Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift

Published: September 19, 2017 doi: 10.3791/56105
Automatic Translation
*1, *1,3, 1,2, 1,2
1Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 2Freiburg Materials Research Center, University of Freiburg, 3Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich
* These authors contributed equally

Summary

En mikrofluid biosensor platform blev designet og fremstillet ved hjælp af billige tør film photoresist teknologi for den hurtige og følsomme kvantificering af forskellige analysander. Denne enkelt-bruger system giver mulighed for den elektrokemiske udlæsning af on-chip-immobiliseret enzym-forbundet assays ved hjælp af stop-flow teknik.

Abstract

I de seneste år blev biomarkør diagnostik et uundværligt værktøj til diagnosticering af sygdom hos mennesker, især for punkt af care diagnostics. En nem at bruge og billig sensor platform er meget eftertragtede til at måle forskellige typer af analysander (fx biomarkører, hormoner og narkotika) kvantitativt og specifikt. Derfor blev tør film photoresist teknologi - så billige, letkøbt, og høj overførselshastighed fabrikation - brugt til at fremstille mikrofluid biosensor præsenteres her. Afhængigt af bioassay bruges bagefter, er den alsidige platform i stand til at opdage forskellige typer af biomolekyler. Til fabrikation af enheden, er platin elektroder struktureret på en fleksibel Polyimid (PI) folie taktfast kun rense-værelse proces. PI folie serverer som substrat for elektroder, som er isoleret med en epoxy-baserede photoresist. Mikrofluid kanalen er efterfølgende genereret af udvikling og laminering af tør film photoresist (DFR) folier på PI wafer. Ved hjælp af en hydrofobe stoppe barriere i kanal, kanal er opdelt i to konkrete områder: en immobilisering sektion for enzym-forbundet analysen og en elektrokemisk måling celle for amperometric signal udlæsning.

På chip bioassay immobilisering udføres af adsorptionen af biomolekyler kanal overflade. Glucose stavbakterier enzym er brugt som en transducer for elektrokemisk signal generation. I nærværelse af substrat, glukose, er hydrogenperoxid produceret, som er registreret på platin arbejder elektrode. Stop-flow teknikken anvendes for at opnå signal forstærkning sammen med hurtig påvisning. Forskellige biomolekyler kan kvantitativt måles ved hjælp af indført mikrofluid-systemet, giver en indikation af forskellige typer af sygdomme, eller med hensyn til terapeutiske drug monitorering, lette en personlig terapi.

Introduction

I de seneste to årtier blevet diagnostiske programmer elementære for dybtgående undersøgelser af udviklingen af globale offentlige sundhed. Traditionelt, bruges laboratorium diagnostiske værktøjer til påvisning af sygdomme. Selvom de stadig spiller en central rolle i diagnosticering af sygdomme, punkt af pleje test (POCT) udført i nærheden af patienten eller af patienten selv er blevet mere og mere almindeligt i de seneste år. Især i sådanne tilfælde, der kræver øjeblikkelig behandling, såsom akut myokardieinfarkt eller diabetes overvågning, er hurtig bekræftelse af en klinisk fund afgørende. Der er derfor et voksende behov for POCT udstyr der kan betjenes af ikke-eksperter og der er samtidig i stand til at udfører præcise in vitro- diagnostiske prøver i en kort tid1,2,3,4 .

Bemærkelsesværdige forbedringer har allerede opnået inden for POCT. Men der er stadig mange udfordringer at overvinde5,6,7,8. For en POCT platform til at blive lanceret med succes på markedet og være konkurrencedygtige med laboratorie diagnostik, enheden strengt skal opfylde følgende krav: (i) give præcise og kvantitative testresultater, der er i overensstemmelse med laboratorium resultater; (ii) har kort prøve at resultatet gange, gør det muligt for den umiddelbare behandling af patienten. (iii) funktionen ukompliceret og nem håndtering, selv når drives af utrænede personer, og kræver minimeret brugerindgriben; og (iv) består af en billig sensor enhed designet til engangsbrug applikationer. Derudover er udstyr-gratis diagnostics gunstige, især i ressource-fattige miljøer3,4,6.

