Summary
Gennem en dobbelt behandling med colchicin, kan et planteafledt toksin, der dræber opdelende celler, genereres nervefri Hydra vulgaris . Disse Hydra kan ikke foder eller egest på egen hånd. Dette dokument beskriver en forbedret metode til langvarig vedligeholdelse af nervefri Hydra vulgaris i laboratoriet.
Abstract
Den interstitielle cellelinie af Hydra indbefatter multipotente stamceller og deres derivater: kirtelceller, nematocytter, kimceller og nerveceller. De interstitielle celler kan elimineres gennem to på hinanden følgende behandlinger med colchicin, et planteafledt toksin, der dræber opdelende celler, således at potentialet for fornyelse af de differentierede celler, som er afledt af de interstitielle stamceller, fjernes. Dette giver mulighed for generering af Hydra, der mangler nerveceller. En nervefri polyp kan ikke åbne munden for at fodre, øge eller regulere osmotisk tryk. Sådanne dyr kan imidlertid overleve og dyrkes på ubestemt tid i laboratoriet, hvis de regelmæssigt styrkes og forøges. Manglen på nerveceller giver mulighed for undersøgelser af nervesystemets rolle ved regulering af dyrs adfærd og regenerering. Tidligere offentliggjorte protokoller til nervefri Hydra- vedligeholdelse involverer forældede teknikker som mundpipettering med hånd-trukket mikropipette tIps til at fodre og rengøre Hydra . Her introduceres en forbedret protokol til vedligeholdelse af nervefri Hydra . Fine-tipped pincet bruges til at tvinge åbne munden og indsætte nyligt dræbt Artemia . Efter kraftfodring skylles kropshulrummet af dyret med frisk medium ved hjælp af en sprøjte og hypodermisk nål for at fjerne ufordøjet materiale, der her refereres til som "burping". Denne nye metode til kraftfodring og burping nervefri Hydra gennem brug af pincet og sprøjter eliminerer behovet for mundpipettering ved hjælp af hånddrevne mikropipette tips. Det gør processen så sikrere og betydeligt mere tidseffektiv. For at sikre, at nervecellerne i hypostomet er elimineret, udføres immunhistokemi ved anvendelse af anti-tyrosin-tubulin.
Introduction
Hydra nervesystemet består af et nervenet, med neuroner forbundet med begge epitelvævslag 1 . Nervenettet er tættere i hypostom og pæn og mindre tæt i kroppens kolonne 2 . Nervecellerne stammer fra interstitielle stamceller, som er multipotente stamceller, som giver anledning til sekretoriske celler, nematocytter, kimceller og neuroner 1 . Det er muligt at eliminere de interstitielle celler fra Hydra vulgaris ved behandling med colchicin 3 , 4 , et planteafledt toksin, der dræber delende celler. Selv om colchicin har vist sig at hæmme mikrotubulumpolymerisation i andre organismer, har en tidligere undersøgelse vist, at mikrotubuli er til stede i Hydra gennem hele behandlingen, hvilket tyder på, at colchicin ikke virker på denne måde i Hydra 3 . En anden stUdy antyder, at colchicin ikke binder effektivt til tubulin i nogle organismer, herunder Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas og Schizosaccharomyces pombe, som kan forklare denne forskel 5 . Colchicinbehandlingen inducerer fagocytose af de interstitielle celler af de endodermale epithelceller 3 og tillader således oprettelse af dyr, som mangler nerveceller, kirtelceller og nematocytter. Det er uklart, hvorfor de interstitielle celler er særligt modtagelige for colchicinbehandling. Da både postmittotiske interstitiale celler og den interstitielle stamcellelinie er beskadiget og fagocytosed, konkluderede Campbell, at colchicin ikke direkte påvirker mitotisk aktivitet 3 . Colchicinbehandling fungerer især godt i Hydra vulgaris, men det har vist sig at virke ikke også i andre arter, såsom Hydra oligactis 6 . Hydra viridis 7 . Nervefri Hydra (også undertiden benævnt "epithelial Hydra " 8 ) er derfor et nyttigt redskab til at studere rollerne i disse specialiserede celletyper fra interstitiel cellelinie i vævshomostase og regenerering.
