Summary
通过秋水仙碱的双重治疗，可以产生一种杀死分裂细胞的植物来源的毒素，可以产生无神经的九头蛇 。这些九头蛇不能自己饲养或觅食。本文介绍了实验室中长期维持无神经寻常性黑 。 病的改进方法。
Abstract
Hydra的间质细胞谱系包括多能干细胞及其衍生物：腺体细胞，线粒体细胞，生殖细胞和神经细胞。间歇细胞可以通过两次连续的处理来消除，秋水仙素是一种植物来源的毒素，其杀死分裂细胞，从而消除了从间质干细胞衍生的分化细胞的更新潜力。这样可以产生缺乏神经细胞的九头蛇 。无神经的息肉不能打开嘴巴进食，最小化或调节渗透压。然而，如果经常强制喂养和褥疮，这样的动物可以在实验室中无限期地存活和培养。神经细胞的缺乏允许研究神经系统在调节动物行为和再生中的作用。以前发布的无神经性Hydra维持方案涉及过时的技术，例如用手拉式微量移液管吸嘴ips喂养和清洁九头蛇 。在这里，介绍了一种用于维持无神经的Hydra的改进方案。精细的镊子用于强制开口并插入新鲜杀死的卤虫 。在强制喂养之后，使用注射器和皮下注射针将动物的体腔用新鲜培养基冲洗以除去未被消化的材料，这里称为“打嗝”。通过使用镊子和注射器，这种通过使用镊子和注射器的强制喂养和打嗝无神经的九头蛇的新方法消除了使用手拉式微量吸头的吸嘴的需要。因此使得该过程更加安全和显着地更加高效。为了确保hypostome中的神经细胞已被消除，使用抗酪氨酸 - 微管蛋白进行免疫组织化学。
Introduction
九头蛇神经系统由神经网组成，神经元与上皮组织层1相关联。神经网在体积较小的密集体和花序梗中较密集，体积不足2 。神经细胞来自间质干细胞，这是造成分泌细胞，神经细胞，生殖细胞和神经元的多能干细胞。可以通过用秋水仙素3,4 （一种杀死分裂细胞的植物来源的毒素）处理来消除寻常性黑草的间质细胞。尽管秋水仙碱已被发现抑制其他生物体中的微管聚合，但以前的研究表明，在整个治疗过程中， Hydra存在微管，这表明秋水仙素在Hydra 3中不起作用。另一个udy表示秋水仙素在一些生物体中不能有效地结合微管蛋白，包括四膜虫，三角豆，衣藻和粟酒裂殖酵母，这可能解释了这种差异。秋水仙碱治疗通过内胚层上皮细胞3诱导间质细胞的吞噬，从而允许产生缺乏神经细胞，腺体细胞和神经细胞的动物。不清楚为什么间质细胞对秋水仙碱治疗特别敏感。鉴于有丝分裂后间质细胞和间质干细胞谱系都受损和吞噬，Campbell认为秋水仙素不直接影响有丝分裂活性3 。值得注意的是，秋水仙碱治疗在寻常 藿香中效果良好，但在其他物种如Hydra oligactis 6中也 表现不佳 。 水ra草 7 。因此，无神经的Hydra （有时也被称为“上皮Hydra ” 8 ）是研究来自间质细胞系的这些特殊细胞类型在组织稳态和再生中的作用的有用工具。
九头蛇可能是没有神经系统能够生活的动物的唯一已知的例子。无神经的九头蛇作为一种特别有用的模型，用于解剖神经网在调节Hydra再生，体内平衡和行为中的作用。例如，通过移植将间质细胞引入无神经的Hydra ，允许将神经细胞分化表征为高度区域特异性9 。此外，因为无神经的Hydra可以再生，它们可以调查替代的，神经系统独立的再生途径。一个这样的例子是顶端神经发生和头部形成，其已显示取决于野生型Hydra中神经系统中的cnox-2功能，但似乎在无神经的Hydra中是不必要的 ，这表明可能存在替代的头部再生过程10 。
神经发生丧失后，神经元和神经传递基因也被用于研究上皮细胞的表达和调节。无神经的九头蛇不会发生自发的收缩爆发12 ，表明这些爆发是由神经系统调节的。然而，无神经的水ra ra ，，in to to the the the force force u u u u u u u u u u u u u u u u u u ugh间隙连接在上皮细胞，而自发收缩行为介导通过间隙连接在神经细胞13 。
