Summary
Dette arbejde præsenterer en ny behandlings- og billedprotokol for tykt, tredimensionelt vævs tværsnit analyse, der muliggør fuld udnyttelse af konfokale billeddannelsesmodaliteter. Denne protokol bevarer antigenicitet og repræsenterer et robust system til analyse af hudhistologi og potentielt andre vævstyper.
Abstract
Behandling af et væv af interesse for at frembringe et mikroskopisk billede, der understøtter et videnskabeligt argument, kan være udfordrende. Købet af mikroskopiske billeder af høj kvalitet er ikke helt afhængig af mikroskopets kvalitet, men også på vævsprocessens metoder, der ofte involverer flere kritiske handlinger eller trin. Desuden repræsenterer mesenkymceller i huden og andre væv en ny udfordring til vævsfremstilling og billeddannelse. Her præsenterer vi en komplet proces, fra vævshøst til mikroskopi. Vores teknik, kaldet "vandret hele mount", er, at nybegyndere hurtigt kan blive dyktige i og det giver mulighed for antigenbeskyttelse og detektion i 60-300 μm tykke sektioner skåret med en kryostat. Afsnit af denne tykkelse tilvejebringer forbedret visualisering af vævs-mikroarkitektur i et tredimensionelt miljø. Derudover bevarer protokollen mesenchymceller på en måde, der forbedrer billedkvaliteten, nårSammenlignet med standardkryostat eller paraffinsektioner, hvorved effekten og pålideligheden af immunfarvning øges. Vi mener, at denne protokol vil gavne alle laboratorier, der visualiserer hud og eventuelt andre væv og organer.
Introduction
Revolutionen af mikroskopisk billeddannelsesudstyr giver mulighed for sofistikerede billeddannelsesinstrumenter med høj opløsning. Men når man erhverver et mikroskopisk billede af et komplet tredimensionalt (3D) vævs tværsnit, giver prøvepræparation betydelige udfordringer og kan være den begrænsende faktor ved at definere billedkvalitet. Hvert særskilt trin fortjener omhyggelig overvejelse for at bevare vævsmorfologi og antigenicitet af målproteiner, for at minimere behandlingsinducerede genstande og for at maksimere den endelige billedkvalitet. For eksempel kræver den traditionelle hudanalyse et billede med epidermis og dermis med hårfollikler, der er korrekt orienteret, hvilket giver mulighed for den anatomiske analyse af stamcellekammerbidrag til hudhomeostase 1 , 2 . Dette kræver grundig koncentration om, hvordan huden er indlejret og sektioneret. Det er vigtigt, at hårsækkene kan være tykkereEnd 100 μm, hvilket i høj grad overstiger standardparafinen eller den frosne sektionstykkelse, hvilket resulterer i en lavere analysemetode sammenlignet med hele monteringer eller tykke tværsnit 3 , 4 , 5 .
Tværtimod er hvert trin i prøvepræparation til mikroskopisk analyse en kritisk determinant, som vil påvirke billedanalyse. Her præsenteres en ny behandlingsprotokol til tykt, 3D-vævs-tværsnitsanalyse, som vi kalder "vandret hele mount". Protokollen bevarer meget antigenicitet og muliggør fuld udnyttelse af tykke hudafsnit ved hjælp af standard konfokal billeddannelsesudstyr. Dette er en komplet vejledning til brug af hud til tykt vævs tværsnit behandling og billeddannelse, herunder vævshøst og paraformaldehyd (PFA) -assistent cryopreservering (trin 1), dannelsen af 100 μm tykke vævs tværsnit med en kryostat (trin 2) Og immunfluorescerende mærkning og montering (trin 3 og 4). De repræsentative resultater sammenligner konfokale billeder af to forskellige histologiske forberedelsesteknikker-klassisk kryosektion og tykt 3D-tværsnit af tværsnit, der fremhæver fordelene ved "horisontale hele monteringer" for den potentielle bruger af denne protokol.
