Summary
صمم منصة biosensor موائع جزيئية وملفقة استخدام تكنولوجيا مقاوم الضوء الفيلم جافة منخفضة التكلفة للتحديد الكمي لمختلف التحاليل السريعة والحساسة. يسمح هذا النظام تستخدم مرة واحدة لقراءات الكهروكيميائية لفحوصات المرتبط بالانزيم على-رقاقة-معطلة عن طريق تقنية وقف التدفق.
Abstract
وفي السنوات الأخيرة أصبح تشخيص العلامات البيولوجية أداة لا غنى عنها لتشخيص الأمراض البشرية، خاصة بالنسبة لعمليات تشخيص نقطة من الرعاية. الغاية هو المطلوب منصة استشعار سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة لقياس أنواع مختلفة من تحليلها (مثلاً، المؤشرات الحيوية والهرمونات والمخدرات) الكمية، وعلى وجه التحديد. لهذا السبب، تم استخدام تكنولوجيا مقاوم الضوء الفيلم الجافة-تمكين رخيصة، تلفيق السطحية، والفائق-لتصنيع biosensor موائع جزيئية المعروضة هنا. اعتماداً على العينة المستخدمة بعد ذلك، منصة متعددة الاستخدامات قادرة على اكتشاف أنواع مختلفة من الجزيئات الحيوية. لتصنيع الجهاز، يتم تأسيسها أقطاب البلاتين في إحباط بوليميد مرنة (PI) في الخطوة العملية فقط في غرفة نظيفة. إحباط PI بمثابة ركيزة للأقطاب، التي هي معزولة مع مقاوم الضوء على أساس الإيبوكسي. بعد ذلك يتم إنشاء القناة موائع جزيئية التنمية والتصفيح من رقائق مقاوم الضوء (الترميد) فيلم الجافة على رقاقة PI. باستخدام حاجز وقف مسعور في القناة، يتم فصل القناة إلى مجالين محددين: قسم التثبيت للانزيم المرتبط بالانزيم وخلية قياس الكهروكيميائية لقراءات إشارة أمبيروميتريك.
تجميد العينة على شريحة يؤديها الامتزاز الجزيئات الحيوية على سطح القناة. إنزيم الجلوكوز أوكسيديز كمحول لتوليد الإشارات الكهروكيميائية. حضور الركازة، السكر، وتنتج بيروكسيد الهيدروجين، التي يتم الكشف عنها في مسرى العامل البلاتين. يتم تطبيق تقنية وقف تدفق للحصول على تضخيم الإشارات جنبا إلى جنب مع الكشف السريع. الجزيئات الحيوية المختلفة يمكن أن تقاس كمياً عن طريق نظام موائع جزيئية أدخلت، يعطي مؤشرا لأنواع مختلفة من الأمراض، أو، فيما يتعلق بالعقاقير العلاجية الرصد، وتيسير علاج شخصية.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، أصبحت التطبيقات التشخيصية الأولية لإجراء دراسات متعمقة في مجال الصحة العامة على الصعيد العالمي. عادة، يتم استخدام أدوات التشخيص المختبري للكشف عن الأمراض. على الرغم من أنها لا تزال تلعب دوراً رئيسيا في تشخيص الأمراض، العناية بنقطة اختبار (جريدتين) يؤديها قرب المريض أو من المريض نفسه وقد أصبح أمرا شائعا أكثر وأكثر في السنوات الأخيرة. خاصة في مثل هذه الحالات التي تتطلب العلاج الفوري، مثل احتشاء عضلة القلب الحاد أو رصد داء السكري، تأكيد استنتاج السريري السريع ضروري. ومن ثم، هناك حاجة متزايدة لجريدتين من الأجهزة التي يمكن أن تعمل غير الخبراء والتي في نفس الوقت قادرة على أداء اختبارات تشخيصية دقيقة في المختبر في وقت قصير1،2،3،4 .
وقد حققت بالفعل تحسينات ملحوظة في ميدان جريدتين. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من التحديات للتغلب على5،6،،من78. لمنصة جريدتين تكون أطلقت بنجاح في السوق وتكون قادرة على المنافسة مع التشخيص المختبري، الجهاز دقة يجب أن تفي بالمتطلبات التالية: (ط) توفير نتائج الاختبار الدقيق والكمية التي تتوافق مع المختبرات النتائج التي توصل إليها؛ (ثانيا) قد قصيرة عينة-إلى-نتيجة مرات، مما يتيح معالجة فورية للمريض؛ (ثالثا) ميزة غير معقدة وسهلة المناولة، حتى عندما كانت تعمل بالأفراد غير المدربين، وتتطلب تدخل المستخدم مصغر؛ و (رابعا) تتألف من وحدة الاستشعار منخفضة التكلفة مصممة لتطبيقات تستخدم مرة واحدة. وعلاوة على ذلك، خالية من معدات التشخيص مواتية، لا سيما في بيئات فقيرة الموارد3،،من46.
