesso attraverso l'entrata del chip applicando un vuoto. Lavare il canale con 50 µ l di tampone di lavaggio (PBS con 0.05% Tween 20), erogata in uscita mentre viene applicato il vuoto. Asciugare il canale per 30 s mentre viene applicato il vuoto.
- Blocco nell'area di canale per inibire il grippaggio aspecifiche.
- Preparare una soluzione di albumina di siero bovino (BSA) di 1% in PBS di 10mm a pH 7.4.
- Pipetta 2 µ l della soluzione di BSA 1% su ingresso e 2 µ l di acqua distillata all'uscita del canale. Incubare il chip a 25 ° C per 1 h in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.
- I oligos di incubazione di DNA etichettati con biotina e 6-FAM.
- Preparare diverse concentrazioni (0,001-5 µM) della soluzione di DNA in 10mm PBS a pH 7.4.
- Erogare 2 µ l di una concentrazione della soluzione del DNA in ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata sulla presa. Incubare il chip a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso.
- Ripetere il punto 2.3.2 per le altre concentrazioni di DNA mediante biosensore ulteriori fiches.
- Rimuovere i reagenti in eccesso e asciugare il canale come descritto al punto 2.1.4.
- Immobilizzazione di GOx-etichettato anticorpi 6-FAM.
- Formulare una concentrazione di 5 µ g/mL di anticorpi di 6-FAM in 10mm PBS a pH 7.4.
- Introdurre 2 µ l della soluzione dell'anticorpo per l'ingresso e 2 µ l di acqua deionizzata per la presa del canale. Incubare gli anticorpi con etichettati a 25 ° C per 15 min in un contenitore chiuso. Rimuovere i reagenti in eccesso, come descritto al punto 2.1.4.
3. Amperometrico segnale rilevamento utilizzando la tecnica Stop-flow
- preparazione della soluzione di substrato per rilevazione elettrochimica.
- Formulare una soluzione di glucosio 40mm in PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.
- Per il trattamento preliminare, preparare una soluzione di PBS 0.1 M a pH 7.4 in acqua ultra-pura.
- Trattamento preliminare degli elettrodi lavoro.
- Usare il supporto di chip su misura per consentire il facile posizionamento delle chip e una connessione elettrica e fluidica.
- Collegare elettricamente il biosensore per il potenziostato. Garantire il contatto fluidico del canale microfluidico per una pompa a siringa e il serbatoio del reagente utilizzando l'adapter su misura e tubi. Avviare il computer portatile che è collegato al potenziostato e avviare il controller di pompe siringa, controllo del flusso fluidic attraverso il chip.
- Avviare la pompa a siringa manualmente, con 0.1 M PBS ad una portata di 20 µ l/min. Presso l'elettrodo di lavoro contro l'elettrodo di riferimento su chip, applicare una tensione alternata di 0,8 e -0,05 V per 5 s ciascuno per 30 cicli. In seguito, si ossidano l'elettrodo di lavoro applicando una tensione di 0,8 V per 60 s.
- Della lettura di dosaggio usando la tecnica stop-flow.
- Per avviare la lettura del segnale di test, attendere il segnale di corrente misurato si stabilizzi. Arrestare la pompa a siringa e passare il reagente da 0.1 M PBS per la soluzione di glucosio di 40 mM e avviare il software presso il controllore della pompa siringa; fermerà automaticamente il flusso per 1, 2 o 5 min e quindi riavvia nuovamente il flusso. Osservare il picco di corrente risultante.
Nota: Per l'analisi dei dati, il picco di corrente o la carica del picco può essere considerata, come descritto nel modello di una lettura del segnale elettrochimico ( Figura 2).
- Per avviare la lettura del segnale di test, attendere il segnale di corrente misurato si stabilizzi. Arrestare la pompa a siringa e passare il reagente da 0.1 M PBS per la soluzione di glucosio di 40 mM e avviare il software presso il controllore della pompa siringa; fermerà automaticamente il flusso per 1, 2 o 5 min e quindi riavvia nuovamente il flusso. Osservare il picco di corrente risultante.
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Representative Results
Progettazione e fabbricazione della piattaforma microfluidica biosensore:
La fabbricazione dei chip microfluidici biosensore è realizzata a livello di wafer da tecniche fotolitografiche standard impiegando strati multipli di DFR. Questa strategia di fabbricazione si basa sulla laminazione degli strati sviluppati di DFRs su un substrato di platino-fantasia di PI, formando i canali microfluidici. Un breve riassunto raffiguranti le fasi di fabbricazione diversi è dato in Figura 1. Un wafer di singolo 6 - in comprende 130 biosensori di microfluidica, ognuno con una dimensione di 8 × 10 mm2.