Protocol
Alle dyreforsøg blev underkastet lokal etisk godkendelse og udført i henhold til en britisk regerings hjemmekontorlicens.
1. Skin Harvest og Cryopreservation
- Præparater.
- Forbered en 100 mm kulturskål med 25 ml 4% PFA og to 100 mm kultivarer med 25 ml 1x phosphatpufret saltopløsning (PBS).
- Fyld rektangulære afskallede cryomolds med to tredjedele med optimal skæringstemperaturforbindelse (OCT).
- Placér en metalplade, hvorpå cryoblocks kan placeres i et senere trin ind i -80 ° C fryseren.
- Hudhøstning, fiksering og kryopreservering.
- Klip den dorsale region af dyrets kadaver med en tør elektrisk barbermaskin.
BEMÆRK: I dette eksempel blev postnatale dag 21 anvendt vildtype mus. - Høst områderne af interesse på huden.
BEMÆRK: Den dorsomediale region af museskind (- Trim den høstede hud i rektangulære stykker af passende størrelse for at passe ind i bunden af cryomolden, idet der tages hensyn til retningsudviklingen af hårsækkekornet.
BEMÆRK: Mindre hudskiver kan være nemmere at håndtere for nybegyndere, da de er mindre tilbøjelige til at flokke under inkubations- og monteringsprocessen. Eksemplet vist her er et område på 1 cm 2 med dorsal hud, som passer ind i en 22 x 30 x 20 mm kryomold ( figur 2a ).- Fastgør huden ved stuetemperatur i 25 ml 4% PFA i 10-30 minutter afhængigt af tykkelsen af hudprøverne ( figur 1b ).
- Vask hudprøverne to gange i 25 ml PBSI mindst 5 minutter hver ( figur 1b ).
- Dab huden prøver på et papir håndklæde for at forsigtigt dræne vævet af overskydende PBS, hvilket kan resultere i krystallisation under fryseprocessen og kan påvirke krysosektion resultater.
BEMÆRK: En standard saccharosegradient er ikke nødvendig. Dette kan dog også indarbejdes i protokollen efter brugerens skøn.- Vær opmærksom på hårfollikernes orientering for hver hudprøve. Brug et dissekeringsmikroskop til visuel hjælp (især enhver, der udfører protokollen for første gang). Indsæt hudprøven i den OCT-fyldte cryomold og ensilibrere alle områder af huden med OCT ved at fjerne eventuelle luftbobler fastgjort til overfladen af det klippede hår ved hjælp af tang ( figur 2a og 2b ).
- Skub huden ned i bunden af den OCT-fyldte blok, så den ligger i bunden med bunden.
BEMÆRK: Huden kan orienteres i enhver retning, aS længe som hårfollikelkornet er kendt for ordentlige skæreprocedurer. Cryomolds vil blive orienteret, når blokkene er fastgjort til kryostat til kryosektion. Marker hårfollikelretningen på cryomolden, da dette trin bestemmer den efterfølgende orientering af kryostatskåret.- Overfør cryoblocks på metalpladen i -80 ° C fryseren for at undgå flydende og dislokation af vævet.
- Overvåg fryseprocessen for at opretholde hudens orientering i bunden af cryomolden, da usete luftbobler kan forårsage, at huden stiger op til cryomoldens overflade.
BEMÆRK: Kryomolds med frosset væv kan opbevares i mere end et år ved -80 ° C og kan genanvendes til yderligere sektioner. - Trim den høstede hud i rektangulære stykker af passende størrelse for at passe ind i bunden af cryomolden, idet der tages hensyn til retningsudviklingen af hårsækkekornet.
- Klip den dorsale region af dyrets kadaver med en tør elektrisk barbermaskin.
Figur 1. Høst og fixering af museskind. ( A ) Hudvæv blev høstet fra dyrets kadaver dorsomediale region. Hårfollikler i denne region er jævnt fordelt og justeret og muliggør derfor optimal orientering under snitning, som angivet ved pilene. ( B ) Efter skæring af firkanter af passende størrelse, der passer ind i cryomolden, blev hudvævet fikseret i 4% PFA i 15 minutter og vasket to gange i PBS i 5 minutter hver. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Tykt vævtværsnit
- Forberedelse og væv orientering til montering på kryostat.