بسبب هذه الاحتياجات الشديدة، سوى نظامين جريدتين استناداً إلى كشف الكهروكيميائية (مثلاً، شرائط اختبار الدم الجلوكوز) والتدفق الأفقي تحديدكم (مثل اختبارات الحمل المنزلية) بنجاح بدأت في السوق حتى الآن. غير أن كلا النظامين تعاني من عيوب مثل ضعف الأداء (أي الدم الجلوكوز رصد نتائج الاختبار غير دقيقة وفحوصات التدفق الأفقي فقط توفر نتائج القياس النوعي (الإيجابية أو السلبية))4، 6. هذه المآخذ على النظم التقليدية في جريدتين أدت إلى تزايد طلب على استكشاف التكنولوجيات الجديدة أن تقدم كشف سريعة ومنخفضة التكلفة والكمية عند نقطة الرعاية4،5.
ولمواجهة هذه التحديات التي تواجه الأجهزة جريدتين، تكنولوجيا الترميد مؤخرا واستخدمت لتصنيع أجهزة الاستشعار المتاح ومنخفضة التكلفة9،10،،من1112، 13 , 14-مقارنة بمواد معدني لينة والسائلة، مثل PDMS أو سو-8، دفرس يقدم العديد من الفوائد: (ط) كانت متوفرة في مجموعة متنوعة من التراكيب وسمك (من بضعة ميكرونات إلى عدة ملليمترات)؛ (ثانيا) بمساحة تقريبية جداً، مما يسهل الانضمام إلى مختلف المواد؛ (ثالثا) ميزة سمك ممتازة التوحيد؛ (رابعا) توفر التلفيق رخيصة وسهلة، والفائق لوسائل الإنتاج؛ (v) هي سهلة لقص مع مختلف أدوات منخفضة التكلفة، مثل زوج بسيط من مقص؛ و (سادسا) يسمح بإنشاء هياكل ثلاثية الأبعاد، مثل قنوات موائع جزيئية، التراص طبقات الترميد متعددة فوق بعضها البعض.
من ناحية أخرى، قد دفرس عموما قرار فقيرة نسبيا بالمقارنة مع مقاومات الضوء السائل، الذي هو أساسا الناجم عن سمك الفيلم وزيادة المسافة بين القناع والترميد بسبب إحباط الواقية، الذي يمكن بالإضافة إلى ذلك الضوء نثر. لا يزال، لتصنيع أجهزة الاستشعار موائع جزيئية متكاملة، دفرس عالية مناسبة لإنتاج منخفضة التكلفة.
ولذلك، نحن الموجودين في هذا العمل على تصنيع وتطبيق بيوسينسور على أساس الترميد موائع جزيئية الكهروكيميائية. يصف البروتوكول مفصلاً كل خطوة إنتاج منهاج بيوسينسور، والتثبيت على الرقاقة مقايسة نموذج القائم على الحمض النووي، وقراءات الكهروكيميائية استخدام تقنية وقف التدفق. ويتيح هذا المنبر العالمي الكشف عن العديد من أنواع من الجزيئات الحيوية، باستخدام تكنولوجيات الإنزيم مختلفة (مثلاً، علم الجينوم، سيلوميكس، والبروتينات) أو صيغ التحليل (مثلاً، قادرة على المنافسة، وساندويتش، أو مباشرة). استناداً إلى منصة الترميد، مجموعتنا سابقا بنجاح أثبت التقدير الكمي السريع والحساسة للتحاليل المختلفة، بما في ذلك المضادات الحيوية13،،من1516 (التتراسيكلين، بريستيناميسين، والمضادات الحيوية ß-لاكتام)، تروبونين أنا17، ومضمون ف18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تصنيع تكنولوجيا الترميد باستخدام Biosensor موائع جزيئية
- قوفرات إعداد بي.
جولة الركازة قص بي
- إلى 6 في الرقائق. وضع رقاقة PI في فرن على 120 درجة مئوية لحوالي 1 ح لخبز جفاف.
- الخطوة التصويرية الأولى لعملية زنتها.
- برنامج تدور-المغطى بوقت غزل 30-s على 3000 دورة في الدقيقة، مع تسارع 2,000 لفة في الدقيقة/س مكان يفر PI في سبين-المغطى وإصلاحه، وتطبيق فراغ. الاستغناء عن 2 مل من مقاومة، مما يتيح عملية انطلاقة، وبدء تشغيل البرنامج تدور المغطى. إزالة يفر من زيادة ونقصان-المغطى ولينة-خبز يفر PI على طبق ساخن لمدة 2 دقيقة في 100 درجة مئوية.
