Summary
Bir mikrosıvısal Biyoalgılayıcı platform tasarlanmıştır ve çeşitli analitlerin hızlı ve hassas miktar için düşük maliyetli kuru film fotorezist teknolojisi kullanılarak imal edilmiştir. Bu tek kullanımlık sistem-küçük parça-immobilize enzim bağlı deneyleri elektrokimyasal göstergesi için stop-akış tekniği yoluyla sağlar.
Abstract
Son yıllarda biyomarker tanılama bakım noktası teşhis için özellikle insan hastalığı tanısı için vazgeçilmez bir araç haline geldi. Bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli sensör platform son derece çeşitli analitlerin (Örneğin, biyolojik, hormonlar ve ilaç) kantitatif ve özellikle ölçmek için isteniyorsa. Bu nedenle, Kuru film fotorezist teknolojisi - ucuz, facile ve yüksek işlem hacmi imalat - burada sunulan mikrosıvısal Biyoalgılayıcı üretimi için kullanıldı. Daha sonra kullanılan bioassay bağlı olarak çok yönlü platformu biomolecules türleri tespit yeteneğine sahiptir. Cihaz imalatı için Platin elektrotlar sadece temiz oda işlem adımının bir esnek polimid (PI) folyo üzerinde yapılandırılmıştır. PI folyo bir epoksi esaslı fotorezist ile yalıtımlı elektrotlar için bir substrat olarak hizmet vermektedir. Mikrosıvısal kanal daha sonra geliştirme ve PI gofret üzerine kuru film fotorezist (DFR) Folyo laminasyon tarafından oluşturulur. Hidrofobik durdurma bariyer kanalda kullanarak, kanal iki özel alana ayrılır: enzim bağlı tahlil ve amperometric sinyal okuma için bir elektrokimyasal ölçüm hücresi için bir immobilizasyon bölümüne.
Üstünde-küçük parça bioassay immobilizasyon kanal yüzeyine biomolecules adsorpsiyon tarafından gerçekleştirilir. Glikoz oksidaz enzimi bir çevirici elektrokimyasal sinyal oluşturmak için kullanılır. Substrat varlığında, glikoz, hidrojen peroksit, üretilen hangi Platin çalışma elektrot algılanır. Dur-akış tekniği sinyal güçlendirme hızlı algılama ile birlikte elde etmek için uygulanır. Farklı biomolecules kantitatif bir konusunda farklı hastalıkların veya izleme, kişiselleştirilmiş bir terapi kolaylaştırıcı tedavi edici ilaç açısından bir isteğinin olmadığınıgöstermiş tanıtılan mikrosıvısal sistemi yoluyla ölçülebilir.
Introduction
Son iki yılda tanı uygulamaları küresel halk sağlığı geliştirme üzerine derinlemesine araştırmalar temel haline gelmiştir. Geleneksel olarak, laboratuvar tanı araçları hastalıkları tespiti için kullanılır. Rağmen onlar hala hastalıkları tanısında önemli rol oynar, bakım noktası test (POCT) hastanın gerçekleştirilen veya hastanın kendisi tarafından son yıllarda daha çok ve daha olağan hale gelmiştir. Özellikle akut miyokard infarktüsünde veya diyabet kontrolü, gibi acil tedavi gerektirir bu gibi durumlarda bir klinik bulgu hızlı onay esastır. Dolayısıyla, bu sigara-uzmanlar tarafından çalıştırılabilen ve hassas vitro tanı testleri bir kısa süre1,2,3' te,4 aynı anda sahip olan POCT cihazlar için büyüyen bir ihtiyaç olduğunu .
Batan zaten POCT alanında elde ettik. Ancak, hala5,6,7,8üstesinden gelmek için pek çok sorun vardır. POCT için bir platform başarılı bir şekilde pazara açılacak ve Laboratuvar teşhis ile rekabet gücünüzü artırmak için cihazın kesinlikle aşağıdaki gereksinimleri yerine getirmeniz gerekir: (i) laboratuvar ile tutarlı olan kesin ve kantitatif test sonuçları sağlamak bulgular; (ii) kısa örnek-için-kez, hastanın acil tedavi etkinleştirme sonucu var; (iii) özelliği basit ve kolay kullanım, zaman bile eğitimsiz bireyler tarafından işletilmektedir ve simge durumuna küçültülmüş kullanıcı müdahalesi gerektirir; (iv) tek kullanımlık uygulamalar için tasarlanmış bir düşük maliyetli sensör birim oluşmaktadır. Ayrıca, ekipman içermeyen tanılama olumlu esas olarak kaynak-yoksul ortamlar3,4,6.
