Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Att upprätthålla Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia släpps in i naturliga populationer att dämpa överföringen av arboviruses. Vi beskriva metoder till bakre Ae. aegypti med Wolbachia infektioner i laboratorium för experiment och fältet release, vidta försiktighetsåtgärder för att minimera laboratorium anpassning och urval.

Abstract

Aedes aegypti myggor experimentellt infekterade med Wolbachia utnyttjas i program för att kontrollera spridningen av arboviruses såsom Zika, denguefeber och chikungunya. Wolbachia-infekterade myggor kan släppas ut i fältet antingen minska befolkningen storlekar genom oförenliga parningar eller att omvandla populationer med myggor som är refraktära mot virus överföring. För dessa strategier för att lyckas, måste myggen släpps ut i fältet från laboratoriet vara konkurrenskraftiga med infödda myggor. Dock kan att upprätthålla myggor i laboratoriet resultera i inavel, genetisk drift och laboratorium anpassning som kan minska deras lämplighet i fältet och kan blanda ihop resultaten av experiment. För att testa lämpligheten av olika Wolbachia infektioner för distribution i fältet, är det nödvändigt att bibehålla myggor i kontrollerad laboratoriemiljö över flera generationer. Vi beskriver ett enkelt protokoll för att upprätthålla Ae. aegypti myggor i laboratoriet, som är lämplig för både Wolbachia-infekterade och vildtyp myggor. Metoderna minimera laboratorium anpassning och genomföra korsningar för att öka relevansen av experiment fältet mygg. Dessutom bibehålls kolonier under optimala förhållanden att maximera deras lämplighet för öppna fältet utgåvor.

Introduction

Aedes aegypti myggor är ansvarig för att överföra några av de viktigaste arboviruses i världen, inklusive Zika, denguefeber och chikungunya1. Dessa virus blir ett allt större hot mot global hälsa eftersom de omfattande distributionen av Ae. aegypti i tropikerna fortsätter att expandera2,3,4. Kvinnliga Ae. aegypti livnär prioriterat sig på människoblod5 och därmed tenderar att leva i nära närhet till människor, särskilt i stadsområden där populationer är mest tät. Genom detta nära samarbete med människor har de också anpassade för att häcka i konstgjorda livsmiljöer, inklusive däck, krukor, rännor och vatten tankar6,7. AE. aegypti också lätt anpassa sig till laboratoriemiljöer där de kan upprätthållas utan särskilda krav efter samlas in direkt från fältet, till skillnad från vissa andra arter i Aedes släkte8, 9,10. Deras enkelt underhåll har sett dem studerade allmänt i laboratorium i ett brett spektrum av områden, i slutändan syftar till att kontrollera sjukdomar myggor kan överföra.

Traditionellt har beroende arboviral kontroll starkt av användning av insekticider att minska mosquito populationer. Dock finns det ökande intresse för metoder där modifierade myggor är uppfödda i laboratoriet och sedan släpps ut i naturliga populationer. Släppta myggor kan modifieras genetiskt11,12,13, biologiskt14,15, genom bestrålning16, kemisk behandling17,18, eller med kombinerade tekniker19 för att undertrycka populationer av myggor eller ersätta dem med myggor som är refraktära mot arboviral överföring20.

Wolbachia är bakterier som används för närvarande som en biologisk kontroll agent för arboviruses. Flera stammar av Wolbachia infördes nyligen i Ae. aegypti experimentellt med hjälp av embryonala Mikroskop21,22,23,24. Dessa stammar minska kapaciteten för arboviruses att sprida och replikera i mygga, minskar deras överföring potentiella23,25,26,27,28 . Wolbachia infektioner överförs från mor till avkomman, men vissa stammar inducera sterilitet när infekterade hanar parar sig med icke-infekterade kvinnor22. Wolbachia-infekterade män kan därför släppas i stora mängder för att undertrycka naturliga mygga populationer, som nyligen visat i andra Aedes arter15,29. Dock eftersom Wolbachia också hämma arboviral överföring i Ae. aegypti, kan myggor också frigöras för att ersätta inhemska bestånd med fattigare vektorer. Ae. aegypti experimentellt infekterade med Wolbachia släpps nu i fältet i flera länder använder denna senare metoden14,30,31.