- ضبط قناع المرجوة للزخرفة أقطاب كهربائية على رقاقة PI بالعين المجردة وتعريضها إلى 400 مللي جول/سم 2 الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة (365 نانومتر). مكان يفر في وعاء مليئة بمطابقة مقاومة مطور في شاكر مداري والسماح لها بهزة قليلاً لدقيقة 1
- بعد إزالة مقاومة الزائد، استخدم دش شطف يفر PI بالمياه (المياه دي) على مقاعد البدلاء رطب والجاف لأنه بعد ذلك باستخدام الهواء المضغوط.
- ترسب البلاتين لتشكيل أقطاب كهربائية-
- تستخدم عملية ترسب بخار مادية قياسية لإيداع 200 نيوتن متر البلاتين على رقاقة 19-
- مكان يفر في وعاء. إضافة مزيل مطابقة للوعاء وإزالة المقاومة زنتها بينما قليلاً تهتز يفر على شاكر مداري حتى تتم إزالة جميع البلاتين الزائدة. شطف وتجفيف يفر بي كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
- التصويرية والخطوة الثانية: تشكيل طبقة العزل.
- وضع رقاقة PI في فرن يسخن إلى 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ليذوي إجرائه. S
- برنامج الخطوة الأولى زيادة ونقصان-المغطى إلى 5 من الغزل الوقت 500 لفة في الدقيقة. برنامج الخطوة الثانية لمدة 30 ثانية على 4000 لفة في الدقيقة، مع تسارع 700 دورة في الدقيقة/س.
- مكان يفر PI على زيادة ونقصان-المغطى وإصلاحه، وتطبيق فراغ. الاستغناء عن 4 مل من مقاوم الضوء على أساس الإيبوكسي المناسبة قبل بدء البرنامج تدور المغطى.
- لينة-خبز يفر المغلفة لمدة 3 دقائق عند 95 درجة مئوية على لوحة الساخن.
- ضبط القناع لطبقة العزل على رقاقة استخدام علامات محاذاة كل منهما وعدسة العين. كشف يفر إلى 100 مللي جول/سم 2 الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة (365 نانومتر).
- لخبز بعد تعرض، مكان الرقاقة على لوحة الساخن مسخن لمدة 2 دقيقة في 95 ° C.
- مكان يفر في وعاء ووضع المقاومة مع مطور مناسبة (مثل 1-ميثوكس-2-بروبيل-أسيتات لمدة 2 دقيقة، في حالة سو-8) على شاكر مداري.
- شطف يفر بي أولاً بالكحول وثم شطف والجافة كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
- الثابت-خبز مقاوم الضوء في فرن ح 3 على 150 درجة مئوية.
- ساعد البلازما التنظيف من أقطاب كهربائية-
- لإزالة بقايا مقاوم الضوء، واستخدام البلازما الأوكسجين مع وحدة بلازما قياسية. ابدأ تشغيل برنامج التنظيف، استخدام طاقة التردد المنخفض 200-ث مع تدفق 100% O 2، بمعدل 250 sccm، ومجموع وقت الحد الأدنى 3
- مكان يفر بي إلى غرفة البلازما وإصلاح الرقاقة على اللوحة على أسس استخدام أغطية الزجاج، وبدء عملية البلازما.
- الفضة وترسيب كلوريد الفضة: إنشاء قطب مرجعي على شريحة.
- باسيفاتي جهة الاتصال البلاتين منصات ليفر مع شريط لاصق حساسة للأشعة فوق البنفسجية. قطع إحباط 5 ملم على نطاق المنظومة و 11 سم طوله المشارب وإرفاقها ليفر، حماية أجزاء لا تودع الفضة.
- ترسيب الفضة، وضع حمام سونيك (35 كيلو هرتز) في خزانة الأبخرة وإدراج حاوية الحل اﻻلكتروﻻيت الفضة (100 غرام/لتر Ag، الأس الهيدروجيني 12.5) في الحمام. تعيين حمام سونيك إلى درجة حرارة الغرفة والسلطة إلى 10%-
تنبيه: حلول اﻻلكتروﻻيت الفضة شديدة السمية وينبغي التعامل معها بعناية فائقة. ينبغي ابدأ أن استنشاق الأبخرة.
الاتصال - الاتصال الجزء الأكبر من أقطاب مرجع مصدر الحالي مستمر. توصيل العداد الكهربائي، سلك فضة هي مغمورة في الحل اﻻلكتروﻻيت الفضة، إلى مصدر الحالية باستخدام كابلات الاتصال القياسية.