Şiddetli bu gereksinimleri nedeniyle, elektrokimyasal algılama (Örneğin, kan glikoz testi şeritler) ve yanal akışı uzun (Örneğin, ev gebelik testi) dayalı sadece iki POCT sistemi başarılı bir şekilde pazara kadar başlatılmıştır çok. Ancak, her iki sistemin dezavantajları düşük performans gibi muzdarip (Yani, kan glikoz izleme vardır yanlış test sonuçları ve yanal akışı deneyleri sadece nitel (pozitif veya negatif) ölçüm sonuçları sağlamak)4, 6. Bu sakıncaları geleneksel POCT sistemlerinin bakım4,5noktasında hızlı, ucuz ve nicel algılama sunmak yeni teknolojileri keşfetmek için artan bir talep açmıştır.
POCT cihazlar karşı karşıya bu zorlukları karşılamak için DFR teknoloji son zamanlarda tek kullanımlık ve düşük maliyetli biyosensörler9,10,11,12, imalat için istihdam edilmiştir 13 , 14. PDMS veya SU-8, gibi yumuşak ve sıvı taş malzemelere göre DFRs mevcut pek çok faydaları: onlar (i) are elde edilebilir içinde çeşitli besteleri ve kalınlıkları (üzerinden birkaç mikron birkaç milimetre için); (ii) yapışma için çeşitli malzemeler kolaylaştırır çok pürüzlü bir yüzey alanı var; (iii) özelliği mükemmel kalınlığı tekdüzelik; (IV), facile, ucuz ve yüksek üretilen iş fabrikasyon seri üretim için sunuyoruz; (v) olan basit bir makas çifti gibi çeşitli düşük maliyetli Araçlar kesmek kolay; ve (vi) üst üste birden çok DFR Katmanlar yığınlama tarafından mikrosıvısal kanalları gibi üç boyutlu yapıların oluşturulması için izin.
Öte yandan, DFRs genel olarak çoğunlukla film kalınlığı ve maske ve DFR nedeniyle Ayrıca ışık sağlayan koruyucu folyo arasında artan mesafe tarafından neden olduğu sıvı photoresists göre nispeten yoksul bir çözünürlüğe sahip saçılma. Yine de, entegre mikrosıvısal biyosensörler üretim için DFRs düşük maliyetli seri üretim için son derece uygundur.
Bu nedenle, biz bu mevcut iş imalat ve elektrokimyasal mikrosıvısal DFR tabanlı Biyoalgılayıcı uygulanması. Detaylı iletişim kuralı her üretim adım Biyoalgılayıcı platformu, bir DNA tabanlı modeli tahlil ve stop-akış tekniği kullanarak, elektrokimyasal okuma üstünde-küçük parça immobilizasyon anlatılmaktadır. Bu evrensel platformu biomolecules, farklı tahlil teknolojileri (Örneğin, genomik, cellomics ve Proteomik) veya tahlil biçimleri (Örneğin, rekabetçi, sandviç veya doğrudan) kullanarak çok sayıda tür tespiti sağlar. Böyle bir DFR platformu dayalı, bizim grup daha önce başarılı bir şekilde çeşitli analitlerin antibiyotik13,15,16 (tetrasiklin, dahil olmak üzere, hızlı ve hassas miktar gösterdi pristinamycin ve β-laktam antibiyotik), troponin ı17ve madde P18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. imalat mikrosıvısal Biyoalgılayıcı kullanarak DFR teknoloji
- PI hazırlanması doldurmuştu.
- Kesim bir PI yüzey içine 6 - inç gofret yuvarlak. PI gofret dehidratasyon fırında için kabaca 1 h için 120 ° c fırında koydu.
- Kalkış işlemi için ilk fotolitografi adım.
- 30-s eğirme işlemi sırasında 3000 rpm, 2000 d/d ivme ile spin coater program/yer PI gofret spin coater tarih s. ve tamir, bir vakum uygulama. Fırlatma işlemi, etkinleştirme bir resist 2 mL dağıtmak ve spin-coater programını başlatın. Gofret spin-coater kaldır ve yumuşak-PI gofret için 100 2 dk sıcak tabakta fırında ° C.
