Summary
Dette arbeidet presenterer en roman behandlings- og bildebehandling protokoll for tykk, tredimensjonal vev tverrsnitt analyse som muliggjør full utnyttelse av konfokale bildeformaliteter. Denne protokollen bevarer antigenicitet og representerer et robust system for å analysere hudhistologi og potensielt andre vevstyper.
Abstract
Behandling av et vev av interesse for å generere et mikroskopisk bilde som støtter et vitenskapelig argument kan være utfordrende. Oppkjøpet av mikroskopiske bilder av høy kvalitet er ikke helt avhengig av mikroskopets kvalitet, men også på fremgangsmåten for vevsbehandling, som ofte involverer flere kritiske handlinger eller trinn. Videre representerer mesenkymcelletyper i huden og andre vev en ny utfordring for vevsforberedelse og avbildning. Her presenterer vi en komplett prosess, fra vevshøst til mikroskopi. Vår teknikk, kalt "horisontal hele fjellet", er en som nybegynnere kan raskt bli dyktige i og som muliggjør antigenbeskyttelse og deteksjon i 60-300 μm tykke seksjoner kuttet med en kryostat. Seksjoner av denne tykkelsen gir forbedret visualisering av vevsmikarkitektur i et tredimensjonalt miljø. I tillegg bevarer protokollen mesenkymceller på en måte som forbedrer bildekvaliteten nårSammenlignet med standardkryostat eller paraffinseksjoner, og øker dermed effekten og påliteligheten av immunostaining. Vi tror at denne protokollen vil være til nytte for alle laboratorier som visualiserer hud, og muligens andre vev og organer.
Introduction
Revolusjonen av mikroskopisk avbildningsutstyr sørger for sofistikerte bildeoppløsningsinstrumenter med høy oppløsning. Imidlertid, når du får et mikroskopisk bilde av et komplett tredimensjonalt (3D) vevtverrsnitt, gir preparatet store utfordringer og kan være begrensende faktor for å definere bildekvalitet. Hvert separat trinn fortjener nøye behandling for å bevare vevsmorfologi og antigenitet av målproteiner, for å minimere prosessinducerte gjenstander og for å maksimere den endelige bildekvaliteten. For eksempel krever den tradisjonelle analysen av hud et bilde med utsikt over epidermis og dermis, med hårsekkene som er riktig orientert, slik at den anatomiske analysen av stamcellekammerbidragene til hudhemostase 1 , 2 kan utføres. Dette krever grundig konsentrasjon om hvordan huden er innebygd og snittet. Viktigst, hårsekkene kan være tykkereEnn 100 μm, som i stor grad overgår standardparafin eller frossen seksjonstykkelse, noe som resulterer i en lavere analysemåte sammenlignet med hele fester eller tykke tverrsnitt 3 , 4 , 5 .
Samlet sett er hvert trinn av prøveutarbeidelse for mikroskopisk analyse en kritisk determinant som vil påvirke bildeanalyse. Her presenteres en ny behandlingsprotokoll for tykt, 3D-vev-tverrsnittsanalyse, som vi kaller "horisontalt hele fjellet". Protokollen opprettholder svært antigenicitet og muliggjør full utnyttelse av tykke hudpartier ved å bruke standard konfokal bildeutstyr. Dette er en komplett guide til bruk av hud for tykt vevtverrsnittbehandling og avbildning, inkludert vevshøst og paraformaldehyd (PFA) -assistert kryopreservering (trinn 1), generering av 100 μm tykk vevtverrsnitt med en kryostat (trinn 2) Og immunfluorescerende merking og montering (trinn 3 og 4). De representative resultatene sammenligner konfokale bilder av to forskjellige histologiske forberedelsesteknikker, klassisk krysoseksjonering og tykt 3D-vevs-tverrsnitt, og fremhever fordelene med "horisontale hele fester" for den potensielle brukeren av denne protokollen.