- Forbered en 100 mm kulturskål med 15 ml PBS. Placer det på et let tilgængeligt område på kryostat. Derudover fremstilles en 12-brønds plade med 2,5 ml PBS pr. Brønd; Mærkning i henhold til prøverne til langtidsopbevaring af søenCtioner ved 4 ° C. Brug tænger til at håndtere sektionerne.
- Juster temperaturen på kryostat til -20 ° C.
BEMÆRK: Temperaturen kan påvirke snitning, men en god vejledning er at starte ved -20 ° C. - For at opnå sektioner ca. to hårsække tykke, juster kryostat for at skære sektioner 150 μm tykt.
BEMÆRK: Tykkelsen af sektionen kan varieres afhængigt af brugerens behov og begrænsningerne af mikroskopet, der skal bruges til analyse.
BEMÆRK: Orienteringen af prøven er afgørende for at opnå hudafsnit med hårsække i passende orientering. Dette opnås ved at montere korrekt på kryostatblokken. Sørg for, at sektionsplanet er parallel med hårfollikelretningen ( figur 2c ). Som tidligere nævnt er den korrekte orientering af sektionsplanet i hudprøven et afgørende skridt til at bestemme kvaliteten af de billeder, der vil blive erhvervet iEt senere trin.
Figur 2. Embedding, cryopreservation og sektionering.
( A ) Markering af hårfollikelretningen (HF) på cryomolden, angivet med de sorte pile, er vigtig for korrekt orientering under kryosektion. ( B ) Sektionsplanet skal tilpasses hårfollikelretningen for at generere sektioner, hvor hårsækkets komplette længde forbliver intakt. ( C ) Sektioner blev skåret pr. Hårfollikelretningen, der var angivet med de sorte pile på cryoformen. ( D ) De tykke vævs-tværsnit blev opsamlet med metalpincer og ( e ) overført til en 100 mm kulturskål indeholdende 1x PBS. ( F ) Ved stuetemperatur løser PBS væk OC'en.T. Sammensætning, der omgiver de tykke vævs tværsnit, som angivet af de hvide pile. Sektionerne flyder så frit i PBS. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Fremstilling af frysesnit.
- Skær et afsnit ved hjælp af kryostat. Brug tang til at samle OLT, der indeholder det indlejrede stykke hud ( figur 2d ).
BEMÆRK: Brug en kryostat, der muliggør uafhængig bevægelse og justering langs akserne X, Y og Z for optimal prøveplacering. Dette giver mulighed for generering af ideelt tilpassede vævs tværsnit. - Overfør sektionen ud af kryostat i 100 mm kulturskålen fyldt med PBS og fortsæt med næste skive. Saml ikke prøverne på et objektglas ( figur 2e ).
BEMÆRK: Ved stuetemperatur vil PBS opløses vækOLT, der efterlader skiver, der er lette at håndtere med tang ( figur 2f ).
BEMÆRK: Der kan være behov for frisk PBS i 100 mm kulturskålen efter opløsning af mange vævssnit 100 μm tykke og kan ændres i overensstemmelse hermed. - Brug pincet til at overføre de flydende hudafsnit til den korrekt mærkede brønd i en 12-brønds plade fyldt med 2,5 ml PBS ( Figur 3a , venstre).
BEMÆRK: Ved 4 ° C kan prøverne opbevares i mindst to dage. Ved langvarig opbevaring af skindholdige OCT-blokke efter snitning skal tætningsoverfladen forsegles med en dråbe af frisk OCT. Efter frysning af OCT-dråbet skal du pakke den brugte OCT-blok i parafilm og placere den i en fryser på -80 ° C .