- Çıplak gözle PI gofret üzerinde elektrotlar desenlendirme için istenen maskeyi ayarlamak ve 400 mJ/cm 2 UV ışığına maruz kalmaktadır (365 nm). Bir kasede gofret resist eşleşen bir geliştirici bir orbital Çalkalayıcı tarih dolu ve izin bir yer sallamak 1 dk. için biraz
- Aşırı resist kaldırıldıktan sonra deiyonize su (DI-su) ile PI gofret ıslak bir bankta durulayın ve basınçlı hava kullanarak sonradan kuru için duş kullanın.
- Devrilmesinden sonra Platin elektrotlar oluşumu için.
- Standart fiziksel Buhar biriktirme depozito 200 için kullanın nm Platin gofret 19 üzerine.
- Gofret bir kase yerleştirin. Eşleşen sökücü kaseye ekleyin ve tüm aşırı Platin kaldırılana kadar biraz gofret bir orbital Çalkalayıcı sallayarak süre kalkış resist kaldırın. Durulama ve PI gofret 1.2.3. adımda açıklandığı gibi kuru.
- İkinci fotolitografi adım: yalıtım katmanı oluşturan.
- Onu kurutmak 5 min için 120 ° c ısıtılmış fırında PI gofret koymak 500 rpm anda iplik,
- program spin coater ilk adım 5'e s. 30 ikinci adım programı s 700 rpm/s. ivme ile 4000 devirde
- PI gofret spin-coater üzerinde yerleştirin ve bir vakum uygulama düzeltebilirim. Spin-coater programına başlamadan önce uygun epoksi esaslı fotorezist 4 mL dağıtmak.
- Yumuşak-fırında kaplı gofret 95 ° c sıcak tabakta 3 dk için.
- İçin belgili tanımlık anılan sıraya göre hizalama işaret ve oküler lens kullanan gofret yalıtım katmanda maske ayarlayın. Gofret 100 mJ/cm 2 UV ışık maruz (365 nm).
- 95, 2 min için Önceden ısıtılmış sıcak tabakta gofret sonrası pozlama fırında yerleştirin ° C.
- Gofret bir kaseye koyun ve orbital Çalkalayıcı üzerinde uygun bir geliştirici (Örneğin, 1-metoksi-2-propil-acetat SU-8 durumunda 2 min için) ile resist geliştirmek.
- PI gofret ilk isopropanol ile durulayın ve sonra durulayın ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi kuru.
- Sabit-fırında 150, 3 h için bir fırın fotorezist ° C.
- Plazma destekli elektrotlar temizlik.
- Fotorezist artıkları kaldırmak için oksijen plazma standart plazma ünitesi ile kullanın. %100 O 2 akışı, 250 sccm oranında ve en az 3 karakterden oluşan toplam süre ile 200-W düşük frekans güç kullanarak temizleme programı başlatmak
- PI gofret plazma odanın içine yerleştirin, gofret cam kapaklar kullanarak topraklı tabağa saptamak ve plazma işlemini başlatmak.
- Gümüş ve gümüş klorür ifade: üstünde-küçük parça referans elektrot oluşturma.
- Passivate Platin iletişim yastıkları bir UV duyarlı yapışkan bant ile gofret. 5 mm çapında ve 11 cm uzunluğunda şeritler için folyo kesim ve onları parçalar ile gümüş yatırılır değil için koruma gofret ekleyin.
- İçin gümüş biriktirme, sonik banyo (35 kHz) duman dolaba koyun ve bir kapsayıcı gümüş elektrolit çözüm (100 g/L Ag, pH 12,5) banyo içine yerleştirin. Sonik banyo oda sıcaklığında ve güç için % 10 olarak ayarlayın.
Dikkat: Gümüş elektrolit çözümler çok zehirli ve aşırı dikkatle ele alınmalıdır. Duman hiç inhale. - Toplu bağlantı referans elektrot sürekli geçerli kaynak için bağlanma. Sayaç elektrot, gümüş elektrolit çözümünde standart bağlantı kabloları kullanarak geçerli kaynak için dalmış bir gümüş tel bağlayın.