- تعيين المصدر الحالي للعاصمة وكثافة التيار-4.5 mA/سم 2، مما أدى إلى معدل ترسيب فضة حوالي 0.3 ميكرومتر/دقيقة بدء حمام سونيك واسمحوا المصدر الحالي تشغيل ل 10 دقيقة شطف يفر مع المياه دي
- لإضافة الكلور مسرى مرجع، إدراج سفينة من 0.1 متر كلوريد البوتاسيوم (بوكل) الحل في الحمام سونيك. ربط جهة الاتصال الأكبر يفر وقطب البلاتين التي هي مغمورة في حل بوكل مع المصدر الحالي المستمر-
- تعيين المصدر الحالي للعاصمة وكثافة التيار +0.6 mA/سم 2، أسفر عن معدل ترسيب تقريبا 0.075 ميكرومتر/دقيقة بدء حمام سونيك واسمحوا المصدر الحالي تشغيل ل 7.5 دقيقة
- الشطف وجاف PI رقاقة، كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
- إزالة الشريط حساسة للأشعة فوق البنفسجية بعد الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) تعرض 300 مللي جول/سم 2 والشطف وجاف يفر PI، مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
- التصويرية الخطوة الثالثة: "استخدام دفرس" لإنشاء قنوات موائع جزيئية.
- قص الطبقات الترميد اللازمة إلى حجم مماثل ليفر (20 × 20 سم 2). إصلاح القناع المطلوب على وحدة التعرض ومحاذاة الطبقة الترميد على قناع باستخدام العين المجردة. تسليط الضوء المقاومة مع 250 مللي جول/سم 2 الأشعة فوق البنفسجية ضوء (365 نانومتر).
- إزالة رقائق واقية من مقاوم الضوء وتطوير المقاومة لحوالي 2 دقيقة (اعتماداً على بنيات) في محلول كربونات الصوديوم (Na 2 CO 3) 1% استخدام حمام سونيك قياسية (35 كيلو هرتز) يسخن إلى 42 درجة مئوية وقوة سونيك من 100%. وقف رد الفعل فورا، اهتز مقاومة لمدة 1 دقيقة في حمام HCl 1% على شاكر مداري. شطف وتجفيف كل طبقة الترميد، كما هو موضح في الخطوة 1.2.3.
ملاحظة: في المجموع، أربع طبقات الترميد بحاجة إلى معالجتها كما هو مذكور في الخطوة 1، 7: طبقة قناة واحدة وطبقة غلاف واحد واثنين من طبقات المؤخر (منع في بيوسينسور من الانحناء في النهاية)-
- طبقات التصفيح الترميد على الركازة بي.
- مكان يفر PI على رقائق النفقات عامة شفافية وإصلاحه باستخدام شريط لاصق القياسية. ضبط طبقة الترميد القناة على رقاقة PI تحت مجهر، استخدام بنيات محاذاة كل منهما.
- للتصفيح، استخدم تغليف رول ساخنة قياسية وتسخَّن لفة الأعلى إلى 100 درجة مئوية ولفه أسفل إلى 60 درجة مئوية. تعيين الضغط على شريط 3، بسرعة إلى الأمام من 0.3 متر/دقيقة مكان يفر مع طبقة الترميد الثابتة في وسط تغليف و بدء تشغيله؛ الترميد دفع من خلال تغليف. كرر الخطوة بعد التناوب يفر من 180°.
- لمنع الانحناء بيوسينسور، الغلاف البلاستيكي طبقتين المؤخر المتقدمة على رقاقة اتباع الخطوات 1.8.1-1.8.2.
- توظيف حاجزاً وقف مسعور وختم الرقاقة.
وضع طبقة واقية من الجانب الأمامي للقناة الترميد
- إزالةأية عن طريق وضع شريط لاصق القياسية في نهاية واحدة من الترميد سحبه إلى أعلى. استخدام موزع يد مع 0.004 في أنابيب إلى الاستغناء عن قطرات صغيرة من تترافلوروايثيلين الذائبة في الآبار طبقة العزل. لختم رقاقة موائع جزيئية، صفح في تغطية الترميد طبقة على طبقة القناة، كما هو موضح في الخطوة 1.8.
- الثابت الخبز biosensor موائع جزيئية.
رقائق
- إزالة جميع الحماية على الغطاء والمؤخر طبقات الترميد. قطع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية إلى شرائح استخدام زوج من مقص عادي. علاج رقائق البطاطس في فرن على 160 درجة مئوية حاء 3
2. فحص التثبيت الداخلي على رقاقة
- الامتزاز avidin في مجال تجميد القناة.
- تعد حلاً عبدين 100 ميكروغرام/مل في 10 مم مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) في الرقم الهيدروجيني 7.4.
- الاستغناء عن 2 ميليلتر من محلول عبدين على المدخل من بيوسينسور-
ملاحظة: القناة مليء بالقوى الشعرية حتى يصل السائل إلى الحاجز وقف مسعور. - لضمان أن يبقى فلويديك التوقف عند الحاجز خلال فترة حضانة كاملة، الاستغناء عن 2 ميليلتر دي بالمياه على منفذ للرقاقة. احتضان الرقاقة عند 25 درجة مئوية ح 1 في حاوية مغلقة. إزالة
- الكواشف الزائدة من خلال مدخل للرقاقة بتطبيق فراغ. أغسل القناة مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (برنامج تلفزيوني مع 0.05% 20 توين)، تخليها على منفذ بينما يجري تطبيقه في الفراغ. الجاف للقناة لمدة 30 ثانية بينما يجري تطبيق الفراغ.
- حجب سطح القناة تمنع الربط غير محدد-
- تعد حلاً ألبومين المصل بقرى (BSA) 1% في 10 ملم برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني 7.4.
- ماصة 2 ميليلتر من حل جيش صرب البوسنة 1% على المدخل و 2 ميليلتر من المياه دي على مخرج القناة. احتضان الرقاقة عند 25 درجة مئوية ح 1 في حاوية مغلقة. إزالة الزائدة الكواشف والجاف للقناة كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.
- أوليجوس "الحضانة للحمض النووي" المسمى مع البيوتين و 6-FAM.
- إعداد تركيزات مختلفة (0.001-5 ميكرومتر) من الحمض النووي الحل في 10 ملم برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني 7.4.
- الاستغناء عن 2 ميليلتر من تركيز واحد من الحل الحمض النووي على المدخل و 2 ميليلتر من المياه دي على المنفذ. احتضان الرقاقة عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاوية مغلقة.
- كرر الخطوة 2.3.2 لتركيزات الحمض النووي الأخرى استخدام رقائق إضافية بيوسينسور-
- إزالة الزائدة الكواشف والجاف للقناة كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.
- المسمى "التثبيت من جو" الأجسام المضادة 6-الاتحاد الماليزي-
- وضع تركيز 5 ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة 6-الاتحاد الماليزي في 10 ملم برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني 7.4.
- إدخال 2 ميليلتر من حل جسم المدخل و 2 ميليلتر DI-المياه بالمأخذ للقناة. احتضان الأضداد المسمى عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاوية مغلقة. إزالة الكواشف الزائدة، كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.
3. أمبيروميتريك إشارة الكشف عن استخدام تقنية وقف تدفق
- إعداد الحل الركيزة لكشف الكهروكيميائية.
- صياغة حل جلوكوز 40 ملم في برنامج تلفزيوني م 0.1 في الرقم الهيدروجيني 7.4 في مياه نقية جداً-
- للعلاج الأولية وإعداد حل م 0.1 برنامج تلفزيوني في الرقم الهيدروجيني 7.4 في مياه نقية جداً-
- المعاملة الأولية من أقطاب العمل.
- استخدام حامل رقاقة مصنوعة خصيصا للسماح للموضع السهل الرقاقة واتصال فلويديك والكهربائية- كهربائياً الاتصال
- بيوسينسور بوتينتيوستات. ضمان الاتصال فلويديك القناة موائع جزيئية لمضخة الحقن وكاشف الخزان باستخدام محول مصنوعة خصيصا وأنابيب. بدء تشغيل الكمبيوتر المحمول متصل بوتينتيوستات وبدء تشغيل وحدة تحكم مضخة الحقن، التحكم في تدفق فلويديك من خلال الرقاقة.
- بدء تشغيل مضخة الحقن يدوياً، مع برنامج تلفزيوني 0.1 متر بمعدل تدفق 20 ميليلتر/دقيقة. في مسرى العامل مقابل مسرى إشارة على شريحة، تنطبق جهد متناوبة من 0.8 و-0.05 V 5 s لدورات 30. وفي أعقاب ذلك، أكسدة مسرى العامل عن طريق تطبيق جهد 0.8 V 60 س.
- قراءات الفحص باستخدام تقنية توقف التدفق.
- لبدء قراءات إشارة المقايسة، انتظر حتى تستقر إشارة الحالية المقاسة. إيقاف المضخة المحاقن والتبديل الكاشف من برنامج تلفزيوني م 0.1 إلى الحل الجلوكوز عيار 40 ملم وبدء تشغيل البرنامج في وحدة تحكم مضخة الحقن؛ فإنه سيقوم تلقائياً بإيقاف تدفق 1 أو 2 أو 5 دقائق وسوف ثم أعد تشغيل التدفق مرة أخرى. مراقبة الذروة الحالية الناتجة.