Figura 1. Illustrazione grafica dei passaggi differenti di fabbricazione della piattaforma microfluidica biosensore. a) taglio il PI substrato nella 6 - in cialde tonde. b) l'esposizione di un possibile spin-rivestito decollo resistere utilizzando la maschera di rispettiva per platino incartonatura. c) substrato dopo l'esposizione, schiena post-esposizione e sviluppando il photoresist. d) deposizione di vapore fisico di platino sul substrato. e) processo Lift-off per rimuovere il photoresist in eccesso. f) spin-coating di SU-8, formando uno strato di isolamento. g) processo al plasma di2 O per rimuovere residui di SU-8 sugli elettrodi di Pt. h) galvanica deposizione dell'elettrodo di riferimento Ag/AgCl. i) UV esposizione e lo sviluppo di diversi strati DFR. j) laminazione degli strati DFR sul wafer di PI. politetrafluoroetilene di erogazione risolto k), formando una barriera idrofoba fermarsi tra il capillare di immobilizzazione e cella elettrochimica. l) biosensore microfluidici elettrochimico finale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ogni biosensore consiste di un microfluidica canale, separati in due aree distinte da una barriera idrofoba arresto: una sezione di immobilizzazione e di una cella elettrochimica, contrassegnato in rosso e blu, rispettivamente, nella Figura 2. La parte di immobilizzazione del microchannel ha un volume di superficie di 10,34 mm2 e un volume di 580 nL, risultante in un rapporto superficie--alto volume di 155 cm-1. Cella elettrochimica comprende un elettrodo di riferimento su chip argento/argento cloruro e un contatore e l'elettrodo di lavoro platino. Questa separazione della zona di immobilizzazione e la lettura elettrochimica del dosaggio impedisce qualsiasi contaminazione degli elettrodi con biomolecole e pertanto inibisce elettrodo incrostazioni. Inoltre, permette il dosaggio preciso dei reagenti immobilizzazione di riempimento capillare.
Figura 2. Illustrazione del principio di funzionamento della piattaforma microfluidica elettrochimica. a) gli schemi di un saggio del modello basato su avidina. b) fotografia del biosensore microfluidici mostrando i suoi elementi principali, tra cui il controelettrodo (CE), l'elettrodo di riferimento (RE), l'elettrodo di lavoro (noi) e la barriera di arresto (SB). L'area di immobilizzazione è evidenziata in rosso, e la cella elettrochimica è segnata in blu. c) schematico reazione di ossidazione del perossido di idrogeno prodotto presso l'elettrodo di lavoro Pt per rilevazione amperometrica all'interno della cella elettrochimica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Utilizzando DFRs per la realizzazione del sensore, il processo di fabbricazione consente ad alta velocità a livello di wafer. Di conseguenza, i costi possono essere tenuti basso al minimo. Lo sviluppo di tutti gli strati DFR è fatto utilizzando maschere di lamina semplice e a basso costo e un'unità di esposizione di vuoto, piuttosto che costoso cromo un allineatore di maschere e maschere. Inoltre, la riduzione dei passaggi del necessario processo di pulito al minimo riduce i costi per la realizzazione anche di più. In totale, la procedura di fabbricazione richiede un carico di lavoro di circa 10 h, esclusi i tempi di cottura e la deposizione di vapore fisico del platino.
On-chip Assay incubazione:
L'incubazione di saggio su chip è fatto solo da forze capillari. Da gocce di pipettaggio di reagenti diversi sull'ingresso del canale microfluidico, i fluidi sono guidati attraverso il canale di azione di capillarità fino a raggiungere la barriera di arresto idrofobo. In condizioni di stato stazionario, i reagenti sono incubati per un tempo distinti. Questo sistema passivo consente il riempimento capillare del canale, senza la necessità di qualsiasi strumentazione esterna come una pompa a siringa e per il dosaggio preciso dei reagenti, come il fluido automaticamente si ferma presso la barriera di arresto. Inoltre, il flusso di lavoro è coerenza con quello di una ELISA convenzionale e funziona con liquidi ad alta viscosità come siero o sangue.
Allo scopo di questo esperimento, l'operazione di chip è dimostrata da un'analisi semplice test che impiegano l'interazione avidina-biotina, come mostrato nella Figura 2. Il saggio su chip incubazione inizia con l'adsorbimento dell'avidina alla superficie capillare per 1 h, seguita da una fase di blocco con BSA per un altro 1 h. Successivamente, 6-FAM/biotina-contrassegnata del DNA viene incubato a immobilizzare il capillare per 15 min, dove si lega alle molecole di avidina. Tra ogni fase di incubazione, qualsiasi biomolecole non associati vengono rimossi da una fase di lavaggio. Il tampone di lavaggio viene applicato tramite la presa di canale utilizzando un adattatore per aspirazione su misura. Nell'ultimo passaggio, anticorpi antifluorescein di glucosio ossidasi-contrassegnati vengono introdotti al canale per 15 min. Dopo di che, il biosensore è pronto per la lettura elettrochimica, utilizzando una soluzione di 40 millimetri di glucosio come substrato.