Protocol
Alle dyreforsøk ble underlagt lokal etisk godkjenning og utført i henhold til vilkårene i en britisk regjeringens hjemmekontorlisens.
1. Skin Harvest og Cryopreservation
- Forberedelser.
- Klargjør en 100 mm kulturrett med 25 ml 4% PFA og to 100 mm kulturretter med 25 ml 1 x fosfatbuffert saltvann (PBS).
- Fyll rektangulære avskallede cryomolds med to tredjedeler med optimal skjæringstemperaturforbindelse (OCT).
- Plasser en metallplate, hvor kryoblokker kan plasseres i et senere trinn, inn i frysen på -80 ° C.
- Høsting av hud, fiksering og kryopreservering.
- Klipp dorsalområdet av dyrkadaveren med en tørr elektrisk barbermaskin.
MERK: I dette eksemplet ble postnatale dag 21 brukt som wildtype-mus. - Høst områdene av interesse på huden.
MERK: Dorsomedialområdet av museskinn (- Trim høstet hud i rektangulære stykker av passende størrelse for å passe inn i bunnen av cryomold, og ta hensyn til retningsveksten av hårsekkekornet.
MERK: Mindre hudskiver kan være lettere å håndtere for nybegynnere, siden de er mindre tilbøyelige til å skjelve under inkubasjons- og monteringsprosessen. Eksemplet som vises her er et område på 1 cm 2 med dorsal hud, som passer inn i en 22 x 30 x 20 mm cryomold ( figur 2a ).- Fiks huden ved romtemperatur i 25 ml 4% PFA i 10-30 minutter, avhengig av tykkelsen av hudprøverne ( Figur 1b ).
- Vask huden prøver to ganger i 25 ml PBSI minst 5 minutter hver ( figur 1b ).
- Dekk hudprøvene på et papirhåndkle for å forsiktig tømme vevet av overskytende PBS, noe som kan resultere i krystallisering under fryseprosessen og kan påvirke krysoseksjonsresultatene.
MERK: En standard sukrose gradient er ikke nødvendig. Dette kan imidlertid også innlemmes i protokollen etter brukerens skjønn.- Vær klar over orienteringen av hårsekkene for hver hudprøve. Bruk et dissekeringsmikroskop for visuell hjelp (spesielt alle som utfører protokollen for første gang). Sett hudprøven inn i OCT-fylt cryomold og balanser alle områder av huden med OCT ved å fjerne eventuelle luftbobler festet til overflaten av det klippede håret med tang ( figur 2a og 2b ).
- Skyv huden til bunnen av OCT-fylt blokk slik at den ligger flush med bunnen.
MERK: Huden kan være orientert i alle retninger, aS lenge som hårfollikelkornet er kjent for riktig skjæreprosedyrer. Cryomolds vil bli reorientert når blokkene er festet til kryostat for krysoseksjonering. Marker hårfollikelretningen på cryomolden, siden dette trinnet bestemmer den etterfølgende orienteringen av kryostatkutt.- Overfør cryoblocks på metallplaten i -80 ° C fryseren for å unngå flytende og dislokasjon av vevet.
- Overvåk fryseprosessen for å opprettholde orienteringen av huden på bunnen av krympetallet, siden usynlige luftbobler kan føre til at huden stiger til overflaten av cryomolden.
MERK: Cryomolds med frosset vev kan lagres i mer enn et år ved -80 ° C og kan gjenbrukes for ytterligere seksjoner. - Trim høstet hud i rektangulære stykker av passende størrelse for å passe inn i bunnen av cryomold, og ta hensyn til retningsveksten av hårsekkekornet.
- Klipp dorsalområdet av dyrkadaveren med en tørr elektrisk barbermaskin.
