Summary
Genom en dubbelbehandling med kolchicin kan ett växtbaserat toxin som dödar delningsceller generera nervfri Hydra vulgaris . Dessa Hydra kan inte mata eller äta på egen hand. I detta dokument beskrivs en förbättrad metod för långsiktigt underhåll av nervfria Hydra vulgaris i laboratoriet.
Abstract
Den interstitiella cellstammen av Hydra innefattar multipotenta stamceller och deras derivat: körtelceller, nematocyter, bakterieceller och nervceller. De interstitiella cellerna kan elimineras genom två konsekutiva behandlingar med kolchicin, ett växt-härledt toxin som dödar delningsceller och därmed raderar potentialen för förnyelse av de differentierade celler som härleds från de interstitiella stamcellerna. Detta möjliggör genereringen av Hydra som saknar nervceller. En nervfri polyp kan inte öppna munnen för att mata, egestera eller reglera osmotiskt tryck. Sådana djur kan emellertid överleva och odlas obestämt i laboratoriet om de regelbundet tvingas matas och burpas. Bristen på nervceller möjliggör studier av nervsystemets roll vid reglering av djurbeteende och regenerering. Tidigare publicerade protokoll för nervfri Hydra- underhåll involverar föråldrade tekniker såsom munpipettering med handdriven mikropipett tIps att mata och rengöra Hydra . Här införs ett förbättrat protokoll för underhåll av nervfritt hydra . Finkopplade tångar används för att tvinga öppna munnen och sätta in nydödad Artemia . Efter kraftmatning spolas kroppens kavitet med färskt medium genom att använda en spruta och injektionsnål för att avlägsna osmält material, här refererad till som "burping". Denna nya metod för kraftmatning och burping nervfri Hydra genom användning av tång och sprutor eliminerar behovet av munpipettering med handdriven mikropipettips. Det gör processen så säkrare och betydligt mer tidseffektiv. För att säkerställa att nervcellerna i hypostomen har eliminerats genomförs immunohistokemi med anti-tyrosin-tubulin.
Introduction
Hydra nervsystemet består av ett nervnät med neuroner associerade med båda epitelvävnadsskikten 1 . Narnätet är tätare i hypostomen och pedunellen och mindre tät i kroppsspalten 2 . Nervcellerna härrör från interstitiella stamceller, vilka är multipotenta stamceller som ger upphov till sekretoriska celler, nematocyter, bakterieceller och neuroner 1 . Det är möjligt att eliminera de interstitiella cellerna av Hydra vulgaris genom behandling med colchicin 3 , 4 , ett växt-härledt toxin som dödar delande celler. Fastän kolchicin har visat sig hämma mikrotubulumpolymerisation i andra organismer har en tidigare studie visat att mikrotubuli är närvarande i Hydra under hela behandlingen, vilket tyder på att kolchicin inte verkar på detta sätt i Hydra 3 . En annan stUdy föreslår att colchicin inte binder effektivt till tubulin i vissa organismer, inklusive Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas och Schizosaccharomyces pombe, vilket kan förklara denna skillnad 5 . Kolchicinbehandlingen inducerar fagocytos av interstitiella celler av endodermala epitelcellerna 3 och möjliggör därigenom skapandet av djur som saknar nervceller, körtelceller och nematocyter. Det är oklart varför de interstitiella cellerna är särskilt mottagliga för kolchicinbehandling. Med tanke på att både postmittotiska interstitiella celler och den interstitiella stamcellerna är skadade och fagocytoserade, konstaterade Campbell att colchicin inte direkt påverkar mitotisk aktivitet 3 . Speciellt fungerar kolchicinbehandlingen väl i Hydra vulgaris, men har visat sig inte fungera lika bra för andra arter, såsom Hydra oligactis 6 . Hydra viridis 7 . Nervfri Hydra (även ibland kallad epithelial Hydra 8 ) är därför ett användbart verktyg för att studera rollerna hos dessa specialiserade celltyper från den interstitiella cellstammen i vävnadshomeostas och regenerering.