无神经的九头蛇在呈现食物或还原型谷胱甘肽3时不要张开嘴巴，这表明感觉神经元是检测食物存在所必需的，并且指示口腔开放。此外，神经网似乎在感测渗透压方面发挥作用，因为无神经动物不能通过开口自主调节其内部静水压力，导致其特征性的气球样外观3,4 （ 图1B ）。通过频繁的手动通气调节无神经的Hydra的静水压，导致hypostome和身体柱中的一些异常形态的损失。然而，长期通缩导致了对经济增长的干扰发病，萌芽和组织组织8 。
虽然无神经的九头蛇不能自己饲养和自发，但可以通过手动强制喂养和打击每只动物在实验室中无限期地保持它们。以前的出版物已经描述了强制喂养和打嗝无神经Hydra的方法 ，然而这些方案涉及使用微量移液器吸头，其必须被小心地手动地拉到适当的尺寸，以及使用通过管道14连接到移液管的接口管。这里描述了一种更简单，更安全，更节省时间的喂食和打嗝方法。
此外，以前的研究涉及通过将固定动物解离成单个细胞来检查神经细胞的缺失和细胞形态的检查3,4,15。 H使用抗α微管蛋白的酪氨酸羧基末端的单克隆抗体的免疫组织化学作为一种补充方法，用于检查hypostome 13,16中神经元的消耗。以前的研究已经表明，也可以使用这种抗体13可视化花序梗中的神经元，然而这些神经元以及体列中的这些神经元更难以形成。虽然免疫组织化学足以证实在hypostome中不存在神经细胞，并且不需要关于细胞类型形态的专门知识，但是它不能用于检查间质干细胞和这些细胞的其它衍生物的缺失。解离和细胞形态学研究更加严格，并且可以给出每个治疗阶段后剩余的每种细胞类型的数量的定量分析。
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Protocol
双秋水仙碱治疗
- 在Hydra介质3,4,17中制备0.4％的秋水仙碱（重量/体积）溶液。
注意：秋水仙碱是急性毒性的，如果吞咽会致命，可能会导致遗传性缺陷，并可能导致眼睛损伤。在通风橱里处理粉末并佩戴完整的个人防护装备（PPE）。 - 在室温下在黑暗中培养在培养皿中每5毫升秋水仙碱溶液在橙子每毫升秋水仙碱溶液中饥饿8小时，在0.4％秋水仙素中饥饿24小时。
注意： 5 Hydra / mL秋水仙碱是确定使用多少溶液以避免用Hydra过度拥挤的指南。使用相同体积的溶液进行后续清洗和溶液更换。 - 取出秋水仙碱溶液并更换干净的Hydra培养基不含秋水仙碱。在Hydra培养基中转移至50μg/ mL利福平之前，用巴斯德玻璃杯吸管清洗Hydra培养基，将Hydra洗5次。将九头蛇保存在18°C的孵化器中。
注意：在4℃下可以储存足够的1,000X利福平（50mg / mL）的二甲基亚砜（DMSO）处理1-2周。精确量可以由每天使用的溶液的总体积确定。例如，如果有2个皿，每个包含10mL需要每天更换两次的溶液，一天中将使用总共40mL的溶液，相当于每天40×1,000个原料或560μL两周以上。然后在Hydra培养基中使用时将原料稀释1：1000。
注意： DMSO是可燃液体，易于渗透皮肤，使其他溶解的化学物质进入人体。手在通风橱中使用溶剂，并佩戴完整的PPE。值得注意的是，DMSO在4℃下冻结 - 每天更换含利福平Hydra培养基两次，直到Hydra停止将细胞排出到培养基中，通常在治疗后1周。此时，介质可以每天更换一次。治疗后的几天， 九头蛇将彻底失去触手。避免使九头蛇彼此接触，因为它们可能融合在一起，并导致奇怪形状的九头蛇 （ 图 2A）。
- 为了防止接触，请避免旋转盘旋转。相反，在垂直和水平方向上轻轻搅动菜肴，直到九头蛇分开。将Hydra放入18℃的培养箱中检查，然后根据需要进行调整。
注意：介质更换两次的日期，请更换介质一天早上又在下午/晚上。
- 为了防止接触，请避免旋转盘旋转。相反，在垂直和水平方向上轻轻搅动菜肴，直到九头蛇分开。将Hydra放入18℃的培养箱中检查，然后根据需要进行调整。