Lettura del segnale amperometrico utilizzando la tecnica Stop-flow:
Per la lettura del segnale del dosaggio immobilizzato, il prodotto di enzimi (qui, H2O2), prodotto in presenza del suo substrato, glucosio, possa essere rilevato elettrochimicamente presso l'elettrodo di lavoro nella cella elettrochimica. Per ottenere veloce rilevamento insieme con amplificazione del segnale, la cosiddetta tecnica di stop-flow è usato13. In questo metodo, il flusso del substrato è interrotto, che conduce ad un'accumulazione del prodotto all'interno del capillare. Pertanto, la quantità di prodotto H2O2 dipende dalla quantità di associato glucosio ossidasi ed è dipenda dalla quantità di legato biotinylated del DNA. Riavviando il flusso, il maggiore concentrazione di H2O2 viene successivamente scaricata attraverso la cella di misura elettrochimica, risultante in un segnale di picco corrente, come illustrato nella Figura 3.
Per l'analisi dei dati, la tecnica stop-flow offre due diversi parametri: l'altezza massima e la carica (cioè, l'integrale) del segnale di picco. Entrambi i parametri sono direttamente proporzionali al tempo di arrestoe può quindi essere utilizzato per analizzare i dati. Considerando la valutazione dei dati, quando si utilizza l'altezza di picco, l'altezza del segnale dipende la concentrazione massima di H2O2 e così il suo coefficiente di diffusione e il tempo di arresto applicata. Più il tempo di fermarsi, maggiore sarà la risposta di segnale misurato. Per questo motivo, l'altezza di picco calibrato rimane costante, fino a una lunghezza minima di immobilizzare il capillare. Questa particolarità della tecnica stop-flow consente una drastica riduzione nelle dimensioni del chip, particolarmente nella lunghezza capillare, preservando la sensibilità del sensore.
Figura 3. Modello di una lettura in genere ottenuti segnale elettrochimico di un'analisi enzima-collegata usando la tecnica stop-flow. un) è stato applicato un flusso di soluzione di glucosio 40 mM a una velocità di 20 µ l/min. Durante la fase di arresto (1, 2 o 5 min), continua la produzione di enzimi di H2O2 . Riavviando il flusso, accumulato H2O2 viene scaricata attraverso la cella elettrochimica, dove il perossido di idrogeno elettrochimicamente viene rilevato. Ripetendo la misurazione più volte (barre di errore; SEM), una calibrazione su chip curva b) è ottenuta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato qui per la realizzazione di un biosensore elettrochimico di microfluidica consente lo sviluppo di una piattaforma di basso costo, compatta e facile da usare per la rilevazione di biomolecole. A seconda del dosaggio utilizzato in seguito il biosensore, diversi biomarcatori diversi possono essere rilevati. Questo rende la piattaforma molto versatile e offre ampio accesso ai vari campi di applicazioni, dai test diagnostici standard (ad esempio, determinare la presenza di malattie specifiche presso l'ufficio del medico) per applicazioni point-of-care (per esempio, il controllo terapeutico della droga di un paziente per individualizzata terapia farmacologica). Soprattutto in diagnostica point-of-care, biosensori miniaturizzati hanno molti vantaggi rispetto ai metodi convenzionali, che di solito richiedono apparecchiature di laboratorio, impiegati specializzati e reagente di grandi dimensioni e volumi di campione e hanno lunghe turnaround volte.
La fabbricazione di questo biosensore richiede rigorosamente seguendo il protocollo; in caso contrario, possono verificarsi di problemi di fabbricazione. Uno dei problemi più spesso osservati è il disallineamento dei diversi strati. Questo può essere facilmente risolto utilizzando un apparato più avanzato per il processo di fabbricazione, che consente il più facile e preciso allineamento dei vari strati.
La tecnologia DFR offre la possibilità di fabbricazione veloce e a basso costo. D'altra parte, la tecnologia è limitata in termini di risoluzione. Ad esempio, canali microfluidici di strutture molto piccole (meno di 100 µm) non possono essere realizzati utilizzando il protocollo presentato qui. In tal caso, photolithography devono essere eseguite da un assetto di alta precisione maschera con vetro fotomaschere. Inoltre, un canale troppo largo può anche essere problematico, poiché il canale potrebbe piegare verso il basso, riducendo l'altezza del canale e che influenzano il comportamento di microfluidica del chip.
Noi crediamo che la tecnologia DFR sarà più presente in future applicazioni perché si possono facilmente essere scalato per uso commerciale. La produzione in serie di sensori basati su DFR microfluidici non sarà nessun ostacolo quando colpisce il mercato perché la tecnica è ormai consolidata in altri campi di applicazione (ad es., elettronica flessibile).
In termini di riduzione della complessità dell'intero sistema, il nostro lavoro futuro si concentrerà sulla progettazione e implementazione di una cartuccia usa e getta microfluidici che include il chip di biosensore; un serbatoio dei rifiuti; e reagenti pre-caricati, come tampone di lavaggio e altri componenti di analisi. Per la misura amperometrici, la consegna del campione e altri reagenti può quindi essere fornita di azionamento pneumatico. Ciò avverrà mediante il lettore palmare e si muoverà attraverso il chip microfluidici di biosensore ad un serbatoio dei rifiuti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare la Fondazione di ricerca tedesca (DFG) per finanziare parzialmente questo lavoro sotto Grant numeri UR 70/10-01 e UR 70/12-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
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