Summary
이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.
Abstract
과학적 논증을 뒷받침하는 현미경 이미지를 생성하기 위해 관심 조직을 처리하는 것은 어려울 수 있습니다. 고품질 현미경 이미지의 획득은 현미경의 품질뿐만 아니라 종종 여러 가지 중요한 동작이나 단계를 포함하는 조직 처리 방법에도 달려 있습니다. 또한, 피부 및 다른 조직에서의 중간 엽 세포 유형은 조직 준비 및 영상화를위한 새로운 도전 과제이다. 여기, 우리는 조직 수확에서 현미경으로 완전한 과정을 제시한다. "수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)"라고 불리는 우리의 기술은 초보자들이 신속하게 능숙해질 수 있고 저온 유지 장치로 절단 된 60-300 μm 두께의 섹션에서 항원 보존과 검출을 가능하게합니다. 이 두께의 섹션은 3 차원 환경에서 조직 마이크로 아키텍처의 향상된 시각화를 제공합니다. 또한, 프로토콜은 중간 엽 세포를 보존 할 때 이미지 품질을 향상시키는 방식으로표준 저온 유지 장치 또는 파라핀 절편과 비교하여 면역 염색의 효능 및 안정성을 증가시킵니다. 우리는이 프로토콜이 피부 및 다른 조직 및 기관을 시각화하는 모든 실험실에 도움이 될 것으로 믿습니다.
Introduction
현미경 영상 장비의 혁명은 정교하고 고해상도 영상 장비를 제공합니다. 그러나, 완전한 3 차원 (3D) 조직 단면의 현미경 이미지를 획득 할 때, 표본 준비는 상당한 도전을 제시하며 이미지 품질을 정의하는 데있어 제한 요소가 될 수 있습니다. 각각의 개별 단계는 표적 단백질의 조직 형태 및 항원 성을 보존하고, 가공에 의해 유발 된 인공물을 최소화하고, 최종 이미지 품질을 최대화하기 위해 신중한 고려가 필요하다. 예를 들어, 전통적인 피부 분석에서는 표정과 진피를 볼 수있는 이미지가 필요합니다. 모공은 적절하게 배향되어 있으며, 줄기 세포 구획을 피부 항상성 1 , 2에 해부학 적으로 분석 할 수 있습니다. 이것은 피부가 어떻게 매립되고 절단되는지에 대한 철저한 집중이 필요합니다. 중요하게, 모낭은 더 두꺼울 수 있습니다100 μm 이상으로 표준 파라핀이나 동결 절편 두께를 크게 능가하므로 전체 장착 또는 두꺼운 단면 3 , 4 , 5에 비해 분석 표준이 낮아집니다.
종합하여, 현미경 분석을위한 표본 준비의 각 단계는 이미지 분석에 영향을주는 중요한 결정 요소입니다. 여기서 "수평 전체 마운트 (horizontal whole mount)"라고 부르는 두껍고 3D 인 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 항원 성을 유지하고 표준 공 촛점 이미징 장비를 사용하여 피부의 두꺼운 부분을 최대한 활용할 수 있습니다. 조직 수확 및 파라 포름 알데히드 (PFA)를 기반으로 한 저온 보존 (단계 1), 저온 저장 장치로 100 μm 두께의 조직 단면 생성 (단계 1)을 포함한 두꺼운 조직 단면 처리 및 이미징을위한 스킨 사용에 대한 완벽한 안내서입니다. 2), 면역 형광성 라벨링 및 마운팅 (단계 3 및 4). 대표적인 결과는이 프로토콜의 잠재적 인 사용자를위한 "수평 전체 마운트"의 장점을 강조하는 두 가지 별개의 조직 학적 준비 기술 (고전적 절제 및 두꺼운 3D 조직 교차 절삭)의 공 촛점 이미지를 비교합니다.
Protocol
모든 동물 실험은 지역 윤리 승인을 받아야하며 영국 정부 본국 면허 조건에 따라 수행되었습니다.
1. 피부 수확 및 냉동 보존
- 준비.
- 1 % 인산 버퍼 식염수 (PBS) 25 ML와 4 % PFA 및 두 100mm 문화 요리 25 ML와 하나의 100mm 문화 요리를 준비합니다.
- 최적의 절삭 온도 컴파운드 (OCT)로 직사각형 껍질을 벗기는 초저온을 3 분의 2까지 채 웁니다.