- 一旦触手开始形成，每周开始强迫哺乳和打嗝九至四次（见第2和第3节）。秋水仙碱治疗约8-9天后， 九头蛇开始伸展他们的触手。
注意：触手再生根据个体而异。有些可能需要长于8 - 9天才能出现触角增长迹象。那些不会再生长它们的触手以及奇怪的形状（ 图 2B）的动物或动物太小而不能进食应该被去除。这些九头蛇可能不会在第二次治疗中生存。 九头蛇也可以芽。然而，一些芽可能仍然具有间质细胞并且能够自己进食。- 去除任何可以在没有帮助的情况下吃的芽，并从父母中分离出来。通过添加活的卤虫来识别这些动物喂养菜，观察动物是否自行捕捉和食用卤虫 。 1或2 Hydra也可以自己吃饭。这些也应该被丢弃。
注意：无神经的九头蛇具有特征性的气球样形态，触角比正常更短和更薄（由于损失了肌细胞），因此可以容易地与正常的动物区分开（ 图 1A，1B ）。
- 去除任何可以在没有帮助的情况下吃的芽，并从父母中分离出来。通过添加活的卤虫来识别这些动物喂养菜，观察动物是否自行捕捉和食用卤虫 。 1或2 Hydra也可以自己吃饭。这些也应该被丢弃。
- 在第一次秋水仙碱治疗后三周，重复秋水仙素治疗（步骤1.1-1.5）。第二次秋水仙碱治疗是消除剩余的间质细胞和神经细胞所必需的3 。
力量喂养
- 将卤虫囊肿加入到底部变细的窄而高的玻璃容器中。用容器装满卤水 （6.72M NaCl）。避免擅长每1升水加1克囊肿以获得更高的孵化率。
- 用石蜡膜覆盖容器的顶部，并通过石蜡膜将10mL血清移液管插入容器中。通过将管道连接到水族箱气泵并将管道安装在移液管周围来进行曝气。确保移液器尖端到达容器的底部，并且没有囊肿在底部沉降。 卤虫将在48小时后孵化。
注意：有许多不同的方法来孵化卤虫 ，这也可能会起作用。
- 用石蜡膜覆盖容器的顶部，并通过石蜡膜将10mL血清移液管插入容器中。通过将管道连接到水族箱气泵并将管道安装在移液管周围来进行曝气。确保移液器尖端到达容器的底部，并且没有囊肿在底部沉降。 卤虫将在48小时后孵化。
- 在卤虫网（可从水族馆供应公司获取）中将卤虫从卤水中应变，并将其在去离子水中洗涤约20秒，然后将其置于含有Hydra培养基的盘中。 卤水的盐度对于九头蛇来说太高了，所以卤虫在使用前必须洗净。
- 在解剖显微镜下，通过用一对精细镊子轻轻地挤压它们来安乐死卤虫 。避免挤压足够的力量排出胆量，因为这会粘在镊子上，使喂养困难。将卤虫轻轻压榨，然后将其送入Hydra将有助于消化过程14 。将新鲜杀死的卤虫附近的九头蛇放在盘子里，以方便快速喂养。
注意：所有后续步骤都在解剖显微镜下进行。 - 使用一对镊子将花to握住九头蛇 。在喂养九头蛇的过程中继续握住花序梗。使用第二对钳子捏住身体柱，以使Hydra合同。
- 在将第二对镊子的尖端保持在一起的同时，点击下丘的中心（动物口端的圆顶结构）。这有时会导致嘴巴打开。一世通过将镊子插入臀部的中心，然后轻轻地释放镊子的尖端上的压力，嘴巴不会通过开口打开，刺穿口腔。这应该伸出由穿刺造成的开口。
注意：嘴巴打开时， 九头蛇可能会放气和塌缩（ 图2 C ）。如果发生这种情况， 卤虫仍然可以插入九头蛇 。如果这样做太难了，请转到下一个九头蛇，然后再回到原来的水Hyd ，再试一次。 Hydra倾向于在随后的口腔中不会泄漏一样多。 - 用镊子快速拿起卤虫 ，将其插入九头蛇的胃腔。插入尽可能多的卤虫 ，直到胃腔充满，更多的卤虫不能插入而不损坏九头蛇 ，事故盟友拉扯任何卤虫 ，或阻止嘴巴闭合。平均来说，这是5 - 6 卤虫 ，然而最多12种已经喂给较大的动物。
- 如果嘴巴开始闭合，如上所述用镊子再次拉伸;但是，当口腔重新开放时，动物内已经有的卤虫可能开始出现，应该小心。
- 如果Hydra对于全卤虫来说太小，用手术刀切割卤虫 ，并将Hydra较小的部分喂食。如果卤虫没有留在九头蛇眼中 ，可能需要将镊子压在卤虫上 ，使其保持在九头蛇之内，直到嘴巴闭合。