Hydra kan vara det enda kända exemplet på ett djur som kan leva utan ett nervsystem. Nervfri Hydra fungerar som en särskilt användbar modell för att dissekera nervnätets roll vid reglering av hydra regenerering, homeostas och beteende. Till exempel tillåts införandet av interstitiella celler i nervfri Hydra via ympning för karakterisering av nervcellsdifferentiering som högregionsspecifik 9 . Dessutom, eftersom nervfri Hydra kan regenerera, deMöjliggöra undersökning av alternativa, nervsystemet oberoende regenereringsvägar. Ett sådant exempel är apisk neurogenes och huvudbildning, som har visat sig bero på cnox-2- funktionen i nervsystemet i vildtypshydra, men verkar vara dispenserbar i nervfri Hydra , vilket tyder på att det kan finnas en alternativ huvudregenereringsprocess 10 .
Nervfri hydra har också använts för att studera epitelcelleruttryck och reglering av neurogena och neurotransmissionsgener efter förlusten av neurogenes 11 . Nervfri Hydra uppvisar inte spontana sammandragningsskurar 12 , vilket indikerar att dessa utbrott regleras av nervsystemet. Nervfri Hydra kontraherar emellertid som svar på att klämma i kroppskolonnen med tångar, vilket tyder på att sammandragning som svar på mekaniska stimuli medieras genom koppling throuGh mellanrum i epithelceller, medan spontant kontraktil beteende medieras genom koppling genom gapskikt i nervceller 13 .
Nervfri Hydra öppnar inte sina mun när de presenteras med mat eller reducerad glutation 3 , vilket tyder på att sensoriska neuroner är nödvändiga för att detektera närvaron av mat och signera munnen att öppna. Dessutom verkar nervnätet spela en roll vid avkänning av osmotiskt tryck, eftersom nervfria djur inte kan autonomt reglera sitt interna hydrostatiska tryck genom munöppning, vilket orsakar deras karakteristiska ballongliknande utseende 3 , 4 ( Figur 1B ). Reglering av hydrostatiskt tryck i nervfri Hydra genom frekvent manuell deflation ledde till förlust av någon abnorm morfologi i hypostom och kropps-kolonn. Men kronisk deflation ledde till störning av tillväxten, elOhation, spirande och vävnadsorganisation 8 .
Trots att nervfri Hydra inte kan mata och äta på egen hand, är det möjligt att behålla dem i obestämd tid i laboratoriet genom att manuellt mata och bursta varje djur. Tidigare publikationer har beskrivit metoder för kraftmatande och burpande nervfria Hydra , men dessa protokoll involverade användningen av mikropipettips som måste handdras försiktigt till lämplig storlek samt användning av ett munstycke anslutet till pipetten via rör 14 . Här beskrivs en enklare, säkrare och mer tidseffektiv metod för utfodring och burping.
Vidare involverade tidigare studier att man undersökte frånvaron av nervceller genom dissociering av fasta djur i enskilda celler och undersökning av cellmorfologi 3 , 4 , 15 . HEre, immunohistokemi med en monoklonal antikropp mot den tyrosinerade karboxylterminalen av alfa-tubulin användes som en komprimerad metod för macerering för att kontrollera uttömningen av neuroner i hypostomen 13 , 16 . Tidigare studier har visat att neuroner i peduncle kan också visualiseras med hjälp av denna antikropp 13 , men dessa neuroner samt de som finns i kroppskolonnen är svårare att ta fram. Medan immunhistokemi är tillräcklig för att bekräfta frånvaron av nervceller i hypostomen och inte kräver expertis om celltypmorfologi kan den inte användas för att kontrollera om frånvaron av de interstitiella stamcellerna och de andra derivaten av dessa celler föreligger. Dissociations- och cellmorfologiprover är strängare och kan ge ett kvantitativt redogörande för antalet kvarvarande celltyper efter varje behandlingsstadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dubbel kolchicinbehandling
- Gör en 0,4% kolchicin (vikt / volym) lösning i Hydra medium 3 , 4 , 17 .
Varning: Colchicin är akut giftigt, dödlig vid förtäring, kan orsaka genetiska defekter och kan orsaka ögonskador. Hantera pulvret i en spishäll och ha full personlig skyddsutrustning (PPE). - Incubate Hydra vulgaris (AEP-stammen användes här) som har svält i 24 timmar i 0,4% kolchicin i ett förhållande av 5 Hydra per ml kolchicinlösning i en petriskål under 8 timmar vid rumstemperatur i mörkret.
Obs! 5 Hydra / mL colchicine är en riktlinje för att bestämma hur mycket lösning som ska användas för att undvika överbeläggning av skålen med Hydra . Använd samma volym av lösningen för efterföljande rengöring och lösningsändringar. - Ta bort kolchicinlösningen och byt utMed rent hydra- medium utan kolchicin. Tvätta Hydra 5 gånger genom seriell överföring med en glaspasteurpipett i ren Hydra- medium före överföring till 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium. Håll Hydra i en 18 ° C inkubator.
Obs! Tillräckligt 1,000X rifampicinlager (50 mg / ml) i dimetylsulfoxid (DMSO) i 1-2 veckors behandling kan förvaras vid 4 ° C. Den exakta mängden kan bestämmas av den totala volymen av lösning som används varje dag. Om till exempel, om det finns 2 diskar, var och en innehåller 10 ml lösning som behöver bytas två gånger dagligen, kommer totalt 40 ml lösning att användas på en dag, vilket motsvarar 40 μl 1000 x stam per dag eller 560 μl Över en tvåveckorsperiod. Beståndet späds sedan 1: 1000 i Hydra- medium vid användning.
Varning: DMSO är en brännbar vätska och tränger lätt in i huden, vilket tillåter andra upplösta kemikalier i kroppen. HandLe lösningsmedlet i en spishäll och ha full PPE. OBS: DMSO fryser vid 4 ° C - Byt det rifampicinhaltiga Hydra- mediet två gånger dagligen tills Hydra slutar utvisa celler i mediet, vilket i allmänhet är 1 vecka efter behandling. Vid denna tidpunkt kan mediet ändras en gång per dag. Under dagarna efter behandlingen kommer Hydra helt att förlora sina tentaklar. Undvik att Hydra kommer i kontakt med varandra, eftersom de kan smälta ihop och resultera i udda Hydra ( Figur 2 A ).
- För att förhindra kontakt, undvik att vrida maträtten i en cirkelrörelse. Istället agitera skålen försiktigt i vertikala och horisontella riktningar tills Hydra är utspridda. Inspektera skålen när Hydra sätts in i inkubatorns 18 ° C och justera vid behov.
Obs! För de dagar då mediet ändras två gånger, byt medietEn gång på morgonen och igen på eftermiddagen / kvällen.
- För att förhindra kontakt, undvik att vrida maträtten i en cirkelrörelse. Istället agitera skålen försiktigt i vertikala och horisontella riktningar tills Hydra är utspridda. Inspektera skålen när Hydra sätts in i inkubatorns 18 ° C och justera vid behov.
- När tentaklarna börjar bilda, börja kraftmatning och borra Hydra 3 till 4 gånger i veckan (se avsnitt 2 och 3). Om 8-9 dagar efter kolchicinbehandling kommer Hydra att börja växa sina tentaklar tillbaka.
Obs! Tentacleåterväxt varierar mellan individer. Vissa kan ta längre tid än 8 - 9 dagar innan de visar tecken på tentakselväxt. De som inte återfår sina tentaklar såväl som konstigt formade ( Figur 2 B ) djur eller djur som är för små för att matas bör avlägsnas. Dessa Hydra kommer sannolikt inte att överleva den andra behandlingen. Hydra kan också buda. Men några av knopparna kan fortfarande ha interstitiella celler och kunna äta på egen hand.- Ta bort alla knoppar som kan äta utan hjälp och lossna från förälderdjuret. Identifiera dessa djur genom att lägga till levande Artemia tillMatar maträtt och observerar huruvida djuren fångar och äter artemiaen själv eller inte. 1 eller 2 Hydra kan också äta på egen hand. Dessa bör också kasseras.
Obs! Nervfri Hydra har en karaktäristisk ballongliknande morfologi och tentaklar som är kortare och tunnare än normalt (på grund av förlust av nematocyter) och kan därför enkelt särskiljas från vanliga djur ( Figur 1 A, 1B ).
- Ta bort alla knoppar som kan äta utan hjälp och lossna från förälderdjuret. Identifiera dessa djur genom att lägga till levande Artemia tillMatar maträtt och observerar huruvida djuren fångar och äter artemiaen själv eller inte. 1 eller 2 Hydra kan också äta på egen hand. Dessa bör också kasseras.
- Tre veckor efter den första kolchicinbehandlingen, upprepa kolchicinbehandlingen (steg 1.1 - 1.5). En andra kolchicinbehandling är nödvändig för att eliminera de återstående interstitiella cellerna och nervcellerna 3 .
2. Force-Feeding
- Lägg till Artemia- cyster i en smal och lång glasbehållare som hinner i botten. Fyll behållaren med Artemia vatten (6,72 M NaCl). Undvik överstigaUtbyte 1 g cystor per 1 liter vatten för ett högre luktutbyte.
- Täck överkanten av behållaren med parafilm och sätt in en 10 ml serologisk pipett genom parafilmen i behållaren. Förse luftning genom att fästa röret på en akvariumluftpump och montera röret runt pipetten. Se till att pipettens spets når botten av behållaren och att inga cyster ligger i botten. Artemia kommer att kläcka efter 48 timmar.
Obs! Det finns många olika sätt att kläcka Artemia som kan fungera lika bra.
- Täck överkanten av behållaren med parafilm och sätt in en 10 ml serologisk pipett genom parafilmen i behållaren. Förse luftning genom att fästa röret på en akvariumluftpump och montera röret runt pipetten. Se till att pipettens spets når botten av behållaren och att inga cyster ligger i botten. Artemia kommer att kläcka efter 48 timmar.
- Stryk Artemia från Artemia- vattnet i ett Artemia- nät (tillgängligt från akvarieföretag) och tvätta dem i ca 20 s i DI-vatten innan de placeras i en maträtt med Hydra- medium. Salthalten av Artemia- vatten är för hög för Hydra , så Artemia måste tvättas innan de används.
- Under ett dissekeringsmikroskop,Euthanize artemia genom att lätt klämma dem med ett par fina pincett. Undvik att klämma tillräckligt hårt för att utvisa tarmarna, eftersom det kommer att hålla fast vid tången och göra det svårt att mata. Att klämma lätt på Artemia innan det matas till Hydra hjälper till med matsmältningen 14 . Placera den nyligen dödade Artemia nära Hydra i disken för att underlätta snabb utfodring.
Obs! Alla efterföljande steg görs under ett dissekeringsmikroskop. - Använd ett par tångar för att hålla Hydra vid pedunen. Fortsätt hålla peduncle under processen att mata Hydra . Använd ett andra par tångar, knippa kroppskolonnen för att göra Hydra- kontraktet.
- Medan du håller spetsarna på det andra paret tångar, knackar du på mitt i hypostomen (den kuperade strukturen vid djurets mun ände). Detta orsakar ibland munen att öppna. jagF munnen öppnas inte genom att knacka, punktera munnen genom att sätta i tången i mitten av hypostomen och sedan lätta trycket på spetsen på tången. Detta bör sträcka ut munöppningen gjord av punkteringen.
Obs! Hydra kan deflata och kollapsa när munnen öppnas ( Figur 2 C ). Om detta inträffar kan Artemia fortfarande införas i Hydra . Om det är för svårt att göra det, gå vidare till nästa Hydra och återvänd till den ursprungliga Hydra någon gång senare och försök igen. Hydra tenderar inte att deflata lika mycket under efterföljande munöppningar. - Hämta snabbt Artemia med tången och sätt in dem i Hydras magehålighet. Sätt in så många Artemia som möjligt tills magsäcken är full och mer Artemia kan inte sättas in utan att skada Hydra , olyckaAllierade dra ut någon artemia inuti, eller förhindra att munen stängs. I genomsnitt är detta 5 - 6 Artemia , men upp till 12 har matats till de större djuren.
- Om munnen börjar stänga, sträcka den igen med tången som beskrivits ovan; Men försiktighet bör tas eftersom någon artemia som redan finns inom djuret kan börja komma ut när munnen återupptas.
- Om Hydra är för liten för en hel Artemia , skär Artemia med en skalpell och mata Hydra mindre bitar. Om Artemia inte stannar inne i Hydra kan det vara nödvändigt att trycka på tången mot Artemia för att hålla den inne i Hydra tills dess mun stängs.
- Överför matad Hydra med ett glas Pasteur pipette, försiktigt för att undvika oavsiktlig burping, till en maträtt med färsk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium. Om en Artemia utvisades fRom Hydra under överföring, sätt in den igen i den nya maträtten.
Obs! En glaspipett används för att överföra Hydra , eftersom det har visat sig att Hydra håller sig mindre i glas än plast. Längden på pipetten spelar ingen roll, men med 5 tums pipetter kan det vara lite enklare.
3. Burping
- Burpa Hydra för att avlägsna osmält material helst mellan 8 och 20 timmar efter matning.
- Sanda ner på en 30G-nål med P320 eller liknande slippapper tills spetsen är platt.
Obs! En 27G hypodermisk nål skulle också fungera, men den mindre spetsen på den högre mätaren är att föredra. - Fäst nålen i en 1 ml plastspruta och fyll in sprutan med färsk 50 μg / ml rifampicin i Hydra- medium.
Obs! Burpning av en enda Hydra tar ca 0,05 ml till 0,1 ml lösning. En 1 ml syriNge är att föredra eftersom kontroll av kraften och volymen av lösningen som kommer ut är svårare med en större volymspruta. - Under ett dissekeringsmikroskop håller du Hydraens peduncle med fina punktpincetter och knackar i mitten av hypostomen med nålen. Om munnen inte öppnar, sätt in tångar i hypostomen och öppna munnen som beskrivet ovan för utfodring.
Obs! Alla efterföljande steg görs under ett dissekeringsmikroskop. - Använd sprutan för att spola, mycket försiktigt för att undvika att blåsa hela djuret, magshålan med 50 μg / ml rifampicinlösningen tills allt skräp har utvisats. Nålen behöver inte nödvändigtvis sättas in i Hydra om storleken på Hydra inte tillåter. Nålen kan hållas nära munnen och peka direkt mot munnen.
- Använd en glaspasteurpipett, överför burpad Hydra till en maträtt med färsk 5081; g / ml rifampicin i Hydra- medium.
4. Kvalitetskontroll via immunohistokemi
OBS: Följande protokoll är anpassat från protokoll av Shenk, M. A, et al. 18 , och Böttger, A 19 . Alla steg sker vid rumstemperatur (RT) om inget annat anges. En mutter kan användas för inkubationsstegen och kan förbättra färgkvaliteten. Men om Hydra blir förvirrad med varandra kan alla steg också utföras utan.
- Förbered blockeringslösningen: 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% DMSO i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Förvara denna lösning vid 4 ° C tills användningen (steg 4.6 och 4.11). Lösningen kan lagras i 1 - 2 dagar.
Obs! Alla lösningar som används i detta protokoll måste samlas på rätt sätt som farligt avfall. - Koppla av Hydra i 200 μL 2% uretan i Hydra mEdium i 1 min i 1,7 ml mikrocentrifugrör. Använd 5 Hydra per rör för var och en av de 4 tillstånden: nervfri, obehandlad, obehandlad utan primär antikropp och obehandlad utan någon sekundär antikropp.
Obs: Överstiga inte 1 min. Tidpunkten här är kritisk eftersom djur kommer att vara i dålig form efter att ha spenderat för mycket tid i uretan. - Ta bort uretan och fixera Hydra i 200 μl 4% paraformaldehyd (PFA) i Hydra- medium i 15 minuter.
- Tvätta proverna 3 gånger med 1x PBS i 10 minuter vardera.
Obs! Alla tvättar med PBS och PBSTx görs med 500 μl lösning. - Permeabilisera med 500 | il 0,5% Triton X-100 i PBS under 15 min.
- Ta bort 0,5% Triton X-100 och tillsätt 500 μL av blockeringslösningen. Blockera provet i minst 1 h.
- Späd anti-tyrosin-tubulin-antikroppen 1: 200 i blockerande lösning.
Obs: Denna koncentration var deAvslutas experimentellt. Om signalen i kontrollerna visar sig vara för svag kan koncentrationen behöva ökas. Om det inte finns någon specifik bindning, kan koncentrationen behöva minskas. Förinkubering av antikroppen kan också bidra till att minska icke-specifik bindning. - Ta bort blockeringslösningen från proverna och tillsätt 200 μl av den primära antikroppen mot de nervfria Hydra , obehandlade kontrollerna och obehandlade kontroller utan sekundär. För de obehandlade kontrollerna utan primär, tillsätt endast 200 μL blockerande lösning utan antikroppen.
- Inkubera proven över natten (> 12 h) vid 4 ° C.
Obs: Alternativt inkubera 5-6 h vid RT. - Ta bort den primära antikroppen och tvätta proven i stor utsträckning med 0,3% Triton X-100 i 1x PBS (PBSTx).
Obs! Spara den primära antikroppen och förvara vid 4 ° C, eftersom den kan återanvändas minst 2-3 gånger. - Förtunna get anti-mouse hP sekundär antibOdy 1: 500 i blockeringslösning. Tillsätt 200 μL till nervfria Hydra , obehandlade kontroller och obehandlade kontroller utan primärt. För de obehandlade kontrollerna utan sekundär tillsätt bara 200 μL blockerande lösning utan antikroppen.
Anm: Alternativt kan en fluorescerande sekundär antikropp användas, för vilken steg 4,13 - 4,17 inte behövs. Användning av fluorescerande sekundär sparar tid och är generellt tillräcklig, men hP-sekundären ger ökad känslighet. Koncentrationen av sekundär bestämdes experimentellt. Om signalerna i kontrollerna visar sig vara för svaga kan koncentrationen behöva ökas. Om det inte finns någon specifik bindning, kan koncentrationen behöva minskas. - Inkubera proven över natten vid 4 ° C.
- Ta bort den sekundära antikroppen och tvätta proverna i stor utsträckning med PBSTx.
- Förbered 1x PBT: 0,2% bovint serumalbumin (vikt / volym) och 0,05% Tween20 i 1x PBS. Inkubera sAmplar i 1x PBT i 30 min.
- Ta bort 1x PBT och inkubera proverna i 1: 1000 NHS-fluorescein och 1: 10.000 H2O2 i 1x PBT under 15 minuter i mörkret. Från det här steget, behåll proverna i mörkret så mycket som möjligt, eftersom den fluorescerande signalen minskar när de utsätts för ljus.
Anm .: NHS-fluorescein framställdes efter ett detaljerat FISH-protokoll av King, RS och Newmark, PA 20 - Tvätta proverna 3 gånger med PBSTx snabbt, sedan 2 gånger i 30 minuter.
- Lämna proven i PBSTx över natten vid 4 ° C för att fortsätta tvätta.
- Tvätta några mer med 1x PBSTx. För att visualisera cellkärnor, utför följande valfria steg för DNA-motfärgning med användning av 4 ', 6-diamindino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI). Annars kan proverna avbildas nu.
- Späd 5 mg / ml DAPI-lager till en arbetskoncentration av 1: 500 i PBSTx och tillsätt 200 μl till varje rör. IncuBata proverna i 30 min.
Varning: DAPI är ett känt cancerframkallande ämne. Använd full PPE. - Ta bort DAPI och tvätta proverna 2 - 3 gånger med PBSTx före bildbehandling med fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omedelbart efter den första 8 timmars colchicinbehandling, överlever alla Hydra . Några av dessa Hydra kommer bara att ha kvar tentacle stubbar ( Figur 3 A ), medan andra helt har förlorat sina tentaklar ( Figur 3 B ). Under de följande 1 eller 2 dagarna fortsätter tentaklarna att krympa tills alla Hydra har tappat sina tentaklar. Omkring en vecka efter behandlingen kommer Hydra att visa tecken på tentaklens återväxt, med små stubben som tentaklar ( Figur 3 C ) innan de fullständigt regenererar sina tentaklar ( Figur 3 D ). Av den ursprungliga Hydra regenererar cirka 50-60% sina tentaklar i mellan 1-2 veckor efter behandlingen.
Efter sEcond behandling, återhämtningen av djuren liknar den efter den första behandlingen. Således återhämtar sig omkring 10% av det ursprungliga antalet djur som gick in i båda behandlingarna och växte till en storlek som var lämplig för experiment ( Figur 1 B ). Dessa Hydra har tentaklar som verkar tunnare än de obehandlade djuren, har vävnad som är mer genomskinlig och kommer att uppstå uppblåst på grund av oförmågan att öppna munnen för att lindra osmotiskt tryck ( Figur 1 A , 1 B). Eventuella djur som inte matas kan överleva i några veckor, men ofrivilliga djur kommer att krympa i storlek och bli allt svårare att mata.
Hydra som återhämtar sig efter den andra behandlingen kan bibehållas obestämt. Dessa djur kan knoppa och därigenom upprätthålla och växa befolkningen. Dessutom kan befolkningen odlasGenom att skära dessa djur och låta dem regenerera 4 .
Immunohistokemi bekräftar förlusten av neuroner i hypostomen efter den andra kolchicinbehandlingen. Det täta nervnätet i hypostomen kan visualiseras med användning av en anti-tyrosin-tubulin-antikropp 13 , 16 och visar separata fibrer som strålar utåt från munnen och uppenbara cellkroppar ( Figur 4 A ). Dessa fibrer är frånvarande i nervfri Hydra som har framställts genom dubbelbehandling med kolchicin ( Figur 4 B ). Vidare avslöjar samfarvning med DAPI ett minskat antal cellkärnor i det nervfria hydraet jämfört med de obehandlade kontrollerna på grund av förlusten av celler i den interstitiella cellstammen som ett resultat av kolchicinbehandlingarna ( Figur4A , 4B ).
Figur 1 . Jämförelse av nervfri och obehandlad hydra .
(A) Obehandlad Hydra . (B) nervfri hydra 22 dagar efter den andra kolchicinbehandlingen. Notera den svullna kroppsskivan och de tunna tentaclesna i det nervfria djuret. Skalstänger är 500 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 . Exempel på deformerad hydra .
(A) Två Hydra (B) En konstigt formad Hydra . (C) En Hydra som har deflaterat efter att munningen har öppnats. Skalstänger är 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 . Representativa bilder av Hydra Efter den första 8 timmars kolchicinbehandling.
(A) A Hydra med stubby tentacles omedelbart efter behandling. (B) En Hydra som helt har förlorat sin tentakel direkt efter behandlingen. (C) En Hydra som börjar återfalla sin tentakel 8 dagar efter behandlingen. (D)En Hydra som har helt omkastat sina tentaklar 13 dagar efter behandlingen. Skalstänger är 400 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 . Förlust av nervceller i hypostomen kan bekräftas av immunohistokemi.
(A) Hypostomen hos ett obehandlat hydra och (B) hypostom av en nervfri hydra ca 2 veckor efter den andra kolchicinbehandlingen, märkt med (i) anti-tyrosin-tubulinantikropp och (ii) DAPI. (Iii) visar överlagringen. * Indikerar platsen för munnen. Maximal z-projiceringar gjordes från spin-disks konfokal fluorescens z staplar tagna med eXposures av 500 ms (GFP) och 15 ms (DAPI). Ljusstyrka och kontrast justerades för att förbättra synligheten. Skalstängerna är 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hydra interstitiella celler kan elimineras genom dubbel kolchicinbehandling 3 , 4 . I dagarna efter den första behandlingen är det avgörande för att förhindra kontakt mellan enskilda Hydra för att undvika fusion av Hydra- delar i deformerade Hydra . Även djur som kan äta oassisterade efter den första behandlingen måste avlägsnas, eftersom den andra kolchicinbehandlingen kanske inte är tillräcklig för att eliminera de återstående interstitiella cellerna från sådana djur. För att maximera överlevnaden för nervfritt Hydra efter den andra kolchicinbehandlingen, ska djuren matas så många Artemia som möjligt efter återhämtning från den första behandlingen, med 1-2 dagar mellan matningen för att återhämta sig och växa. Varje kolchicinbehandling medför att hydraen minskar signifikant i storlek då cellerna är upptagna, så ju större Hydra är före varje behandling, bEfter chanserna att Hydra kommer att återhämta sig till en storlek som kan matas och underhållas.
På grund av den låga överlevnadsgraden för Hydra efter varje behandling kan det vara önskvärt att börja med många Hydra . Dock måste försiktighet åtgärdas vid behandling av för många Hydra på en gång. Detta kommer att göra matning efter den första behandlingen svår och extremt tidskrävande. Djur som matas väl efter den första behandlingen återhämtar sig till större storlekar och har därför en högre överlevnad efter den andra behandlingen. Således kan det vara mer produktivt att börja med färre och fokusera på att mata bättre. Generellt är start med 50-100 djur hanterbara för 1-2 personer. Det är också bäst att börja med den största Hydra som är möjligt, eftersom de bättre överlever de två behandlingarna.
Metoden för kraftmatning och burping Hydra som saknar nervceller beskrivna här är säkrare, enklare och mer tid-effektiva än metoder som beskrivits i tidigare 3 , 4 , 14 . Användningen av kommersiellt tillgängliga tångar och sprutor eliminerar behovet av handdriven mikropipetttips, vilka är tidskrävande och svåra att göra. Användningen av dessa verktyg undviker också behovet av munpipett. Kraftmatning med tång kan vara svårt först, men med tanke på tid och övning blir det ganska enkelt och effektivt. Man bör först träna kraftmatning och burping normal Hydra för att få en känsla för hur mycket kraft att använda med verktygen och hur man ska manipulera Hydra . Olika tångar och nålstorlekar testades för att hitta de optimala verktygen för kraftmatning och burping.
Användningen av antikroppsfärgning som beskrivs här är endast tillräcklig för att kontrollera för frånvaron av nervceller i hypostomen. För att säkerställa att alla interstitiella celler har eliminerats kan djur macereras ochDe närvarande cellerna kan undersökas 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar doktor Dick Campbell (UC Irvine) för diskussioner om det ursprungliga protokollet för att generera och bibehålla nervfria djur, Ms Rui Wang för hjälp med att anpassa sprut- och nåltekniken, och Danielle Hagstrom och Dr. Rob Steele (UC Irvine) för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av RCSA och NSF-beviljandet CMMI-1463572.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X - 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 mL Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , Plenum Press. New York. 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