- Skær et afsnit ved hjælp af kryostat. Brug tang til at samle OLT, der indeholder det indlejrede stykke hud ( figur 2d ).
3. Immunfluorescerende mærkning.
- Forbered PB buffer (PBS suppleret med 0,5% skummetmælkspulver, 0,25% fiskhudgelatine og 0,5% Triton X-100) ved leasT 2 timer i forvejen, som beskrevet tidligere 5 .
BEMÆRK: Natriumazid kan tilsættes til PB-buffer til antistofbeskyttelse for gentagen brug af farvningsbufferen. - Mærke 1,5 ml mikrocentrifugerør og tilsæt 500 μL PB buffer pr. Rør. Brug forsigtigt tænger til at overføre hudskiverne fra PBS til separate rør indeholdende PB-bufferen til blokering ( Figur 3a , højre). Sørg for, at alle skiver er helt nedsænket. Placér mikrocentrifugerørene på en savsåger med hastigheder på højst 10 oscillationer pr. Minut, hvilket ikke bør forstyrre vævsintegriteten i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Det er afgørende, at hastigheden ikke overstiger 10 oscillationer pr. Minut på savsåbningen, da det vil fremkalde sammenfletning.- Selvom det er muligt at tilføje mere end et skive pr. Mikrocentrifugerør, for at gemme antistoffer, placer kun en skive pr. Rør. For at reducere antistoff brug, brug et volumen250 μL.
BEMÆRK: Om nødvendigt erstattes mikrocentrifugerør med for eksempel 96-brøndsplader. Placeringen af de tykke vævs tværsnit i 1,5 ml mikrocentrifugerør tillader imidlertid den mest effektive antistofindtrængning i vævet på grund af forøget væskestørrelse.
- Selvom det er muligt at tilføje mere end et skive pr. Mikrocentrifugerør, for at gemme antistoffer, placer kun en skive pr. Rør. For at reducere antistoff brug, brug et volumen250 μL.
- Mærk separat 1,5 ml mikrocentrifugerør til hver hudskive og tilsæt 500 μl PB-buffer og den passende mængde primært antistof. Efter 1 time blokering overføres hudskiverne til de frisklavede rør, der indeholder antistofferne. Inkubér skiverne ved 4 ° C natten over.
BEMÆRK: I dette eksempel blev følgende primære antistoffer anvendt: FITC rotte anti-human CD49f i en koncentration på 1:50 og gede-anti-mus / rotte integrin alpha 8 i en koncentration på 1: 100. - Den næste dag fremstilles to separate 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 μl PBS pr. Prøve. Vask huden skiver to gange i 1 time ved stuetemperature.
- Tilbered separate 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 500 μl PB buffer med den passende koncentration af anvendelige sekundære antistoffer og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
BEMÆRK: De sekundære antistoffer, der anvendes i dette eksempel, er Alexa Fluor 488 æsel anti-rotte-IgG og Alexa Fluor 555 æsel-anti-gede-IgG i en koncentration på 1: 500. DAPI blev anvendt i en koncentration på 1: 100. - Overfør forsigtigt hudprøverne til PB-bufferen, som indeholder det sekundære antistof og DAPI, og inkubér hudskiverne ved stuetemperatur i 1 time ved lav hastighed på rotator eller ryster.
- Opbevar skiverne ved 4 ° C i PB-bufferen indeholdende det sekundære antistof og DAPI i op til fire dage og muligvis længere, hvis natriumazid tilsættes til PBS.
4. Montering til mikroskopisk visualisering 
Figur 3. ImmunofluorescMærkning og montering.