- 저온 냉각 장치가 나중에 배치 될 수있는 금속 플레이트를 -80 ° C의 냉동 장치에 놓습니다.
- 피부 수확, 고정 및 냉동 보존.
- 마른 전기 면도기로 동물 시체의 등쪽 부위를 자릅니다.
참고 :이 예제에서는 출생 후의 21 일 야생형 마우스를 사용했습니다. - 피부에 관심있는 부위를 수확하십시오.
참고 : 마우스 피부의 등쪽 부위 (- 수확 한 피부를 냉동 크기의 바닥에 맞게 적당한 크기의 직사각형 조각으로 잘라내어 모근 입자의 방향 성장을 고려하십시오.
주 : 초소형 스킨 슬라이스는 초보자가 다루기가 쉽기 때문에 인큐베이터 및 장착 과정에서 뒤죽박죽이 될 가능성이 적습니다. 여기에 표시된 예제는 ~ 1cm 2 의 등 지느러미 영역으로, 22 x 30 x 20 mm의 청색 결정 ( 그림 2a )에 들어 있습니다.- 피부 샘플 ( 그림 1b )의 두께에 따라 10-30 분 동안 4 % PFA 25 ML에 실온에서 피부를 고정.
- 25 mL의 PBS로 2 번 피부 샘플을 씻으십시오.각각 최소 5 분 동안 ( 그림 1b ).
- 종이 타올에 스킨 샘플을 담가서 과도한 PBS 조직을 조심스럽게 배수하십시오. 그러면 얼어 붙는 과정에서 결정화를 일으킬 수 있으며 cryosectioning 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
참고 : 표준 자당 기울기가 필요하지 않습니다. 그러나 이는 사용자의 재량에 따라 프로토콜에 통합 될 수도 있습니다.- 각 피부 샘플에 대한 모낭의 방향을 알고 있어야합니다. 시각 보조를 위해 해부 현미경을 사용하십시오 (특히 프로토콜을 처음 수행하는 사람). 피부 샘플을 OCT로 채워진 크라이 놀드에 넣고 포셉을 사용하여 잘린 머리카락의 표면에 부착 된 기포를 제거하여 피부의 모든 부위를 OCT로 평형시킵니다 ( 그림 2a 및 2b ).
- OCT가 채워진 블록의 바닥에 피부를 밀어서 바닥과 평평하게 놓습니다.
참고 : 피부는 어떤 방향으로도 배향 될 수 있습니다.머리카락의 알갱이가 적절한 절단 과정에 대해 언급되는 한 오래 지속됩니다. cryosolding은 블록이 cryosectioning을 위해 cryostat에 부착 될 때 방향이 바뀔 것이다. 이 단계는 저온 유지 장치 절단의 후속 방향을 결정하기 때문에 냉동 표준에서 모낭의 방향을 표시하십시오.- 조직의 부동 및 탈락을 피하기 위해 -80 ° C의 냉동고에있는 금속판에 저온 차단 장치를 옮기십시오.
- 보이지 않는 공기 방울이 피부가 초저온 물체의 표면으로 올라갈 수 있으므로 냉동 과정을 모니터링하여 초저온의 바닥에있는 피부의 방향을 유지합니다.
참고 : 냉동 조직이있는 Cryomold는 -80 ° C에서 1 년 이상 보관할 수 있으며 추가 섹션을 위해 재사용 할 수 있습니다. - 수확 한 피부를 냉동 크기의 바닥에 맞게 적당한 크기의 직사각형 조각으로 잘라내어 모근 입자의 방향 성장을 고려하십시오.
- 마른 전기 면도기로 동물 시체의 등쪽 부위를 자릅니다.
그림 1. 마우스 스킨 수집 및 고정. ( a ) 동물 시체의 등쪽 부위에서 피부 조직을 수확했다. 이 영역의 모낭은 균등하게 간격을두고 배열되어 있으며 따라서 화살표로 표시된 바와 같이 절단 중에 최적의 방향을 허용합니다. ( b ) 크리오 몰드에 맞는 적절한 크기의 사각형을 절단 한 후, 피부 조직을 4 % PFA에서 15 분간 고정시키고 각각 5 분 동안 PBS로 2 회 세척 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 두꺼운 조직 횡단면
- 저온 유지 장치에 장착 할 준비 및 조직 방향.