Wolbachia-baserade strategier för arboviral kontroll är beroende av en god förståelse av samspelet mellan Wolbachia, mygga och miljö. Wolbachia förekommer naturligt i en rad insekter och de stammar som införs i myggor är olika i deras effekter32. Eftersom nya Wolbachia infektion typer förs in Ae. aegypti24, är det nödvändigt att karakterisera varje stam för sina effekter på mosquito fitness, reproduktion och arboviral störningar under en rad villkor. Rigorösa experiment i laboratoriet är därför nödvändigt att utvärdera potentialen för Wolbachia stammar att lyckas i fältet.

Öppna fältet utgåvor av Ae. aegypti med Wolbachia infektioner kan ofta kräva tusentals till tiotusentals myggor per utgåva zon vara uppfödda varje vecka14,30,31. Framgången för första utgåvor kan förbättras genom att släppa myggor av en stor storlek för att maximera sin fruktsamhet33 och parning framgång34,35. Myggor bör också anpassas till de förhållanden som de kommer att uppleva i fältet, men långsiktigt laboratorium uppfödning kan orsaka förändringar i beteende och fysiologi som kan påverka området prestanda36,37, 38.

Vi beskriver ett enkelt protokoll för uppfödning Ae. aegypti i laboratorium med hjälp av grundläggande utrustning. Detta protokoll är lämplig för både vildtyp och Wolbachia-infekterade myggor, den senare som kan kräva särskild uppmärksamhet eftersom vissa Wolbachia stammar har betydande effekter på mosquito livshistoria drag39, 40. uppfödning villkoren undvika överbefolkning och konkurrens om mat att producera myggor av konsekvent storlek, vilket är avgörande för vektor kompetens och lämplighet experiment, och säkerställer att myggen är friska för fältet övergång41 . Vi också vidta försiktighetsåtgärder för att minimera laboratorium anpassning och inavel genom att minska selektiva påtryckningar och att se till att nästa generation samplas från en stor, slumpmässiga pool. Men laboratoriemiljöer skiljer sig tydligt från fältförhållanden och långsiktigt underhåll under avslappnade förhållanden kunde minska av myggor vid utsättning i fält37,42,43 lämplighet . Vi därför passera honor från laboratoriet linjer till fältet-samlat män regelbundet, vilket resulterar i kolonier som är genetiskt lika för experimentell jämförelser och som är anpassade till de mål fältet befolkningen39. Metoderna kräver inte någon specialiserad utrustning och kan skalas upp till bakre tiotals tusentals individer per vecka för fältet utgåvor. Protokollet prioriterar också lämplighet myggor inom och mellan generationer, en viktig faktor för insekter som är avsedda för etablering i naturliga populationer. Protokollet är lämplig för de flesta laboratorier som kräver underhåll av Ae. aegypti, särskilt för experimentell jämförelser där en konsekvent kvalitet av myggor och relatability till fältet är viktiga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod utfodring av myggor på människor och godkändes av University of Melbourne mänskliga etikkommittén (godkännande nr: 0723847). Alla volontärer som informerade skriftliga samtycke.

1. larval uppfödning

Obs: Myggor hålls på 26 ± 0,5 ° C och 50-70% relativ luftfuktighet, med en 12:12 h (ljus: mörker) fotoperiod för denna koloni underhållsprotokoll. Dessa villkor är liknande till genomsnittliga klimatförhållandena i Cairns, Australien och inom optimal värmeintervall för Ae. aegypti överlevnad och utveckling44,45,46. Höga temperaturer kan resultera i förlust av Wolbachia infektioner från mosquito kolonier och bör undvikas47. Vi bibehålla minst 500 individer per invånare att minimera inavel; att upprätthålla kolonier av en mindre storlek kan få fitness konsekvenser [Ross et al. opublicerade]. Under dessa förhållanden och under förutsättning att tillräcklig näring är genomsnittlig generationstid 28 dagar (se tabell 1).