( A ) Flydende vævs tværsnit kan opbevares i 12-brøndsplader i mindst to dage ved 4 ° C. Før immunfluorescerende (IF) mærkning overføres vævs-tværsnit af interesse til 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende PB-buffer til blokering, som angivet ved pil 1. Til IF-mærkning adhærer man til multi-trin-proceduren, der udarbejdes i trin 3. Hver En del af trin 3 kræver en omhyggelig overførsel af vævs tværsnit til frisk fremstillede mikrocentrifugerør indeholdende primær antistofopløsning, sekundær antistofopløsning eller vaskebuffer, som er angivet med pil 2. ( b ) Efter IF-mærkning, Sektionerne raffineres og flades i en dråbe glycerol ved hjælp af hjælp af et dissekeringsmikroskop. ( C ) Når vævstværsnittet er helt fladt på bunden af en dækslip, anvendes et regelmæssigt mikroskopglas til at montere sektionen.
BEMÆRK: Da skiven flyder i gliderenCerol-dråbe, kan det løsnes ved at coaxe vævets naturlige tilbøjelighed til at vende tilbage til sin normale form. Tving ikke den unaturlige udlægning af skiven, da dette kan forårsage beskadigelse af vævet.
BEMÆRK: Undgå luftindfangning ( Figur 3c ).
BEMÆRK: Langvarig opbevaring påvirker væv og billedkvalitet negativt. I dette eksempel blev alle billeder erhvervet med et opretstående konfokalmikroskop ved hjælp af et 20x objektiv.
Representative Results
For at understrege fordelene ved vores teknik sammenlignede vi vores tykke 3D-vævs tværsnitsteknik, "vandret hel mount" til klassiske frosne sektioner. Klassiske frosne sektioner blev skåret som tidligere beskrevet 5 . For at tilvejebringe en visuel struktur for epidermis i temikroskopiske billeder, immunostaines vi for integrin alpha-6 (Itga6), som er en komponent, som forankrer epidermale celler til den underliggende kældermembran 6 . Vi har også mærket arrector pili muskel (APM), som er ansvarlig for piloerektion (også kendt som "goosebumps"), med integrin alpha-8 7 . I de klassiske frosne sektioner blev de fleste hårsækkene visualiseret med Itga6 ikke snittede langs hele længden, hvilket genererede overvejende ufuldstændige hårsække pr. Sektion sammenlignet med horisontale hele fester ( Figur 4a -4d figur 4a -4d ). Endvidere bevares vævsintegriteten i det hypodermale rum i horisontale hele fester i sammenligning med ødelæggelsen af adipocytter, når kryosektioner er fastgjort til varme glasskinner, hvilket er en velkendt fryse-optøning artefakt ( figur 4a- b , sammenligner hypodermal Regioner) 8 .
Figur 4. Vandret hele mouNt i forhold til en klassisk kryosektion.
( A ) Klassisk opnåede hudkryosektioner 10 μm tykke og ( b ) 100 μm tykke 3D vævs tværsnit blev mærket med integrin alpha-6 (Itga6) og integrin alpha-8 (Itga8) for at visualisere epidermalrummet og arrector pili musklerne , henholdsvis. Billederne af de tykke vævs tværsnit er repræsenteret som maksimale fremspring af en stor Z-stak. De hvide rammer angiver de områder, der forstørres, vist i ( c ) de klassiske og ( d ) vandrette hele monteringsafsnit. ( E ) intakte hårfollikler og ( f ) intakte arrector pili muskler blev kvantificeret i både de klassiske og de vandrette helmonterede sektioner. Skalestænger angiver 100 μm. Dataene er repræsenteret som Middel ± Standardfejl for middelværdien (SEM). Én sektion pr. Biologisk replikat ( n = 3) blev kvantificeret. Upareret t-test * P <0,05, *** P <0,0005. Klik her for at se en større version af denne figur.
Disclosures
Forfatterne vil gerne oplyse, at publikationen af dette manuskript blev finansieret af Thermo-Fisher Scientific Inc.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender sponsorering fra Thermo-Fisher Scientific og takker Nikon Imaging Center på Kings College London for support under konfokal billedkøb.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | homemade | ||
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
| O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
| Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Culture dishes | |||
| Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| pointed metal forceps | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
| 12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
| Dissecting microscope | Nikon | ||
| 20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
| 1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Rocking shaker plate | |||
| Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
| Confocal microscope | Nikon |
References
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