Hydra kan være det eneste kendte eksempel på et dyr, der er i stand til at leve uden et nervesystem. Nervefri Hydra tjener som en særlig nyttig model til dissekering af nervenettens rolle ved regulering af Hydra regenerering, homeostase og adfærd. For eksempel tillod indførelsen af interstitielle celler i nervefri Hydra via podning til karakterisering af nervecelle-differentiering som meget regionspecifik 9 . Desuden, fordi nervefri Hydra kan regenerere, deMuliggøre undersøgelsen af alternative, nervesystemafhængige regenereringsveje. Et sådant eksempel er apisk neurogenese og hoveddannelse , som har vist sig at afhænge af cnox-2- funktionen i nervesystemet i vildtype- hydra , men synes at være dispensabel i nervefri Hydra , hvilket tyder på, at der kan være en alternativ hovedregenerationsproces 10 .
Nervefri Hydra er også blevet brugt til at studere epithelcelleekspression og regulering af neurogene og neurotransmissionsgener efter tabet af neurogenese 11 . Nervefri Hydra udviser ikke spontane sammentrækningsudbrud 12 , hvilket indikerer at disse udbrud reguleres af nervesystemet. Nervefri Hydra kontraherer imidlertid som reaktion på klemning af kropsøjlen med pincet, hvilket tyder på, at sammentrækning som følge af mekaniske stimuli medieres ved kobling throuGh mellemrumsforbindelser i epithelceller, mens spontan kontraktile adfærd formidles ved kobling gennem mellemrumskryds i nerveceller 13 .
Nervefri Hydra åbner ikke deres mund, når de præsenteres med mad eller reduceret glutathion 3 , hvilket tyder på, at sensoriske neuroner er nødvendige for at detektere tilstedeværelsen af mad og signalere munden at åbne. Derudover synes nervenettet at spille en rolle ved at detektere osmotisk tryk, fordi nervefrie dyr ikke er i stand til selvstændigt at regulere deres interne hydrostatiske tryk gennem mundåbning, hvilket forårsager deres karakteristiske ballonlignende udseende 3 , 4 ( figur 1B ). Regulering af hydrostatisk tryk i nervefri Hydra ved hyppig manuel deflation førte til tab af noget abnorm morfologi i hypostom og kropsøjle. Men kronisk deflation førte til forstyrrelse af væksten, elUlation, spirende og vævsorganisation 8 .
Selvom nervfri Hydra ikke er i stand til at fodre og skabe sig selv, er det muligt at opretholde dem på ubestemt tid i laboratoriet ved manuelt at tvinge og dyrke hvert dyr. Tidligere publikationer har beskrevet metoder til kraftfodring og burping nervefri Hydra , men disse protokoller involverede brugen af mikropipette tips, som skal håndtrækkes forsigtigt til den passende størrelse samt brug af et mundstykke forbundet til pipetten ved rør 14 . Her beskrives en enklere, sikrere og mere tidseffektiv metode til fodring og burping.
Derudover involverede tidligere undersøgelser kontrol af fraværet af nerveceller gennem dissociation af faste dyr i individuelle celler og undersøgelse af cellemorfologi 3 , 4 , 15 . HImmunohistokemi med et monoklonalt antistof mod den tyrosinerede carboxylterminal af alfa-tubulin blev anvendt som en gratis metode til maceration for at undersøge udtømningen af neuroner i hypostom 13 , 16 . Tidligere undersøgelser har vist, at neuroner i peduncle også kan visualiseres ved hjælp af dette antistof 13 , men disse neuroner såvel som dem i kropsøjlen er vanskeligere at lave. Selvom immunhistokemi er tilstrækkeligt til at bekræfte fraværet af nerveceller i hypostomet og ikke kræver ekspertise på celletypemorfologi, kan det ikke bruges til at kontrollere for fraværet af de interstitielle stamceller og de andre derivater af disse celler. Dissociation og cellemorfologi studier er strengere og kan give en kvantitativ redegørelse for antallet af hver celletype, der er tilbage efter hver fase af behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dobbelt kolchicinbehandling
- Lav en 0,4% colchicin (vægt / volumen) opløsning i Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Forsigtig: Colchicin er akut toksisk, dødelig ved indtagelse, kan forårsage genetiske defekter og kan forårsage øjenskade. Håndtag pulveret i en dampkåbe og brug fuldt personlig beskyttelsesudstyr (PPE). - Incubate Hydra vulgaris (AEP stamme blev anvendt her), der har været sultet i 24 timer i 0,4% colchicin i et forhold på 5 Hydra pr. Ml colchicinopløsning i en petriskål i 8 timer ved stuetemperatur i mørket.
Bemærk: 5 Hydra / mL colchicin er en vejledning til bestemmelse af, hvor meget opløsning der skal bruges for at undgå overfyldning af fadet med Hydra . Brug samme volumen opløsning til efterfølgende rengøring og opløsningsændringer. - Fjern kolchicinopløsningen og udskiftMed rent hydra medium uden colchicin. Vask Hydra 5 gange ved seriel overførsel med en glas Pasteur pipette i rent Hydra medium før overførsel til 50 μg / ml rifampicin i Hydra medium. Hold Hydra i en 18 ° C inkubator.
Bemærk: Tilstrækkelig 1,000X rifampicin stamme (50 mg / ml) i dimethylsulfoxid (DMSO) i 1-2 ugers behandling kan opbevares ved 4 ° C. Det nøjagtige beløb kan bestemmes af den samlede mængde opløsning, der anvendes hver dag. For eksempel, hvis der er 2 retter, der hver indeholder 10 ml opløsning, der skal ændres to gange dagligt, vil i alt 40 ml opløsning blive brugt på en dag svarende til 40 μl 1.000X bestand pr. Dag eller 560 μL Over en periode på to uger. Beholdningen fortyndes derefter 1: 1000 i Hydra- medium ved anvendelse.
Forsigtig: DMSO er en brændbar væske og trænger let ind i huden, hvilket tillader andre opløste kemikalier i kroppen. HåndLe opløsningsmidlet i en dampplade og brug fuld PPE. Bemærk, fryser DMSO ved 4 ° C - Ændre det rifampicinholdige Hydra- medium to gange dagligt, indtil Hydra stopper udstødning af celler i mediet, hvilket normalt er 1 uge efter behandling. På dette tidspunkt kan mediet ændres en gang dagligt. I dagene efter behandlingen vil Hydra helt tabe deres tentakler. Undgå at have Hydra i kontakt med hinanden, da de kan smelte sammen og resultere i mærkeligt formede Hydra ( Figur 2 A ).
- For at forhindre kontakt skal du undgå at skifte skålen i en cirkelbevægelse. I stedet agitere retterne let i lodrette og vandrette retninger, indtil Hydra er spredt fra hinanden. Undersøg fadet ved at placere Hydra i 18 ° C inkubatoren og juster efter behov.
Bemærk: For de dage, hvor mediet ændres to gange, skift medietEn gang om morgenen og igen om eftermiddagen / aftenen.
- For at forhindre kontakt skal du undgå at skifte skålen i en cirkelbevægelse. I stedet agitere retterne let i lodrette og vandrette retninger, indtil Hydra er spredt fra hinanden. Undersøg fadet ved at placere Hydra i 18 ° C inkubatoren og juster efter behov.
- Når tentaklerne begynder at danne, begynder kraftfodring og burping Hydra 3 til 4 gange om ugen (se afsnit 2 og 3). Om 8-9 dage efter colchicin behandling, vil Hydra begynde at vokse deres tentacles tilbage.
Bemærk: Tentacle genvækst varierer mellem enkeltpersoner. Nogle kan tage længere tid end 8 - 9 dage, før de viser tegn på tentakel vækst. De, der ikke regrow deres tentakler såvel som mærkeligt formede ( figur 2 B ) dyr eller dyr, der er for små til at blive fodret, skal fjernes. Disse Hydra vil sandsynligvis ikke overleve den anden behandling. Hydra kan også bud. Dog kan nogle af knopperne stadig have interstitiale celler og være i stand til at spise alene.- Fjern eventuelle knopper, der kan spise uden hjælp og løsne fra forældredyret. Identificer disse dyr ved at tilføje levende Artemia tilFodre parabol og observere om dyrene fanger og spiser artemia alene eller ej. 1 eller 2 Hydra kan også være i stand til at spise alene. Disse bør også kasseres.
Bemærk: Nervefri Hydra har en karakteristisk ballonlignende morfologi og tentakler, der er kortere og tyndere end normalt (på grund af tab af nematocytter) og kan således let skelnes fra normalt udseende dyr ( figur 1 A, 1 B ).
- Fjern eventuelle knopper, der kan spise uden hjælp og løsne fra forældredyret. Identificer disse dyr ved at tilføje levende Artemia tilFodre parabol og observere om dyrene fanger og spiser artemia alene eller ej. 1 eller 2 Hydra kan også være i stand til at spise alene. Disse bør også kasseres.
- Tre uger efter den første colchicinbehandling gentages kolchicinbehandlingen (trin 1.1 - 1.5). En anden colchicinbehandling er nødvendig for at eliminere de resterende interstitiale celler og nerveceller 3 .
2. Force-Feeding
- Tilsæt Artemia cyster til en smal og høj glasbeholder, der binder i bunden. Fyld beholderen med Artemia vand (6,72 M NaCl). Undgå at overskrideUdgivelse 1 g cyster pr. 1 liter vand til et højere lugeudbytte.
- Dæk toppen af beholderen med parafilm og indsæt en 10 ml serologisk pipette gennem parafilmen i beholderen. Sørg for beluftning ved at fastgøre slangen til en akvarieluftpumpe og montere slangen rundt om pipetten. Sørg for, at pipettespidsen når bunden af beholderen, og at der ikke sættes ned cyster i bunden. Artemia kommer til at luge efter 48 timer.
Bemærk: Der er mange forskellige måder at lukke Artemia på, der kan fungere lige så godt.
- Dæk toppen af beholderen med parafilm og indsæt en 10 ml serologisk pipette gennem parafilmen i beholderen. Sørg for beluftning ved at fastgøre slangen til en akvarieluftpumpe og montere slangen rundt om pipetten. Sørg for, at pipettespidsen når bunden af beholderen, og at der ikke sættes ned cyster i bunden. Artemia kommer til at luge efter 48 timer.
- Træk Artemia fra Artemia- vandet i et Artemia- netværk (fås hos akvarieforsyningsvirksomheder) og vask dem i ca. 20 s i DI-vand, før de placeres i en skål med Hydra- medium. Salmien af Artemia- vand er for høj til Hydra , så Artemia skal vaskes, før de anvendes.
- Under et dissekeringsmikroskop,Euthanize Artemia ved let at klemme dem med et par fine tang. Undgå at klemme hårdt nok til at udvise tarmene, da dette vil holde fast i tangen og gøre fodring vanskelig. Lette at klemme Artemia, før du fodrer det til Hydra, vil hjælpe med fordøjelsesprocessen 14 . Placer den nyligt dræbte Artemia tæt på Hydra i skålen for at lette hurtig fodring.
Bemærk: Alle efterfølgende trin udføres under et dissekeringsmikroskop. - Brug et par tænger til at holde Hydra ved hjælp af peduncle. Fortsæt med at holde peduncle under processen med at fodre Hydra . Brug et andet par tænger til at klemme på kropsøjlen for at gøre Hydra kontrakten.
- Mens du holder tingene i det andet par tang sammen, skal du trykke i midten af hypostomen (den kuplede struktur ved den dybe ende af dyret). Dette forårsager undertiden munden at åbne. jegF munden åbnes ikke ved at banke på, punktere munden ved at sætte tangene ind i midten af hypostomet og derefter let udløse trykket på spidsen af tangene. Dette skal strække ud i mundåbningen, der er lavet af punkteringen.
Bemærk: Hydra kan deflate og falde sammen, når munden åbnes ( Figur 2 C ). Hvis dette sker, kan Artemia stadig blive indsat i Hydra . Hvis det er for svært at gøre det, skal du fortsætte til næste Hydra og vende tilbage til den oprindelige Hydra et stykke tid senere, og prøv igen. Hydra har tendens til ikke at deflate så meget under efterfølgende mundåbninger. - Hent hurtigt Artemia med tang og indsæt dem i Hydras gastrisk hulrum. Indsæt så mange Artemia som muligt, indtil mavens hulrum er fyldt og mere Artemia kan ikke indsættes uden at skade Hydra , ulykkenAllieret trækker enhver artemia inde, eller forhindrer munden i at lukke. I gennemsnit er dette 5 - 6 Artemia , men op til 12 er blevet fodret til de større dyr.
- Hvis munden begynder at lukke, stræk igen med tangen som beskrevet ovenfor; Dog skal forsigtighed tages som enhver artemia allerede inde i dyret kan begynde at komme ud, når munden genåbnes.
- Hvis Hydra er for lille til en hel Artemia , skal du klippe Artemia ved hjælp af en skalpell og føje Hydra mindre stykker. Hvis Artemia ikke bliver inde i Hydra , kan det være nødvendigt at trykke på tangene mod Artemia for at holde det inde i Hydra, indtil munden lukker.
- Overfør fodret Hydra med et glas Pasteur pipette forsigtigt for at undgå utilsigtet burping til en skål med frisk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium. Hvis en Artemia blev udvist fRom Hydra mens du overfører, sæt det igen i den nye skål.
Bemærk: En glaspipette bruges til at overføre Hydra , da det er blevet fundet, at Hydra holder mindre til glas end plast. Længden af pipetten spiller ingen rolle, men det kan være lidt lettere at bruge 5 tommer pipetter.
3. Burping
- Burp Hydra for at fjerne ufordøjet materiale helst mellem 8 og 20 timer efter fodring.
- Sand ned i punktet af en 30G nål med P320 eller lignende slibepapir, indtil spidsen er flad.
Bemærk: En 27G hypodermisk nål ville også fungere, men den mindre tip af den højere måle er at foretrække. - Fastgør nålen til en 1 ml plastiksprøjte og fyld sprøjten med frisk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium.
Bemærk: Burping en enkelt Hydra tager ca. 0,05 ml til 0,1 ml opløsning. En 1 ml syriNge er at foretrække, da styring af kraften og volumenet af opløsningen, der kommer ud, er vanskeligere med en større volumen sprøjte. - Under et dissekeringsmikroskop skal du holde Pedracle of Hydra med fine punkt tang og trykke i midten af hypostomet med nålen. Hvis munden ikke åbner, sættes tænger ind i hypostom og åbner munden som beskrevet ovenfor til fodring.
Bemærk: Alle efterfølgende trin udføres under et dissekeringsmikroskop. - Brug sprøjten til at skylle, meget forsigtigt for at undgå at sprænge hele dyret, maveskavheden med 50 μg / ml rifampicinopløsningen, indtil alt snavs er blevet udvist. Nålen skal ikke nødvendigvis indsættes i Hydra, hvis Hydra- størrelsen ikke tillader det. Nålen kan holdes tæt på mundsåbningen og spids direkte mod munden.
- Brug en glas Pasteur pipette, overfør burped Hydra til en skål med frisk 5081; g / ml rifampicin i Hydra- medium.
4. Kvalitetskontrol via immunhistokemi
BEMÆRK: Følgende protokol er tilpasset fra protokoller af Shenk, M. A, et al. 18 , og Böttger, A 19 . Alle trin udføres ved stuetemperatur (RT) med mindre andet er angivet. En nutator kan bruges til inkubationstrinnene og kan forbedre farvningskvaliteten. Men hvis Hydraen bliver sammenflettet med hinanden, kan alle trin også udføres uden.
- Forbered blokeringsopløsningen: 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% DMSO i 1x phosphatpufret saltvand (PBS). Opbevar denne opløsning ved 4 ° C indtil brug (trin 4.6 og 4.11). Opløsningen kan opbevares i 1 - 2 dage.
Bemærk: Alle løsninger, der anvendes i denne protokol, skal samles korrekt som farligt affald. - Slap af Hydra i 200 μL 2% urethan i Hydra mEdium i 1 minut i 1,7 ml mikrocentrifugerør. Brug 5 Hydra pr. Rør for hver af de 4 betingelser: nervefri, ubehandlet, ubehandlet uden primært antistof og ubehandlet uden sekundært antistof.
Bemærk: Må ikke overstige 1 min. Tidspunktet her er kritisk, da dyr vil være i dårlig form efter at have brugt for meget tid i urethan. - Fjern urethan og sæt Hydra i 200 μl 4% paraformaldehyd (PFA) i Hydra- medium i 15 minutter.
- Vask prøverne 3 gange med 1x PBS i 10 minutter hver.
Bemærk: Alle vasker med PBS og PBSTx udføres med 500 μl opløsning. - Permeabiliseres med 500 μl 0,5% Triton X-100 i PBS i 15 minutter.
- Fjern 0,5% Triton X-100 og tilsæt 500 μL af blokeringsopløsningen. Bloker prøverne i mindst 1 time.
- Fortynd anti-tyrosin-tubulin-antistoffet 1: 200 i blokeringsopløsning.
Bemærk: Denne koncentration var deAfsluttet eksperimentelt. Hvis signalet i kontrollerne viser sig at være for svagt, kan koncentrationen muligvis øges. Hvis der er uspecifik binding, skal koncentrationen muligvis sænkes. Forinkubation af antistoffet kan også bidrage til at reducere ikke-specifik binding. - Fjern blokeringsopløsningen fra prøverne og tilsæt 200 μL af det primære antistof til de nervefrie Hydra , ubehandlede kontroller og ubehandlede kontroller uden sekundær. For de ubehandlede kontroller uden primærstof tilsættes kun 200 μL blokeringsopløsning uden antistoffet.
- Inkuber prøverne natten over (> 12 timer) ved 4 ° C.
Bemærk: Alternativt inkuberes 5-6 timer ved stuetemperatur. - Fjern det primære antistof og vaske prøverne i vid udstrækning med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS (PBSTx).
Bemærk: Gem det primære antistof og opbevar ved 4 ° C, da det kan genbruges mindst 2 - 3 gange. - Fortynd geit-anti-mus hP sekundær antibOdy 1: 500 i blokerende opløsning. Tilsæt 200 μL til de nervefrie Hydra , ubehandlede kontroller og ubehandlede kontroller uden primær. For de ubehandlede kontroller uden sekundær, tilsæt kun 200 μL blokeringsopløsning uden antistoffet.
Bemærk: Alternativt kan et fluorescerende sekundært antistof anvendes, for hvilke trin 4.13 - 4.17 ikke er nødvendige. Brug af en fluorescerende sekundær sparer tid og er generelt tilstrækkelig, men hP sekundæret giver øget følsomhed. Koncentrationen af sekundær blev bestemt eksperimentelt. Hvis signalerne i kontrollerne viser sig at være for svage, kan koncentrationen muligvis øges. Hvis der er uspecifik binding, skal koncentrationen muligvis sænkes. - Inkuber prøverne natten over ved 4 ° C.
- Fjern det sekundære antistof og vask prøverne i vid udstrækning med PBSTx.
- Forbered 1x PBT: 0,2% bovint serumalbumin (vægt / volumen) og 0,05% Tween20 i 1x PBS. Inkubér sAmpler i 1x PBT i 30 minutter.
- Fjern 1x PBT og inkuber prøverne i 1: 1000 NHS-fluorescein og 1: 10.000 H202 i 1x PBT i 15 minutter i mørke. Fra dette trin skal du holde prøverne i mørket så meget som muligt, da det fluorescerende signal vil falde, da de udsættes for lys.
Bemærk: NHS-fluorescein blev fremstillet efter en detaljeret FISH-protokol af King, RS og Newmark, PA 20 - Vask prøverne 3 gange med PBSTx hurtigt, derefter 2 gange i 30 min.
- Lad prøverne i PBSTx natten over ved 4 ° C for at fortsætte vask.
- Gør et par ekstra vasker med 1x PBSTx. For at visualisere cellekerner udføres følgende valgfrie trin til DNA-modstrygning ved anvendelse af 4 ', 6-diamindino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI). Ellers kan prøverne nu afbildes.
- Fortynd 5 mg / ml DAPI-stamme til en arbejdskoncentration på 1: 500 i PBSTx og tilsæt 200 μL til hvert rør. INCUBate prøverne i 30 min.
Forsigtig: DAPI er et kendt kræftfremkaldende middel. Bær fuld PPE. - Fjern DAPI og vask prøverne 2 - 3 gange med PBSTx før billeddannelse med fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Umiddelbart efter den første 8 timers colchicinbehandling overlever alle Hydra . Nogle af disse Hydra vil kun have tentacle stubs tilbage ( Figur 3 A ), mens andre vil have helt tabt deres tentakler ( Figur 3 B ). I løbet af de følgende 1 eller 2 dage vil tentaklerne fortsætte med at krympe, indtil alle Hydra har mistet deres tentakler. Ca. 1 uge efter behandlingen viser Hydra tegn på tentakelgenvækst, med små stub som tentacles ( Figur 3 C ), før de fuldstændigt regenererer deres tentakler ( Figur 3 D ). Af den oprindelige Hydra regenererer omkring 50-60% deres tentakler til sidst mellem 1-2 uger efter behandlingen.
Efter sEcond behandling er genopretningen af dyrene ligner den efter den første behandling. Således genvinder ca. 10% af det oprindelige antal dyr, der gik ind i begge behandlinger, og vokser til en størrelse, der er egnet til forsøg ( Figur 1 B ). Disse Hydra har tentakler, der synes tyndere end de ubehandlede dyr, har et væv, som er mere gennemsigtigt og vil blive opustet på grund af manglende evne til at åbne deres mund for at lette osmotisk tryk ( figur 1 A , 1 B). Eventuelle dyr, der ikke er fodret, kan overleve i et par uger, men ufedlede dyr vil krympe i størrelse og blive stadig vanskeligere at fodre.
Hydra , der genvinder efter den anden behandling, kan opretholdes på ubestemt tid. Disse dyr er i stand til at knoppe og dermed opretholde og vokse befolkningen. Derudover kan befolkningen dyrkesVed at skære disse dyr og lade dem regenerere 4 .
Immunohistokemi bekræfter tabet af neuroner i hypostomen efter anden kolchicinbehandling. Det tætte nervenet i hypostomet kan visualiseres ved anvendelse af et anti-tyrosin-tubulin-antistof 13 , 16 og viser forskellige fibre, der udstråler udad fra munden og oplagte cellekroppe ( figur 4A ). Disse fibre er fraværende i nervefri Hydra, der er fremstillet ved dobbeltbehandling med colchicin ( Figur 4 B ). Endvidere afslører co-farvning med DAPI et reduceret antal cellekerner i den nervefrie Hydra sammenlignet med de ubehandlede kontroller på grund af tabet af celler i den interstitielle cellelinie som følge af colchicinbehandlingerne ( Figur4A, 4B ).
Figur 1 . Sammenligning af nervfri og ubehandlet hydra .
(A) Ubehandlet Hydra . (B) Nervefri Hydra 22 dage efter den anden colchicinbehandling. Bemærk den hævede kropsøjle og de tynde tentakler i det nervefrie dyr. Skalestænger er 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2 . Eksempler på deformeret hydra .
(A) To Hydra (B) En mærkeligt formet Hydra . (C) En Hydra, der har deflateret efter at have åbnet munden. Skalestænger er 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3 . Repræsentative billeder af Hydra Efter den første 8 timers kolchicinbehandling.
(A) A Hydra med stubby tentacles umiddelbart efter behandling. (B) En Hydra, der helt har mistet sine tentakler umiddelbart efter behandling. (C) En Hydra , der begynder at genvinde sine tentakler 8 dage efter behandlingen. (D)En Hydra, der har fuldstændig omdannet sine tentakler 13 dage efter behandlingen. Skalestænger er 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4 . Tab af nerveceller i hypostosen kan bekræftes af immunhistokemi.
(A) Hypostomet for et ubehandlet hydra og (B) hypostom af en nervefri Hydra ca. 2 uger efter den anden colchicinbehandling, mærket med (i) anti-tyrosin-tubulin antistof og (ii) DAPI. (Iii) viser overlejringen. Den * angiver placeringen af munden. Maksimale z fremskrivninger blev lavet af spin confocal fluorescence z stacks taget med eXposures på 500 ms (GFP) og 15 ms (DAPI). Lysstyrke og kontrast blev justeret for at forbedre synligheden. Skalestænger er 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra interstitielle celler kan elimineres gennem en dobbelt colchicinbehandling 3 , 4 . I dagene efter den første behandling er det afgørende at forhindre kontakt mellem individuelle Hydra for at undgå fusion af Hydra stykker i deformeret Hydra . Dyr, der kan spise uassisteret efter den første behandling, må også fjernes, da den anden colchicinbehandling ikke er tilstrækkelig til at fjerne de resterende interstitiale celler fra sådanne dyr. For at maksimere overlevelsesgraden for nervefri Hydra efter den anden colchicinbehandling, skal dyrene fodres så mange Artemia som muligt efter genopretning fra den første behandling, med 1-2 dage mellem fødninger for at komme sig og vokse. Hver kolchicinbehandling medfører, at Hydra reduceres signifikant i størrelse, da cellerne egestes, så jo større Hydra er forud for hver behandling, bEfter chancerne for, at Hydra vil komme sig til en størrelse, der kan fodres og vedligeholdes.
På grund af den lave overlevelse af Hydra efter hver behandling kan det være ønskeligt at starte med mange Hydra . Imidlertid skal man være forsigtig med at starte behandlingen på for mange Hydra på en gang. Dette vil gøre fodring efter den første behandling vanskelig og ekstremt tidskrævende. Dyr fodret godt efter den første behandling gendannes til større størrelser og har derfor en højere overlevelsesrate efter den anden behandling. Således kan det være mere produktivt at starte med færre og fokusere på fodring bedre. Generelt er start med 50-100 dyr håndterbare for 1-2 personer. Det er også bedst at begynde med den største Hydra- mulige, da disse bedre vil overleve de to behandlinger.
Metoden til kraftfodring og burping Hydra , der mangler nerveceller beskrevet her, er sikrere, enklere og mere tid-effektive end metoder beskrevet i fortiden 3 , 4 , 14 . Anvendelsen af kommercielt tilgængelige tænger og sprøjter eliminerer behovet for hånddrevne mikropipette tips, hvilket er tidskrævende og vanskeligt at gøre. Brugen af disse værktøjer undgår også behovet for mundpipette. Kraftfodring ved hjælp af pincet kan være svært ved starten, men i betragtning af tilstrækkelig tid og praksis bliver det ret nemt og effektivt. Man bør først udøve kraftfodring og burping normal Hydra for at få en fornemmelse af, hvor meget kraft at bruge med værktøjerne og hvordan man skal manipulere Hydra . Forskellige tang og nålestørrelser blev testet for at finde de optimale værktøjer til kraftfodring og burping.
Anvendelsen af antistoffarvning som beskrevet her er kun tilstrækkelig til at kontrollere for fraværet af nerveceller i hypostomet. For at sikre at alle interstitiale celler er blevet elimineret, kan dyrene macereres ogDe eksisterende celler kan undersøges 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Dick Campbell (UC Irvine) for drøftelser om den oprindelige protokol til generering og vedligeholdelse af nervefrie dyr, fru Rui Wang for hjælp med tilpasning af sprøjten og nålteknikken og fru Danielle Hagstrom og Dr. Rob Steele (UC Irvine) for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af RCSA og NSF-tilskuddet CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