  1. Dränka ägg på substrat i tråg (figur 1A) innehållande 3 L vatten (omvänd osmos eller åldern kranvatten, genereras genom att lämna kranvatten i fack för 24 h före användning), ~ 300 mg av fiskmat (en krossad tablett, se Tabell av material) och en några korn av aktiv torrjäst inducera kläckning48.
  2. En dag efter kläckningen, Använd glas pipett att överföra cirka 500 larver till tråg innehållande 4 L vatten (figur 1B), räkna med en klicker räknare. Lägg till två krossade fisk mat tabletter i varje fack. Om det behövs, Använd behållare av olika storlekar för uppfödning larver (figur 1A), men hålla larval densiteter under 0,5 larver/mL att undvika överbeläggning.
  3. Kontrollera fack dagligen för att säkerställa att larverna har tillräckligt med mat; Lägg till cirka två mat tabletter i magasinen varannan dag. Ge mat ad libitum men säkerställa att 0,5 mg/larv/dag är tillgänglig under denna period att säkerställa utveckling är synkrona och kroppslängd är konsekvent, annars resultaten av experiment kan blandas ihop (se representativa resultat).
  4. Var noga med för att undvika overfeeding av larver, särskilt i mindre uppfödning behållare med vatten mindre yta och volym. Om vattnet ser grumlig ut eller om det finns betydande larval dödlighet, ersätta den med färskt vatten; mortalitet bör vara försumbar om larverna matas optimalt.

2. vuxen uppkomst

Obs: Larver kommer att börja förpuppas från fem dagar efter kläckningen om välgödd och majoriteten bör förpuppas av sju dagar efter kläckningen. Vuxna börjar framväxande ungefär två dagar efter förpuppningen om underhålls optimalt vid 26 ° C (se Representativa resultat). Larval development är vanligen opåverkad av Wolbachia infektioner när gott om mat tillhandahålls23,39,49.

  1. Sju dagar efter kläckningen Häll hela innehållet i magasinet genom en finmaskig (porstorlek 0,4 mm). Hålla det filtrerade larval vattnet för senare användning i ovicups (”blod utfodring och ovipositionen” avsnitt). Invertera mesh och doppa den i en plastbehållare med 200 mL vatten att överföra puppor. Tillhandahålla ytterligare mat om någon larver kvar.
  2. Förbereda vuxen uppkomst burar (figur 1 c) genom att tillhandahålla två koppar 10% sackaroslösning (figur 1F) och två koppar fuktig bomullstuss att förhindra uttorkning (figur 1E).
  3. Om puppor inte behöver sorteras efter kön, placera de lockförsedda behållarna av puppor i buren och lämna locket lite på glänt så att de vuxna att dyka upp i buren. Alternativt kan du placera en inverterad tratt över behållaren för att minimera drunkning. Se till att alla vuxna har uppstått innan du tar bort behållaren från buren för att förhindra att välja mot långsam utvecklare.