Figur 1. Harvest og fiksering av museskinn. ( A ) Hudvev ble høstet fra dorsomedialområdet av dyrkadaveren. Hårfollikler i denne regionen er jevnt fordelt og justert og muliggjør dermed optimal orientering under snitting, som angitt av pilene. ( B ) Etter kutting av firkanter av passende størrelse som passer inn i cryomoldet ble hudvævet fikset i 4% PFA i 15 minutter og vasket to ganger i PBS i 5 minutter hver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Tykt Vev Tverrsnitt
- Forberedelse og vev orientering å montere på kryostat.
- Forbered en 100 mm kulturrett med 15 ml PBS. Plasser den på et lett tilgjengelig område på kryostat. I tillegg skal du lage en brønn med 12 brønner med 2,5 ml PBS per brønn; Etikett i henhold til prøvene for langsiktig lagring av sjøenCtions ved 4 ° C. Bruk tanger for å håndtere seksjonene.
- Juster temperaturen på kryostat til -20 ° C.
MERK: Temperaturen kan påvirke snittet, men en god veiledning er å starte ved -20 ° C. - For å få seksjoner omtrent to hårsekkene tykke, juster kryostat for å kutte snitt 150 μm tykk.
MERK: Tykkelsen på seksjonen kan varieres, avhengig av brukerens behov og begrensningene i mikroskopet som skal brukes til analyse.
MERK: Orienteringen av prøven er kritisk for å skaffe hudseksjoner med hårsekkene i riktig retning. Dette oppnås ved å montere riktig på kryostatblokken. Pass på at seksjonsplanet er parallelt med hårfollikelretningen ( figur 2c ). Som nevnt tidligere er riktig orientering av seksjonsplanet i hudprøven et avgjørende skritt for å bestemme kvaliteten på bildene som vil bli anskaffet iEt senere trinn.
Figur 2. Embedding, cryopreservation og sectioning.
( A ) Merking av hårfollikelretningen (HF) på cryomold, indikert av de svarte pilene, er viktig for riktig orientering under kryosekretisering. ( B ) Seksjonsplanet må justeres med hårfollikelretningen for å generere seksjoner der hele hårsekkene hele tiden er intakte. ( C ) Seksjoner ble kuttet per hårfollikelretningen som ble indikert av de svarte pilene på cryomold. ( D ) De tykke vevtverrsnittene ble samlet med metallpincer og ( e ) overført til en 100 mm kulturskål inneholdende 1x PBS. ( F ) Ved romtemperatur løser PBS bort OC.T. Sammensetning som omgir de tykke vevets tverrsnitt, som angitt av de hvite pilene. Seksjonene flyter så fritt i PBS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Cryosectioning.
- Klipp en seksjon ved hjelp av kryostat. Bruk tanger for å samle OLT som inneholder det innebygde hudstykket ( figur 2d ).
MERK: Bruk en kryostat som muliggjør uavhengig bevegelse og justering langs X-, Y- og Z-aksene for optimal prøveplassering. Dette gjør det mulig å generere idealt tilpassede vevtverrsnitt. - Overfør delen ut av kryostaten i 100 mm kultiveringsretten fylt med PBS og fortsett med neste stykke. Ikke samle prøvene på et lysbilde ( Figur 2e ).
MERK: Ved romtemperatur vil PBS løses oppOCT, forlater skiver som er lette å håndtere med tau ( figur 2f ).
MERK: Fersk PBS kan være nødvendig i 100 mm kultiveringsrett etter å ha løst mange vevseksjoner 100 μm tykk og kan endres tilsvarende. - Bruk tanger for å overføre de flytende hudseksjonene til riktig merket brønn i en 12 brønnplate fylt med 2,5 ml PBS ( figur 3a , venstre).
MERK: Ved 4 ° C kan prøvene lagres i minst to dager. Ved langvarig lagring av OCT-blokker som inneholder hud, skal de tette skjæreflaten med en dråpe frisk OCT. Etter frysing av OCT-dråpen, sett den brukte OCT-blokkene i parafilm og sett den tilbake i frysen på -80 ° C .
- Klipp en seksjon ved hjelp av kryostat. Bruk tanger for å samle OLT som inneholder det innebygde hudstykket ( figur 2d ).
