Summary
באמצעות טיפול כפול עם קולצ'יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח הורג תאים מחולקים, הידרה ללא עצה הידראולית יכול להיות שנוצר. הידרה אלה לא יכולים להאכיל או egest בעצמם. מאמר זה מתאר שיטה משופרת עבור תחזוקה לטווח ארוך של העצב חינם הידרה vulgaris במעבדה.
Abstract
השושלת התא interstitial של הידרה כולל תאי גזע multipotent, ונגזרותיהם: תאי בלוטת, נמטוציטים, תאי נבט, ותאי עצב. תאים interstitial ניתן לבטל דרך שני טיפולים רצופים עם קולצ'יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח כי הורג תאים מחולקים, ובכך מוחק את הפוטנציאל לחידוש של תאים מובחנים נגזרות תאי גזע interstitial. זה מאפשר את הדור של הידרה כי חוסר תאי עצב. פוליפ נטול עצבים אינו יכול לפתוח את פיו כדי להאכיל, לגדול, או להסדיר לחץ אוסמוטי. בעלי חיים כאלה, לעומת זאת, יכולים לשרוד ולהיות מתורבת ללא הגבלת זמן במעבדה אם באופן קבוע להאכיל בכוח ו גיהוק. היעדר תאי עצב מאפשר מחקרים על תפקידה של מערכת העצבים בוויסות התנהגות בעלי חיים והתחדשות. שפורסמו בעבר פרוטוקולים עבור תחזוקה ללא הידרה הידרה כרוך טכניקות מיושנות כגון פיפטינג פה עם יד משך micropipetteIps כדי להאכיל ולנקות את ההידרה . הנה, פרוטוקול משופר לתחזוקה של הידרה ללא עצב הוא הציג. מלקחיים עדינים משמשים לכפות לפתוח את הפה ולהכניס טריים Artemia נהרג. לאחר האכלה בכוח, חלל הגוף של החיה הוא סומק בינוני בינוני באמצעות מזרק ומחט מזרק כדי להסיר חומר מעוכל, המכונה כאן "גיהוק". שיטה חדשה זו של האכלה בכוח ו גיהוק ללא הידרה ללא שימוש במלקחיים ומזרקים מבטלת את הצורך בפה פיפטינג באמצעות משיכת יד micropipette עצות. זה ובכך הופך את התהליך בטוח יותר באופן משמעותי יותר זמן. כדי להבטיח כי תאי עצב hypostome בוטלו, אימונוהיסטוכימיה באמצעות אנטי tyrosine- טובולין מתנהל.
Introduction
מערכת העצבים של הידרה מורכבת של רשת עצבים, עם נוירונים הקשורים בשתי שכבות רקמה אפיתל 1 . רשת העצבים צפופה יותר בהיפוסטומה ובמחזור הדם ופחות צפופה בעמודה השנייה של הגוף. תאי העצבים מקורם בתאי גזע אינטרסטיציאליים, שהם תאי גזע רב-תכליתיים המביאים לתאים מפרידים, נמטוציטים, תאי נבט, ונוירונים. ניתן לחסל את התאים interstitial של הידרה vulgaris באמצעות טיפול עם colchicine 3 , 4 , נגזרות צמח נגזר כי הורג תאים מחולקים. למרות colchicine נמצא לעכב פילמור microtubule באורגניזמים אחרים, מחקר קודם הוכיח כי microtubules נוכחים בהידרה לאורך כל הטיפול, מה שמרמז כי קולכיצין לא מתנהג כך הידרה 3 . רחוב נוסףAudy מציע כי colchicine אינו נקשר ביעילות toulinin בכמה אורגניזמים, כולל Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas, ו Schizosaccharomyces pombe, אשר עשוי להסביר את ההבדל 5 . הטיפול קולצ'יצין גורם phagocytosis של תאים interstitial על ידי תאים אפיתלתיים endodermal 3 ובכך מאפשר את היצירה של בעלי חיים שחסרים תאים עצביים, תאי בלוטת, ו nematocytes. לא ברור מדוע התאים interstitial רגישים במיוחד לטיפול קולכיצין. בהתחשב בכך שתאי ביניים של פוסט-מיטוטי ותאי גזע של תאי גזע פגומים ופגוסיטוסים, קמפבל סיכם כי קולצ'יצין לא משפיע ישירות על פעילות מיטוטית. יש לציין כי הטיפול בקולכיצין פועל היטב בהידרה וולגריס, אך הוכח כי אינו פועל גם במינים אחרים, כגון הידרה אוליגקטוס 6 . הידרה viridis 7 . ללא עצב הידרה (המכונה גם לעתים קרובות " הידרה אפיתל" 8 ) ולכן הם כלי שימושי ללמוד את התפקידים של סוגי תאים מיוחדים אלה מן השושלת תא interstitial בהומיאוסטזיס רקמות התחדשות.
הידרה עשויה להיות הדוגמה המוכרת היחידה של בעל חיים המסוגל לחיות ללא מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה משמשים מודל שימושי במיוחד עבור לנתח את התפקיד של רשת העצבים בוויסות התחדשות הידרה , הומאוסטזיס, והתנהגות. לדוגמה, המבוא של תאים interstitial לתוך הידרה ללא עצב באמצעות השתלת מותר אפיון של התמיינות תאים עצביים כמו אזור ספציפי במיוחד 9 . יתר על כן, כי הידרה ללא עצב יכול להתחדש, הםלאפשר את החקירה של אלטרנטיבי, העצבים מערכת עצמאית התחדשות מסלולים. דוגמה אחת כזו היא neurogenesis apical ו היווצרות הראש, אשר הוכח להיות תלוי פונקציה cnox-2 במערכת העצבים wildtype הידרה , אבל נראה להיות ניתנת להסרה ב הידרה ללא עצבים, דבר המצביע על כך עשוי להיות חלופי ראש התחדשות התהליך 10 .
העצבים ללא הידרה שימשו גם כדי ללמוד ביטוי תא אפיתל תקנה של גנים neurogenic ו neurotransmission לאחר אובדן neurogenesis 11 . עצבים ללא הידרה אינם מציגים התפרצויות ספונטניות בהתכווצות 12 , מה שמראה כי התפרצויות אלה מוסדרים על ידי מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה לעשות, עם זאת, חוזה בתגובה צביטה של עמודה הגוף עם מלקחיים, מה שמרמז כי התכווצות בתגובה לגירויים מכניים מתווכת על ידי צימוד throuצומת פערים בתאים אפיתל, בעוד התנהגות התכווצות ספונטנית מתווכת על ידי צימוד דרך צמתים הפער בתאי עצב 13 .
העצבים ללא הידרה לא לפתוח את הפה כאשר הציג עם מזון או מופחת גלוטתיון 3 , דבר המצביע על כך נוירונים חושית נחוצים כדי לזהות את הנוכחות של מזון לאות את הפה לפתוח. בנוסף, נראה כי רשת העצבים ממלאת תפקיד בחישה של לחץ אוסמוטי, מכיוון שחיות ללא עצב אינן מסוגלות לסדר באופן אוטומטי את הלחץ ההידרוסטטי הפנימי שלהן באמצעות פתיחת הפה, דבר הגורם להופעתן של בלון אופייני 3 , 4 ( איור 1 ב ' ). תקנה של לחץ הידרוסטטי ב הידרה ללא עצב על ידי דפלציה ידנית תכופים הובילה לאובדן של מורפולוגיה חריגה בעמודה hypostome ואת הגוף. עם זאת, דפלציה כרונית הובילה להפרעה לצמיחה, אלOngation, נבגי, ואת רקמת הארגון 8 .
למרות הידרה ללא עצבים אינם מסוגלים להאכיל ו egest על שלהם, אפשר לשמור אותם ללא הגבלה במעבדה על ידי ידני האכלה בכוח ו גיהוק כל בעל חיים. פרסומים קודמים תיארו שיטות של האכלה בכוח ו גיהוק הידרה ללא עצבים, אולם פרוטוקולים אלה מעורבים השימוש עצות micropipette כי חייב להיות מושך יד בזהירות לגודל המתאים, כמו גם שימוש של שפופרת מחובר פיפטה ידי צינורות 14 . הנה, שיטה פשוטה יותר, בטוחה יותר, זמן יעיל יותר של האכלה ו גיהוק מתואר.
בנוסף, מחקרים קודמים היו כרוכים בבדיקת היעדר תאי עצב באמצעות ניתוק של בעלי חיים קבועים לתאים בודדים ובדיקת מורפולוגיה של התא 3 , 4 , 15 . חאז, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן חד שבטי נגד carboxyl- tyrosinated מסוף של אלפא טובולין שימש כשיטה חינם כדי macation כדי לבדוק את דלדול של נוירונים ב hypostome 13 , 16 . מחקרים קודמים הראו כי נוירונים ב peduncle יכול גם להיות דמיינו באמצעות נוגדן זה 13 , אולם אלה נוירונים כמו גם אלה בעמודה הגוף קשה יותר לעשות. בעוד אימונוהיסטוכימיה מספיקה כדי לאשר את היעדר תאי עצב ב hypostome ואינו דורש מומחיות על סוג מורפולוגיה התא, זה לא יכול לשמש כדי לבדוק את היעדר תאי גזע interstitial ואת נגזרות אחרות של תאים אלה. דיסוציאציה ומחקרים מורפולוגיה תא הם קפדניים יותר והוא יכול לתת חשבון כמותי של המספרים של כל סוג התא שנותרו לאחר כל שלב של הטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיפול קולכיצין כפול
- הפוך 0.4% colchicine (משקל / נפח) פתרון המדיום הידרה 3 , 4 , 17 .
זהירות: קולציצין הוא רעיל מאוד, קטלני אם בלע, עלול לגרום ליקויים גנטיים, ועלול לגרום נזק לעיניים. ידית את האבקה במכסה המנוע וללבוש ציוד מגן אישי מלא (PPE). - דגירה הידרה vulgaris (זן AEP שימש כאן), כי כבר רעב במשך 24 שעות ב colchicine 0.4% ביחס של 5 הידרה לכל מ"ל של תמיסת קולצ'יצין בצלחת פטרי 8 שעות בטמפרטורת החדר בחושך.
הערה: 5 Hydra / מ"ל colchicine הוא קו מנחה לקביעת כמה פתרון להשתמש כדי למנוע הצפיפות של המנה עם הידרה . השתמש באותו נפח של פתרון עבור ניקיון הבאים ושינויים פתרון. - הסר את הפתרון colchicine ולהחליףעם מדיום הידרה נקי ללא קולצ'יצין. שטפו את ההידרה 5 פעמים על ידי העברת טורי עם כוס פיפטה פסטר לתוך המדיום הידרה נקי לפני העברת ל 50 מיקרוגרם / מ"ל rifampicin במדיום הידרה . שמור את ההידרה ב 18 ° C חממה.
הערה: כמות מספקת של 1,000x ריפמפיצין במלאי (50 מ"ג / מ"ל) ב- dimethyl sulfoxide (DMSO) למשך 1-2 שבועות של טיפול יכולה להיות מאוחסנת ב- 4 ° C. את הסכום המדויק ניתן לקבוע על ידי נפח הכולל של פתרון בשימוש בכל יום. לדוגמה, אם יש 2 מנות, כל המכיל 10 מ"ל של פתרון זה צריך להיות שונה פעמיים ביום, סך של 40 מ"ל של פתרון ישמש ביום אחד, המקביל ל 40 μL של 1,000X מניות ליום או 560 μL על פני שבועיים. המלאי הוא מדולל אז 1: 1000 במדיום הידרה בשימוש.
זהירות: DMSO הוא נוזל דליק בקלות חודר העור, ומאפשר כימיקלים אחרים מומס לתוך הגוף. ידלהמס את מכסה המנוע ברדס קטרני ללבוש PPE מלא. שים לב, DMSO קופא על 4 מעלות צלזיוס - לשנות את מדיום הידראפי המכיל rifampicin פעמיים ביום עד הפסקת הידרה לגרש תאים לתוך המדיום, וזה בדרך כלל על ידי 1 בשבוע לאחר הטיפול. בשלב זה, המדיום יכול להשתנות פעם ביום. במהלך הימים שלאחר הטיפול, ההידרה תאבד לחלוטין את זרועותיהם. הימנע שיש הידרה במגע אחד עם השני, כפי שהם עשויים למזג יחד ולגרום בצורת הידרה מוזר ( איור 2 א ).
- כדי למנוע מגע, הימנע מערבולת את המנה בתנועה מעגלית. במקום זאת, בעדינות להתסיס את המנה אנכית ואופקית כיוונים עד הידרה הם התפשטו. בדוק את הצלחת על הצבת ההידרה לתוך החממה 18 ° C ולהתאים לפי הצורך.
הערה: עבור הימים שבהם המדיום משתנה פעמיים, שנה את המדיוםפעם בבוקר ושוב בשעות אחר הצהריים / הערב.
- כדי למנוע מגע, הימנע מערבולת את המנה בתנועה מעגלית. במקום זאת, בעדינות להתסיס את המנה אנכית ואופקית כיוונים עד הידרה הם התפשטו. בדוק את הצלחת על הצבת ההידרה לתוך החממה 18 ° C ולהתאים לפי הצורך.
- לאחר זרועות להתחיל להרכיב, להתחיל כוח האכלה ו גיהוק ההידרה 3 עד 4 פעמים בשבוע (ראה סעיפים 2 ו -3). בערך 8-9 ימים לאחר טיפול קולכיצין, ההידרה יתחילו לגדל את זרועותיהם בחזרה.
הערה: לצמיחה מחודשת של זרוע משתנה בין פרטים. חלקם עשויים להימשך יותר מ 8 - 9 ימים לפני מראה סימנים של צמיחה זרוע. אלה שאינם regrow זרועותיהם, כמו גם בצורת מוזר ( איור 2 ב ) בעלי חיים או בעלי חיים קטנים מדי כדי להיות מוזן יש להסיר. הידרה זו לא תשרוד את הטיפול השני. הידרה עשוי גם הניצן. עם זאת, כמה ניצנים עשויים עדיין יש תאים interstitial ולהיות מסוגלים לאכול בכוחות עצמם.- הסר כל ניצנים שיכולים לאכול ללא סיוע לנתק מן החיה האב. זיהוי חיות אלה על ידי הוספת Artemia לחיותצלחת להאכיל ותצפית אם החיות לתפוס ולאכול את הארטמיה בכוחות עצמם. 1 או 2 הידרה עשוי גם להיות מסוגל לאכול בעצמם. אלה גם צריך להיות מושלך.
הערה: הידרה ללא עצב יש מורפולוגיה כמו בלון אופייני, זרועות כי הם קצרים דקים מהרגיל (עקב אובדן של nematocytes) ולכן ניתן להבחין בקלות מן בעלי חיים רגילים ( איור 1 א, 1 ב ).
- הסר כל ניצנים שיכולים לאכול ללא סיוע לנתק מן החיה האב. זיהוי חיות אלה על ידי הוספת Artemia לחיותצלחת להאכיל ותצפית אם החיות לתפוס ולאכול את הארטמיה בכוחות עצמם. 1 או 2 הידרה עשוי גם להיות מסוגל לאכול בעצמם. אלה גם צריך להיות מושלך.
- שלושה שבועות לאחר הטיפול הראשון קולצ'יצין, לחזור על טיפול קולכיצין (צעדים 1.1-1.5). טיפול קולצ'יצין שני יש צורך לחסל את התאים interstitial הנותרים ותאי עצב 3 .
2. האכלה בכוח
- מוסיפים ציסטות ארטמיה למכל זכוכית צרה וגבוהה שמתחכך בתחתית. ממלאים את מיכל עם מים Artemia (6.72 M NaCl). הימנע exceEding 1 גרם של ציסטות לכל 1 L של מים עבור תשואה גבוהה יותר.
- מכסים את החלק העליון של מיכל עם parafilm ולהכניס 10 מ"ל פיפטה סרולוגית דרך parafilm לתוך המיכל. לספק אוורור על ידי צירוף צינורות למשאבת אוויר אקווריום ו מתאים צינורות מסביב פיפטה. ודא כי קצה פיפטה מגיע לתחתית המיכל וכי ציסטות לא התיישבו בתחתית. הארטמיה תבקע אחרי 48 שעות.
הערה: ישנן דרכים רבות ושונות לבקוע Artemia שעשויים לעבוד גם כן.
- מכסים את החלק העליון של מיכל עם parafilm ולהכניס 10 מ"ל פיפטה סרולוגית דרך parafilm לתוך המיכל. לספק אוורור על ידי צירוף צינורות למשאבת אוויר אקווריום ו מתאים צינורות מסביב פיפטה. ודא כי קצה פיפטה מגיע לתחתית המיכל וכי ציסטות לא התיישבו בתחתית. הארטמיה תבקע אחרי 48 שעות.
- מסננים את ארטמיה ממי הארטמיה ברשת ארטמיה (זמין מחברות אספקת האקווריום) ומרחצים אותם בכ -20 שניות במים די לפני הנחתם בצלחת עם מדיום הידרה . המליחות של מים ארטמיה גבוהה מדי עבור הידרה , כך הארטמיה חייב להיות שטף לפני שהם משמשים.
- תחת מיקרוסקופ לנתח,להרדים את הארטמיה על ידי לחיצה קלה עליהם עם זוג מלקחיים נאים. הימנע לסחוט מספיק חזק כדי לגרש את האומץ, כמו זה יהיה מקל על מלקחיים ולהפוך את האכלה קשה. קל לסחוט את הארטמיה לפני האכלה אותו הידרה יעזור עם תהליך העיכול 14 . מניחים את Artemia טריים קרוב להידרה בצלחת כדי להקל על האכלה מהירה.
הערה: כל השלבים הבאים נעשים תחת מיקרוסקופ לנתח. - השתמש זוג אחד של מלקחיים להחזיק את ההידרה על ידי peduncle. המשך להחזיק את peduncle במהלך תהליך האכלה ההידרה . באמצעות זוג השני של מלקחיים, צביטה עמודה הגוף על מנת להפוך את חוזה הידרה .
- בעוד מחזיקים את הקצה של זוג מלקחיים יחד יחד, הקש במרכז היפהוסטום (מבנה מכוסה בקצה הפה של החיה). זה לפעמים גורם לפה להיפתח. אניF הפה לא נפתח על ידי הקשה, לנקב את הפה על ידי הוספת מלקחיים למרכז hypostome ולאחר מכן מעט לשחרר את הלחץ על קצות המלקחיים. זה צריך למתוח את הפה פותח על ידי נקב.
הערה: הידרה עשויה לנפח ולקרוס כאשר הפה נפתח ( איור 2 ג ). אם זה קורה, ארטמיה עדיין יכול להיות מוכנס לתוך ההידרה . אם זה קשה מדי לעשות זאת, לעבור להידרה הבאה ולחזור ההידרה המקורי כמה זמן מאוחר יותר ונסה שוב. ההידרה נוטה לא לנפח כמות גדולה במהלך פתחי הפה הבאים. - מהר להרים Artemia עם מלקחיים להכניס אותם לתוך חלל קיבה של הידרה . הכנס כמו ארטמיה רבים ככל האפשר עד חלל קיבה מלא ועוד ארטמיה לא יכול להיות מוכנס מבלי לפגוע הידרה , תאונהבעל ברית שולף כל ארטמיה בפנים, או מונע את הפה מלהיסגר. בממוצע, זה 5 - 6 Artemia , אולם עד 12 כבר הוזנו חיות גדולות.
- אם הפה מתחיל להיסגר, למתוח לפתוח שוב עם מלקחיים כמתואר לעיל; עם זאת, יש להיזהר כי כל Artemia כבר בתוך החיה עשוי להתחיל לצאת כאשר הפה נפתח מחדש.
- אם הידרה קטנה מדי עבור ארטמיה שלמה, לחתוך את הארטמיה באמצעות איזמל להאכיל את חתיכות קטנות הידרה . אם הארטמיה לא נשארת בתוך ההידרה , ייתכן שיהיה צורך ללחוץ על מלקחיים נגד הארטמיה כדי לשמור אותו בתוך ההידרה עד הפה נסגר.
- העברת הזנה הידרה עם כוס פיפטה פסטר, בזהירות כדי למנוע גיהוק בשוגג, למאכל עם טרי 50 מיקרוגרם / מ"ל rifampicin במדיום הידרה . אם גורשה ארטמיה וROM את hydra תוך העברת, reinsert אותו בזמן בצלחת החדשה.
הערה: פיפטה זכוכית משמש להעברת ההידרה , כפי שנמצא כי הידרה מקל פחות זכוכית לעומת פלסטיק. אורך פיפטה לא משנה, אבל באמצעות 5 אינץ 'פיפטה עשוי להיות קצת יותר קל.
3. גיהוק
- לסתום את ההידרה כדי להסיר חומר מעוכל בכל עת בין 8 ל 20 שעות לאחר האכלה.
- חול למטה בנקודה של מחט מזרק 30G עם P320 או נייר זכוכית חצץ דומה עד קצה שטוח.
הערה: מחט 27G hypodermic יעבוד גם, אבל קצה קטן יותר של מד גבוה עדיף. - צרף את המחט מזרק חד פעמיות 1 מ"ל פלסטיק ולמלא את המזרק עם 50 מ"ג חדש / מ"ל rifampicin במדיום הידרה .
הערה: גיהוק אחת הידרה לוקח בערך 0.05 מ"ל ל 0.1 מ"ל של פתרון. סורי 1 מ"לNge עדיף מאז השליטה בכוח והנפח של הפתרון יוצא קשה יותר עם מזרק נפח גדול יותר. - תחת מיקרוסקופ לנתח, להחזיק את peduncle של הידרה עם מלקחיים נקודה עדינה ואת ברז במרכז היפוסטומה עם המחט. אם הפה לא נפתח, הכנס מלקחיים לתוך hypostome ופתח את הפה כפי שתואר לעיל עבור האכלה.
הערה: כל השלבים הבאים נעשים תחת מיקרוסקופ לנתח. - השתמש במזרק כדי לשטוף, בעדינות רבה כדי למנוע נושבת משם את החיה כולה, חלל קיבה עם פתרון 50 מיקרוגרם / מ"ל rifampicin עד כל פסולת כבר גורשו. המחט לא בהכרח צריך להיות מוכנס לתוך ההידרה אם גודל ההידרה אינו מאפשר. המחט עשויה להיות קרובה לפתיחת הפה והצביעה ישירות לכיוון הפה.
- באמצעות זכוכית פסטר פיפטה, העברת הידרל גיהוק למנה עם טריים 5081; G / מ"ל rifampicin במדיום הידרה .
4. בקרת איכות באמצעות אימונוהיסטוכימיה
הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מפרוטוקולים על ידי Shenk, M., et al. 18 , ו Böttger, A 19 . כל השלבים נעשים בטמפרטורת החדר (RT), אלא אם צוין אחרת. A nutator ניתן להשתמש בשלבי הדגירה עשוי לשפר את איכות מכתים. עם זאת, אם ההידרה לקבל מסובך אחד עם השני, כל השלבים יכולים גם להתבצע ללא.
- הכן את הפתרון חוסם: 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% DMSO ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חנות פתרון זה ב 4 ° C עד לשימוש (שלבים 4.6 ו -4.11). הפתרון יכול להיות מאוחסן במשך 1-2 ימים.
הערה: כל הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה חייבים להיות נאספים כראוי כמו פסולת מסוכנת. - להירגע הידרה μL 200 של urethane 2% ב הידרה מ 'אדיום דקות 1 ב 1.7 צינורות microcentrifuge מ"ל. השתמש 5 Hydra לכל צינור עבור כל אחד מארבעת התנאים: ללא עצבים, ללא טיפול, ללא טיפול ללא נוגדן ראשוני, ללא טיפול נוגדנים משני.
הערה: אל תעבור דקה אחת. העיתוי כאן הוא קריטי כמו בעלי חיים יהיה במצב רע לאחר ההוצאות יותר מדי זמן ב urethane. - הסר את urethane ולתקן את ההידרה μL 200 של paraformaldehyde 4% (PFA) במדיום הידרה במשך 15 דקות.
- שטפו את הדגימות 3 פעמים עם 1x PBS במשך 10 דקות כל אחד.
הערה: כל שוטף עם PBS ו PBSTx נעשים עם 500 μL של פתרון. - Permeabilize עם 500 μL של 0.5% Triton X-100 ב PBS במשך 15 דקות.
- הסר את 0.5% Triton X-100 ולהוסיף 500 μL של פתרון חסימה. חסום את דגימות לפחות 1 ח.
- לדלל את נוגדנים נגד tyrosine-tubulin 1: 200 ב חסימת פתרון.
הערה: ריכוז זה היה דהשהסתיים בניסויים. אם האות בבקרות נמצא חלש מדי, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הריכוז. אם יש מחייב לא ספציפי, הריכוז עשוי להיות מופחת. טרום הדגירה של הנוגדן עשוי גם לעזור להפחית מחייב ספציפי. - הסר את הפתרון חוסם מן דגימות ולהוסיף 200 μL של הנוגדן העיקרי העצם ללא הידרה , בקרות מטופל, פקדים מטופלים ללא משנית. עבור פקדים מטופלים ללא העיקרי, רק להוסיף 200 μL של פתרון חסימת ללא נוגדן.
- דגירה הדגימות לילה (> 12 שעות) ב 4 ° C.
הערה: לחילופין, דגירה 5 - 6 שעות ב RT. - הסר את הנוגדן העיקרי לשטוף את דגימות בהרחבה עם 0.3% Triton X-100 ב 1x PBS (PBSTx).
הערה: שמור את הנוגדן הראשי ולאחסן ב 4 ° C, כפי שניתן לעשות בה שימוש חוזר לפחות 2 - 3 פעמים. - לדלל עז נגד עכבר hp משני antibOdy 1: 500 פתרון חסימה. הוסף 200 μL אל הידרה ללא עצבים, בקרות מטופל, פקדים מטופלים ללא הראשוני. עבור פקדים מטופלים ללא משנית, רק להוסיף 200 μL של פתרון חסימת ללא נוגדן.
הערה: לחלופין, נוגדנים משני ניאון ניתן להשתמש, שבו צעדים 4.13 - 4.17 אין צורך. שימוש משני ניאון חוסך זמן הוא מספיק בדרך כלל, אבל משנית hP מספק רגישות מוגברת. ריכוז המשני נקבע באופן ניסיוני. אם האותות בבקרות נמצאים חלשים מדי, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את הריכוז. אם יש מחייב לא ספציפי, הריכוז עשוי להיות מופחת. - דגירה הדגימות לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את הנוגדן משני לשטוף את דגימות בהרחבה עם PBSTx.
- הכן 1x PBT: 0.2% אלבומין בסרום שור (משקל / נפח), ו 0.05% Tween20 ב 1x PBS. דגירה של sדגימות 1x PBT למשך 30 דקות.
- הסר את PBT 1x ו דגירה דגימות 1: 1000 NHS-fluorescein ו 1: 10,000 H 2 O 2 ב PBT 1x במשך 15 דקות בחושך. משלב זה על, לשמור על דגימות בחושך ככל האפשר, כמו האות ניאון יקטן כפי שהם חשופים לאור.
הערה: NHS-fluorescein הוכן בעקבות פרוטוקול דגים מפורט על ידי המלך, RS ו Newmark, הרשות הפלסטינית 20 - שטפו את הדגימות 3 פעמים עם PBSTx במהירות, ואז 2 פעמים במשך 30 דקות.
- השאירו את הדגימות PBSTx לילה ב 4 ° C להמשיך כביסה.
- לעשות עוד כמה שוטף עם 1x PBSTx. כדי לדמיין גרעיני תאים, לבצע את השלבים האופציונליים הבאים עבור counterstaining DNA באמצעות 4, 6-diamindino-2-phenylindole, דיהידרוכלוריד (DAPI). אחרת, הדגימות עשוי להיות צילמו עכשיו.
- לדלל 5 מ"ג / מ"ל DAPI המניות לריכוז עבודה של 1: 500 ב PBSTx ולהוסיף 200 μL לכל צינור. אינקולהכות את הדגימות למשך 30 דקות.
זהירות: DAPI הוא מסרטן ידוע. ללבוש PPE מלא. - הסר את DAPI לשטוף את הדגימות 2 - 3 פעמים עם PBSTx לפני הדמיה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיד לאחר הטיפול הראשוני 8 colchicine, כל הידרה לשרוד. חלק אלה הידרה יהיה רק זרועות בדלי הנותרים ( איור 3 א ), בעוד שאחרים איבדו לחלוטין זרועותיהם ( איור 3 ב ). במהלך 1 או 2 ימים הבאים, זרועות ימשיך להתכווץ עד כל הידרה איבדו את זרועותיהם. כשבוע לאחר הטיפול, ההידרה יראה סימנים של לצמיחה מחודשת זרוע, עם בדל קטן כמו זרועות ( איור 3 ג ) לפני שהם מלא מחדש את זרועותיהם ( איור 3 ד ). של ההידרה המקורי, סביב 50-60% בסופו של דבר מחדש את זרועותיהם בין 1-2 שבועות לאחר הטיפול.
בעקבות הטיפול אקולוגי, ההתאוששות של בעלי החיים דומה לזה לאחר הטיפול הראשון. לפיכך, סביב 10% של המספר המקורי של בעלי חיים שנכנסו שני הטיפולים להתאושש לגדול לגודל מתאים ניסויים ( איור 1 ב ' ). אלה הידרה יש זרועות כי להיראות דק יותר מאלה של בעלי חיים מטופלים, יש רקמות שהוא שקוף יותר, ותופיע bloated בשל חוסר יכולת לפתוח את הפה שלהם כדי להקל על הלחץ האוסמוטי ( איור 1 א , 1B). כל בעלי חיים שאינם מוזנים יכולים לשרוד במשך כמה שבועות, עם זאת, בעלי חיים לא מנוסים יקטן בגודל ויהיה קשה יותר ויותר להאכיל.
הידרה כי לעשות להתאושש לאחר הטיפול השני יכול להישמר ללא הגבלת זמן. בעלי חיים אלה מסוגלים להניע, ובכך לקיים ולגדול האוכלוסייה. בנוסף, ניתן להגדיל את האוכלוסייהעל ידי חיתוך בעלי חיים אלה ומאפשר להם להתחדש 4 .
אימונוהיסטוכימיה מאשרת את אובדן הנוירונים ב hypostome בעקבות הטיפול השני קולכיצין. רשת העצבים צפופה hypostome יכול להיות דמיינו באמצעות נוגדן אנטי טירוזין-טובולין 13 , 16 ומראה סיבים שונים מקרין החוצה מן הפה ואת גופי התא ברור ( איור 4 א ). סיבים אלה נעדרים הידרה ללא עצב כי כבר מיוצר על ידי טיפול כפול עם קולצ'יצין ( איור 4 ב ). יתר על כן, מכתים שיתוף עם DAPI מגלה מספר מופחת של גרעיני תאים ב הידרה ללא עצבים לעומת בקרות מטופל עקב אובדן של תאים של השושלת תא interstitial כתוצאה של טיפולי קולצ'יצין ( איור4 א, 4 ב ).
איור 1 . השוואה של הידרה נטולת עצבים ולא מטופלים.
(א) הידרא לא מטופל. (B) ללא עצב הידרה 22 ימים לאחר הטיפול השני קולכיצין. שימו לב לטור הגוף הנפוח ולמחושים הדקים בחיה נטולת העצבים. סולם ברים הם 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 . דוגמאות של הידרה מעוותת.
(א) שני הידרה (ב) הידרה בצורת מוזר. (ג) הידרה כי יש deflated לאחר פתיחת הפה. סולם ברים הם 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 . נציג תמונות של הידרה בעקבות טיפול ראשון 8 Colchicine.
(א) הידרה עם זרועות stubby מיד לאחר הטיפול. (ב) הידרה שאיבדה לחלוטין את זרועותיה מיד לאחר הטיפול. (ג) הידרה כי הוא מתחיל לצמוח זרועות שלה 8 ימים לאחר הטיפול. (ד)הידרה כי יש לחלוטין regrown זרועות שלה 13 ימים לאחר הטיפול. סולם ברים הם 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 . אובדן תאי עצב בהיפוסטום יכול להיות מאושר על ידי אימונוהיסטוכימיה.
(א) hypostome של הידרה מטופל ו- (B) hypostome של הידרה ללא עצב כ 2 שבועות לאחר הטיפול השני קולצ'יצין, שכותרתו עם (i) נוגדן אנטי טירוזין-טובולין (ii) DAPI. (Iii) מציג את שכבת העל. * מציין את מיקום הפה. תחזיות z מקסימלית נעשו מתוך ספינינג דיסק confocal פלואורסצנטי z ערימות נלקח עם eXposures של 500 אלפיות השנייה (GFP) ו -15 ms (DAPI). בהירות וניגודיות הותאמו כדי לשפר את הנראות. סולם ברים הם 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הידרה interstitial תאים ניתן לבטל דרך טיפול קולצ'יצין פעמיים 3 , 4 . בימים שלאחר הטיפול הראשון, זה קריטי כדי למנוע מגע בין הידרה בודדים כדי למנוע היתוך של חלקים הידרה לתוך הידרה מעוות. כמו כן, בעלי חיים אשר יכולים לאכול ללא סיוע לאחר הטיפול הראשון יש להסיר כמו טיפול colchicine השני לא יכול להיות מספיק כדי לחסל את התאים interstitial הנותרים מבעלי חיים כאלה. כדי למקסם את שיעור ההישרדות של הידרה ללא עצבים לאחר הטיפול השני של קולצ'יצין, יש להאכיל את בעלי החיים כארמטיה רבים ככל האפשר לאחר ההתאוששות מהטיפול הראשון, עם 1-2 ימים בין האכלות להתאושש ולצמוח. כל טיפול קולכיצין גורם להידרה לרדת באופן משמעותי בגודל כמו תאים egested, כך גדול הידרה הם לפני כל טיפול, את bאת הסיכויים כי ההידרה יתאושש לגודל שניתן להאכיל ומתוחזק.
בשל שיעור ההישרדות הנמוך של הידרה לאחר כל טיפול, זה עשוי להיות רצוי להתחיל עם הידרה רבים. עם זאת, יש להיזהר עם תחילת הטיפול על יותר מדי Hydra בבת אחת. זה יגרום להאכיל לאחר הטיפול הראשון קשה מאוד זמן רב. בעלי חיים מוזנים היטב לאחר הטיפול הראשון להתאושש לגדלים גדולים יותר ולכן יש שיעור הישרדות גבוה יותר לאחר הטיפול השני. לכן, זה עשוי להיות פרודוקטיבי יותר להתחיל עם פחות ולהתמקד האכלה טוב יותר. בדרך כלל, החל 50-100 בעלי חיים הוא לניהול עבור 1 - 2 אנשים. זה גם הכי טוב להתחיל עם הידרה הגדול ביותר האפשרי, כמו אלה יהיה טוב יותר לשרוד את שני הטיפולים.
השיטה של האכלה בכוח ו גיהוק הידרה כי חסרים תאי עצב המתואר כאן הוא בטוח יותר, פשוט יותר, זמן רב יותריעיל יותר משיטות שתוארו בעבר 3 , 4 , 14 . השימוש במלקחיים זמינים מסחרית מזרקים לבטל את הצורך יד משך טיפים micropipette, אשר זמן רב וקשה לעשות. השימוש בכלים אלה גם מונע את הצורך פיפה פיפטה. כוח האכלה באמצעות מלקחיים עשוי להיות קשה בהתחלה, אך נתון מספיק זמן בפועל, זה הופך להיות די קל ויעיל. יש קודם להתאמן כוח האכלה ו גיהוק נורמלי הידרה כדי לקבל תחושה של כמה כוח להשתמש עם הכלים וכיצד לתפעל הידרה . מלקחיים שונים גודל המחט נבדקו כדי למצוא את הכלים האופטימליים עבור האכלה בכוח ו גיהוק.
השימוש מכתים נוגדנים כמתואר כאן הוא מספיק רק כדי לבדוק את היעדר תאי עצב היפותוסטום. כדי להבטיח כי כל התאים interstitial כבר חיסלו, בעלי חיים עשויים להיות מקוטרת וניתן לבדוק את סוגי התאים הקיימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
המחברים מודים לד"ר דיק קמפבל (UC Irvine) לדיונים על הפרוטוקול המקורי להפקת ושמירה על בעלי חיים ללא עצבים, גב 'רוי וואנג על עזרה בהתאמת טכניקת המזרק והמחט, וגברת דניאלה הגסטרום וד"ר רוב סטיל (UC Irvine) להערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי RCSA ו- NSF מענק CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