- Küme geçerli kaynak etki alanı denetleyicisinin ve-4.5 akım yoğunluğunun mA/cm 2 yaklaşık 0.3 µm/dak bir gümüş biriktirme hızı sonuçlanan, sonik banyo başlangıç ve 10 dk. durulama gofret DI-su ile Çalıştır geçerli kaynak sağlar
- Referans elektrot klorlama için bir gemi 0.1 M Potasyum klorür (KCl) çözüm sonik banyo içine yerleştirin. Gofret ve sürekli geçerli kaynak ile KCl çözümde batırılır Platin elektrot toplu bağlantı bağlanma.
- Küme geçerli kaynak etki alanı denetleyicisinin ve +0.6 akım yoğunluğunun mA/cm 2 yaklaşık 0.075 µm/dak bir birikim hızı sonuçlanan, sonik banyo başlatmak ve çalıştırmak için 7,5 dk. geçerli kaynak izin
- Durulama ve kuru PI gofret, 1.2.3. adımda açıklandığı gibi.
- Sonra bir UV UV duyarlı bandı çıkarın (365 nm) 300 mJ/cm 2 ve durulama ve kuru açıklandığı adım 1.2.3 olarak tekrar PI gofret maruz.
- Üçüncü fotolitografi adım: mikrosıvısal kanalları oluşturmak için kullanarak DFRs.
- Gerekli DFR katmanları bir boyuta gofret (20 x 20 cm 2) benzer kesti. Pozlama birim üzerine istenilen maskesi düzeltmek ve DFR katman çıplak gözle kullanarak maskesi üzerine hizalayın. Resist 250 mJ/cm 2 UV ışık ile aydınlatmak (365 nm).
- Fotorezist koruyucu folyo kaldırın ve kabaca 2 dk (bağlı olarak yapıları) için resist 42 ° C ve sonik güç için ısıtılmış standart sonik banyo (35 kHz) kullanarak bir % 1 Sodyum karbonat (Na 2 CO 3) çözüm geliştirmek % 100. Reaksiyon hemen durdurmak için % 1 HCl banyo bir orbital Çalkalayıcı üzerinde 1 dk. için resist sallamak. Durulama ve her DFR katman 1.2.3. adımda açıklandığı gibi kuru.
Not: Toplamda, dört DFR Katmanlar adım 1.7 belirtildiği gibi işlenmesi gereken: bir kanal katmanı, bir kapak katman ve iki arka Katmanı (Biyoalgılayıcı vasıl belgili tanımlık son bükme önlenmesi).
- DFR laminasyon katmanlar üzerinde PI substrat.
- PI gofret şeffaflık genel gider folyo üzerine yerleştirin ve standart yapışkan bant kullanarak bunu düzeltin. PI gofret ilgili hizalama yapıları kullanarak bir mikroskop altında kanal DFR katmanda ayarlayın.
- Bir çift sıcak rulo laminar Laminasyon için kullanın ve 100 ° c en iyi rulo ve 60 alt Roll'a Onceden ° C. ayarla basıncı 0,3 m/dak yer ileri peşpeşe 3 bar laminar ortasında sabit DFR tabaka ile gofret ve Başlat; DFR laminar itilir. Gofret 180 ° döner sonra yineleyin.
- Biyoalgılayıcı bükme önlemek için aşağıdaki adımları 1.8.1-1.8.2 gofret üzerine iki gelişmiş arka katmanları laminat.
- Bir hidrofobik durdurma bariyer istihdam ve çip mühürleme.
- Kaldır DFR kanal ön tarafındaki koruyucu tabaka yatıyorduEr standart yapışkan bant DFR bir ucunda yerleştirerek ve yukarı doğru çekerek. Dağıtıcı eliniz 0,004-in tüpleri ile yalıtım katmanı kuyu çözünmüş politetrafloroetilen küçük damlacıkları dağıtmak için kullanın. Mikrosıvısal çip mühür için 1.8 adımda anlatıldığı gibi kapak DFR katman kanal katman üzerine laminat.
- Sabit-pişirme mikrosıvısal Biyoalgılayıcı.
- Kaldır tüm koruyucu kapak ve arka DFR katmanları Grup. Biyosensörler sıradan bir pair makas kullanarak şeritler halinde kesin. Fiş için 3 h. 160 ° c fırında tedavi
2. Çip üzerinde tahlil immobilizasyon yordam
- kanal immobilizasyon alanında avidin adsorpsiyon.