3. Immunfluorescerende merking.
- Klargjør PB-bufferen (PBS supplert med 0,5% skummetmælkspulver, 0,25% fiskhudgelatin og 0,5% Triton X-100) ved leasT 2 timer på forhånd, som beskrevet tidligere 5 .
MERK: Natriumazid kan tilsettes til PB-buffer for antistoff-bevaring for gjentatt bruk av fargebufferen. - Merk 1,5 ml mikrocentrifugerør og tilsett 500 μl PB buffer per rør. Bruk forsiktig tverr for å overføre hudskiver fra PBS til separate rør som inneholder PB-bufferen for blokkering ( figur 3a , høyre). Pass på at alle hudskiver er helt nedsenket. Plasser mikrocentrifugerørene på en såsavler med hastigheter ikke høyere enn 10 oscillasjoner per minutt, som ikke bør forstyrre vevets integritet i 1 time ved romtemperatur.
MERK: Det er avgjørende at hastigheten ikke overstiger 10 oscillasjoner per minutt på saw-saw rocker, siden det vil føre til sammenfletting.- Mens det er mulig å legge til mer enn ett stykke per mikrocentrifugerør, for å lagre antistoffer, plasser bare ett skive per rør. For å redusere antistoffbruk, bruk et volumPå 250 μl.
MERK: Bytt ut mikrocentrifugerør med, for eksempel, 96-brønnsplater. Plasseringen av de tykke vevstverrsnittene i 1,5 ml mikrocentrifugerør tillater imidlertid den mest effektive antistoffpenetrering i vevet på grunn av forstyrret væskestørrelse.
- Mens det er mulig å legge til mer enn ett stykke per mikrocentrifugerør, for å lagre antistoffer, plasser bare ett skive per rør. For å redusere antistoffbruk, bruk et volumPå 250 μl.
- Merk separat 1,5 ml mikrocentrifugerør for hver hudskive og tilsett 500 μl PB buffer og riktig mengde primær antistoff. Etter 1 time blokkering, overfør hudskivene til de tilberedte rørene som inneholder antistoffene. Inkubér skiver ved 4 ° C over natten.
MERK: I dette eksemplet ble følgende primære antistoffer anvendt: FITC rotte anti-human CD49f ved en konsentrasjon på 1:50 og geit anti-mus / rotte integrin alpha 8 i en konsentrasjon på 1: 100. - Neste dag, lag 2 separate 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder 500 ul PBS per prøve. Vask huden skiver to ganger i 1 time ved romtemperature.
- Tilbered separate 1,5 ml mikrocentrifugerør inneholdende 500 ul PB buffer med riktig konsentrasjon av anvendelige sekundære antistoffer og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI).
MERK: De sekundære antistoffene som brukes i dette eksemplet er Alexa Fluor 488 esel anti-rotte IgG og Alexa Fluor 555 esel anti-geit IgG i en konsentrasjon på 1: 500. DAPI ble brukt i en konsentrasjon på 1: 100. - Forsiktig overfør hudprøver til PB-bufferen, som inneholder sekundær antistoff og DAPI, og inkuber hudskiver ved romtemperatur i 1 time ved lav hastighet på rotator eller shaker.
- Oppbevar skiver ved 4 ° C i PB-bufferen som inneholder det sekundære antistoffet og DAPI i opptil fire dager, og muligens lenger hvis natriumazid blir tilsatt til PBS.
4. Montering for mikroskopisk visualisering 
Figur 3. ImmunofluorescEnt merking og montering.
( A ) Flytvevs-tverrsnittene kan lagres i 12-brønnsplater i minst to dager ved 4 ° C. Før immunfluorescerende (IF) merking, overfør vævstverrsnittene av interesse til 1,5 ml mikrocentrifugerør som inneholder PB-buffer for blokkering, som angitt ved pil 1. For IF-merking, adhærer til fler-trinns prosedyre utarbeidet i trinn 3. Hver En del av trinn 3 krever omhyggelig overføring av vev-tverrsnittene til ferske preparerte mikrocentrifugerør som inneholder primær antistoffløsning, sekundær antistoffløsning eller vaskebuffer, som er indikert med pil 2. ( b ) Etter IF-merking, Seksjoner er oppravd og flatet i en dråpe glycerol ved hjelp av et disseksjonsmikroskop. ( C ) Når vevtverrsnittet er helt flatet på bunnen av et dekselglass, brukes en vanlig mikroseskive for å montere delen.
MERK: Når skiven flyter i glideneCerol-dråpe, kan den løsnes ved å koaksialere vevets naturlige tilbøyelighet til å returnere til sin normale form. Ikke tving den unaturlige rettingen av skiven, da dette kan forårsake skade på vevet.
MERK: Unngå luftinntak ( Figur 3c ).
MERK: Langvarig lagring vil påvirke vev og bildekvalitet negativt. I dette eksemplet ble alle bilder kjøpt med et oppreist konfokalmikroskop ved hjelp av et 20x objektiv.
Representative Results
For å understreke fordelene med vår teknikk, sammenlignet vi vår tykke, tredimensjonale vevsveisingsteknikk, "horisontal helfest", til klassiske frosne seksjoner. Klassiske frosne seksjoner ble kuttet som tidligere beskrevet 5 . For å gi en visuell struktur for epidermis i te mikroskopiske bilder, immunostaines vi for integrin alpha-6 (Itga6), som er en komponent som forankrer epidermale celler til den underliggende kjellermembranen 6 . Vi merket også arrector pili muskel (APM), som er ansvarlig for piloereksjon (også kjent som "goosebumps"), med integrin alpha-8 7 . I de klassiske frosne seksjonene ble de fleste hårsekkene visualisert med Itga6 ikke snittet langs hele lengden, noe som genererte overveiende ufullstendige hårsekk per snitt i forhold til horisontale hele fester ( Figur 4a -4d figur 4a -4d ). Dessuten bevares vevets integritet i det hypodermale rommet i horisontale hele fester, i forhold til ødeleggelsen av adipocytter når kryoseksjoner er festet til varme glassglass, som er en kjent frysetøtningsartefaktor ( figur 4a- b , sammenligner hypodermalt Regioner) 8 .
Figur 4. Horisontal hele mouNt sammenlignet med en klassisk kryoseksjon.
( A ) Klassisk oppnådde hudkryoseksjoner 10 μm tykk og ( b ) 100 μm tykke 3D-vev-tverrsnitt ble merket med integrin alfa-6 (Itga6) og integrin alfa-8 (Itga8) for å visualisere epidermalkammeret og arrectorpili-musklene , Henholdsvis. Bildene av de tykke vevtverrsnittene er representert som maksimale fremspring av en stor Z-stabel. De hvite rammene angir de områdene som forstørres, vist i ( c ) de klassiske og ( d ) horisontale hele monteringsdelene. ( E ) intakte hårsekk og ( f ) intakte arrector pili muskler ble kvantifisert i både de klassiske og de horisontale helmonterte seksjonene. Skalestenger angir 100 μm. Dataene er representert som Mean ± Standard Feil av Mean (SEM). En del per biologisk replikat ( n = 3) ble kvantifisert. Unpaired t-test * P <0,05, *** P <0,0005. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disclosures
Forfatterne vil gjerne avsløre at publikasjonen av dette manuskriptet ble finansiert av Thermo-Fisher Scientific Inc.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner sponsorering fra Thermo-Fisher Scientific og takker Nikon Imaging Center på Kings College London for støtte under konfokalt bildeoppkjøp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | homemade | ||
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
| O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
| Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Culture dishes | |||
| Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| pointed metal forceps | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
| 12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
| Dissecting microscope | Nikon | ||
| 20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
| 1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Rocking shaker plate | |||
| Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
| Confocal microscope | Nikon |
References
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