3. Pupp könsbestämning för korsningar

  1. Om puppor behöver sorteras efter kön (t.ex., för korsningar), pipett the puppor från larval fack och separera könen (figur 2) i plastburkar (figur 1A) med 200 mL vatten varje 24 h tills önskat antal av varje kön har nåtts. Placera locken på behållarna och lämna dem stängda.
  2. Vuxna kommer att dyka upp i behållare; bekräfta deras kön innan du släpper in burar (figur 2 c). Ta bort alla vuxna könsbestämmas felaktigt med en insugningsventil inom 24 h uppkomst innan de når könsmognad. När könen har bekräftats, släppa vuxna i burar varje 24 h.
  3. Att få Wolbachia-infekterade kolonier av en liknande genetiska bakgrunden till en naturlig population, ropen genom att lägga till Wolbachia-smittade hondjur från laboratoriet kolonier till burar av icke-infekterade män härrör från ägg som samlats in av ovitraps i i fält39, bibehålla föreskriven täthet 500 individer per invånare.
    1. Upprepa de korsningar för minst tre på varandra följande generationer att producera kolonier som minst 87,5% genetiskt liknar den fält befolkningen39. Kritisk: Säkerställa att könen är korrekta i detta skede (se steg 3.1).
  4. Kvinnliga Ae. aegypti är vanligtvis refraktära mot ytterligare insemination inom timmar efter parning50. När korsningar kolonier, låt honor och hanar att mogna i separata burar för två dagar och sug sedan upp honorna i manliga buren att ge ett lika möjligheter till alla män.

4. blod utfodring och ovipositionen

  1. Vänta i minst tre dagar efter den sista kvinnligt har framkommit innan blod utfodring för att ge gott om tid att mogna. Blod flöde honorna inom två veckor efter uppkomsten till förhindra överdriven dödlighet, särskilt för myggor med Wolbachia infektioner som inverkar på longevity22,24,49. Ta bort socker kopparna dagen före utfodring för att förbättra utfodring priser.
    1. Fråga volontär att infoga sin underarm i buren för att tillåta kvinnliga myggor att mata. De flesta kvinnor bör foder till tillskott inom 5 min, men för att minska urval mot långsam matare, lämna underarmen i buren i 15 min, eller tills alla honor är synbart svullna; en latexhandske att skydda handen från biter är valfritt men rekommenderas.
    2. Två dagar efter blod utfodring, placera två plastmuggar innehållande larver uppfödning vatten och fodrad med en remsa av sandpapper (figur 1 g) (eller filterpapper (figur 1 H)) in i buren för honorna att lägga ägg. Delvis dränka sandpapper remsan i vattnet för att hålla den fuktig. Ta bort andra källor vatten för att förhindra att honorna lägger sina ägg utanför ovipositionen koppen.
      Obs: kranvatten kan användas i kuporna, men larval-uppfödning vatten uppmuntrar ovipositionen51,52 och honorna lägger sina ägg mer synkront.

5. ägg insamling och konditionering

  1. Honorna lägger ägg på sandpapper strax ovanför vattenlinjen; samla och ersätta remsor av sandpapper dagligen tills inga fler ägg. Observera att ovipositionen kan fortsätta i upp till en vecka.
  2. Delvis torrt sandpapper remsor genom att försiktigt läska dem på en pappershandduk för 30 s, noga med att inte få bort äggen. Sedan wrap remsorna i ett ark med torr pappershandduk och placera den i en förslutningsbar plastpåse (figur 1I).
  3. Kontrollera skicket på ägg i dissekera Mikroskop (figur 3). Om sandpapper remsor är för våt, ägg kan kläckas innan att vara nedsänkt i vatten (figur 3B), men om torkade alltför hårt, ägg kan kollapsa (figur 3 c).
  4. Äggen kan vara kläckta helst utöver tre dagar efter samlingen; kläcka alla ägg från varje koloni, samlas över alla dagar, i samma behållare av vatten för att säkerställa att nästa generation samplas från en stor, slumpmässiga individer.
  5. För långsiktig lagring, hålla äggen i en sluten behållare på en hög (> 80%) fuktighet vid cirka 20 ° C. Under dessa förhållanden, kan ägg utan Wolbachia lagras i flera månader bibehållen hög lucka priser53,54.
  6. Som vissa Wolbachia infektioner kraftigt minska lönsamheten för ägg med ålder49,55, kläcks äggen från Wolbachia-infekterade rader inom en vecka för att förhindra överdriven dödlighet för de relevanta stammar. Blod flöde honorna igen efter en vecka om fler ägg behövs.
Dag Steg
0 Kläcka ägg
1 Räkna larverna i brickor
7 Överföra larver och puppor till kolonin burar
17 Blod flöde kvinnliga vuxna
21 Börja samla ägg
25 Avsluta att samla ägg
28 Kläcka ägg