- 15 ML의 PBS와 100mm 문화 요리를 준비합니다. 저온 저장 장치에 쉽게 접근 할 수있는 곳에 놓으십시오. 또한, 웰당 2.5 ML의 PBS와 12 잘 접시를 준비; se의 장기 보관을위한 샘플에 따른 라벨4 ℃에서. 포셉을 사용하여 섹션을 처리하십시오.
- -20 ° C에 저온 유지 장치의 온도를 조정하십시오.
참고 : 온도는 절단에 영향을 줄 수 있지만 -20 ° C에서 시작하는 것이 좋습니다. - 두 개의 모낭이 두꺼운 섹션을 얻으려면 절편을 150 μm 두께로 자르십시오.
참고 : 섹션의 두께는 사용자의 요구와 분석에 사용되는 현미경의 한계에 따라 달라질 수 있습니다.
참고 : 샘플의 방향은 모발이 적절한 방향으로 피부 절편을 얻는 데 중요합니다. 이것은 저온 유지 장치 블록에 올바르게 장착하여 이루어집니다. 단면 평면이 모낭의 방향과 평행한지 확인하십시오 ( 그림 2c ). 이전에 언급했듯이 스킨 샘플에서 단면 평면의 정확한 방향은 이미지의 품질을 결정하는 중요한 단계입니다.나중 단계.
그림 2. Embedding, cryopreservation 및 sectioning.
( a ) 흑색 화살표로 표시된 크리오 몰드에서 머리 여포 (HF) 방향을 표시하는 것은 cryosectioning 동안 적절한 방향에 중요합니다. ( b ) 단면 모서리는 모낭의 전체 길이가 그대로 유지되는 섹션을 생성하기 위해 모낭 오리 엔테이션과 정렬해야합니다. ( c ) 섹션은 모낭의 방향에 따라 검은 모서리 방향으로 절단되었습니다 냉동고. ( d ) 두꺼운 조직 단면을 금속 집게로 수집하고 ( e ) 1x PBS가 들어있는 100mm 배양 접시에 옮겼다. ( f ) 실온에서, PBS는 OC를 용해시킨다.티. 흰색 화살표로 표시된 것처럼 두꺼운 조직 단면을 둘러싸는 화합물. 섹션은 PBS에서 자유롭게 부유됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- Cryosectioning.
- 저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 자르십시오. 삽입 된 피부 조각을 포함하는 OCT를 집게를 사용하여 집게를 사용하십시오 ( 그림 2d ).
참고 : 최적의 시편 포지셔닝을 위해 X, Y 및 Z 축을 따라 독립적으로 이동하고 조정할 수있는 저온 유지 장치를 사용하십시오. 이를 통해 이상적으로 정렬 된 조직 단면을 생성 할 수 있습니다. - PBS로 채워진 100mm 문화 접시에 저온 저장 장치에서 절편을 옮기고 다음 조각을 계속합니다. 슬라이드에 샘플을 채취하지 마십시오 ( 그림 2e ).
참고 : 실온에서 PBS는 용해됩니다OCT는 포셉으로 다루기 쉬운 피부 조각을 남겨 둡니다 ( 그림 2f ).
참고 : 100 μm 두께의 많은 조직 절편을 용해한 후 100 mm 배양 접시에 신선한 PBS가 필요할 수 있으므로 그에 따라 변경할 수 있습니다. - 겸자를 사용하여 2.5 ML의 PBS ( 그림 3a , 왼쪽)로 가득 12 잘 접시에 올바르게 표시된 우물로 이동 피부 섹션을 전송합니다.
참고 : 4 ° C에서 샘플을 최소 2 일 동안 보관할 수 있습니다. 절단 후 피부를 함유 한 OCT 블록을 장기간 보관하려면 신선한 OCT 액 적을 사용하여 절단 표면을 밀봉하십시오. OCT 액 적의 냉동 후 사용 된 OCT 블록을 파라 필름에 싸서 -80 ° C 냉동고 .
- 저온 유지 장치를 사용하여 섹션을 자르십시오. 삽입 된 피부 조각을 포함하는 OCT를 집게를 사용하여 집게를 사용하십시오 ( 그림 2d ).
3. 면역 형광성 라벨링.
- Leas에서 0.5 % 탈지 분유, 0.25 % 생선 피부 젤라틴 및 0.5 % Triton X-100을 보충 한 PBS 완충액을 준비합니다t 2 h를 사전에 설명한대로 5 .
참고 : 염색 완충액을 반복적으로 사용하기 위해 항균 보존을 위해 나트륨 아자 이드를 PB 완충액에 첨가 할 수 있습니다. - 라벨 1.5 ML microcentrifuge 튜브와 튜브 당 PB 버퍼 500 μL를 추가합니다. 조심스럽게 포셉을 사용하여 PBS에서 피부 조각을 차단 용 PB 버퍼가 들어있는 별도의 튜브로 옮깁니다 ( 그림 3a , 오른쪽). 모든 스킨 슬라이스가 완전히 잠겼는지 확인하십시오. 미세 원심 분리 튜브를 시시 로커에 놓고 상온에서 1 시간 동안 조직 무결성을 방해하지 않는 분당 10 회 이상의 진동을 발생 시키십시오.
참고 : 톱니 모양의 로커에서 속도가 분당 10 번의 진동을 초과하지 않는 것이 중요합니다. 톱니 모양의 로커가 꼬임을 유발할 수 있기 때문입니다.- 미세 원심 분리 튜브 당 하나 이상의 슬라이스를 추가하는 것은 가능하지만 항체를 절약하려면 튜브 당 하나의 슬라이스 만 배치하십시오. 항체 사용을 줄이려면 볼륨을 사용하십시오.250 μL.
참고 : 필요할 경우, 예를 들어 96- 웰 플레이트로 마이크로 원심 분리 튜브를 대체하십시오. 그러나, 1.5-mL 미세 원심 분리 튜브에 두꺼운 조직 단면을 배치하면 향상된 액체 섭동으로 인해 조직에 가장 효과적인 항체 침투가 가능합니다.
- 미세 원심 분리 튜브 당 하나 이상의 슬라이스를 추가하는 것은 가능하지만 항체를 절약하려면 튜브 당 하나의 슬라이스 만 배치하십시오. 항체 사용을 줄이려면 볼륨을 사용하십시오.250 μL.
- 각 피부 슬라이스에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를 별도로 레이블 및 PB 버퍼 및 기본 항체의 적절한 금액의 500 μL를 추가합니다. 차단 1 시간 후 항체가 들어있는 새롭게 준비된 튜브에 피부 조각을 옮깁니다. 4에서 조각을 품어 ° C 밤새.
참고 :이 예제에서는 다음과 같은 기본 항체가 사용되었습니다 : 1:50의 농도에서 FITC 쥐 항 - 인간 CD49f와 1 : 100의 농도에서 염소 항 마우스 / 쥐 integrin 알파 8. - 다음날, 시료 당 PBS 500 μL가 들어있는 2 개의 분리 된 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브를 준비하십시오. 실내 온도에서 1 시간 동안 피부 조각을 2 번 씻으십시오.이자형.
- 적용 가능한 2 차 항체 및 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)의 적절한 농도로 PB 버퍼 500 μL를 포함하는 별도의 1.5 ML microcentrifuge 튜브를 준비합니다.
참고 :이 예제에서 사용되는 보조 항체는 1 : 500의 농도에서 Alexa Fluor 488 당나귀 항 - 래트 IgG 및 Alexa Fluor 555 당나귀 항 염소 IgG입니다. DAPI는 1 : 100의 농도로 사용되었다. - 조심스럽게 보조 항체와 DAPI가 들어있는 PB 버퍼에 피부 샘플을 옮기고 로터 또는 쉐이커에서 저속으로 1 시간 동안 실온에서 피부 조각을 품어 라.
- 최대 4 일 동안 2 차 항체와 DAPI가 포함 된 PB 완충액에 4 ° C로 슬라이스를 보관하십시오. 나트륨 아자 이드가 PBS에 추가되는 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다.
4. 현미경 시각화를위한 설치 
그림 3. Immunofluorescent 라벨 부착 및 장착.