- 使用玻璃巴斯德移液管转运Hydra ，仔细避免意外打嗝，在Hydra培养基中加入新鲜的50μg/ mL利福平的菜肴。如果卤虫被驱逐f在转移的同时，在新的菜中重新插入Hydra 。
注意：使用玻璃移液器来转移Hydra ，因为与塑料相比， Hydra比玻璃更少。移液器的长度并不重要，但是使用5英寸移液器可能会更容易一些。
打嗝
- 在进食后8至20小时之间任何时候，打开九头蛇去除未消化的物质。
- 用P320或类似的砂砾砂纸将30G皮下注射针点降下，直到尖端平坦。
注意： 27G皮下注射针也可以工作，但较高规格的较小尖端是优选的。 - 将针头连接到一次性1mL塑料注射器，并在Hydra培养基中用新鲜的50μg/ mL利福平填充注射器。
注意：打破单个Hydra需要约0.05 mL至0.1 mL溶液。 1 mL syringe是优选的，因为用更大体积的注射器控制出来的溶液的力和体积更加困难。 - 在解剖显微镜下，用精细镊子握住九头蛇的花序梗，并用针头敲击hypostome中心。如果嘴巴没有打开，请将镊子插入腰包，然后按照上述方式打开嘴巴进行喂食。
注意：所有后续步骤都在解剖显微镜下进行。 - 使用注射器非常轻轻地冲洗，以避免用50μg/ mL利福平溶液吹走整个动物，胃腔，直到所有碎片都被排出。如果Hydra的尺寸不允许，则针不一定需要插入Hydra 。针可以保持靠近开口并且直接指向嘴。
- 使用玻璃巴斯德移液器，将九头蛇转移到一个新鲜的50碟81; g / mL利福平在Hydra培养基中。
4. 通过免疫组织化学的质量控制
注意：以下协议由Shenk，M.A 等人的协议改编18 ，Böttger，A 19 。所有步骤均在室温（RT）下进行，除非另有说明。培养步骤可以使用养分器，并且可以改善染色质量。然而，如果九头蛇相互纠缠，所有的步骤也可以不执行。
- 准备封闭溶液：10％胎牛血清（FBS）和1％DMSO在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。将此溶液储存在4°C直至使用（步骤4.6和4.11）。溶液可以储存1 - 2天。
注意：本协议中使用的所有解决方案必须作为危险废物进行适当的收集。 - 在Hydra m的200μL2 ％氨基甲酸酯中放置Hydra在1.7 mL微量离心管中放置1 min。在4种情况下，每个管使用5只Hydra ，无神经，未经治疗，未经第一抗体治疗，未经二抗治疗。
注意：不要超过1分钟。这里的时间是至关重要的，因为在氨基甲酸乙酯花费太多时间之后，动物会变得不好。 - 取出氨基甲酸酯并将Hydra在Hydra培养基中的200μL4 ％多聚甲醛（PFA）中固定15分钟。
- 用1x PBS洗涤样品3次，每次10分钟。
注意：用PBS和PBSTx洗涤全部用500μL溶液完成。 - 用500μL的0.5％Triton X-100在PBS中渗透15分钟。
- 取出0.5％Triton X-100并加入500μL封闭溶液。阻止样品至少1小时。
- 在阻滞溶液中稀释抗酪氨酸 - 微管蛋白抗体1：200。
注意：这个浓度是de实验终止。如果发现控制信号太弱，可能需要增加浓度。如果存在非特异性结合，则可能需要降低浓度。抗体的预孵育也可以有助于减少非特异性结合。 - 从样品中取出封闭溶液，并向无神经的Hydra ，未处理的对照组和未处理的对照组中加入200μL的无抗体，无次要的。对于未经初步处理的未处理对照，仅添加200μL无抗体的封闭溶液。
- 在4℃下孵育样品过夜（> 12小时）。
注意：或者，在室温孵育5 - 6 h。 - 取出第一抗体，并用1×PBS（PBSTx）中的0.3％Triton X-100大量洗涤样品。
注意：保存一次抗体并保存在4°C，因为它可以重复使用至少2-3次。 - 稀释山羊抗小鼠hP二抗ody 1：500阻塞溶液。向无神经的Hydra ，未处理的对照组和未处理的对照组中加入200μL，无原代培养。对于没有继发的未处理对照，只加入200μL无抗体的封闭溶液。
注意：或者，可以使用荧光二抗，不需要步骤4.13-4.17。使用荧光辅助器节省时间并且通常是足够的，但hP次级提供增加的灵敏度。实验确定次级浓度。如果控制中的信号太弱，则可能需要增加浓度。如果存在非特异性结合，则可能需要降低浓度。 - 在4℃下孵育样品过夜。
- 取出第二抗体并用PBSTx广泛洗涤样品。
- 在1×PBS中制备1×PBT：0.2％牛血清白蛋白（重量/体积）和0.05％Tween20。孵出来在1×PBT中的30分钟。
- 取出1×PBT并在1x PBT中1：1,000 NHS-荧光素和1：10,000H 2 O 2的样品在黑暗中孵育15分钟。从这一步开始，尽可能保持样品在黑暗中，因为荧光信号会在暴露于光下时减少。
注意： NHS-荧光素是按照King，RS和Newmark，PA 20的详细FISH方案制备的 - 用PBSTx快速洗涤样品3次，然后2次30分钟。
- 将样品放在PBSTx中4℃过夜，继续洗涤。
- 再用1x PBSTx洗几次。为了可视化细胞核，使用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚，二盐酸盐（DAPI）进行DNA复染的以下任选步骤。否则，现在可以对样品进行成像。
- 在PBSTx中稀释5 mg / mL DAPI原液至1：500的工作浓度，并向每个管中加入200μL。 INCU将样品叮咬30分钟。
注意： DAPI是一种已知的致癌物质。穿全PPE。 - 在用荧光显微镜成像之前，用PBSTx去除DAPI并洗涤样品2-3次。
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Representative Results
在最初的8小时秋水仙碱治疗之后，所有Hydra都存活下来。其中一些Hydra只会有触角残留物（ 图3A ），而其他的则会完全失去触手（ 图 3B ）。在接下来的1或2天之内，触手将继续缩小，直到所有的九头蛇都已经失去触手。治疗后约1周， Hydra将在触角充分再生之前显示触角再生的迹象，如触角（ 图3 C ），小短柄如图3 所示 。在原来的九头蛇眼中 ，大约50-60％的人最终在治疗1-2周之间再生触手。
之后治疗后，动物的恢复与第一次治疗后相似。因此，进入两种治疗的原始动物数量的大约10％恢复并增长到适合于实验的尺寸（ 图1B ）。这些九头蛇具有比未经处理的动物看起来更薄的触角，具有更透明的组织，并且由于不能打开嘴巴以便减轻渗透压力而会显得膨胀（ 图 1A ，1B）。任何未喂养的动物都可以存活数周，然而，未驯化的动物的尺寸会缩小，并且越来越难以进食。
在第二次治疗后恢复的九头蛇可以无限期地保持。这些动物能够发芽，从而维持和增长人口。此外，人口可能会增长通过切割这些动物并允许它们再生4 。
免疫组织化学证实了第二次秋水仙碱治疗后hypostome神经元的损失。利用抗酪氨酸 - 微管蛋白抗体13,16可以观察到hypostome中的致密神经网，并且显示从口腔向外辐射的明显的纤维和明显的细胞体（ 图4A ）。这些纤维不存在通过用秋水仙碱双重处理产生的无神经的Hydra （ 图 4B ）。此外，由于秋水仙碱处理导致的间质细胞谱系细胞的损失，与DAPI共染色显示无神经的Hydra中的细胞核数量与未处理的对照相比减少（ 图4 A，4B ）。
图1 。无神经和未处理的九头蛇比较 。
（A）未处理的九头蛇 （B）第二次秋水仙碱治疗22天后无神经的九头蛇 。注意无神经动物的肿胀的身体柱和薄的触手。刻度棒为500μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 。变形九头蛇的例子。