- 10 mM fosfat tamponlu tuz (PBS) bir pH 7.4 100 µg/mL avidin çözeltilerine hazırlayın.
- Biyoalgılayıcı giriş üzerine avidin çözüm dağıtmak 2 µL.
Not: sıvı hidrofobik durdurma bariyer ulaşıncaya kadar kanalı kılcal kuvvetler tarafından doldurulur. - Bariyer tüm kuluçka süresi sırasında durdurma akışkan tutar DI-su 2 µL çip çıkış üzerinde dağıtmak emin olmak için. Kapalı bir kapta 1 h için 25 ° c çip kuluçkaya.
- Çip giriş yoluyla aşırı reaktifler bir vakum uygulayarak kaldırın. Kanal yıkama arabelleği 50 µL ile yıkayın (PBS % 0.05 ile ara 20), vakum uygulanırken çıkış olarak kullanılmış. Kanal için 30 kuru vakum uygulanırken s.
- Belirsiz bağlama etkisizleştirmek için kanal yüzey engelleme.
- 10 mM PBS pH %7,4 1 sığır serum albumin (BSA) çözeltilerine hazırlayın.
- Pipet 2 µL % 1 BSA çözüm giriş ve 2 µL kanal çıkış DI-su. Kapalı bir kapta 1 h için 25 ° c çip kuluçkaya. Aşırı reaktifler kaldırmak ve Kanal 2.1.4 adımda anlatıldığı gibi kuru.
- DNA kuluçka oligos biotin ve 6-FAM. ile Etiketlenmiş
- Farklı konsantrasyonlarda hazırlamak (0,001-5 µM) 10 mM PBS pH 7.4 DNA çözüm.
- Dağıtmak 2 µL DNA çözüm üzerinde koyu bir konsantrasyon ve 2 µL çıkış DI-su. Kapalı bir kap 15dk için 25 ° c çip kuluçkaya.
- Ek Biyoalgılayıcı fiş kullanarak diğer DNA konsantrasyonları için yineleme adım 2.3.2.
- Kaldırmak aşırı reaktifler ve Kanal 2.1.4 adımda anlatıldığı gibi kuru.
- 6-FAM antikorlar GOx immobilizasyon etiketli.
- 5 µg/mL konsantrasyonu 10 mM PBS pH 7.4 6-FAM antikorların formüle. Kanal çıkışına
- tanıtmak 2 µL giriş ve 2 için antikor çözümün µL DI-su. Kapalı bir kapta 15 dakika 25 ° C'de etiketli antikorlar kuluçkaya. 2.1.4. adımda açıklandığı gibi aşırı reaktifleri kaldırmak.
3. Amperometric sinyal algılama kullanarak Stop-akış tekniği
- substrat çözeltisi hazırlama elektrokimyasal algılama için.
- 0.1 M PBS pH 7.4 ultra saf su, 40 mM glikoz çözümde formüle.
- Ön tedavisi için bir 0.1 M PBS çözüm pH 7.4 ultra saf su hazırlamak.
- Ön tedavi çalışma elektrot.
- Kolay yerleştirme çip ve sıvı ve elektrik bağlantısı için izin vermek için özel yapım chip sahibi kullanın.
- Elektrik potansiyostat Biyoalgılayıcı bağlayın. Mikrosıvısal kanal bir şırınga pompa ve özel bağdaştırıcı ve tüpler kullanarak reaktif rezervuar sıvı temas sağlamak. Potansiyostat için bağlı dizüstü başlatmak ve çipi üzerinden geçir sıvı akışı kontrol eden şırınga pompa denetleyicisini başlatmak.
- Şırınga pompa el ile 0.1 M PBS 20 µL/dk akış hızında başlayın. Üstünde-küçük parça referans elektrot karşı çalışma elektrot 0.8 ve-0.05 V 5 için alternatif bir gerilim uygulamak her 30 döngüleri için s. Bunu bir gerilim 0,8 V 60 uygulayarak çalışma elektrot okside s.
- Durağı akış tekniği kullanarak tahlil okuma.
- Tahlil sinyal okuma başlatmak için ölçülen geçerli sinyal stabilize kadar bekleyin. Şırınga pompa durdurun ve 0.1 M PBS üzerinden reaktif 40 mM glikoz çözüm için geçiş ve şırınga pompa denetleyicisinde yazılımını başlatın; Bu otomatik olarak 1, 2 veya 5 min için akışı durur ve sonra akışını yeniden başlar. Elde edilen geçerli en yüksek dikkat.
Not: veri analizi için geçerli en yüksek veya en yüksek ücret, bir elektrokimyasal sinyal göstergesi ( Şekil 2) modelinde açıklandığı gibi düşünülebilir.
- Tahlil sinyal okuma başlatmak için ölçülen geçerli sinyal stabilize kadar bekleyin. Şırınga pompa durdurun ve 0.1 M PBS üzerinden reaktif 40 mM glikoz çözüm için geçiş ve şırınga pompa denetleyicisinde yazılımını başlatın; Bu otomatik olarak 1, 2 veya 5 min için akışı durur ve sonra akışını yeniden başlar. Elde edilen geçerli en yüksek dikkat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tasarım ve üretim mikrosıvısal Biyoalgılayıcı platformu:
Mikrosıvısal Biyoalgılayıcı cips imalatı gofret düzeyde birden çok DFR Katmanlar istihdam standart photolithographic teknikleri tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu imalat stratejisi gelişmiş DFRs katmanlarda mikrosıvısal kanalları oluşturan bir platin desenli PI substrat, laminasyon kullanır. Farklı üretim adımları gösteren kısa bir Özet şekil 1' de verilmiştir. Bir tek 6 - inç gofret 130 mikrosıvısal biyosensörler, her bir Boyut 8 × 10 mm ile oluşur2.
Şekil 1. Grafik illüstrasyon mikrosıvısal Biyoalgılayıcı platformun farklı imalat adımlardan. a) 6 - inç içine kesim PI substrat yuvarlak gofret. b) teshir edilmesi mümkün bir spin kaplı kalkış karşı ilgili maskesi Platin desenlendirme için kullanma. c) maruz kalma, sonrası pozlama arka ve fotorezist geliştirme sonra alt katman. d) fiziksel Buhar biriktirme substrat üzerine platin. e) kalkış işlemi aşırı fotorezist kaldırmak için. f) SU-8 bir yalıtım katmanı oluşturan, spin-kaplama. g) O2 plazma işlemi SU-8 artıkları Pt elektrot üzerinde kaldırmak için. h) Ag/AgCl referans elektrot galvanik birikimi. i) UV Işınlarına maruz kalma ve farklı DFR Katmanlar gelişimi. j) laminasyon PI gofret üzerine DFR katmanların. k) çözüldü dağıtım politetrafloroetilen, immobilizasyon kılcal ve elektrokimyasal hücre arasında bir hidrofobik durdurma engel oluşturan. l) son elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Her Biyoalgılayıcı iki farklı alanlara bir hidrofobik durdurma bariyer tarafından ayrılmış bir mikrosıvısal kanalının oluşur: bir immobilizasyon bölümü ve bir elektrokimyasal hücre sırasıyla, işaretli kırmızı ve mavi, Şekil 2' de. Microchannel immobilizasyon parçası 10.34 mm2 yüzey hacmi ve 580 bir hacmi vardır nL, bir yüksek yüzey için hacim oranı 155 cm-1içinde sonuçlanır. Elektrokimyasal hücre bir üstünde-küçük parça gümüş/gümüş klorür referans elektrot ve bir sayaç ve çalışma Platin elektrot içerir. Bu ayrılık immobilizasyon çevrenin ve elektrokimyasal okuma testin herhangi bir kirlenme ile biomolecules elektrot engeller ve bu nedenle elektrot kirlenme engeller. Ayrıca, hassas immobilizasyon reaktifler tarafından kapiller dolum ölçüm hizmeti sağlar.
