Summary
Attraverso un doppio trattamento con colchicina, può essere generata una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie, senza idrografia Hydra vulgaris . Questi Hydra non possono nutrire o esaminare da soli. Questo documento descrive un metodo migliorato per la manutenzione a lungo termine di Idra vulgaris privo di nervi in laboratorio.
Abstract
La linea di cellule interstiziali di Hydra comprende cellule staminali multipotenti ei loro derivati: cellule ghiandolari, nematociti, cellule germinali e cellule nervose. Le cellule interstiziali possono essere eliminate mediante due trattamenti consecutivi con colchicina, una tossina derivata da piante che uccide le cellule divisorie, eliminando così il potenziale di rinnovamento delle cellule differenziate derivate dalle cellule staminali interstiziali. Ciò consente alla generazione di Hydra che mancano di cellule nervose. Un polipo privo di nervi non può aprire la bocca per alimentare, controllare o regolare la pressione osmotica. Tali animali, tuttavia, possono sopravvivere e essere coltivati indefinitamente in laboratorio se regolarmente alimentati e burped. La mancanza di cellule nervose consente di studiare il ruolo del sistema nervoso nel regolare il comportamento e la rigenerazione degli animali. I protocolli precedentemente pubblicati per la manutenzione Idra libera da idrocarburi comprendono tecniche obsolete quali la pipettazione a bocca con micropipetta tirata a manoIps per alimentare e pulire l' Hydra . Qui viene introdotto un miglioramento del protocollo per la manutenzione di Idra priva di nervi. Le pinze fine-punte vengono utilizzate per forzare la bocca e inserire Artemia appena uccisa. Dopo l'alimentazione della forza, la cavità del corpo dell'animale viene lavata con un mezzo fresco usando una siringa e un ago ipodermico per rimuovere il materiale non digerito, qui indicato come "burping". Questo nuovo metodo di erogazione di forza e burping Hydra senza nervi attraverso l'uso di pinze e siringhe elimina la necessità di pipettazione a bocca con punte a micropipetta tirate a mano. Questo rende il processo più sicuro e significativamente più tempo efficiente. Per garantire che le cellule nervose nel iostomo siano state eliminate, viene condotta l'immunohistochemistry usando l'anti-tirosina-tubulina.
Introduction
Il sistema nervoso di Hydra è costituito da una rete nervosa, con i neuroni associati a entrambi gli strati di tessuto epiteliale 1 . La rete nervosa è più densa nel hypostome e nel peduncolo e meno densa nella colonna del corpo 2 . Le cellule nervose provengono da cellule staminali interstiziali, che sono cellule staminali multipotenti che danno origine a cellule secretarie, nematociti, cellule germinali e neuroni 1 . È possibile eliminare le cellule interstiziali di Hydra vulgaris attraverso il trattamento con colchicina 3 , 4 , una tossina derivata da piante che uccide cellule divisorie. Anche se la colchicina è stata trovata per inibire la polimerizzazione del microtubulo in altri organismi, uno studio precedente ha dimostrato che i microtubuli sono presenti in Hydra per tutto il trattamento, suggerendo che la colchicina non agisce in Hydra 3 . Un altro stUdy suggerisce che la colchicina non lega efficacemente la tubulina in alcuni organismi, tra cui Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas e Schizosaccharomyces pombe, che possono spiegare questa differenza 5 . Il trattamento della colchicina induce la fagocitosi delle cellule interstiziali dalle cellule epiteliali endodermiche 3 e consente quindi la creazione di animali che mancano di cellule nervose, di cellule ghiandolari e nematociti. Non è chiaro perché le cellule interstiziali siano particolarmente sensibili al trattamento della colchicina. Dato che entrambe le cellule interstitiali post-mitotiche e le cellule delle cellule staminali interstiziali sono danneggiate e fagocitose, Campbell ha concluso che la colchicina non influiva direttamente l'attività mitotica 3 . In particolare, il trattamento colchicina funziona bene in Hydra vulgaris, ma è stato dimostrato di non funzionare anche in altre specie, come Hydra oligactis 6 . Idra viridis 7 privo di nervi. Idra priva di nervi (anche a volte definita come " Hydra epiteliale" 8 ) sono quindi uno strumento utile per studiare i ruoli di questi tipi di cellule specializzate dalla linea di cellule interstitiali nell'omeostasi tissutale e nella rigenerazione.
L'idra può essere l'unico esempio noto di un animale capace di vivere senza un sistema nervoso. Idra priva di nervi servono come un modello particolarmente utile per dissectare il ruolo della rete nervosa nella regolazione della rigenerazione idraulica , dell'omeostasi e del comportamento. Ad esempio, l'introduzione di cellule interstiziali in Idra priva di nervi tramite innesto ha permesso di caratterizzare la differenziazione delle cellule nervose come regione altamente specifica 9 . Inoltre, perché l' Idra priva di nervi può rigenerarsiConsentire l'indagine di percorsi alternativi di rigenerazione indipendenti dal sistema nervoso. Un esempio di questo tipo è la neurogenesi apicale e la formazione delle teste, che è stato dimostrato dipendente dalla funzione cnox-2 nel sistema nervoso di tipo idrico tipico , ma sembra essere dispensabile in Idra priva di nervi, suggerendo che ci possa essere un processo alternativo di rigenerazione della testa 10 .
Hydra senza nervi sono stati utilizzati anche per studiare l'espressione delle cellule epiteliali e la regolazione dei geni neurogenici e neurotrasmettitori dopo la perdita della neurogenesi 11 . L' Idra priva di nervi non presenta esplosioni spontanee di contrazione 12 , indicando che queste esplosioni sono regolate dal sistema nervoso. L' Idra priva di nervi, invece, si contrae in risposta al pizzicamento della colonna corporea, suggerendo che la contrazione in risposta agli stimoli meccanici è mediata dall'accoppiamentoGh junction in cellule epiteliali, mentre il comportamento contrattile spontaneo è mediato da accoppiamento attraverso giunzioni gap nelle cellule nervose 13 .
Idra priva di nervi non apre le bocche quando viene presentata con cibo o ridotto glutatione 3 , suggerendo che neuroni sensoriali sono necessari per rilevare la presenza di cibo e segnalare la bocca da aprire. Inoltre, la rete nervosa sembra svolgere un ruolo nel rilevare la pressione osmotica, poiché gli animali privi di nervi non sono in grado di regolare autonomamente la loro pressione idrostatica interna attraverso l'apertura della bocca, causando il loro aspetto simile al pallone 3 , 4 ( figura 1B ). La regolazione della pressione idrostatica in Hydra priva di nervi con una frequente deflazione manuale ha portato ad una perdita di qualche morfologia anormale nella colonna del hypostome e del corpo. Tuttavia, la deflazione cronica ha causato interferenze con la crescita, elOngation, germinazione e organizzazione dei tessuti 8 .
Sebbene l' idra priva di nervi non sia in grado di nutrirsi e di esplorare da soli, è possibile mantenerli a tempo indefinito in laboratorio mediante l'alimentazione manuale a mano e burping ogni animale. Le pubblicazioni precedenti hanno descritto metodi di forza-alimentazione e burping Hydra senza nervi, tuttavia questi protocolli hanno coinvolto l'uso di punte di micropipette che devono essere manualmente tirato con attenzione alla dimensione appropriata, nonché l'uso di un boccaglio collegato alla pipetta da tubo 14 . Qui viene descritto un metodo più semplice, più sicuro e più efficiente nel tempo per l'alimentazione e il burping.
Inoltre, studi precedenti hanno coinvolto il controllo dell'assenza di cellule nervose attraverso la dissociazione degli animali fissi in singole cellule e l'esame della morfologia cellulare 3 , 4 , 15 . HL'immunohistochemistry con un anticorpo monoclonale contro il terminale carbossilato tirosinato di alfa-tubulina è stato usato come metodo complementare alla macerazione per verificare l'esaurimento dei neuroni nell'ipostomo 13 , 16 . Studi precedenti hanno dimostrato che i neuroni nel peduncolo possono anche essere visualizzati utilizzando questo anticorpo 13 , tuttavia questi neuroni e quelli della colonna corporea sono più difficili da definire. Mentre l'immunohistochemistry è sufficiente a confermare l'assenza di cellule nervose nel hypostome e non richiede competenze sulla morfologia di tipo cellulare, non può essere utilizzato per verificare l'assenza delle cellule staminali interstitiali e degli altri derivati di queste cellule. Gli studi sulla dissociazione e sulla morfologia cellulare sono più rigorosi e possono dare un resoconto quantitativo dei numeri di ciascun tipo di cellula che rimangono dopo ogni fase del trattamento.
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Protocol
1. Doppia Colchicina Trattamento
- Fai una soluzione colchicina del 0.4% (peso / volume) in Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Attenzione: La colchicina è acutamente tossica, fatale se ingerita, può causare difetti genetici e può causare danni agli occhi. Maneggiare la polvere in un cappuccio e portare l'attrezzatura protettiva personale (PPE) completa. - Incubato Hydra vulgaris (il ceppo AEP è stato usato qui) che sono stati affamati per 24 ore in colchicina 0,4% in un rapporto di 5 Idra per ml di soluzione colchicina in un piatto di Petri per 8 ore a temperatura ambiente al buio.
Nota: 5 L' idra / ml colchicina è una linea guida per determinare la quantità di soluzione da utilizzare per evitare sovraffollature del piatto con Hydra . Utilizzare lo stesso volume di soluzione per le successive pulizie e le modifiche della soluzione. - Rimuovere la soluzione colchicina e sostituireCon il mezzo pulito Hydra senza colchicina. Lavare l' Hydra 5 volte per trasferimento seriale con una pipetta di Pasteur di vetro in un mezzo di Hydra pulito prima di trasferirlo a 50 μg / mL rifampicina in mezzo Hydra . Tenere l' idra in un incubatore a 18 ° C.
Nota: Una quantità sufficiente di rifampicina da 1000X (50 mg / mL) in dimetilsolfossido (DMSO) per 1-2 settimane di trattamento può essere conservata a 4 ° C. L'importo esatto può essere determinato dal volume totale di soluzione utilizzata ogni giorno. Ad esempio, se ci sono 2 piatti, ognuno dei quali contiene 10 ml di soluzione che deve essere cambiato due volte al giorno, un totale di 40 ml di soluzione sarà utilizzato in un giorno, corrispondente a 40 μL di scorte di 1000X al giorno o di 560 μL Durante un periodo di due settimane. Lo stock è quindi diluito 1: 1000 in mezzo Hydra dopo l'uso.
Attenzione: DMSO è un liquido combustibile e penetra facilmente la pelle, permettendo ad altri prodotti chimici disciolti nel corpo. ManoIl solvente in una cappa di fumo e indossare il PPE completo. Da notare, DMSO si blocca a 4 ° C - Cambiare il medesimo Hydra contenente rifampicina due volte al giorno finché l' idra non espelle le cellule nel mezzo, generalmente dopo un trattamento post-settimana. A questo punto, il mezzo può essere cambiato una volta al giorno. Durante i giorni successivi al trattamento, l' Hydra perderà completamente i tentacoli. Evitate di avere l' Hydra in contatto tra loro, in quanto potrebbero fondersi e provocare Idra di forma stranamente formata ( Figura 2 A ).
- Per prevenire il contatto, evitare di roteare il piatto in un movimento circolare. Invece agitare delicatamente il piatto in direzioni verticali e orizzontali finché l' idra non si distribuisce a parte. Ispezionare il piatto dopo aver posizionato l' Hydra nell'incubatrice a 18 ° C e regolare se necessario.
Nota: nei giorni in cui il supporto viene modificato due volte, cambiare il supportoUna volta al mattino e ancora nel pomeriggio / sera.
- Per prevenire il contatto, evitare di roteare il piatto in un movimento circolare. Invece agitare delicatamente il piatto in direzioni verticali e orizzontali finché l' idra non si distribuisce a parte. Ispezionare il piatto dopo aver posizionato l' Hydra nell'incubatrice a 18 ° C e regolare se necessario.
- Una volta che i tentacoli iniziano a formarsi, iniziare a forzare l'alimentazione e burping l' Hydra 3 a 4 volte a settimana (vedere Sezioni 2 e 3). Circa 8-9 giorni dopo il trattamento con colchicina, l' Hydra comincerà a crescere i tentacoli.
Nota: La ricrescita del tentennino varia tra gli individui. Alcuni possono richiedere più di 8 - 9 giorni prima di mostrare segni di crescita tentacolare. Quelli che non ricrescono i loro tentacoli e gli animali o animali troppo piccoli da alimentare ( Figura 2 B ), devono essere rimossi. Questi Hydra probabilmente non sopravvivere al secondo trattamento. L' idra può anche germogliare. Tuttavia, alcuni dei germogli possono ancora avere cellule interstiziali e poter mangiare da sola.- Rimuovere tutti i germogli che possono mangiare senza assistenza e staccarsi dall'animale genitore. Individuare questi animali aggiungendo Artemia dal vivo alMangiando piatto e osservando se gli animali catturano e mangiano l' Artemia da soli. 1 o 2 Hydra può anche mangiare in proprio. Questi dovrebbero essere scartati.
Nota: l' Idra priva di nervi ha una caratteristica morfologia simile a palloncini, e tentacoli più corti e più sottili rispetto alla normale (a causa della perdita di nematociti) e possono quindi essere facilmente distinti da animali normali ( Figura 1 A, 1B ).
- Rimuovere tutti i germogli che possono mangiare senza assistenza e staccarsi dall'animale genitore. Individuare questi animali aggiungendo Artemia dal vivo alMangiando piatto e osservando se gli animali catturano e mangiano l' Artemia da soli. 1 o 2 Hydra può anche mangiare in proprio. Questi dovrebbero essere scartati.
- Tre settimane dopo il primo trattamento della colchicina, ripetere il trattamento della colchicina (passaggi 1.1 - 1.5). È necessario un secondo trattamento colchicina per eliminare le restanti cellule interstiziali e le cellule nervose 3 .
2. Forza-alimentazione
- Aggiungere cisti di Artemia ad un contenitore di vetro stretto e alto che si aggrappa in basso. Riempire il contenitore con acqua di Artemia (6.72 M NaCl). Evita di uscireCon 1 g di cisti per 1 L di acqua per una resa più elevata.
- Coprire la parte superiore del contenitore con il parafilm e inserire una pipetta serologica da 10 ml attraverso il parafilm nel contenitore. Fornire l'aerazione collegando il tubo ad una pompa dell'aria dell'acquario e montando il tubo attorno alla pipetta. Assicurarsi che la punta della pipetta raggiunga il fondo del contenitore e che non ci siano cisti al fondo. L' Artemia sbarcherà dopo 48 h.
Nota: Ci sono molti modi diversi per aprire Artemia che può funzionare altrettanto bene.
- Coprire la parte superiore del contenitore con il parafilm e inserire una pipetta serologica da 10 ml attraverso il parafilm nel contenitore. Fornire l'aerazione collegando il tubo ad una pompa dell'aria dell'acquario e montando il tubo attorno alla pipetta. Assicurarsi che la punta della pipetta raggiunga il fondo del contenitore e che non ci siano cisti al fondo. L' Artemia sbarcherà dopo 48 h.
- Togliere l' Artemia dall'acqua di Artemia in una rete Artemia (disponibile presso le società di approvvigionamento di acquari) e lavare per circa 20 s in acqua di DI, prima di piazzarli in un piatto con il mezzo di Hydra . La salinità dell'acqua di Artemia è troppo elevata per Hydra , quindi la Artemia deve essere lavata prima di essere utilizzata.
- Sotto un microscopio di dissezione,Eutanizzano l' Artemia leggendolo spremendolo con un paio di pinze fine. Evitare di spremere abbastanza duro per espellere il budello, poiché questo si attacca alle pinze e rende difficile l'alimentazione. Leggermente schiacciando l' Artemia prima di alimentarla all'Hydra aiuterà con il processo di digestione 14 . Posizionare l' Artemia appena ucciso vicino all'Hydra nel piatto per facilitare l'alimentazione veloce.
Nota: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti con un microscopio di dissezione. - Utilizzare una coppia di pinze per tenere l' idra dal peduncolo. Continuare a tenere il peduncolo durante il processo di alimentazione dell'Hydra . Utilizzando una seconda coppia di pinze, pizzicare la colonna del corpo per fare il contratto Hydra .
- Tenendo insieme le punte della seconda coppia di pinze, toccate al centro del hypostome (la struttura a cupola all'estremità orale dell'animale). Questo a volte apre la bocca. ioLa bocca non si apre premendo, punzonare la bocca inserendo la pinza nel centro del hypostome e quindi rilasciare leggermente la pressione sulle punte della pinza. Questo dovrebbe allungare l'apertura della bocca fatta dalla puntura.
Nota: l' idra può sgonfiarsi e collassare quando la bocca è aperta ( Figura 2 C ). Se ciò accade, l' Artemia può essere ancora inserita nell'Hydra . Se è troppo difficile farlo, passare alla prossima Hydra e tornare all'Hydra originale più tardi e riprovare. L' idra tendono a non sgonfiare tanto durante le successive aperture della bocca. - Raccogli rapidamente Artemia con le pinze e inserirle nella cavità gastrica dell'Hydra . Inserisci il maggior numero possibile di Artemia fino a quando la cavità gastrica è piena e più Artemia non può essere inserita senza danneggiare l' Hydra , l'incidenteAlleati che tira fuori qualsiasi Artemia , o impedisce la chiusura della bocca. In media, questa è 5 - 6 Artemia , tuttavia fino a 12 sono stati alimentati agli animali più grandi.
- Se la bocca inizia a chiudere, allungare nuovamente con le pinze come sopra descritto; Tuttavia, si dovrebbe prendere precauzione come qualunque Artemia già dentro l'animale possa cominciare a uscire quando la bocca è riaperta.
- Se l' Hydra è troppo piccola per un'intera Artemia , tagliare l' Artemia usando un bisturi e alimentare i pezzi più piccoli Hydra . Se l' Artemia non rimane all'interno dell'Hydra , potrebbe essere necessario premere la pinza contro l' Artemia per mantenerlo all'interno dell'Hydra fino alla sua chiusura della bocca.
- Trasferire l' idra alimentata con una pipetta di Pasteur di vetro, attentamente per evitare burping accidentale, ad un piatto con rifampicina fresca 50 μg / mL in mezzo Hydra . Se un'Artemia è stata espulsa fRom l' idra durante il trasferimento, reinserirlo mentre nel nuovo piatto.
Nota: una pipetta di vetro viene utilizzata per il trasferimento dell'Hydra , in quanto si è riscontrato che Hydra non è più a vetro rispetto alla plastica. La lunghezza della pipetta non importa, ma utilizzando pipette da 5 pollici può essere un po 'più facile.
3. Burping
- Far scorrere l' Hydra per rimuovere il materiale non immerso in qualsiasi momento tra 8 e 20 ore dopo l'alimentazione.
- Sabbia il punto di un ago ipodermico da 30G con P320 o carta simile a graniglia fino a quando la punta è piatta.
Nota: Un ago ipodermico 27G funzionerebbe anche, ma la punta più piccola del manometro superiore è preferibile. - Attaccare l'ago ad una siringa di plastica monouso da 1 ml e riempire la siringa con fresca rifampicina 50 μg / mL in mezzo Hydra .
Nota: il burping di una singola idra richiede circa 0,05 ml a 0,1 ml di soluzione. A 1 ml di syriNge è preferibile poiché è più difficile controllare la forza e il volume della soluzione uscente con una siringa di volume maggiore. - Sotto un microscopio di dissezione, tenere il peduncolo dell'Hydra con pinze fine punto e toccare al centro del hypostome con l'ago. Se la bocca non si apre, inserire le pinze nel hypostome e aprire la bocca come descritto sopra per l'alimentazione.
Nota: Tutti i passaggi successivi vengono eseguiti con un microscopio di dissezione. - Utilizzare la siringa per sciacquare, molto dolcemente, per evitare di soffiare l'intero animale, la cavità gastrica con la soluzione di rifampicina da 50 μg / mL fino a quando tutti i detriti sono stati espulsi. L'ago non deve necessariamente essere inserito nell'Hydra se la dimensione dell'Hydra non lo consente. L'ago può essere tenuto vicino all'apertura della bocca e punta direttamente verso la bocca.
- Utilizzando una pipetta di Pasteur di vetro, trasferire Hydra burped a un piatto con 50 freschi81; g / mL rifampicina in mezzo Hydra .
4. Controllo della qualità attraverso l' immunohistochemistry
NOTA: Il seguente protocollo è adattato dai protocolli di Shenk, M. A, et al. 18 , e Böttger, A 19 . Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT), salvo diversa indicazione. Un nutatore può essere utilizzato per le fasi di incubazione e può migliorare la qualità di colorazione. Tuttavia, se l' Hydra si aggrappa l'uno con l'altro, tutti i passaggi possono anche essere eseguiti senza.
- Preparare la soluzione di blocco: 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% DMSO in 1x salina fosfato-tamponata (PBS). Conservare questa soluzione a 4 ° C fino all'uso (punti 4.6 e 4.11). La soluzione può essere conservata per 1 - 2 giorni.
Nota: Tutte le soluzioni utilizzate in questo protocollo devono essere raccolte correttamente come rifiuti pericolosi. - Rilassare Hydra in 200 μl di uretano al 2% in Hydra mPer 1 min in 1,7 mL di microcentrifuga. Utilizzare 5 idrati per tubo per ciascuna delle 4 condizioni: senza nervo, non trattato, non trattato con nessun anticorpo primario e non trattato con nessun anticorpo secondario.
Nota: non superare 1 min. Il tempo qui è critico poiché gli animali saranno in cattive condizioni dopo aver trascorso troppo tempo in uretano. - Rimuovere l'uretano e fissare l' idra in 200 μl di 4% di paraformaldeide (PFA) in media di Hydra per 15 minuti.
- Lavare i campioni 3 volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno.
Nota: tutte le liscive con PBS e PBSTx vengono fatte con 500 μL di soluzione. - Permeabilizzare con 500 μl di 0,5% di Triton X-100 in PBS per 15 minuti.
- Rimuovere lo 0,5% di Triton X-100 e aggiungere 500 μL della soluzione di blocco. Bloccare i campioni per almeno 1 h.
- Diluire l'anticorpi anti-tirosina-tubulina 1: 200 nella soluzione di blocco.
Nota: questa concentrazione era deTerminato sperimentalmente. Se il segnale nei controlli è risultato troppo debole, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione. Se vi è un legame non specifico, la concentrazione può essere necessaria per essere ridotta. La preincubazione dell'anticorpo può anche contribuire a ridurre il legame non specifico. - Rimuovere la soluzione di blocco dai campioni e aggiungere 200 μL dell'anticorpo primario ai controlli non trattati e ai controlli non trattati senza nessun secondario. Per i controlli non trattati senza primaria, solamente aggiungere 200 μL di soluzione di blocco senza l'anticorpo.
- Incubare i campioni durante la notte (> 12 h) a 4 ° C.
Nota: In alternativa, incubare 5 - 6 h a RT. - Rimuovere l'anticorpo primario e lavare ampiamente i campioni con lo 0,3% di Triton X-100 in 1x PBS (PBSTx).
Nota: Salvare l'anticorpo primario e conservare a 4 ° C, poiché può essere riutilizzato almeno 2 - 3 volte. - Anti-mouse anti-mouse hP secondario anti-topo diluitoOdy 1: 500 in soluzione di blocco. Aggiungere 200 μL ai controlli non trattati Hydra senza nervi e controlli non trattati senza primaria. Per i controlli non trattati senza secondario, aggiungere solo 200 μL di soluzione di blocco senza l'anticorpo.
Nota: In alternativa, è possibile utilizzare un anticorpo secondario fluorescente, per i quali non sono necessari i punti 4.13 - 4.17. L'utilizzo di un secondario fluorescente consente di risparmiare tempo e generalmente è sufficiente, ma la secondaria hP fornisce una maggiore sensibilità. La concentrazione di secondaria è stata determinata sperimentalmente. Se i segnali nei controlli si trovano troppo deboli, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione. Se vi è un legame non specifico, la concentrazione può essere necessaria per essere ridotta. - Incubare i campioni durante la notte a 4 ° C.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare ampiamente i campioni con PBSTx.
- Preparare 1x PBT: l'albumina di siero bovina 0,2% (peso / volume) e 0,05% Tween20 in 1x PBS. Incubare la sAmpli in 1x PBT per 30 min.
- Rimuovere il 1x PBT e incubare i campioni in 1: 1.000 NHS-fluoresceina e 1: 10.000 H 2 O 2 in 1x PBT per 15 minuti al buio. Da questo passo, tenere i campioni nel buio il più possibile, in quanto il segnale fluorescente diminuirà in quanto sono esposti alla luce.
Nota: Fluoresceina NHS è stata preparata seguendo un protocollo FISH dettagliato da King, RS e Newmark, PA 20 - Lavare i campioni 3 volte con PBSTx rapidamente, quindi 2 volte per 30 min.
- Lasciare i campioni in PBSTx per una notte a 4 ° C per continuare a lavare.
- Fare qualche lavaggio più con 1x PBSTx. Per visualizzare i nuclei cellulari, eseguire le seguenti fasi facoltative per il conteggio del DNA utilizzando 4 ', 6-diamindino-2-fenilindolo, dihydrochloride (DAPI). In caso contrario, i campioni possono essere imaged ora.
- Diluire la massa di DAPI da 5 mg / ml a una concentrazione di lavoro di 1: 500 in PBSTx e aggiungere 200 μL ad ogni tubo. incuBalla i campioni per 30 min.
Attenzione: DAPI è un cancerogeno noto. Indossare il PPE completo. - Rimuovere il DAPI e lavare i campioni 2 - 3 volte con PBSTx prima di imaging con microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Subito dopo il trattamento iniziale di 8 ore di colchicina, tutti i Hydra sopravvivono. Alcune di queste Hydra avranno solo stoppini tentacoli ( Figura 3 A ), mentre altri avranno completamente perso i tentacoli ( Figura 3 B ). Nei prossimi 1 o 2 giorni, i tentacoli continueranno a ridursi fino a quando tutti i Hydra hanno perso i tentacoli. Circa una settimana dopo il trattamento, l' Hydra mostrerà segni di ricrescita tentacolare, con piccoli stub come tentacoli ( Figura 3 C ) prima di rigenerare completamente i tentacoli ( Figura 3 D ). Dall'Hydra originale, circa il 50-60% alla fine rigenera i tentacoli tra 1-2 settimane dopo il trattamento.
Dopo la sEcond trattamento, il recupero degli animali è simile a quello dopo il primo trattamento. Così, circa il 10% del numero originale di animali che è entrato in entrambi i trattamenti recupera e cresce ad una dimensione adatta alla sperimentazione ( Figura 1 B ). Questi Hydra hanno tentacoli che sembrano più sottili di quelli di animali non trattati, hanno tessuto più trasparente e appariranno gonfiati a causa dell'incapacità di aprire le bocche per alleviare la pressione osmotica ( Figura 1 A , 1B). Tutti gli animali che non vengono nutriti possono sopravvivere per poche settimane, tuttavia gli animali sconnessi si riducono di dimensioni e diventano sempre più difficili da nutrirsi.
L'idra che si recupera dopo il secondo trattamento può essere mantenuta indefinitamente. Questi animali sono in grado di germogliare, sostenendo e coltivando la popolazione. Inoltre, la popolazione può essere coltivataTagliando questi animali e consentendo loro di rigenerarsi 4 .
L'immunohistochemistry conferma la perdita di neuroni nel hypostome dopo il secondo trattamento con colchicina. La rete nervosa fitta nel hypostome può essere visualizzata utilizzando un anticorpo anti-tirosina-tubulina 13 , 16 e presenta fibre distinte che irradiano verso l'esterno dalla bocca e dai corpi cellulari evidenti ( Figura 4 A ). Queste fibre sono assenti in Idra priva di nervi che sono state prodotte dal trattamento con la colchicina ( Figura 4 B ). Inoltre, la co-colorazione con DAPI rivela un numero ridotto di nuclei cellulari nell'Hydra privi di nervi rispetto ai controlli non trattati a causa della perdita di cellule della linea di cellule interstiziali a seguito dei trattamenti colchicina ( Figura4 A, 4B ).
Figura 1 . Confronto tra Idra priva di nervi e non trattati.
(A) Idra non trattata. (B) Idra priva di nervi 22 giorni dopo il secondo trattamento della colchicina. Si noti la colonna corporea gonfia e i tentacoli sottili nell'animale privo di nervi. Le barre di scala sono 500 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Esempi di idruro deformato.
(A) due idrati (B) Un Iddio stranamente sagomato. (C) L' idra che ha sgonfiato dopo aver aperto la bocca. Le barre di scala sono 400 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Immagini rappresentative di Hydra dopo il primo 8 h trattamento della colchicina.
(A) Una idra con tentacoli stubby subito dopo il trattamento. (B) L' idra che ha completamente perso i tentacoli immediatamente dopo il trattamento. (C) L' idra che sta cominciando a ricreare i suoi tentacoli 8 giorni dopo il trattamento. (D)Un'idra che ha completamente ripreso i tentacoli 13 giorni dopo il trattamento. Le barre di scala sono 400 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . La perdita di cellule nervose nell'ipostomo può essere confermata da Immunohistochemistry.
(A) Il hypostoma di un Idra non trattato e (i) ipostato anti-tirosina-tubulina e (ii) DAPI. (Iii) mostra l'overlay. Il * indica la posizione della bocca. Le proiezioni z massime sono state fatte dalle spine di rotazione dello zoccolo confocale di fluorescenza z prese con eXposure di 500 ms (GFP) e 15 ms (DAPI). La luminosità e il contrasto sono stati regolati per migliorare la visibilità. Le barre di scala sono 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le cellule interstiziali Idra possono essere eliminate tramite un doppio trattamento con colchicina 3 , 4 . Nei giorni successivi al primo trattamento, è fondamentale impedire il contatto tra l' idra individuale per evitare la fusione di pezzi Hydra in idra deformata. Inoltre, gli animali che possono mangiare non assistiti dopo il primo trattamento devono essere rimossi in quanto il secondo trattamento della colchicina potrebbe non essere sufficiente per eliminare le restanti cellule interstiziali da tali animali. Per massimizzare il tasso di sopravvivenza dell'idra senza nervo dopo il secondo trattamento della colchicina, gli animali dovrebbero essere alimentati come più Artemia possibile dopo il recupero dal primo trattamento, con 1 - 2 giorni tra le alimenti per recuperare e crescere. Ogni trattamento con colchicina induce l' Hydra a diminuire in maniera significativa in termini di dimensione delle cellule, in modo che maggiori sono i Hydra prima di ogni trattamento, i bElimina le probabilità che l' Hydra si riprenderà ad una dimensione che può essere alimentata e mantenuta.
A causa del basso tasso di sopravvivenza di Hydra dopo ogni trattamento, può essere auspicabile iniziare con molti idro . Tuttavia, deve essere presa con cautela con il trattamento iniziale su troppe Idra contemporaneamente. Questo renderà difficile l'alimentazione seguendo il primo trattamento e richiede molto tempo. Gli animali alimentati bene dopo il primo trattamento recuperano le dimensioni più grandi e quindi hanno un tasso di sopravvivenza più elevato dopo il secondo trattamento. Pertanto, potrebbe essere più produttivo cominciare con meno e concentrarsi sull'alimentazione migliore. Generalmente, a partire da 50-100 animali è gestibile per 1 - 2 persone. È anche meglio iniziare con la più grande idra possibile, in quanto questi superano meglio i due trattamenti.
Il metodo di forzatura di forza e burping Hydra che mancano di cellule nervose qui descritte è più sicuro, più semplice e più tempo- efficace dei metodi descritti in passato 3 , 4 , 14 . L'uso di pinze e siringhe disponibili in commercio elimina la necessità di punte a micropipetta tirate a mano, che richiedono tempo e sono difficili da realizzare. L'uso di questi strumenti evita anche la necessità di pipetta a bocca. Forza di alimentazione con pinze può essere difficile in un primo momento, ma dato sufficiente tempo e pratica, diventa abbastanza facile ed efficiente. Bisogna praticare innanzitutto la forza di alimentazione e il burping dell'Hydra normale per ottenere una sensazione di quanto forza da utilizzare con gli strumenti e come manipolare Hydra . Sono state testate diverse pinze e dimensioni dell'ago per trovare gli strumenti ottimali per l'alimentazione e il burping.
L'uso della colorazione degli anticorpi come descritto qui è solo sufficiente per verificare l'assenza di cellule nervose nel hypostome. Per garantire che tutte le cellule interstiziali siano state eliminate, gli animali possono essere macerati eI tipi di cellule presenti possono essere esaminati 15 .
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il dottor Dick Campbell (UC Irvine) per discutere del protocollo originale per la generazione e il mantenimento di animali privi di nervi, la sig.ra Rui Wang per aiutare ad adattare la siringa e la tecnica dell'ago, e la signora Danielle Hagstrom e il dottor Rob Steele (UC Irvine) per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da RCSA e NSF concedere CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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