（A）两只九头蛇 （B）奇怪的九头蛇 。 （C）嘴巴开口后放气的九头蛇 。刻度棒为400μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 。 Hydra先前8小时秋水仙碱治疗的代表性图像。
（A）在治疗后立即用紧身触角触手的九头蛇 。 （B）治疗后立即完全失去触手的九头蛇 。 （C）治疗后8天开始再次触手的九头蛇 。 （D）在治疗后13天， Hydra已经彻底再生长了触手。刻度棒为400μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4 。 Hypostome神经细胞的损失可以通过免疫组织化学证实。
（A）在第二次秋水仙碱治疗后约2周，用（i）抗酪氨酸 - 微管蛋白抗体和（ii）DAPI标记的未处理的Hydra和（B）未神经的Hydra的 （B） hypostome。 （iii）显示重叠。 *表示嘴的位置。最大z投影是用旋转圆盘共聚焦荧光z叠层制成的500毫秒（GFP）和15毫秒（DAPI）的针刺。调整亮度和对比度以提高可见度。刻度棒为20μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
Hydra间质细胞可以通过双秋水仙碱治疗3,4消除。在第一次处理之后的几天内，防止个人Hydra之间的接触，以避免Hydra碎片融入变形Hydra中至关重要。此外，第一次治疗后可以不助食的动物必须去除，因为第二次秋水仙碱治疗可能不足以从这些动物中消除剩余的间质细胞。为了使第二次秋水仙碱治疗后无神经性九头蛇的存活率最大化，从第一次治疗开始恢复后，动物应尽可能多地喂食卤虫 ，饲养后1-2天恢复生长。每个秋水仙碱治疗会导致Hydra在细胞被排卵时大小减小，所以Hydra在每次处理之前就越大，b将Hydra恢复到可以饲养和维持的大小的机会。
由于Hydra每次处理后存活率低，可能需要从许多Hydra开始。但是，一旦开始治疗太多Hydra时，必须小心。这将使第一次治疗中的喂养困难和非常耗时。在第一次治疗后喂养的动物恢复到更大的尺寸，因此在第二次处理后具有更高的存活率。因此，开始更少，更注重饲养可能会更有成效。一般来说，从50-100只动物开始可以管理1-2人。最好还是从最大的九头蛇开始，因为这两种治疗方法更好。
强制喂养和打嗝方法本文所述缺乏神经细胞的九头蛇是更安全，更简单，更多的时间低于过去3,4,4中描述的方法。使用市售的镊子和注射器不需要手拉式微量吸头，这是耗时且难以制造的。使用这些工具也避免了口吸移液器的需要。首先使用镊子进行强制喂养可能很困难，但给予足够的时间和实践，变得相当容易和有效。应该首先练习强力喂养和打嗝正常的九头蛇，以了解使用工具多少力量以及如何操纵九头蛇 。测试各种镊子和针头尺寸，以找到用于强力喂养和打嗝的最佳工具。
使用本文所述的抗体染色仅足以检查hypostome中神经细胞的缺失。为了确保所有的间质细胞已被消除，动物可能被浸没和可以检查存在的细胞类型15 。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
作者感谢杜克坎贝尔博士（UC Irvine）就关于产生和维持无神经动物的原始方案进行讨论，王瑞女士帮助适应注射器和针头技术，Danielle Hagstrom女士和Rob Steele博士（加州大学欧文分校）对手稿发表评论。这项工作得到RCSA和NSF授权CMMI-1463572的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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