Tabell 1: Översikt över Ae. aegypti kolonin underhåll tidtabellen på 26 ° C. Tidpunkten för kvinnliga blod-utfodring och kläckningen av ägg är flexibel, men långa räntebindningstider på dessa stadier bör undvikas, särskilt för myggor infekterade med Wolbachia, för att minimera dödlighet. Efter detta schema minimerar urval mot mygg som snabb eller långsam att utveckla eller mogen i alla levnadsstadier, förutsatt att larverna matas optimalt.

Figure 1
Figur 1: Utrustning som används för uppfödning av Ae. aegypti i laboratoriet. (A) plastbehållare används för kläckägg eller uppfödning larver med volymer på 500, 750 och 5000 mL (från vänster till höger). (B) brickor används för uppfödning av larver på en kontrollerad densitet, oftast 500 larver i 4 L vatten. (C) 19,7 L och (D), 3 L köttburar för bostäder vuxna. En täthet av 25 vuxna eller mindre per liter bör bibehållas för att ge tillräckligt utrymme. (E) 35 mL kopp med fuktig bomullstuss som tillhandahålls som en källa till vatten till vuxna. (F) 35 mL kopp med sackaroslösning tillhandahålls genom en sladd eller dental wick som en källa till socker. (G–H) Cups larval uppfödning vattenfylld och fodrad med en ovipositionen substrat för sandpapper eller filterpapper (G och H, respektive). (jag) Zip-lock påse används för lagring av sandpapper remsor eller filterpapper. Svarta fläckar på sandpapper är mosquito ägg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Laterala (A) och dorsala (B) utsikt över puppor och vuxen Ae. aegypti (C) visar sin könsdimorfism. Hanar är placerade till vänster och honor till höger i varje panel. När optimalt matas, kännetecknas manliga och kvinnliga puppor av storlek; Honorna är större än hanarna (A) och har en relativt uppsvällda framkroppen jämfört med män som har plattare sidor (B). Manliga vuxna är lätt urskiljas från honor under alla uppfödning förhållanden, främst genom sin plumose antenner och lång palps. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Fyra dagar gamla Ae. aegypti ägg under olika förhållanden. (A) intakta ägg på sandpapper remsor bibehålls på en hög (> 80%) fuktighet men utan någon synlig fukt. Hatch priser bör vara över 90% för vildtyp Ae. aegypti om underhålls på rätt sätt. (B) ägg som kläcks innan att vara nedsänkt i vatten (brådmogen kläckning) kännetecknas av en fristående ägg cap och synliga larv. Detta indikerar att sandpapper remsan hölls för fuktigt. (C) ägg som torkas för hårt kan kollapsa och syns tydligt av deras konkav utseende. Om sandpapper blir stel indikerar detta också att äggen kan vara alltför torr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 visar effekterna av suboptimal kost på utvecklingen av Ae. aegypti larver. När behållarna är försedda med 0,25 mg mat per larv per dag eller mindre, utvecklingstiden ökar för både män och kvinnor, och är mindre synkron än i behållare försedd med 0,5 mg av mat. Om tillräcklig föda inte tillhandahålls under hela larval development, kan detta ha en negativ inverkan på underhållsschema. Långsam-utveckla individer löper risk att bli utvald mot, blod utfodring kan vara fördröjda och det finns en högre risk för dödlighet hos vuxna innan reproduktion sker.

Figur 5 visar wing längd (en uppskattning av kroppsstorlek) Ae. aegypti vuxna uppfödda under en mängd näring regimer. Wing längder av både män och kvinnor minska avsevärt och bli mer rörlig när nutrition är suboptimalt. Enhetlig storlekar är viktiga för experimentell jämförelser som kroppsstorlek är positivt associerad med fruktsamhet och stora myggor förväntas uppvisa större fitness under fältet villkor33,34,35 .