På grund af disse strenge krav, er kun to POCT systemer baseret på elektrokemisk detektion (f.eks. blod glucose test strips) og laterale flow immunassays (fx hjem graviditetstests) blevet lanceret med succes på markedet så langt. Men begge systemer lider af ulemper såsom ringe ydelse (dvs. blod glucose overvågning har unøjagtige testresultater og laterale flow assays kun giver kvalitative (positive eller negative) måleresultater)4, 6. Disse ulemper af konventionelle POCT systemer har ført til en stigende efterspørgsel på at udforske nye teknologier, der tilbyder hurtig, billig og kvantitativ påvisning ved pleje4,5.

For at imødekomme disse udfordringer POCT udstyr, har DFR teknologi været for nylig ansat for fabrikation af engangs og billig biosensorer9,10,11,12, 13 , 14. i forhold til bløde og flydende Litografisk materialer, såsom PDMS eller SU-8, DFRs præsentere mange fordele: de (i) er tilgængelige i en række kompositioner og tykkelser (fra nogle få mikrometer til flere millimeter); (ii) har en meget ru overflade område, der fremmer vedhæftning på forskellige materialer; (iii) funktion fremragende tykkelse ensartethed; (iv) tilbyde billig, letkøbt og høj overførselshastighed fabrikation for masseproduktion; (v) er nemt at skære med forskellige lavprisselskaber værktøjer, som en simpel par saks; og (vi) tillader oprettelsen af tre-dimensionelle strukturer, såsom mikrofluid kanaler, ved at stable flere DFR lag oven på hinanden.

På den anden side har DFRs i almindelighed en relativt dårlig opløsning i forhold til flydende photoresists, som er hovedsageligt forårsaget af filmtykkelse og af den øgede afstand mellem masken og DFR på grund af den beskyttende folie, som desuden giver mulighed for lys spredning. Stadig, til fremstilling af integrerede mikrofluid biosensorer, DFRs er særdeles velegnet til billig masseproduktion.

Derfor arbejder vi i denne fremstilling og anvendelse af en DFR-baserede elektrokemisk mikrofluid biosensor. Den detaljerede protokollen beskriver hver produktion trin i biosensor platform, på chip immobilisering af en DNA-baseret forsøgsopstilling, og dens elektrokemiske udlæsning ved hjælp af stop-flow teknik. Denne universelle platform giver mulighed for påvisning af mange former for biomolekyler, ved hjælp af forskellige assay teknologier (f.eks. genomforskning, cellomics og proteomics) eller assay formater (fx konkurrencedygtige, sandwich eller direkte). Baseret på sådan en DFR platform, demonstreret vores gruppe tidligere med succes den hurtige og følsomme kvantificering af forskellige analysander, herunder antibiotika13,15,16 (tetracyklin, pristinamycin, og β-lactam antibiotika), troponin jeg17, og substans P18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fabrikation af mikrofluid Biosensor bruger DFR teknologi

  1. forberedelse af PI wafers.
    1. Cut en PI substrat til 6 - tommer runde vafler. Sætte PI wafer i ovnen ved 120 ° C i ca 1 time for en dehydrering bage.
  2. Første fotolitografi skridt for lift-off proces.
    1. Program spin-coater til en 30-s spinning tid ved 3000 rpm, med en acceleration på 2.000 omdr/s. sted PI wafer på spin-coater og ordne det, anvende et vakuum. Der afpipetteres 2 mL af en modstå, at aktivere lift-off proces, og starte programmet spin-coater. Fjerne wafer fra spin-coater og soft-bage PI wafer på en varm tallerken for 2 min. ved 100 ° C.
    2. Justere den ønskede maske for mønster elektroder på PI wafer med det blotte øje og udsætte den for 400 mJ/cm 2 UV lys (365 nm). Sted wafer i en skål fyldt med en resist-matching udvikler på en orbitalryster og lad det ryster lidt i 1 min.
    3. Efter den overskydende modstå er fjernet, bruge en bruser skyl PI wafer med deioniseret vand (DI-vand) på en våd bænk og tørre det bagefter ved hjælp af trykluft.
  3. Depositionen for platin for dannelsen af elektroderne.
    1. Bruger en standard fysiske damp deposition proces til indbetaling 200 nm af platinum på wafer 19.
    2. Sted wafer i en skål. Tilføje de tilsvarende remover til skålen og fjerne lift-off modstå mens lidt ryste wafer på en orbitalryster indtil alle overskydende platinum er fjernet. Skyl og tørlæg PI wafer som beskrevet i trin 1.2.3.
  4. Andet fotolitografi trin: danner laget isolering.
    1. Sætte PI wafer i ovnen forvarmes til 120 ° C i 5 min at dehydrere det.
    2. Program det første trin i en spin-coater til 5 s af spinning tid på 500 rpm. Programmere det andet skridt for 30 s ved 4,000 rpm, med en acceleration af 700 rpm/s.
    3. Placer PI wafer på spin-coater og ordne det, anvende et vakuum. Dispensere 4 mL af en passende epoxy-baserede photoresist før du starter programmet spin-coater.
    4. Soft-bage den coatede wafer i 3 min. ved 95 ° C på en varm tallerken.
    5. Justere maske til laget isolering på wafer ved hjælp af de respektive justering varemærker og en okulær linsen. Udsætte wafer at 100 mJ/cm 2 UV lys (365 nm).
    6. For en efterfølgende bages, placere wafer på en forvarmet varmeplade for 2 min. ved 95 ° C.
    7. Placere wafer i en skål og udvikle modstå med en egnet udvikler (f.eks. 1-methoxy-2-propyl-acetat i 2 min., i forbindelse med SU-8) på en orbitalryster.
    8. Skylles PI wafer først med isopropanol og skyl og tør det som beskrevet i trin 1.2.3.
    9. Hard-bag photoresist i ovnen i 3 timer ved 150 ° C.
  5. Plasma-assisteret rengøring af elektroderne.
    1. Til at fjerne photoresist rester, bruger ilt plasma med en standard plasma enhed. Starte programmet rengøring, med 100% O 2 flow, en sats på 250 sccm, og en samlet tid på 3 min. 200-W lav frekvens magt
    2. Placer PI wafer i plasma kammer, fastsætte wafer på jordet pladen ved hjælp af glas låg og starte plasma proces.
  6. Sølv og sølv chlorid deposition: oprettelse på chip-referenceelektrode.
    1. Passivate platin kontakt puder af wafer med en UV-følsomme selvklæbende tape. Skære folien til 5 mm bred og 11 cm lange striber og tillægger dem den wafer, beskytte dele ikke skal deponeres med sølv.
    2. For sølv deposition, sætte en sonic bad (35 kHz) i et stinkskab og indsætte en beholder med sølv elektrolyt opløsning (100 g/L Ag, pH-værdi 12,5) i badet. Sæt den sonic bad til stuetemperatur og magt til 10%.
      Forsigtig: Sølv elektrolyt løsninger er yderst giftige og skal håndteres med ekstrem forsigtighed. Dampene bør aldrig blive indåndet.
    3. Tilsluttes en konstant nuværende source bulk kontakt til reference elektroderne. Tilslut counter elektrode, en sølv wire, der er nedsænket i sølv elektrolyt opløsningen, den aktuelle datakilde ved hjælp af standard tilslutningskabler.
    4. Indstille den aktuelle kilde til DC og en strømtæthed af-4.5 mA/cm 2, hvilket resulterer i en sølv deposition på ca. 0,3 µm/min. Start sonic badet og lade den aktuelle kilde køre i 10 min. Skyl wafer med DI-vand
    5. Til chlorering af referenceelektrode, indsætte et fartøj af 0,1 M kaliumchlorid (KCl) løsning i sonic badet. Tilslut bulk kontakt wafer og en platin elektrode, der er nedsænket i KCl løsning med den konstante strømkilde.
    6. Indstille den aktuelle kilde til DC og en strømtæthed af +0.6 mA/cm 2, hvilket resulterer i en aflejring på ca 0.075 µm/min. Start sonic badet og lade den aktuelle kilde køre i 7,5 min.
    7. Skyl og tør PI wafer, som beskrevet i trin 1.2.3.
    8. Fjerne UV-følsomme tape efter en UV (365 nm) eksponering af 300 mJ/cm 2 og skyl og tør PI-wafer igen som beskrevet i trin 1.2.3.
  7. Tredje fotolitografi trin: Brug DFRs til at oprette mikrofluid kanalerne.
    1. Skære de nødvendige DFR lag til en størrelse svarer til wafer (20 x 20 cm 2). Fastsætte den ønskede maske på enhedens eksponering og justere DFR lag på masken med det blotte øje. Belyse modstå med 250 mJ/cm 2 UV lys (365 nm).
    2. Fjerne den beskyttende folie af photoresist og udvikle modstå for ca 2 min (afhængigt af strukturer) i en 1% natriumkarbonat (Na 2 CO 3) løsning ved hjælp af en standard sonic bad (35 kHz) forvarmes til 42 ° C og en sonic power på 100%. For at stoppe reaktionen straks, ryste modstå for 1 min i en 1% HCl bad på en orbitalryster. Skyl og tørlæg hver DFR lag, som beskrevet i trin 1.2.3.
      NOTE: I alt fire DFR lag skal behandles som nævnt i trin 1.7: én kanal lag, et cover lag og to bagside lag (forebyggelse af biosensor bøjning i slutningen).
  8. Laminering af DFR lag på PI substrat.
    1. Placere PI wafer på en gennemsigtighed overhead folie og ordne det ved hjælp af standard selvklæbende tape. Juster kanalen DFR lag på PI wafer under et mikroskop, ved hjælp af de respektive justering strukturer.
    2. For laminering, bruge en standard hot roll laminator og Forvarm top roll til 100 ° C og nederste roll til 60 ° C. sæt trykket til 3 bar med en fremad hastighed på 0,3 m/min. sted wafer med det faste DFR lag midt i laminator og Start det; DFR er skubbet gennem laminator. Gentag trin efter omløbende wafer af 180°.
    3. For at forhindre bøjning af biosensor, laminat de to udviklede bagside lag på wafer efter trin 1.8.1-1.8.2.
  9. Beskæftiger en hydrofobe stoppe barriere og forsegling chippen.
    1. Fjern det beskyttende lag fra forsiden af DFR kanal låØh ved at placere standard klæbebånd i den ene ende af DFR og trække det opad. Bruge en hånd dispenser med 0,004-i rør til at fritage små dråber af opløste polytetrafluorethylen i wells af isolering lag. For at forsegle mikrofluid chip, laminat dække DFR lag på lag kanal som beskrevet i trin 1.8.
  10. Hard-bagning mikrofluid biosensor.
    1. Fjern alle beskyttende foils på forsiden og bagsiden DFR lag. Skær biosensorer i strimler ved hjælp af en almindelig saks. Helbrede chips i en ovn ved 160 ° C i 3 h.

2. Immobilisering analyseprocedure på chip

  1. Adsorption af begærlighed i området immobilisering af kanalen.
    1. Forberede en 100 µg/mL begærlighed løsning i 10 mM fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved en pH på 7.4.
    2. Give afkald på 2 µL af begærlighed løsning på biosensor indfaldende.
      Bemærk: Kanalen er fyldt af kapillære kræfter indtil væsken når den hydrofobe stoppe barriere.
    3. Til at sikre, at de fluidic holder stop ved barrieren under den hele inkubationstiden, dispensere 2 µL af DI-vand på outlet af chippen. Inkuber chip ved 25 ° C i 1 time i en lukket beholder.
    4. Fjerne overskydende reagenser gennem indfaldende for chippen ved at anvende et vakuum. Vaske kanal med 50 µL af vaskebuffer (PBS med 0,05% Tween 20), udleveres på outlet mens vakuum anvendes. Tør kanalen for 30 s mens vakuum anvendes.
  2. Blokerer kanal overfladen for at hæmme uspecifik bindende.
    1. Der fremstilles en 1% bovint serumalbumin (BSA) opløsning i 10 mM PBS ved en pH på 7.4.
    2. Pipette 2 µL af 1% BSA løsningen på fjorden og 2 µL af DI-vand på outlet af kanalen. Inkuber chip ved 25 ° C i 1 time i en lukket beholder. Fjern overskydende reagenser og tørre kanalen som beskrevet i trin 2.1.4.
  3. Inkubation af DNA oligos mærket med biotin og 6-FAM.
    1. Forberede forskellige koncentrationer (0,001-5 µM) af DNA-løsning i 10 mM PBS ved en pH på 7.4.
    2. Give afkald på 2 µL af en koncentration af DNA løsning på fjorden og 2 µL af DI-vand på stikkontakten. Inkuber chip ved 25 ° C i 15 min i en lukket beholder.
    3. Gentag trin 2.3.2 de andre DNA koncentrationer ved hjælp af yderligere biosensor chips.
    4. Fjerne overskydende reagenser og tørre kanalen som beskrevet i trin 2.1.4.
  4. Immobilisering af GOx-mærket 6-FAM antistoffer.
    1. Formulere en 5 µg/mL koncentration af 6-FAM antistoffer i 10 mM PBS ved en pH på 7.4.
    2. Indføre 2 µL af opløsningen antistof til fjorden og 2 µL af DI-vand til outlet af kanalen. Inkuber de mærkede antistoffer ved 25 ° C i 15 min i en lukket beholder. Fjern de overskydende reagenser, som beskrevet i trin 2.1.4.

3. Amperometric Signal detektion ved hjælp af Stop-flow teknik

  1. forberedelse substratopløsning for elektrokemisk detektion.
    1. Formulere 40-mM glucose opløsning i 0,1 M PBS ved en pH på 7,4 i ultra-rene vand.
    2. For den indledende behandling, forberede en 0,1 M PBS løsning ved en pH på 7,4 i ultra-rene vand.
  2. Indledende behandling af de arbejdende elektroder.
    1. Brug specialfremstillet chip indehaveren til at tillade for nem placering af chip og en fluidic og elektrisk forbindelse.
    2. Elektrisk forbinde biosensor til potentiostat. Sikre den fluidic kontakt af mikrofluid kanalen til en sprøjten pumpe og reagens reservoiret ved hjælp af skræddersyede adapter og rør. Starte den bærbare computer, der er forbundet med potentiostat og start sprøjten pumpe controller, styre fluidic strømmen gennem chippen.
    3. Start sprøjten pumpe manuelt, med 0,1 M PBS med en væskehastighed på 20 µL/min. På arbejde elektrode versus på chip-referenceelektrode, anvende en skiftende spænding på 0,8 og-0.05 V for 5 s til 30 cykler. Efter dette, oxidere arbejder elektrode ved at anvende en spænding på 0,8 V for 60 s.
  3. Assay udlæsning ved hjælp af stop-flow teknik.
    1. At starte analysen signal udlæsning, vente, indtil den målte nuværende signal stabiliserer. Stoppe sprøjten pumpe og skifte reagens fra 0,1 M PBS til 40-mM glukose løsning og starte softwaren på sprøjten pumpe controller; det vil automatisk stoppe strømmen for 1, 2 eller 5 min og derefter genstarter strømmen igen. Observere den resulterende aktuelle top.
      Bemærk: For analysen af dataene, enten den aktuelle peak eller afgift for toppen kan betragtes, som beskrevet i modellen af en elektrokemisk signal udlæsning ( figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Design og fabrikation af mikrofluid Biosensor Platform:

Fabrikation af mikrofluid biosensor chips er realiseret på wafer-niveau af standard photolithographic teknikker beskæftiger flere DFR lag. Denne fabrikation strategi bygger på laminering af udviklede lag af DFRs på et platinum-mønstrede PI substrat, danner mikrofluid kanaler. Et kort resumé skildrer forskellige fabrikation trin som vist i figur 1. En enkelt 6 - tommer wafer omfatter 130 mikrofluid biosensorer, hver med en dimension af 8 × 10 mm2.

Figure 1
Figur 1. Grafisk illustration af de forskellige fabrikation trin i mikrofluid biosensor platform. a) cut PI substrat til 6 - tommer runde vafler. b) eksponering af et muligt spin-belagt lift-off modsætter sig at bruge de respektive maske for platin mønstre. c) substrat efter eksponering, efter eksponering ryggen og udvikle photoresist. d) fysisk dampudfældning Platinum på underlaget. e) lift-off proces til at fjerne den overskydende photoresist. f) spin-coating af SU-8, danner en isolering lag. g) O2 plasma proces at fjerne SU-8 rester på Pt elektroder. h) galvaniske aflejring af Ag/AgCl-referenceelektrode. i) UV-eksponering og udvikling af forskellige DFR lag. j) laminering af DFR lag på PI wafer. k) udlevering løst polytetrafluorethylen, danner en hydrofobe stoppe barriere mellem immobilisering kapillær og elektrokemiske celler. l) endelige elektrokemisk mikrofluid biosensor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Hver biosensor består af en mikrofluid kanal, opdelt i to særskilte områder ved en hydrofobe stoppe barriere: en immobilisering sektion og en elektrokemiske celler, markeret med rød og blå, henholdsvis i figur 2. Immobilisering del af microchannel har en overflade volumen af 10.34 mm2 og et volumen på 580 nL, hvilket resulterer i en høj overflade-til volumen-forholdet på 155 cm-1. Elektrokemiske celler omfatter en på chip sølv/sølvchloridelektrode som referenceelektrode og en counter og arbejder platin elektrode. Denne adskillelse af området immobilisering og den elektrokemiske udlæsning af analysen forhindrer enhver forurening af elektroder med biomolekyler og derfor hæmmer elektrode begroning. Derudover kan den præcise måling af immobilisering reagenser kapillær fyldning.

Figure 2
Figur 2. Illustration af den Funktionsprincip af elektrokemiske mikrofluid platform. a) skema i en forsøgsopstilling, baseret på begærlighed. b) fotografi af mikrofluid biosensor viser dens vigtigste elementer, herunder counter elektrode (CE), referenceelektrode (RE), arbejder elektrode (WE) og stoppe barriere (SB). Immobilisering område er fremhævet med rødt, og elektrokemiske celler er markeret med blåt. c) skematiske reaktion af oxidation af den producerede brintoverilte på Pt arbejder elektrode til amperometric påvisning inde i cellen elektrokemiske. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Ved at ansætte DFRs for fabrikation af sensoren, fremstillingsprocessen giver mulighed for høj overførselshastighed på wafer-niveau. Derfor kan omkostningerne holdes nede på et minimum. Udviklingen af alle DFR lag er sker ved hjælp af simple og billige folie masker og et vakuum eksponering enhed, snarere end dyre krom masker og en maske aligner. Derudover skærer reduktion af de nødvendige rydde værelse proces skridt til et minimum omkostningerne for fabrication endnu mere. I alt tager proceduren fabrikation en arbejdsbyrde på ca 10 h, undtagen de bagning gange og fysisk dampudfældning af platin.

Chip Assay inkubation:

På chip assay inkubationen sker kun ved kapillære kræfter. Af pipettering dråber af forskellige reagenser på inlet af mikrofluid kanalen, er væskerne drevet gennem kanalen af kapillarvirkning handling indtil de når den hydrofobe stoppe barriere. Under steady-state-betingelser, er reagenser derefter inkuberes i en særskilt tid. Denne passivt system gør det muligt for kapillær påfyldning af den engelske kanal, uden savn i hvilken som helst ekstern instrumentering som en sprøjten pumpe, og giver mulighed for præcis måling af reagenser, som væsken automatisk stopper ved standsning barriere. Også, arbejdsprocessen er overens med en konventionel ELISA og det virker med høj viskositet væsker som serum eller blod.

Med henblik på dette eksperiment, er handlingen chip påvist ved en simpel test assay beskæftiger begærlighed-biotin interaktion, som vist i figur 2. Chippen assay inkubation starter med adsorption af begærlighed kapillær overflade for 1 h, efterfulgt af en blokerende skridt med BSA i en anden 1 time. Efterfølgende er 6-FAM/biotin-mærket DNA udruget i immobilisering kapillær for 15 min, hvor det binder sig til begærlighed molekyler. Mellem hver inkubation skridt fjernes enhver ubundne biomolekyler ved en vask trin. Wash buffer er anbragt via den kanal stikkontakt ved hjælp af en skræddersyet vakuum adapter. I det sidste trin, er glucose stavbakterier-mærket antifluorescein antistoffer indført til kanalen i 15 min. Ovenpå er biosensor klar til den elektrokemiske udlæsning, bruger en løsning med 40-mM glukose som substrat.

Amperometric Signal udlæsning ved hjælp af Stop-flow teknik:

For signal udlæsningen af immobiliserede analysen, kan enzymer produktet (her, H2O2), produceret i overværelse af sit bæremateriale, glukose, påvises elektrokemisk på arbejde elektrode i elektrokemiske celler. For at opnå hurtig detektion sammen med signal forstærkning, er det såkaldte stop-flow teknik brugt13. I denne metode, er strømmen af substratet stoppet, hvilket fører til en ophobning af produktet indeni kapillar. Mængden af produceret H2O2 derfor afhænger af mængden af bundne glucose stavbakterier og er afhængig af mængden af bundne biotinylated DNA. Ved at genstarte strømmen, er forbedret H2O2 koncentration derefter skylles igennem cellen elektrokemiske måling, hvilket resulterer i en nuværende peak signal, som illustreret i figur 3.

Til dataanalyse, stop-flow teknik tilbyder to forskellige parametre: den maksimale højde og opladning (dvs. integralet) af peak signal. Begge parametre er direkte proportional med standsning tidog kan derfor bruges til at analysere dataene. Overvejer datavurdering, når ved hjælp af tophøjde, signal højde afhænger den maksimale H2O2 koncentration og dermed sin diffusion koefficient og anvendt stoptiden. Jo længere standsning tid, jo højere den målte signal reaktion. Af denne grund forbliver måles tophøjde konstant, ned til en mindstelængde på immobilisering kapillær. Denne særlige funktion af stop-flow teknik giver mulighed for en drastisk nedgang i chip dimensioner, navnlig i den kapillære længde, samtidig bevare følsomheden af sensoren.

Figure 3
Figur 3. Model af et typisk opnået elektrokemiske signal udlæsning af en enzym-forbundet analyse ved hjælp af stop-flow teknik. a) en strøm af 40-mM glukose løsning med en hastighed på 20 µL/min blev anvendt. Fasen stop (1, 2 eller 5 min), enzymproduktion af H2O2 fortsætter. Ved at genstarte strømmen, er den akkumulerede H2O2 skyllet igennem den elektrokemiske celle, hvor hydrogenperoxid registreres elektrokemisk. Ved at gentage måling flere gange (fejllinjer; SEM), en på chip kalibrering kurve b) er opnået. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteret her for fabrikation af en mikrofluid elektrokemiske biosensor muliggør udvikling af en billig, kompakt og nem at bruge platformen til påvisning af biomolekyler. Afhængigt af analysen bruges bagefter på biosensor, kan flere forskellige biomarkører påvises. Det gør platformen meget alsidig og giver bred adgang til forskellige områder af applikationer, fra standard diagnostiske tests (f.eks. bestemmelse af specifikt sygdomme på lægens kontor) til punkt af pleje programmer (f.eks. terapeutiske drug overvågning af en patient for individualiseret medicinsk behandling). Især i punkt af care diagnostics, miniaturiserede biosensorer har mange fordele i forhold til konventionelle metoder, som normalt kræver omfattende laboratorieudstyr, specialiserede medarbejdere, og store reagens og prøve diskenheder og har lang ekspeditionstid gange.

Fabrikation af denne biosensor kræver nøje efter protokollen; ellers, fremstiller problemer kan opstå. Et af de oftest observerede spørgsmål er forskydning i forskellige lag. Dette kan løses nemt ved hjælp af en mere avanceret apparatur til fabrikationsproces, som giver mulighed for lettere og mere præcise tilpasning af forskellige lag.

DFR teknologi giver mulighed for hurtig og billig fabrikation. På den anden side er teknologien begrænset i forhold til opløsning. For eksempel, kan ikke mikrofluid kanaler af meget små strukturer (mindre end 100 µm) realiseres ved hjælp af den protokol, der præsenteres her. I sådanne tilfælde skal fotolitografi udføres af en høj præcision maske aligner med glas komponeneter. En alt for bred kanal kan desuden også være problematisk, da kanalen kunne bøje ned, reducere højden af kanalen og påvirke mikrofluid opførslen af chippen.

Vi mener, at DFR teknologi vil være mere til stede i fremtidige programmer, fordi det kan let skaleres til kommerciel brug. Masseproduktion af DFR-baserede mikrofluid sensorer vil være ingen hindring, når det rammer markedet, fordi teknikken er veletableret i andre anvendelsesområder (f.eks. fleksibel elektronik).

Med hensyn til at reducere kompleksiteten i hele systemet, vil vores fremtidige arbejde fokusere på udvikling og implementering af en engangs mikrofluid patron, der indeholder biosensor chip; en affald reservoir; og pre-belæsset reagenser, såsom wash buffer og andre assay komponenter. Til amperometric måling, kan leveringen af prøven og andre reagenser derefter gives ved pneumatisk aktivering. Dette vil blive udført af håndholdte læseren og vil flytte gennem mikrofluid biosensor chip til en affald reservoir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke den tyske Research Foundation (DFG) til delvis finansiering af dette arbejde under Grant numre UR 70/10-01 og UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
  2. Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
  3. Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
  4. Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
  5. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).
  6. Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
  7. Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
  8. Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
  9. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
  10. Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. , 7,691,623 (2010).
  11. Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
  12. Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
  13. Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
  14. Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
  15. Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).
  16. Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).
  17. Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
  18. Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
  19. Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , Elsevier Inc. (2010).

Tags

Bioteknologi sag 127 elektrokemiske biosensor mikrofluidik tør film photoresist enhed fabrikation lab-on-a-chip punkt af pleje testning stop-flow teknik på chip assay forberedelse
Tør Film Photoresist-baserede elektrokemisk mikrofluid Biosensor Platform: Enhed fabrikation, On-chip Assay forberedelse og drift
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A.,… More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter