Summary
colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다.
Abstract
히드라 의 간질 세포 계통에는 다 분화능 줄기 세포와 그 파생물이 포함됩니다 : 샘 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 신경 세포. 간질 세포는 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 (collicicine)을 2 회 연속 처리하여 제거함으로써 간질 줄기 세포에서 유래 한 분화 세포의 재생 가능성을 없앨 수 있습니다. 이것은 신경 세포가 부족한 히드라 의 생성을 가능하게합니다. 신경이없는 폴립은 삼투압을 공급, 제거 또는 조절하기 위해 입을 열 수 없습니다. 그러나 그러한 동물은 규칙적으로 강제로 먹이를 먹이고 짐을 싣기 만하면 생존하고 실험실에서 무기한 배양 될 수 있습니다. 신경 세포가 부족하여 동물 행동과 재생을 조절하는 신경계의 역할을 연구 할 수 있습니다. 신경이없는 히드라 유지를 위해 이전에 발표 된 프로토콜에는 손으로 뽑은 마이크로 피펫을 사용한 구강 (mouth-pipetting)히드라 를 먹이고 닦으십시오. 여기서 신경이없는 히드라 유지를위한 개선 된 프로토콜이 소개됩니다. 잘게 썰린 집게는 강제로 입을 열고 갓 죽인 아르테 미아 (Artemia)를 삽입하는 데 사용됩니다. 강제 공급 후 동물의 체강을 시린지와 피하 주사침을 사용하여 신선한 배지로 씻어내어 소화되지 않은 물질을 제거합니다. 여기서는 "burping"이라고합니다. 포셉과 주사기를 사용하여 힘을 공급하고 신경이없는 히드라 를 버핑하는이 새로운 방법은 손으로 뽑은 마이크로 피펫 팁을 사용하는 입 피펫팅의 필요성을 없애줍니다. 따라서 프로세스를보다 안전하고 훨씬 더 효율적으로 만듭니다. hypostome의 신경 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 anti-tyrosine-tubulin을 이용한 면역 조직 화학 법을 시행합니다.
Introduction
히드라 의 신경계는 상피 조직층과 관련된 뉴런과 함께 신경 네트로 구성됩니다 1 . 신경망은 hypostome과 peduncle에서 밀도가 높고 body 칼럼 2 에서는 밀도가 낮습니다. 신경 세포는 분비 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 뉴런을 생성하는 다 능성 줄기 세포 인 간질 줄기 세포에서 기원합니다 1 . 분열 된 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 3 , 4로 처리하여 히드라 분비 선의 간질 세포를 제거 할 수 있습니다. colchicine이 다른 유기체에서 미세 소관의 중합을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 이전의 연구에 따르면 microtubules은 Hydra 3 에서 전체적으로 콜히친이 이런 작용을하지 않는다는 것을 시사하는 전체 치료 과정에서 Hydra 에 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 또 다른 성udy는 Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas 및 Schizosaccharomyces pombe를 포함한 일부 유기체에서 콜히친이 tubulin에 효율적으로 결합하지 않는다고 제안하는데 , 이는이 차이를 설명 할 수있다. 콜히친 치료는 내배엽 상피 세포에 의한 간질 세포의 식균 작용을 유도하므로 신경 세포, 간 세포 및 혈구 세포가 결핍 된 동물을 만들 수 있습니다. 간질 세포가 콜히친 치료에 특히 민감한 이유는 분명하지 않습니다. 사후 mitotic interstitial cell과 interstitial stem cell lineage가 모두 손상되고 탐식 된 것을 감안할 때, Campbell은 콜히친이 유사 분열 활성에 직접적으로 영향을 미치지 않는다고 결론 지었다 3 . 특히, 콜히친 치료는 히드라 vulgaris 에서 잘 작동하지만 Hydra oligactis 6 와 같은 다른 종에서는 효과가없는 것으로 나타났습니다 . Hydra viridis 7 을 생산하는데 사용될 수 있습니다. 신경이없는 히드라 (때로는 "상피 히드라 "라고도 함)는 조직 항상성과 재생에서 간질 세포 계통에서 이러한 특수 세포 유형의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
히드라 는 신경계없이 살 수있는 동물의 유일한 예일 수 있습니다. 신경이없는 히드라 는 히드라 재생, 항상성 및 행동을 조절하는 신경 망의 역할을 분석하는 데 특히 유용한 모델입니다. 예를 들어, 간질 세포를 이식을 통한 신경없는 히드라 로 도입하면 신경 세포 분화의 특성을 고도의 부위 특이 적 특성으로 인정할 수 있었다. 또한, 신경이없는 히드라 가 재생할 수 있기 때문에, 그들은대안적이고 신경계에 독립적 인 재생 경로를 조사 할 수 있습니다. 하나의 그러한 예는 apical neurogenesis와 head formation이며, 이것은 wild type Hydra 의 신경계에서 cnox-2 기능에 의존하는 것으로 나타 났지만, 신경이없는 Hydra 에는 필요하지 않은 것처럼 보이며, 대체 머리 재생 과정이있을 수 있음을 시사한다 10 .
신경이없는 히드라 는 또한 신경 발생을 상실한 후에 신경 세포와 신경 전달 유전자의 상피 세포 발현과 조절을 연구하는데 사용되어왔다. 신경이없는 히드라 는 자발적인 수축 버스트 12를 나타내지 않으며, 이는 이러한 버스트가 신경계에 의해 조절된다는 것을 나타냅니다. 그러나 신경이없는 히드라 는 신체 칼럼을 집게로 꼬집는 것에 반응하여 기계적 자극에 반응하는 수축이 커플 링에 의해 매개되는 것으로 나타났습니다gh 갭 접합부를 형성하는 반면, 자연적 수축 작용은 신경 세포의 갭 접합부를 통해 커플 링 됨으로써 매개된다.
신경이없는 히드라 는 음식이나 감칠맛이있는 글루타티온 3을 선물로 먹었을 때 입을 열지 않아 음식의 존재를 감지하고 입을 열어야한다는 감각 뉴런이 필요합니다. 또한, 신경이없는 동물은 입안을 통해 내부 정압을 자율적으로 조절할 수 없기 때문에 삼투압을 감지하는 역할을하는 것으로 보이며, 풍선 모양과 같은 모양을 띄게됩니다 ( 그림 1B ). 신경 수분이없는 히드라 의 수압을 수동으로 수축 시켜서 수압을 조절하면 hypostome과 body column의 비정상적인 형태가 손실됩니다. 그러나 만성적 인 디플레이션은 성장에 대한 간섭으로 이어졌다.구성, 출생 및 조직 구성 8 .
신경이없는 히드라 는 스스로 먹일 수는 없지만 실험실에서 각 동물을 수동으로 강제로 먹이고 버핑하여 무한히 유지할 수 있습니다. 이전의 간행물은 힘을 먹이는 방법과 신경이없는 히드라를 트랩하는 방법을 설명했지만, 이러한 프로토콜은 적절한 크기로 조심스럽게 잡아 당겨야하는 마이크로 피펫 팁과 튜빙 14로 피펫에 연결된 마우스 피스를 사용해야합니다. 여기에서는 더 간단하고, 안전하며, 시간이 절약되는 사료 공급과 버핑 방법이 설명됩니다.
또한 이전 연구에서는 고정 된 동물을 개별 세포로 분리하고 세포 형태학을 검사하여 신경 세포의 부재를 확인하는 것이 포함되었습니다 3 , 4 , 15 . H예를 들어 알파 - 튜 불린의 티로신 화 된 카르 복실 말단에 대한 단일 클론 항체를 이용한 면역 조직 화학 염색을 hypostome 13 , 16 에서 뉴런의 고갈 여부를 확인하기위한 연쇄 반응의 보완적인 방법으로 사용했다. 이전 연구에서 보듯이 peduncle의 뉴런도이 항체 13을 사용하여 시각화 할 수 있지만,이 뉴런뿐만 아니라 신체 칼럼의 뉴런도 만들어내는 것이 더 어렵습니다. immunohistochemistry hypostome에 신경 세포의 부재를 확인하는 데 충분하고 세포 유형의 형태에 대한 전문 지식을 필요로하지 않지만, 그것은 간질 줄기 세포와 이러한 세포의 다른 파생물의 부재를 확인하는 데 사용할 수 없습니다. 해리 및 세포 형태학 연구는보다 엄격하며 치료의 각 단계 이후에 남아있는 각 세포 유형의 수를 정량적으로 설명 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 더블 콜히친 치료
- Hydra 배지 3 , 4 , 17에 0.4 % 콜히친 (중량 / 부피) 용액을 만듭니다.