Effekterna av Wolbachia infektioner på de ovanstående egenskaperna beskrivs i andra studier men generellt finns det liten eller ingen effekt23,39,49.

Figure 4
Figur 4: Kumulativ andel av Ae.aegypti (A) och hondjur (B) utveckla till vuxenlivet under olika mat regimer på 26 ° C. 100 larver har fötts upp i behållare på 500 mL vatten (en larval täthet av 0.2 larver per mL), med olika nivåer av livsmedel (se tabellen för material) och gjorde för deras utvecklingstid. Det ingick endast larverna som överlevde till vuxen ålder. Felstaplar är standard fel, med n = 4 replikat per behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Wing längden på Ae.aegypti (A) och hondjur (B) utveckla under olika mat regimer på 26 ° C. 100 larver var uppfödda i behållare på 500 mL vatten (en larval täthet av 0.2 larver per mL) och med olika nivåer av mat. En delmängd av vuxna mättes sedan för deras wing längd med hjälp av tidigare beskrivna metoder56. Felstaplar är standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter protokollet presenteras här för underhåll av Wolbachia-infekterade Ae. aegypti bör säkerställa att friska myggor av en konsekvent kvalitet produceras för experiment och öppna fältet utgåvor. I motsats till andra protokoll som prioriterar produktionen av massa mängder mygg (se referens57), är metoderna inriktade på att maximera deras fitness, både inom generationer av avslappnad uppfödning genomförandevillkor, och över generationer genom att minimera inavel, urval och laboratorium anpassning. Detta protokoll är också speciellt utformad för Ae. aegypti med Wolbachia infektioner men bör vara lämplig för någon typ av Ae. aegypti. Det passar dock inte för uppfödning masstillverkning (i storleksordningen miljoner per vecka), som kan vara nödvändiga för sterila eller inkompatibel insekt utgåvor som kräver höga siffror att uppnå befolkningen dämpning57,58.

Det finns några kritiska steg som bör följas noggrant. Det är viktigt att mata larverna optimalt och undvika trångboddhet för varaktigheten av deras utveckling. Detta kommer att säkerställa att myggen utveckla synkront och av en konsekvent storlek. Särskild försiktighet bör också iakttas när luftkonditionering äggen. Larverna kan mycket enkelt kläcker för tidigt eller ägg kan ut om de oviposition substratesna är alltför våt eller torr, respektive. På alla steg i protokollet rekommenderar vi ger tillräckligt med tid för så många individer i kolonin som möjligt för att slutföra varje steg. Urval mot individer som är långsamma att utveckla, mogna, blod flöde, oviposit eller kläcks kommer sannolikt att leda till förlust av genetisk variation.

Vi noterar några ytterligare överväganden för underhåll av Wolbachia-infekterade myggor som inte beskrivs i protokollet ovan. Det är möjligt för Wolbachia infektioner försvinner från laboratoriet kolonier, och vi rekommenderar därför att kolonierna övervakas rutinmässigt för sin Wolbachia infektionsstatus. Vi använder kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR)49,59 för att testa minst 30 personer från varje Wolbachia-infekterade linje varje generation. Om eventuella personer testar negativt för lämpliga Wolbachia infektionen, kan kolonier renas genom isolera så många honor som möjligt från den drabbade kolonin och sedan använda avkomma från infekterade mödrar endast, för att grunda nästa generation. Orsaken till förlusten av vissa Wolbachia stammar från laboratoriet kolonier är till stor del okända, men kunde förklaras av misslyckandet med temperaturkontroll, eftersom höga temperaturer kan orsaka förlust av Wolbachia infektioner47, 60.