Şekil 2. Elektrokimyasal mikrosıvısal platformu çalışma prensibi Illustration. a) şemaları avidin üzerinde dayalı bir modeli testin. b) ana unsurları sayaç elektrot (CE), referans elektrot (RE), çalışma elektrot (biz) ve durdurma bariyer (SB) de dahil olmak üzere, gösterilen mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotoğrafı. İmmobilizasyon alan kırmızıyla vurgulanır ve elektrokimyasal hücre mavi renkle işaretlenir. c) şematik reaksiyon üretilen hidrojen peroksit amperometric algılama elektrokimyasal hücre içindeki Pt çalışma elektrot, oksidasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
DFRs sensörü imalatı için istihdam ederek, üretim süreci için üretilen yüksek-iş gofret düzeyinde izin verir. Bu nedenle, maliyetleri minimum düzeyde tutulabilir. Tüm DFR katmanları yapılan basit ve düşük maliyetli folyo maskeleri ve bir vakum pozlama birim kullanarak yerine pahalı gelişmedir krom maskeleri ve maske aligner. Buna ek olarak, en az gerekli temiz oda süreç adımları azalma daha fazla üretim masraflarını keser. Toplamda, üretim yordamı kabaca 10 h pişirme süreleri ve fiziksel Buhar biriktirme Platin hariç, bir iş yükünü alır.
On-chip tahlil kuluçka:
Üstünde-küçük parça tahlil kuluçka kılcal kuvvetler tarafından yapılır. Farklı reaktifler mikrosıvısal Kanal giriş üzerine pipetting damla tarafından hidrofobik durdurma bariyer ulaşana kadar sıvılar kanalı ile capillarity eylem tarafından tahrik edilmektedir. Kararlı durum koşullar altında reaktifleri o zaman için farklı bir saat inkübe. Bu pasif sistem bir şırınga pompa gibi herhangi bir dış araçları gerek kalmadan kanal kapiller dolum sağlar ve hassas reaktifler sıvı otomatik olarak ölçüm durdurma bariyer durur sağlar. Ayrıca, iş akışı bir geleneksel ELISA ile tutarlı ve serum veya kan gibi yüksek viskozite sıvılar ile çalışıyor.
Bu deney amacıyla çip işlemi basit bir test tahlil avidin-biotin etkileşim Şekil 2' de gösterildiği gibi istihdam gösterilmiştir. 1s için başka bir 1 h BSA ile engelleme bir adım takip için kılcal yüzeye avidin adsorpsiyon ile üstünde-küçük parça tahlil kuluçka başlar. Daha sonra 6-FAM/biotin-etiketli DNA immobilizasyon nerede avidin molekülleri bağlar 15dk için kılcal damar içinde inkübe. Her kuluçka adım arasında ilişkisiz herhangi bir biomolecules bir çamaşır adım tarafından kaldırılır. Yıkama arabellek özel yapım bir vakum adaptörü kullanarak kanal çıkış yolu ile uygulanır. Son adımda, glikoz oksidaz etiketli antifluorescein antikorlar 15dk için kanal tanıtılmaktadır. Bundan sonra Biyoalgılayıcı bir 40 mM glikoz çözüm substrat kullanarak elektrokimyasal okuma için hazırdır.
Amperometric sinyal okuma: Stop-akış tekniği kullanarak
İmmobilize tahlil sinyal göstergesi için substrat varlığında, glikoz, üretilen enzimler ürün (burada, H2O2), mamüllerinin elektrokimyasal hücredeki çalışma elektrot, tespit edilebilir. Sinyal güçlendirme ile birlikte hızlı algılama, sözde dur akış tekniği kullanılan13ulaşmaktır. Bu yöntemde, yüzey akışı durdu hangi ürünün kılcal damar içine bir birikimi yol açar. Üretilen H2O2 miktarı bu nedenle ilişkili glikoz oksidaz miktarına bağlıdır ve ilişkili biotinylated DNA miktarına bağlıdır. Akışını yeniden başlatarak, Gelişmiş H2O2 konsantrasyonu daha sonra şekil 3' te gösterildiği gibi geçerli en yüksek sinyal, sonuçlanan elektrokimyasal ölçüm hücresi aracılığıyla temizlendi.
Veri analizi için stop-akış teknik iki farklı parametre sunar: maksimum yükseklik ve şarj (Yani, integral) en yüksek sinyal. Her iki parametre için durdurma zaman doğrudan orantılıdırve bu nedenle verileri analiz etmek için kullanılabilir. En yüksek yükseklik kullanırken veri değerlendirme göz önüne alındığında, sinyal yüksekliği maksimum H2O2 konsantrasyon ve böylece kendi Difüzyon katsayısı ve uygulanan durdurma saati bağlıdır. Durdurma uzun, yüksek ölçülen sinyal yanıt. Bu nedenle, gauged pik yüksekliği en az uzunluğunu kapiller immobilizasyon aşağı sabit kalır. Sensör hassasiyeti koruma sırasında bir ciddi azalma yongası boyutları, özellikle kılcal damar uzunluğu, stop-akış tekniği bu özelliği sağlar.
Şekil 3. Genellikle elde edilen elektrokimyasal sinyal okuma durdurmak akış tekniği kullanarak bir enzim bağlı testin model. bir) 40 mM glikoz çözüm 20 µL/dk hızında bir akış uygulandı. Dur aşamasında (1, 2 veya 5 dk) H2O2 enzim üretimi devam ediyor. Akışını yeniden başlatarak, birikmiş H2O2 hidrojen peroksit mamüllerinin nerede algılanır elektrokimyasal hücre temizlendi. Ölçüm (hata çubukları; defalarca yinelenen tarafından SEM), bir üstünde-küçük parça kalibrasyon eğrisi b) elde edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir mikrosıvısal elektrokimyasal Biyoalgılayıcı imalatı için sunulan Protokolü biomolecules tespiti için düşük maliyetli, kompakt ve kullanımı kolay bir platform geliştirme sağlar. Daha sonra Biyoalgılayıcı üzerinde kullanılan tahlil bağlı olarak birkaç farklı biyolojik tespit edilebilir. Bu platform çok yönlü yapan ve noktası bakım uygulamaları için standart tanı sınamaları (doktorun ofisinde özgül hastalık varlığı belirlemeÖrneğin, ) uygulamaları, çeşitli alanlarda geniş erişim sağlar (Örneğin, bir hasta için tedavi edici ilaç izleme bireyselleştirilmiş ilaç tedavisi). Özellikle bakım noktası teşhis, kırılan biyosensörler hangi genellikle kapsamlı Laboratuar donanımları, uzman çalışanları ve büyük reaktif ve örnek birimleri gerektiren ve uzun dönüş var geleneksel yöntemler üzerinde pek çok avantajı var kez.
Bu Biyoalgılayıcı imalatı kesinlikle protokol gerektirir; Aksi takdirde, üretim sorunları oluşabilir. En sık gözlenen konulardan biri farklı katmanların kayma olduğunu. Bu kolayca farklı katmanların daha kolay ve daha kesin hizalama için sağlar imalat işleminin daha gelişmiş cihazlar kullanılarak çözülebilir.
DFR teknoloji hızlı ve düşük maliyetli üretim imkanı sunuyor. Öte yandan, çözünürlük açısından sınırlı bir teknolojidir. Örneğin, mikrosıvısal kanalları çok küçük yapıları (100 µm) burada sunulan protokolü kullanarak fark edemez. Böyle bir durumda fotolitografi cam photomasks ile bir yüksek-tamlık maskesi aligner tarafından gerçekleştirilmelidir. Kanal kanal yüksekliğini azaltmak ve çip mikrosıvısal davranışını etkileyen, bükme beri Ayrıca, bir çok geniş kanal da sorunlu olabilir.
Çünkü bu kolayca ticari kullanım için ölçeklendirilebilir DFR teknoloji gelecekteki uygulamalarda daha mevcut olacağına inanıyoruz. Teknik uygulama (Örneğin, esnek elektronik) diğer alanlarında köklü olduğu için piyasada çarptığında DFR tabanlı mikrosıvısal sensörler yetişkinlerin hiçbir engel olacaktır.
Tüm sistem karmaşıklığı azaltmak açısından, bizim gelecekteki iş tasarım ve uygulama Biyoalgılayıcı çip içerir ve tek kullanımlık mikrosıvısal kartuşu ele alınacak; atık su deposu; ve yıkama tampon ve diğer tahlil bileşenleri gibi önceden yüklenmiş Kimyasalları. Amperometric ölçüm için örnek ve diğer Kimyasalları teslimini sonra pnömatik çalıştırma tarafından sağlanabilir. Bu el okuyucu tarafından gerçekleştirilecek ve mikrosıvısal Biyoalgılayıcı çip ile atık su deposu için hareket edecek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar bu eser Grant numaraları UR 70/10-01 ve UR 70/12 / 01 altında kısmen finansman için Alman Araştırma Vakfı (DFG) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
- Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
- Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
- Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
- Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).
- Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
- Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. , 7,691,623 (2010).
- Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
- Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
- Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
- Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
- Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).
- Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
- Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , Elsevier Inc. (2010).