ملاحظة: لتحليل البيانات، أما ذروة الحالي أو المسؤول عن الذروة يمكن اعتبارها، كما هو موضح في نموذج لقراءات الإشارات الكهروكيميائية ( الشكل 2).
- لبدء قراءات إشارة المقايسة، انتظر حتى تستقر إشارة الحالية المقاسة. إيقاف المضخة المحاقن والتبديل الكاشف من برنامج تلفزيوني م 0.1 إلى الحل الجلوكوز عيار 40 ملم وبدء تشغيل البرنامج في وحدة تحكم مضخة الحقن؛ فإنه سيقوم تلقائياً بإيقاف تدفق 1 أو 2 أو 5 دقائق وسوف ثم أعد تشغيل التدفق مرة أخرى. مراقبة الذروة الحالية الناتجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تصميم وتصنيع منصة Biosensor موائع جزيئية:
تصنيع الرقائق biosensor موائع جزيئية حققتها على الرقاقة--المستوى تقنيات فوتوليثوغرفيك القياسي استخدام طبقات متعددة من الترميد. تعتمد استراتيجية تصنيع هذا على تصفيح الطبقات المتقدمة من دفرس على الركازة PI منقوشة البلاتين، تشكل القنوات موائع جزيئية. ويرد موجز قصير يصور خطوات تصنيع مختلفة في الشكل 1. رقاقة واحدة في 6-تضم 130 موائع جزيئية أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، كل مع بعدا من أبعاد 8 × 10 مم2.
رقم 1. التوضيح الرسومية من خطوات تصنيع مختلفة لمنصة biosensor موائع جزيئية. أ) جولة الركازة قطع بي إلى 6 في الرقائق. ب) التعرض الإمكان زنتها المغلفة بزيادة ونقصان مقاومة استخدام قناع كل منها للزخرفة البلاتين. ج) الركيزة بعد التعرض، ومرة أخرى بعد التعرض، وتطوير مقاوم الضوء. د) المادية بخار ترسب من البلاتين على الركازة. ه) انطلاقة عملية لإزالة مقاوم الضوء الزائد. و) تدور-طلاء من سو-8، تشكيل طبقة عزل. ز) س2 بلازما عملية لإزالة بقايا سو-8 على أقطاب حزب العمال. ح) غلفانيه ترسب مسرى مرجع Ag/AgCl. ط) التعرض للأشعة فوق البنفسجية والتنمية من مختلف الطبقات الترميد. ي) تصفيح طبقات الترميد على رقاقة PI. ك) تترافلوروايثيلين Dispensing حلها، تشكل حاجزاً وقف مسعور بين الشعرية التثبيت وخلية كهروكيميائية. l) بيوسينسور موائع جزيئية الكهروكيميائية النهائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كل بيوسينسور ويتكون من قناة واحدة موائع جزيئية، مفصولة حاجزاً وقف مسعور إلى مناطق منفصلة اثنين: قسم التثبيت وخلية كهروكيميائية، تميز بالأحمر والأزرق، على التوالي، في الشكل 2. تجميد جزء من microchannel قد وحدة تخزين سطحي 10.34 مم2 وحجم 580 nL، مما أدى إلى نسبة حجم سطح عالية لمن 155 سم-1. خلية كهروكيميائية يشمل قطب مرجع كلوريد فضة/فضة على شريحة والعداد والقطب العامل البلاتين. هذا الفصل بين مجال التثبيت وقراءات الكهروكيميائية للمقايسة يمنع أي تلوث للأقطاب مع الجزيئات الحيوية وبالتالي يحول دون قاذورات القطب. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن القياس الدقيق من الكواشف التثبيت بملء الشعرية.
رقم 2. شكل توضيحي لمبدأ العمل بمنهاج موائع جزيئية الكهروكيميائية. أ) الخطط لفحص نموذج استناداً إلى عبدين. ب) صورة فوتوغرافية ل biosensor موائع جزيئية عرض عناصره الرئيسية، بما في ذلك وقف الجدار الفاصل (SB) ومسرى العامل (نحن)، العداد الكهربائي (CE) ومسرى مرجع (RE). يتم تمييز منطقة التثبيت باللون الأحمر، ويتم تمييز الخلايا الكهروكيميائية باللون الأزرق. ج) التخطيطي رد فعل أكسدة فوق أكسيد الهيدروجين المنتجة في مسرى Pt العامل للكشف عن أمبيروميتريك داخل الخلايا الكهروكيميائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
عن طريق استخدام دفرس لتصنيع أجهزة الاستشعار، يسمح بعملية التصنيع الفائق على الرقاقة--المستوى. لذلك، يمكن الاحتفاظ التكاليف إلى الحد أدنى. تطوير جميع الترميد الطبقات يتم القيام به باستخدام أقنعة إحباط بسيطة ومنخفضة التكلفة، ووحدة تعرض فراغ، بدلاً من أن تكون مكلفة الكروم أقنعة وراصفه قناع. وباﻹضافة إلى ذلك، تخفيضات الحد خطوات عملية تنظيف الغرف الضرورية إلى أدنى حد تكاليف التصنيع أكثر. وفي المجموع، يستغرق الإجراء تلفيق عبء عمل من ح 10 تقريبا، باستثناء الأوقات الخبز وترسب بخار المادية من البلاتين.