( a ) 부동 조직 단면은 4 ℃에서 최소 2 일 동안 12- 웰 플레이트에 저장할 수 있습니다. immunofluorescent (IF) 표시하기 전에 화살표 1에 표시된 바와 같이 차단을위한 PB 버퍼가 포함 된 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 관심있는 조직 단면을 전송하십시오. IF 라벨 들어, 3 단계에서 정교한 다중 단계 절차를 준수합니다. 각 단계 3의 일부는 화살표 2로 표시된 1 차 항체 용액, 2 차 항체 용액 또는 세척 완충액을 함유하는 새로 제조 된 미세 원심 분리 튜브 내로 조직 단면을 조심스럽게 옮길 것을 요구한다. ( b ) IF 표지 후, 섹션은 해부 현미경의 도움을 사용하여 글리세롤의 물방울에서 풀리고 평평합니다. ( c ) 일단 조직 횡단면이 커버 슬립의 바닥에 완전히 편평하게되면, 일정한 현미경 슬라이드가 단면을 장착하는데 사용된다.
참고 : 슬라이스가 gly에 떠있을 때cerol 물방울, 그것은 정상적인 모양으로 돌아갈 수있는 조직의 자연적인 성향을 coaxing하여 untangled 수 있습니다. 슬라이스의 부 자연스러운 직선화를 강요하지 마십시오. 슬라이스가 조직에 손상을 줄 수 있습니다.
참고 : 공기 함몰을 피하십시오 ( 그림 3c ).
참고 : 장기간 보관하면 조직 및 영상 품질에 부정적인 영향을 미칩니다. 이 예제에서 모든 이미지는 20x 대물 렌즈를 사용하여 직립 공 촛점 현미경으로 획득했습니다.
Representative Results
우리 기술의 장점을 강조하기 위해 우리는 두꺼운 3D 조직 교차 절삭 기법 인 "수평 전체 마운트"를 기존의 고정 된 섹션과 비교했습니다. 고전 냉동 섹션은 이전에 설명한대로 잘라 5 . 현미경 이미지에서 표피에 대한 시각적 구조를 제공하기 위해, 우리는 integrin alpha-6 (Itga6)에 대해 면역 염색을하였으며, 이것은 표피 세포를 기저막 6에 고정시키는 성분이다. 우리는 또한 인테그린 알파 - 8 7 (또한 "소름"로 알려진) 경직을 담당하는 arrector의 필리 근육 (APM)를 표시. 고전적인 동결 절편에서 Itga6로 시각화 된 대부분의 모낭은 전체 길이에 따라 절개되지 않았으며, 수평 전체 마운트에 비해 섹션 당 우세하게 불완전한 모낭을 생성했습니다 ( 그림 4a -4d 그림 4a - 4d ). 또한 cryosections가 잘 알려진 냉동 동결 해물 인 따뜻한 유리 슬라이드에 부착되었을 때 지방 세포의 파괴와 비교하여 피하 지방실의 조직 무결성이 수평 전체 마운트에서 보존됩니다 ( 그림 4a - b , 피하 지방 영역) 8 .
그림 4. 수평 전체클래식 cryosection에 비해 nt.
(a) 고전적 수득 피부는 10 μm의 두께 (B)를 100 ㎛의 두께의 3 차원 조직 단면이 인테그린 알파 6 (Itga6)로 표지하고, 인테그린 알파 8 (Itga8) 시각화 표피 실과 arrector 필리 근육 저온부 로 나타났다. 두꺼운 조직 단면의 이미지는 큰 Z 스택의 최대 투영으로 표시됩니다. 흰색 프레임은 ( c ) 클래식 및 ( d ) 수평 전체 마운트 섹션에 표시되는 확대 된 영역을 나타냅니다. ( e ) 손상되지 않은 모낭과 ( f ) 손상되지 않은 근력 약근 근육은 고전 및 수평 전체 마운트 섹션에서 정량화되었다. 눈금 막대는 100 μm를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차 (SEM)로 표시됩니다. 생물학적 복제 ( n = 3) 당 하나의 섹션을 정량화했습니다. 페어링되지 않은 t- 테스트 * P <0.05, *** P <0.0005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Disclosures
저자는이 원고의 출판물이 Thermo-Fisher Scientific Inc.에 의해 지원되었음을 공개하고자합니다.
Acknowledgments
저자는 Thermo-Fisher Scientific의 후원을 인정하고 공 촛점 이미지 수집 중 지원을 위해 Kings College London의 Nikon Imaging Center에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | homemade | ||
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
| O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
| Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Culture dishes | |||
| Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| pointed metal forceps | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
| 12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
| Dissecting microscope | Nikon | ||
| 20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
| 1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Rocking shaker plate | |||
| Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
| Confocal microscope | Nikon |
References
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