주의 : 콜히친은 급성 독성이며, 삼키면 치명적이며, 유전 적 결함을 유발할 수 있으며, 눈에 손상을 줄 수 있습니다. 흄 후드에서 분말을 다루고 완전한 개인 보호 장비 (Personal Protective Equipment, PPE)를 착용하십시오. - 어둠 속에서 실온에서 8 시간 동안 페트리 디쉬에 콜히친 용액 1 mL 당 5 Hydra 의 비율로 0.4 % 콜히친에서 24 시간 동안 굶어 놓은 Hydra vulgaris (AEP 균주가 여기에 사용 됨)를 품는다.
참고 : 5 Hydra / mL 콜히친은 Hydra로 접시를 과밀하게 지나치는 것을 피하기 위해 사용할 솔루션의 양을 결정하기위한 지침입니다. 이후의 세척 및 솔루션 변경에는 동일한 볼륨의 솔루션을 사용하십시오. - 콜히친 솔루션을 제거하고 교체하십시오.콜히친이없는 깨끗한 히드라 배지. Hydra 매체에서 50 μg / mL rifampicin으로 옮기기 전에 깨끗한 Hydra 배지에 유리 파스퇴르 피펫으로 직렬 전달하여 5 회 세척하십시오. 히드라 를 18 ° C 배양기에 보관하십시오.
참고 : 1-2 주간의 치료를 위해 디메틸 술폭 시드 (DMSO)에 충분한 1,000X 리팜피신 원료 (50mg / mL)를 4 ° C에서 저장할 수 있습니다. 정확한 양은 매일 사용되는 용액의 총량으로 결정할 수 있습니다. 예를 들어, 매일 2 회 교체해야하는 10 mL의 용액을 담고있는 2 개의 접시가있는 경우, 하루에 총 40 mL의 용액이 사용됩니다 (하루에 1,000 X 재고량 40 μL 또는 하루 560 μL 2 주 동안. 그 다음에 스톡은 사용시 히드라 배지에서 1 : 1000으로 희석한다.
주의 사항 : DMSO는 가연성 액체이며 피부에 쉽게 침투하여 다른 용해 된 화학 물질이 신체에 유입되도록합니다. 손흄 후드에 솔벤트를 넣고 완전히 PPE를 착용하십시오. 참고로, DMSO는 4 ° C에서 얼게된다. - 히드라가 배지로 세포를 배출하는 것을 중지 할 때까지 매일 2 회 리팜피신 함유 하이 드라 배지를 교환하십시오. 이는 일반적으로 1 주간의 치료 후입니다. 이 시점에서 매체는 매일 한 번 변경할 수 있습니다. 치료 후 며칠 동안 히드라 는 촉수를 완전히 잃을 것입니다. 히드라 가 서로 닿아 서 서로 융합되어 이상한 모양의 히드라가 생기는 것을 피하십시오 ( 그림 2A ).
- 접촉을 방지하려면 원형 동작으로 접시를 소용돌이 치지 마십시오. 대신 히드라 가 벌어 질 때까지 접시를 수직 및 수평 방향으로 조심스럽게 흔들어주십시오. 히드라 를 18 ° C 배양기에 넣고 접시를 검사하고 필요에 따라 조정하십시오.
참고 : 매체가 두 번 변경된 날에는 매체를 변경하십시오아침에 한 번, 오후 / 저녁에 다시 한 번.
- 접촉을 방지하려면 원형 동작으로 접시를 소용돌이 치지 마십시오. 대신 히드라 가 벌어 질 때까지 접시를 수직 및 수평 방향으로 조심스럽게 흔들어주십시오. 히드라 를 18 ° C 배양기에 넣고 접시를 검사하고 필요에 따라 조정하십시오.
- 촉수가 형성되기 시작하면, 일주일에 3 ~ 4 회 히드라를 힘을 주어 먹이기 시작하십시오 (2 절과 3 절 참조). 콜히친 치료 후 약 8 ~ 9 일, 히드라 는 촉수를 다시 자라게됩니다.
참고 : 촉수 재성장은 개인마다 다릅니다. 일부는 촉각 증의 징후가 보이기까지 8 - 9 일 이상 걸릴 수 있습니다. 이상한 모양을 한 촉수 ( 그림 2B ) 동물이나 동물을 다시 키우지 않는 동물은 제거해야합니다. 이 히드라 는 두 번째 치료에서 살아남지 못할 것입니다. 히드라 는 또한 새싹이 날 수도 있습니다. 그러나 일부 새싹은 여전히 간질 세포를 가지고 있으며 스스로 먹을 수 있습니다.- 보조없이 먹을 수있는 모돈을 제거하고 모 동물로부터 분리하십시오. 라이브 Artemia 를먹는 요리를하고 동물들이 Artemia 를 잡아 먹는 지 관찰합니다. 1 또는 2 히드라 는 스스로 먹을 수도 있습니다. 이것도 버려야합니다.
참고 : 신경이없는 히드라 는 특징적인 풍선 모양의 형태와 정상보다 짧고 얇은 촉수 (nematocytes의 손실로 인한)를 가지므로 정상적인 동물 ( 그림 1A, 1B )과 쉽게 구분할 수 있습니다.
- 보조없이 먹을 수있는 모돈을 제거하고 모 동물로부터 분리하십시오. 라이브 Artemia 를먹는 요리를하고 동물들이 Artemia 를 잡아 먹는 지 관찰합니다. 1 또는 2 히드라 는 스스로 먹을 수도 있습니다. 이것도 버려야합니다.
- 첫 번째 콜히친 치료 후 3 주 동안 콜히친 치료를 반복하십시오 (1.1-1.5 단계). 나머지 간질 세포와 신경 세포를 제거하기 위해서는 두 번째 콜히친 치료가 필요합니다.
2. 강제 공급
- Artemia 낭종을 좁은 높이의 유리 용기에 넣습니다. 용기에 Artemia water (6.72M NaCl)를 채 웁니다. Exce 피하기높은 해치 수율을 위해 물 1L 당 1g의 낭종을 수정.
- 용기의 상단을 parafilm으로 덮고 parafilm을 통해 10 mL 혈청 피펫을 용기에 넣습니다. 수족관 공기 펌프에 튜브를 연결하고 피펫 주위에 튜브를 끼워서 포기하십시오. 피펫 팁이 용기의 바닥에 도달하고 하단에 낭종이 없다는 것을 확인하십시오. 아르테미아 는 48 시간 후 부화 할 것입니다.
참고 : Artemia 를 부화하는 데는 여러 가지 방법이 있습니다.
- 용기의 상단을 parafilm으로 덮고 parafilm을 통해 10 mL 혈청 피펫을 용기에 넣습니다. 수족관 공기 펌프에 튜브를 연결하고 피펫 주위에 튜브를 끼워서 포기하십시오. 피펫 팁이 용기의 바닥에 도달하고 하단에 낭종이 없다는 것을 확인하십시오. 아르테미아 는 48 시간 후 부화 할 것입니다.
- 아르테 미아 (Artemia) 물에서 아르테 미아 (Artemia) 물을 Artemia net (수족관 공급 업체에서 구입 가능)에 변형시키고 DI water에서 약 20 초 동안 씻어서 Hydra 배지에 넣습니다. Artemia 물의 염도가 Hydra의 경우 너무 높기 때문에 Artemia 를 사용하기 전에 세척해야합니다.
- 해부 현미경으로,미세한 포셉 한 쌍으로 가볍게 짜내서 Artemia 를 안락사시킵니다. 그것이 포셉에 충실하고 먹이를 어렵게하므로 내장을 배출하기 위해 열심히 쥐어 짜지 마십시오. 히드라에 공급하기 전에 Artemia 를 가볍게 눌러 짜내면 소화 과정을 도울 수 있습니다 14 . 빠른 먹이기를 용이하게하기 위해 갓 살생 된 Artemia 를 접시에있는 Hydra 가까이에 두십시오.
참고 : 모든 후속 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다. - Peduncle에 의해 Hydra 를 잡으려면 한 쌍의 포셉을 사용하십시오. 히드라 에게 먹이를주고있는 동안 pedhencle을 계속 잡아 당깁니다 . 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여, 히드라 계약을 만들기 위해 바디 칼럼을 꼬집어 라.
- 포셉의 두 번째 쌍의 끝을 함께 들고 hypostome (동물의 구강 끝에 돔형 구조)의 중심을 누릅니다. 때때로 입을 열게됩니다. 나는f 입이 두드리기에 의해 열리지 않으며 hypostome의 중앙에 포셉을 삽입하여 입을 찔러 낸 다음 포 셉터의 팁에 약간의 압력을 가하지 마십시오. 이것은 펑크로 만든 입을 펼쳐야합니다.
참고 : 입이 열리면 히드라 는 수축 및 붕괴 할 수 있습니다 ( 그림 2 C ). 이 경우 Artemia 가 여전히 Hydra에 삽입 될 수 있습니다. 그렇게하기가 어렵다면 다음 히드라 로 이동 한 다음 나중에 오리지날 히드라로 돌아가 다시 시도하십시오. 히드라 는 이후 입을 벌리는 동안 수축하지 않는 경향이 있습니다. - 포셉으로 Artemia 를 빠르게 집어 들고 Hydra 의 위장에 삽입하십시오. 위액이 가득 찰 때까지 가능한 한 많은 Artemia 를 삽입하고 Artemia 는 Hydra 를 손상시키지 않고 삽입 할 수 없습니다. 사고아티 미아를 안으로 끌어 내거나 입이 막히는 것을 방지합니다. 평균적으로, 이것은 5 - 6 아르테 미아 이지만, 최대 12 마리는 큰 동물에게 먹이를주었습니다.
- 입이 닫히기 시작하면 위에서 설명한대로 집게로 다시 엽니 다. 그러나 입안을 다시 열 때 이미 동물 내부에있는 어떤 Artemia도 나오기 시작할 수 있으므로주의해야합니다.
- 히드라 가 전체 아르테미아 에게 너무 작 으면 메스를 사용하여 아르테 미아 를 잘라 내고 히드라 보다 작은 조각을 먹이십시오. Artemia 가 Hydra 안에 머 무르지 않으면 Artemia 에 대해 포셉을 눌러 입이 막힐 때까지 Hydra 안에 유지해야합니다.
- Hydra 배지에서 신선한 50 μg / mL rifampicin이 담긴 접시에 우발적 인 burping을 방지하기 위해 신중하게 유리 파스퇴르 피펫으로 먹이를 공급하십시오. Artemia 가 추방 된 경우옮기는 동안 히드라 를 씻어서 새 접시에 넣고 다시 넣으십시오.
참고 : 히드라 는 플라스틱에 비해 유리에 덜 부착되는 것으로 밝혀 졌으므로 유리 피펫을 사용하여 히드라 를 옮깁니다 . 피펫의 길이는 중요하지 않지만 5 인치 피펫을 사용하면 다소 쉬울 수 있습니다.
3. 버핑
- 먹이를 마신 후 8 시간에서 20 시간 사이에 소화되지 않은 물질을 제거하기 위해 히드라 를 버프하십시오.
- 팁이 평평해질 때까지 P320 또는 유사한 모래 샌드페이퍼로 30G 피하 주사 바늘을 내려 놓습니다.
참고 : 27G 피하 주사침도 작동하지만 더 높은 게이지의 작은 팁이 좋습니다. - 일회용 1 ML 플라스틱 주사기에 바늘을 연결하고 Hydra 매체에 신선한 50 μg / ML rifampicin와 주사기를 채 웁니다.
참고 : 단일 히드라를 버핑하는 데는 약 0.05 mL ~ 0.1 mL의 용액이 필요합니다. 1 mL syri더 큰 용량의 주사기를 사용하면 나오는 용액의 힘 및 부피를 제어하기가 더 어렵 기 때문에 바람직하다. - 해부 현미경에서, 미세 포인트 포 셉과 Hydra 의 peduncle 잡고 바늘 hypostome의 중심에 누릅니다. 입이 열리지 않으면 hypostome에 포셉을 넣고 위의 설명과 같이 입을 벌리십시오.
참고 : 모든 후속 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다. - 모든 잔해가 제거 될 때까지 전체 동물, 50 μg / ML rifampicin 솔루션 위장을 멀리 불어 피하기 위해 매우 부드럽게 플러시하는 주사기를 사용하십시오. 히드라 의 크기가 허용하지 않으면 반드시 바늘을 히드라에 삽입 할 필요는 없습니다. 바늘은 입 개구에 가깝게 유지되고 입쪽으로 직접 향하게 될 수 있습니다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새우 50 개가 담긴 접시에 이드 라 를 옮겼습니다.81; g / mL rifampicin ( Hydra 배지).
4. 면역 조직 화학을 통한 품질 관리
참고 : 다음 프로토콜은 Shenk, M. A, et al. 18 절 , 벧 거어, 19 장 . 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온 (RT)에서 수행됩니다. 배양 단계에 nutator를 사용할 수 있으며 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 히드라 가 서로 얽혀 있으면 모든 단계가 없이도 수행 될 수 있습니다.
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 인산염 완충 식염수 (PBS)에 1 % DMSO를 차단 용액을 준비합니다. 이 용액을 사용하기 전까지 4 ° C에서 보관하십시오 (4.6 및 4.11 단계). 용액은 1 ~ 2 일 동안 보관할 수 있습니다.
참고 : 이 프로토콜에 사용 된 모든 솔루션은 위험 폐기물로 올바르게 수집해야합니다. - 히드라 에서 2 % 우레탄 200 μL로 히드라 완화1.7 mL의 마이크로 원심 분리기 튜브에서 1 분간에 듐. 신경 조건이없는, 치료되지 않은, 일차 항체가없는 상태에서 치료받지 않은 상태, 이차 항체가없는 상태에서 튜브 당 5 Hydra를 사용하십시오.
참고 : 1 분을 초과하지 마십시오. 우레탄에 너무 많은 시간을 소비 한 후에 동물의 상태가 좋지 않기 때문에 여기에 타이밍이 중요합니다. - 우레탄을 제거하고 15 분 동안 Hydra 배지에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 200 μL로 히드라 를 고정시킨다.
- 각 10 분 1X PBS로 샘플을 3 번 씻으십시오.
참고 : PBS와 PBSTx로 모든 세척은 500 μL의 용액으로 이루어집니다. - 15 분 동안 PBS에 0.5 % Triton X-100 500 μL로 침투.
- 0.5 % 트리톤 X - 100을 제거하고 차단 솔루션 500 μL를 추가합니다. 최소 1 시간 동안 시료를 차단하십시오.
- 항 - 티로신 - 튜 불린 항체를 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석한다.
주 : 이 농도는 de실험적으로 종료되었습니다. 컨트롤의 신호가 너무 약한 것으로 밝혀지면 농도를 높여야 할 수 있습니다. 비특이적 결합이있는 경우, 농도를 낮추어야 할 수도 있습니다. 항체의 사전 배양은 또한 비특이적 결합을 감소 시키는데 도움을 줄 수있다. - 샘플에서 차단 솔루션을 제거하고 신경이없는 히드라 , 치료되지 않은 컨트롤 및 보조없이 치료되지 않은 컨트롤에 기본 항체 200 μL를 추가하십시오. 1 차 처리가없는 미처리 대조군의 경우 항체가없는 200 μL의 차단 용액 만 첨가하십시오.
- 4 ° C에서 밤새 (> 12 시간) 샘플을 품어 낸다.
참고 : 또는 RT에서 5 ~ 6 시간 동안 배양하십시오. - 일차 항체를 제거하고 1x PBS (PBSTx)에서 0.3 % 트리톤 X - 100로 광범위하게 샘플을 씻으십시오.
참고 : 2 ~ 3 회 이상 재사용 할 수 있으므로 1 차 항체와 저장 물을 4 ° C에서 보관하십시오. - 염소 항 마우스 hP 2 차 항균 희석1 : 500의 블로킹 용액. 신경이없는 히드라 , 치료되지 않은 대조군 및 치료되지 않은 대조군에 200μL를 추가하십시오. 2 차 처리가없는 미처리 대조군의 경우 항체가없는 200 μL의 차단 용액 만 추가하십시오.
주 : 또는, 형광 이차 항체를 사용할 수 있으며, 4.13 - 4.17 단계가 필요하지 않습니다. 형광성 이차를 사용하면 시간이 절약되고 일반적으로 적절하지만 hP 보조는 민감도가 증가합니다. 이차 농도는 실험적으로 결정되었다. 대조군의 신호가 너무 약한 것으로 밝혀지면 농도를 증가시켜야 할 수도 있습니다. 비특이적 결합이있는 경우, 농도를 낮추어야 할 수도 있습니다. - 4 ° C에서 밤새 샘플을 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고 PBSTx로 광범위하게 샘플을 씻으십시오.
- 1x PBT에서 0.2 % 소 혈청 알부민 (체중 / 부피), 0.05 % Tween20을 준비하십시오. s를 품어 라.30 분 동안 1x PBT의 양.
- 1x PBT를 제거하고 어둠 속에서 15 분 동안 1x PBT에서 1 : 1,000 NHS- fluorescein과 1 : 10,000 H 2 O 2 에 시료를 품을 것. 이 단계에서 형광 신호가 빛에 노출 될 때 형광 신호가 감소하므로 샘플을 최대한 어둡게 유지하십시오.
주 : NHS- 플루 오레 신은 King, RS 및 Newmark, PA 20에 의한 상세한 FISH 프로토콜에 따라 제조되었다 - PBSTx로 3 번 빠르게 씻은 다음 30 분 동안 2 번 씻으십시오.
- 4 ° C에서 밤새 PBSTx에 샘플을 남겨두고 세척을 계속하십시오.
- 1x PBSTx로 몇 번 더 세척하십시오. 세포핵을 시각화하려면 4 ', 6-diamindino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI)를 사용하여 DNA 대조 염색을 위해 다음의 선택적 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 샘플을 이미징 할 수 있습니다.
- PBSTx에서 작업 농도 1 : 500으로 5mg / mL DAPI 스톡을 희석하고 각 튜브에 200 μL를 첨가합니다. 인큐샘플을 30 분 동안 말리십시오.
주의 : DAPI는 알려진 발암 물질입니다. PPE를 착용하십시오. - 형광 현미경으로 이미징하기 전에 DAPI를 제거하고 샘플을 PBSTx로 2 ~ 3 회 씻으십시오.
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Representative Results
초기 8 시간 콜히친 치료 직후 모든 히드라는 생존합니다. 이 히드라 중 일부는 촉수 스텁을 남기고 ( 그림 3A ), 나머지는 촉수를 완전히 잃을 것입니다 ( 그림 3B). 다음 1 또는 2 일 동안, 촉수는 모든 히드라 가 촉수를 잃을 때까지 계속 줄어들 것입니다. 치료 후 약 일주일 후 Hydra 는 촉수가 완전히 재생되기 전에 ( 그림 3 D ) 촉수와 같은 작은 스터브 ( 그림 3 C )와 함께 촉각 재성장의 징후를 보여줍니다. 원래 히드라 의 약 50-60 %는 결국 치료 후 1-2 주 사이에 촉수를 재생합니다.
다음에econd 치료의 경우, 동물의 회복은 첫 번째 치료 후와 유사합니다. 따라서 두 치료법에 들어간 동물의 원래 수의 약 10 %가 회복되어 실험에 적합한 크기로 성장합니다 ( 그림 1B ). 이 히드라 는 촉촉한 동물의 것보다 더 얇은 촉촉한 촉감을 보이며 더 투명한 조직을 가지고 있으며 삼투압을 완화하기 위해 입을 열 수 없기 때문에 부풀어 오른 것처럼 보일 것입니다 ( 그림 1A, 1B). 먹이를 먹지 않은 동물들은 몇 주 동안 생존 할 수 있지만, 동물은 크기가 줄어들어 먹기가 점점 어려워 질 것입니다.
두 번째 치료 후 회복되는 히드라 는 무한정 유지 될 수 있습니다. 이 동물들은 새싹을 쥘 수있어 인구를 유지하고 키울 수 있습니다. 또한 인구는 성장할 수 있습니다.이 동물들을 자르고 재생시키는 것을 허용합니다. 4 .
Immunohistochemistry는 두 번째 콜히친 치료 후 hypostome에서 뉴런의 손실을 확인합니다. hypostome에있는 조밀 한 신경 그물은 anti-tyrosine-tubulin 항체 13 , 16을 사용하여 시각화 할 수 있으며 입과 명백한 세포 체에서 바깥쪽으로 방사되는 별개의 섬유를 보여줍니다 ( 그림 4 A ). 이 섬유들은 콜히친으로 이중 처리함으로써 생성 된 신경이없는 히드라 에는 존재하지 않는다 ( 그림 4 B ). 또한, DAPI와의 공동 염색은 콜히친 치료 결과 간질 세포 계통의 세포 손실로 인해 치료되지 않은 대조군에 비해 신경이없는 히드라 에서 세포핵의 감소 된 수를 나타냅니다 ( 그림4A, 4B ).
그림 1 . 신경이없는 히드라 와 비 치료 된 히드라의 비교.
(A) 미처리 히드라 . (B) 두 번째 콜히친 치료 후 22 일 동안 신경이없는 히드라 . 신경이없는 동물의 부은 몸통과 얇은 촉수에주의하십시오. 스케일 바는 500μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 변형 된 히드라의 예.
(A) 두 히드라 (B) 이상한 모양의 히드라 . (C) 입을 열었을 때 수축 된 히드라 . 스케일 바는 400 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 처음 8 시간 콜히친 치료를받은 히드라의 대표 이미지.
(A) 치료 후 바로 촉수 촉수가있는 히드라 . (B) 치료 직후에 촉수를 완전히 잃은 히드라 . (C) 치료 후 8 일 동안 촉수를 다시 자라기 시작한 히드라 . (디)치료 후 13 일 동안 촉수를 완전히 다시 뻗은 히드라 . 스케일 바는 400 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . 면역 조직 화학 검사에 의해 최하부 신경 세포의 손실을 확인할 수 있습니다.
(A) (i) 항 티로신 - 튜 불린 항체 및 (ii) DAPI로 표기된, 제 2 콜히친 치료 후 약 2 주간의 치료되지 않은 히드라 의 최하부 및 (B) 신경없는 히드라의 최하부. (iii)은 오버레이를 보여줍니다. *는 입의 위치를 나타냅니다. 최대 z 돌기는 회전 디스크 공 촛점 형광 z 스택으로 만들어졌으며500ms (GFP) 및 15ms (DAPI)의 노출. 밝기와 대비를 조정하여 가시성을 향상 시켰습니다. 스케일 바는 20 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이드 라 간질 세포는 이중 콜히친 치료를 통해 제거 할 수 있습니다 3 , 4 . 첫 번째 치료를 한 다음날에는 히드라 조각이 변형 된 히드라와 융합되는 것을 피하기 위해 개별 히드라 간의 접촉을 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 두 번째 콜히친 치료는 그러한 동물에서 잔여 간질 세포를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으므로, 첫 번째 치료 후 보조없이 섭취 할 수있는 동물은 제거해야합니다. 두 번째 콜히친 치료 후 신경이없는 히드라 의 생존율을 극대화하려면 첫 번째 치료에서 회복 한 후 가능한 한 많은 Artemia 를 공급해야하며, 회복과 성장을 위해 1 ~ 2 일의 사료 공급이 필요합니다. 각 콜히친 치료는 세포가 배출 될 때 Hydra의 크기가 현저하게 줄어들 기 때문에 각 치료 전에 Hydra 가 커질수록 b히드라 가 먹이를주고 유지할 수있는 크기로 회복 될 수있는 기회를 놓치지 마라.
각 치료 후에 히드라 의 낮은 생존율 때문에, 많은 히드라 로 시작하는 것이 바람직 할 수 있습니다. 그러나 한 번에 너무 많은 히드라 치료를 시작할 때주의해야합니다. 이렇게하면 첫 번째 치료를 따르는 것이 어렵고 시간이 많이 걸릴 것입니다. 첫 번째 치료 후 잘 먹은 동물은 더 큰 크기로 회복되므로 두 번째 치료 후 더 높은 생존율을 보입니다. 따라서 적은 양으로 시작하여 더 나은 먹이에 집중하는 것이 더 생산적 일 수 있습니다. 일반적으로, 50-100 마리의 동물로 시작하는 것은 1 ~ 2 명이 관리 할 수 있습니다. 가능한 가장 큰 히드라 로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 두 가지 치료법에서 더 잘 살아남을 수 있습니다.
여기에 설명 된 신경 세포가 부족한 히드라 를 강제로 먹이기와 burping하는 방법은 더 안전하고 간단하며 시간이 더 오래갑니다.이전 3 , 4 , 14 에서 설명한 방법보다 효율적입니다. 상업적으로 사용 가능한 포셉과 주사기를 사용하면 손으로 잡아 당긴 마이크로 피펫 팁을 사용할 필요가 없어지며 시간이 많이 소요되고 제작하기가 어렵습니다. 이 도구를 사용하면 입 피펫이 필요하지 않습니다. 겸자를 사용하는 강제 공급은 처음에는 어려울 수 있지만 충분한 시간과 실습을 받으면 매우 쉽고 효율적입니다. 먼저 도구를 사용하는 데 필요한 힘과 Hydra 를 조작하는 방법에 대한 느낌을 얻기 위해 먼저 힘을 공급하고 정상적인 Hydra 를 트림하도록 연습해야합니다. 다양한 포셉과 바늘 크기가 힘 공급과 burping을위한 최적의 도구를 찾기 위해 테스트되었습니다.
여기에 설명 된 항체 염색의 사용은 hypostome에서 신경 세포의 부재를 확인하기에 충분합니다. 모든 간질 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 동물들은존재하는 세포의 유형을 검사 할 수 있습니다 15 .
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 신경이없는 동물을 생성하고 유지하기위한 원래의 프로토콜에 대해 토론하기 위해 Dr. Dick Campbell (UC Irvine)에게 감사하고, 주사기와 바늘 기술을 적용하는 데 도움을 준 Rui Wang과 Danielle Hagstrom 및 Dr. Rob Steele (UC Irvine)에게 원고에 대한 의견을 말했습니다. 이 연구는 RCSA 및 NSF 보조금 CMMI-1463572에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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