على رقاقة حضانة المقايسة:
ويتم في الحضانة مقايسة على شريحة فقط من قبل القوى الشعرية. قبل بيبيتينج قطرات من الكواشف المختلفة على مدخل القناة موائع جزيئية، السوائل تدفعها من خلال القناة الشعرية العمل حتى تصل إلى الحاجز وقف مسعور. ظروف حالة ثابتة، ثم هي المحتضنة الكاشفات لفترة متميزة. هذا النظام السلبي يمكن ملء الشعرية للقناة، دون الحاجة إلى أي من الأجهزة الخارجية مثل مضخة الحقن، ويسمح لدقة القياس من الكواشف، كالسائل تلقائياً يتوقف عند حاجز التوقف. أيضا، سير العمل يتفق مع أليسا التقليدية وأنه يعمل مع السوائل عالية اللزوجة مثل المصل أو الدم.
غرض هذه التجربة، يتجلى العملية رقاقة مقايسة اختبار بسيط استخدام تفاعل البيوتين عبدين، كما هو مبين في الشكل 2. يبدأ حضانة مقايسة على شريحة مع امتزاز عبدين إلى السطح الشعرية ح 1، تليها خطوة حظر مع جيش صرب البوسنة لآخر ح 1. وفي وقت لاحق، هو المحتضنة 6-الاتحاد الماليزي/البيوتين-المسمى الحمض النووي في تجميد الشعرية لمدة 15 دقيقة، حيث أنها تربط بين جزيئات عبدين. بين كل خطوة الاحتضان، تتم إزالة أي الجزيئات الحيوية غير منضم بخطوة غسيل. يتم تطبيق المخزن المؤقت الغسيل عبر منفذ قناة باستخدام محول فراغ مصنوعة خصيصا. في الخطوة الأخيرة، يتم إدخال الجلوكوز أوكسيديز المسمى أنتيفلوريسسين الأجسام المضادة للقناة لمدة 15 دقيقة. وبعد ذلك، بيوسينسور جاهز لقراءات الكهروكيميائية، استخدام حل جلوكوز 40 ملم كالركيزة.
قراءات إشارة أمبيروميتريك باستخدام تقنية إيقاف التدفق:
لقراءات إشارة للانزيم المعطل تداولها، يمكن اكتشاف المنتج الإنزيمات (هنا، ح2س2)، أنتجت حضور على الركازة، السكر، اليكتروتشيميكالي في مسرى العامل في خلية كهروكيميائية. تحقيقا للكشف السريع جنبا إلى جنب مع تضخيم الإشارات، هو أسلوب وقف تدفق ما يسمى المستخدمة13. في هذا الأسلوب، هو وقف تدفق الركازة، الأمر الذي يؤدي إلى تراكم المنتج داخل شعري. كمية إنتاج ح2س2 ولذلك يعتمد على مقدار أوكسيديز الجلوكوز منضم ويعتمد على مقدار بيوتينيلاتيد منضم الحمض النووي. قبل إعادة تشغيل التدفق، بعد ذلك يتم مسح ح2س2 تركيز معزز من خلال الخلية الكهروكيميائية القياس، أسفر عن إشارة ذروة الحالية، كما هو موضح في الشكل 3.
لتحليل البيانات، ويوفر هذا الأسلوب إيقاف تدفق معلمتين من معلمات مختلفة: أقصى ارتفاع، والمسؤول عن (أي، التكامل) من إشارة الذروة. كل المعلمات طرديا مع الوقت وقفوذلك يمكن استخدامها لتحليل البيانات. في ضوء تقييم البيانات، عند استخدام في ذروة الذروة، يتوقف الارتفاع إشارة على أقصى تركيز2 2س ح وبالتالي على معامل نشر به ووقت الإيقاف التطبيقية. أطول فترة توقف، وكلما زادت استجابة الإشارات المقاسة. لهذا السبب، ذروة الذروة قياس يظل ثابتاً، وصولاً إلى طول الحد أدنى من تعطيل تداول الشعرية. تسمح هذه الميزة الخاصة لتقنية وقف تدفق لانخفاض حاد في أبعاد رقاقة، لا سيما في طول الشعرية، مع الحفاظ على حساسية أجهزة الاستشعار.
الشكل 3. نموذج قراءات الإشارات الكهروكيميائية التي يتم الحصول عليها عادة من الإنزيم المرتبط بالانزيم استخدام تقنية توقف التدفق. أ) وقد طبق تدفق الحل الجلوكوز 40 ملم بمعدل 20 ميليلتر/دقيقة. خلال مرحلة توقف (1 أو 2 أو 5 دقائق)، ما زال إنتاج إنزيم ح2س2 . عن طريق إعادة تشغيل التدفق، يتم مسح المتراكمة2س ح2 عن طريق خلية كهروكيميائية، حيث اليكتروتشيميكالي الكشف عن فوق أكسيد الهيدروجين. بتكرار القياس عدة مرات (أشرطة الخطأ؛ وزارة شؤون المرأة)، منحنى معايرة على شريحة ب) يتم الحصول عليها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتيح البروتوكول المعروضة هنا لتلفيق biosensor الكهروكيميائية موائع جزيئية تطوير منصة منخفضة التكلفة والمدمجة، وسهلة الاستخدام للكشف عن الجزيئات الحيوية. اعتماداً على المقايسة تستخدم بعد ذلك على بيوسينسور، ويمكن الكشف عن العديد من المؤشرات الحيوية المختلفة. وهذا يجعل المنصة متعددة جداً ويوفر الوصول بشكل واسع في مختلف مجالات التطبيقات، من اختبارات التشخيص القياسية (مثلاً، تحديد وجود أمراض معينة في مكتب الطبيب) لتطبيقات نقطة من الرعاية (مثلاً، مراقبة المريض للعقاقير العلاجية استعملوا العلاج بالعقاقير). لا سيما في نقطة من الرعاية التشخيص، المنمنمة أجهزة استشعار العوامل البيولوجية لها العديد من المزايا على الأساليب التقليدية، التي عادة ما تتطلب معدات المختبرات واسعة والموظفين المتخصصة، وكاشف كبير وحجم العينة، وقد تحول طويلة مرات.
تصنيع هذا biosensor يتطلب دقة في أعقاب البروتوكول؛ خلاف ذلك، يمكن أن تحدث مشاكل التصنيع. واحدة من القضايا التي لوحظت في أغلب الأحيان هو اختلالها طبقات مختلفة. وهذا يمكن حلها بسهولة باستخدام جهاز أكثر تطورا لعملية التصنيع، مما يسمح لمحاذاة أسهل وأكثر دقة من طبقات مختلفة.
تكنولوجيا الترميد يوفر إمكانية تصنيع سريعة ومنخفضة التكلفة. من ناحية أخرى، أن التكنولوجيا محدودة فيما يتعلق بالقرار. على سبيل المثال، لا يمكن أن تتحقق قنوات موائع جزيئية من هياكل صغيرة جداً (أقل من 100 ميكرومتر) باستخدام البروتوكول المعروضة هنا. في هذه حالة، يجب أن يؤديها التصويرية راصفة قناع عالية الدقة مع الزجاج فوتوماسكس. وباﻹضافة إلى ذلك، قناة جداً على نطاق يمكن أيضا إشكالية، حيث يمكن أن ينحني القناة الأسفل والحد من الارتفاع للقناة والتأثير على سلوك الرقاقة موائع جزيئية.
ونحن نعتقد أن التكنولوجيا الترميد سيكون حاضرا أكثر في التطبيقات المستقبلية لأنه يمكن قياسه بسهولة للاستخدام التجاري. وسيكون الإنتاج الشامل لأجهزة الاستشعار المستندة إلى الترميد موائع جزيئية لا عائق عندما يضرب السوق نظراً لأن هذه التقنية راسخة في ميادين أخرى من التطبيق (مثلاً، مرنة للإلكترونيات).
فيما يتعلق بالحد من الطابع المعقد للنظام برمته، عملنا في المستقبل سوف تركز على تصميم وتنفيذ خرطوشة المتاح موائع جزيئية يتضمن رقاقة بيوسينسور؛ خزان نفايات؛ والكاشفات محملة مسبقاً، مثل المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وغيرها من مكونات المقايسة. لقياس أمبيروميتريك، يمكن ثم توفير تسليم العينة والكواشف الأخرى التي تعمل بالهواء المضغوط يشتغل. هذا سوف يقوم بها القارئ يده وسينتقل عن طريق رقاقة موائع جزيئية biosensor إلى مستودع لنفايات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) للتمويل جزئيا هذا العمل في إطار منحة أرقام أور 70/10/01 وجولة أوروغواي 70/12-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
- Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
- Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
- Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
- Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).
- Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
- Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. , 7,691,623 (2010).
- Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
- Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
- Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
- Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
- Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).
- Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
- Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , Elsevier Inc. (2010).