Kolonier och experiment kan också bli kontaminerade med individer från olika linjer om man inte är vaksam när uppfödning. Kontaminering kan leda från vårdslös pipettering av larver, blanda upp partier av ägg, mislabeling burar eller felaktigt könsbestämning puppor i korsar. Särskild försiktighet bör därför iakttas vid hantering av kolonier med olika Wolbachia infektion. Grundligt ren någon ovipositionen koppar, uppfödning brickor och burar innan återanvända dem, rensa ut pipetter innan du hanterar varje ny bricka av larver och rengör mesh varje gång när du överför larver och puppor till andra behållare. Dessutom inspektera fingrar för ägg när du hanterar sandpapper remsor och använda färska hushållspapper när torkning varje remsa, säkerställa att vuxna är rätt kön innan du släpper dem i burar och snabbt ta itu med eventuella rymlingar. Tar dessa försiktighetsåtgärder bör undvika de flesta kontaminering, men kolonierna fortfarande övervakas rutinmässigt med hjälp av diagnostiska analyser59.

Kvinnliga Ae. aegypti kräver en blodmjöl för att lägga ägg och laboratorier runt om i världen ger dem i en mängd olika sätt, från membran utfodring system57, återhållen djur61 och, i mindre utsträckning, konstgjort blod62 . Men myggor med experimentella Wolbachia infektioner ofta fungera dåligt på icke-mänskliga blod och kan uppvisa minskad fruktsamhet och kläcka priser och ofullständig överföring av Wolbachia till deras avkomma63, 64 , 65. upprätthålla mottaglighet av Honor till mänskliga lukter är också viktigt för myggor att släppas in i fältet, och utfodra dem genom membran eller andra djur kan äventyra denna förmåga37. Därför väljer vi för att använda underarmen av frivilliga försökspersoner för detta kolonin underhållsprotokoll, även om andra metoder krävs under vissa omständigheter. Blod bör tillhandahållas på andra sätt när du arbetar direkt med arboviruses, och man bör vara försiktig när kolonierna härstammar från fältet populationer med hög virusbelastning som transovarial överföring av arboviruses kan förekomma66. Frivilliga försökspersoner bör också inte blod foder om de har nyligen besökt arboviral endemiska länder eftersom det kan finnas en risk för överföring.

Vår underhåll protokollet syftar till att minimera laboratorium anpassning och selektiv tryck, men det finns utrymme för förbättringar. Leftwich o.a. 42 ger ytterligare rekommendationer för att upprätthålla myggor lämplighet för öppna fältet utgåvor, inklusive användning av mer varierade och naturliga larval kostvanor, minska tätheten av vuxna i burar och ger en komplex miljö. Dessa överväganden kan förstärka Ae. aegypti lämplighet till en högre nivå, men för närvarande finns det inga belägg för fitness förändringar på grund av laboratoriet anpassning under underhåll protokollet beskrivs här [Ross et al. opublicerade]. Vissa ytterligare åtgärder kanske inte är möjligt för laboratorier med begränsat utrymme och resurser, men är ändå värt att undersöka. Att upprätthålla stora storlekar, för att undvika stora selektiv tryck genom uppfödning protokoll och genomföra bör periodiska korsningar fältet mygg hjälpa att säkerställa hög lämplighet Ae. aegypti för öppna fältet utgåvor. Principerna som är inblandade i metoden kan tillämpas på uppfödning andra sjukdom vektor arter för release att manipulera eller undertrycka naturliga populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Vi erkänner Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson och Clare Doig för deras bidrag till utvecklingen av vår koloni underhåll metoder och tre anonyma recensioner för deras förslag som bidrog till att förbättra manuskriptet. Vår forskning stöds av ett program grant och gemenskap till AAH från National Health och medicinska forskningsrådet och en översättning bevilja från Wellcome Trust. PAR är en mottagare av en australiensisk regering forskning utbildning Program stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Tags

Grundläggande protokoll fråga 126 insekt uppfödning mygga Aedes aegypti denguefeber Zika Wolbachia fitness blod utfodring
Att upprätthålla <em>Aedes aegypti</em> myggor infekterade med <em>Wolbachia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, P. A., Axford, J. K.,… More

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter