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Biology

Manter o Aedes aegypti , mosquitos infectados com Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Os mosquitos Aedes aegypti infectados com Wolbachia estão sendo liberados em populações naturais para suprimir a transmissão de arbovírus. Descrevemos métodos para traseira Ae. aegypti com Wolbachia infecções no laboratório para experiências e lançamento de campo, tomando as precauções para minimizar a seleção e adaptação de laboratório.

Abstract

Os mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia estão sendo utilizados em programas para controlar a propagação de arbovírus como dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-mosquitos infectados podem ser lançados no campo também reduzir tamanhos de população através de acasalamentos incompatíveis ou transformar as populações com mosquitos que são refratários a transmissão do vírus. Para estas estratégias ter sucesso, os mosquitos liberados no campo do laboratório devem ser do competidor com mosquitos nativos. No entanto, manter os mosquitos no laboratório pode resultar em endogamia, deriva genética e adaptação de laboratório que pode reduzir sua aptidão no campo e pode confundir os resultados de experimentos. Para testar a adequação de diferentes infecções Wolbachia para implantação no campo, é necessário manter os mosquitos em um ambiente de laboratório controlado através de várias gerações. Descreveremos um protocolo simples para manter mosquitos Ae. aegypti em laboratório, que é apropriado para ambos Wolbachia-mosquitos infectados e selvagem-tipo. Os métodos de minimizar a adaptação de laboratório e implementam cruzamento para aumentar a relevância das experiências para mosquitos de campo. Além disso, colônias são mantidas em condições óptimas para maximizar a sua aptidão para lançamentos de campo aberto.

Introduction

Os mosquitos Aedes aegypti são responsáveis pela transmissão de algumas dos arbovírus mais importantes do mundo, incluindo a dengue, Zika e chikungunya1. Estes vírus estão se tornando uma ameaça crescente à saúde global, como a distribuição generalizada do Ae. aegypti nos trópicos continua a expandir a2,3,4. Feminino Ae. aegypti preferencialmente se alimentam de sangue humano5 e, portanto, tendem a viver em estreita proximidade com os seres humanos, particularmente em áreas urbanas, onde as populações são mais densas. Através desta associação estreita com os humanos eles também se adaptaram para procriar em habitats artificiais, incluindo pneus, vasos, calhas e tanques de água6,7. Ae. aegypti também facilmente adaptar-se a ambientes de laboratório, onde eles podem ser mantidos sem quaisquer requisitos especiais após ser coletado diretamente do campo, ao contrário de algumas outras espécies do género Aedes 8, 9,10. Sua facilidade de manutenção tem visto amplamente estudados no laboratório em uma ampla gama de campos, em última análise, com o objetivo de controlar os mosquitos de doenças pode transmitir.

Tradicionalmente, o controle arboviral confia pesadamente sobre o uso de inseticidas para reduzir populações do mosquito. No entanto, há um crescente interesse em abordagens onde os mosquitos modificados são criados em laboratório e em seguida lançados em populações naturais. Os mosquitos liberados podem ser modificados geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, através de irradiação16, tratamento químico de17,18, ou para o conjunto de técnicas19 para suprimir as populações de mosquitos ou substituí-los por mosquitos que são refratários a transmissão arboviral20.

Wolbachia são bactérias que estão atualmente sendo usadas como um agente de controle biológico para arbovírus. Várias cepas de Wolbachia foram recentemente introduzidas Ae. aegypti experimentalmente utilizando microinjeção embrionárias21,22,23,24. Estas cepas reduzem a capacidade dos arbovírus para divulgar e replicar no mosquito, diminuindo sua transmissão potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecções são transmitidas da mãe à prole, no entanto certas estirpes induzem esterilidade quando machos infectados acasalam com as fêmeas não infectadas22. Wolbachia-machos infectados, portanto, podem ser liberados em grandes quantidades para suprimir as populações naturais de mosquitos, como recentemente demonstradas em outras espécies de Aedes 15,29. No entanto, desde que a Wolbachia também inibir a transmissão arboviral em Ae. aegypti, mosquitos também podem ser liberados para substituir as populações nativas com vetores mais pobres. Ae. aegypti infectados experimentalmente com Wolbachia agora estão sendo liberados para o campo em vários países que utilizam esta última abordagem14,30,31.

Wolbachia-abordagens com base para controle arboviral dependem de uma sólida compreensão das interacções entre Wolbachia, o mosquito e o ambiente. Wolbachia ocorrem naturalmente em uma ampla variedade de insetos, e as cepas introduzidas os mosquitos são diversas em seus efeitos,32. Como novos tipos de infecção de Wolbachia sejam introduzidos Ae. aegypti24, é necessário caracterizar cada estirpe para seus efeitos sobre a aptidão do mosquito, a reprodução e a interferência arboviral sob uma variedade de condições. Rigorosa experimentação em laboratório, portanto, é necessário para avaliar o potencial de Wolbachia cepas suceder no campo.

Lançamentos de campo aberto do Ae. aegypti com Wolbachia infecções muitas vezes podem exigir milhares a dezenas de milhares de mosquitos por zona de lançamento a ser criados a cada semana14,30,31. O sucesso dos lançamentos iniciais pode ser melhorado através da libertação de mosquitos de um tamanho grande para maximizar sua fecundidade33 e acasalamento sucesso34,35. Os mosquitos também devem ser adaptados às condições que eles experimentarão no campo, criação de laboratório no entanto a longo prazo pode causar alterações no comportamento e fisiologia, o que poderia afetar o campo desempenho36,37,, 38.

Descreveremos um protocolo simples para a criação de Ae. aegypti em laboratório usando equipamento básico. Este protocolo é apropriado para ambos selvagem-tipo e Wolbachia-infectadas de mosquitos, o último dos quais pode exigir atenção especial como algumas cepas de Wolbachia têm efeitos significativos no mosquito-história de vida características39, 40. as condições de criação evitar superlotação e competição por comida produzir mosquitos de um tamanho consistente, que é fundamental para a competência de vetor e experimentos de aptidão e garante que os mosquitos são saudáveis para a liberação do campo41 . Também tomamos precauções para minimizar a adaptação de laboratório e endogamia, reduzindo as pressões selectivas e garantindo que a próxima geração é amostrado de uma grande piscina aleatória. No entanto, ambientes de laboratório são distintamente diferentes das condições de campo, e manutenção a longo prazo sob condições relaxadas poderia reduzir a aptidão dos mosquitos após a liberação para o campo37,42,43 . Portanto, atravessamos fêmeas das linhas de laboratório para coleta de campo machos periodicamente, resultando em colônias que são geneticamente semelhantes para comparações experimentais e que são adaptados para o campo de destino população39. Os métodos não exigem qualquer equipamento especializado e podem ser ampliados para trás dezenas de milhares de indivíduos por semana para lançamentos de campo. O protocolo também prioriza a adequação de mosquitos dentro e através das gerações, uma consideração importante para destinado a estabelecimento em populações naturais de insetos. O protocolo é apropriado para a maioria dos laboratórios que requerem manutenção de Ae. aegypti, particularmente para comparações experimentais onde uma qualidade consistente de mosquitos e relatability para o campo são importantes.

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Protocol

Sangue se alimentando de mosquitos em seres humanos foi aprovado pela Universidade de Melbourne Comitê de ética humana (aprovação #: 0723847). Todos os voluntários prestados informaram consentimento por escrito.

1. larval de criação

Nota: Os mosquitos são realizados em 26 ± 0,5 ° C e 50-70% umidade relativa, com um fotoperíodo de h (luz: escuro) 12:12 por este protocolo de manutenção de colônia. Estas condições são semelhantes às condições climáticas médias em Cairns, na Austrália e o intervalo térmico ideal para Ae. aegypti sobrevivência e desenvolvimento44,,45,46. Temperaturas elevadas podem resultar na perda de Wolbachia infecções das colônias de mosquito e devem ser evitada,47. Nós mantemos pelo menos 500 indivíduos por população para minimizar a consanguinidade; manutenção de colônias de tamanho menor pode ter consequências de aptidão [Ross et al não publicado]. Sob essas condições e assumindo uma nutrição adequada, o tempo de geração média é de 28 dias (ver tabela 1).

  1. Mergulhe os ovos no substrato em bandejas (figura 1A), que contém 3 L de água (água de osmose reversa ou água da torneira envelhecido, gerada, deixando a água da torneira em bandejas para 24 h antes da sua utilização), ~ 300 mg de comida de peixe (um esmagado da tabuleta, consulte Tabela de materiais) e um alguns grãos de fermento seco ativo para induzir a incubação de48.
  2. Um dia após a eclosão, use uma pipeta de vidro para transferir aproximadamente 500 larvas para bandejas contendo 4 L de água (figura 1B), conta usando um contador de controle remoto. Adicione dois comprimidos de comida de peixe moído para cada bandeja. Se necessário, use recipientes de tamanhos diferentes para a criação de larvas (figura 1A), mas manter a densidade larval abaixo de 0,5 larvas/mL para evitar superlotação.
  3. Verifique as bandejas diariamente para garantir que as larvas têm comida suficiente; Adicione aproximadamente dois comprimidos de comida para as bandejas em dois dias. Fornecer alimentação ad libitum , mas certifique-se que 0,5 mg/larva/dia está disponível durante este período para garantir o desenvolvimento é síncrono e tamanho de corpo é consistente, caso contrário os resultados dos experimentos podem ser confundidos (ver resultados de representante).
  4. Tome cuidado para evitar a superalimentação de larvas, particularmente em recipientes menores criação com menos água, volume e área de superfície. Se a água parece nublada ou se houver significativa mortalidade larval, substituí-lo com água fresca; mortalidade deve ser insignificante se larvas são alimentadas de forma otimizada.

2. adulto surgimento

Nota: As larvas começará a empupar de cinco dias após a eclosão, se bem alimentados e a maioria deve pupate por sete dias após a eclosão. Adultos começará emergentes aproximadamente dois dias após a pupação se otimamente a 26 ° C (ver Resultados de representante). Desenvolvimento larval é normalmente afetado pela Wolbachia infecções quando amplo alimento é fornecido23,39,49.

  1. Sete dias após a eclosão despeje todo o conteúdo da bandeja através de uma malha fina (tamanho de poro 0,4 mm). Manter a água filtrada larval para uso posterior em ovicups (consulte a seção "Sangue alimentação e oviposição"). Inverter a malha e mergulhá-lo em um recipiente plástico com 200 mL de água para transferir as pupas. Fornece alimento adicional se qualquer larvas permanecem.
  2. Prepare as gaiolas de emergência de adultos (Figura 1) fornecendo dois copos de solução de sacarose 10% (Figura 1F) e duas xícaras de algodão úmido para evitar a dessecação (Figura 1E).
  3. Se as pupas não precisa ser classificados por sexo, coloque os recipientes extraível de pupas na gaiola e deixe a tampa entreaberta para permitir que os adultos a emergir dentro da jaula. Como alternativa, coloque um funil invertido sobre o recipiente para minimizar a afogar-se. Certifique-se de todos os adultos têm surgido antes de retirar o recipiente da gaiola para evitar selecionando contra desenvolvedores lentos.

3. pupa sexagem para cruzamento

  1. Se as pupas precisam ser classificados por sexo (por exemplo, para o cruzamento), pipetar as pupas de bandejas larvas e separar os sexos (Figura 2) em recipientes de plástico (figura 1A) com 200 mL de água cada 24h até o número desejado de cada sexo. foi alcançado. Coloque as tampas nos recipientes e deixá-los fechados.
  2. Adultos vão surgir nas gavetas; Confirme o seu sexo antes de liberar em gaiolas (Figura 2). Remova qualquer adultos sexados incorretamente com um aspirador dentro de 24 h de emergência antes de atingirem a maturidade sexual. Uma vez confirmados os sexos, solte os adultos em gaiolas cada 24 h.
  3. Para obter a Wolbachia-colônias infectadas de um fundo genético similar a uma população natural, outcross adicionando Wolbachia-infectados fêmeas de colônias de laboratório para gaiolas de machos não infectados derivados de ovos recolhidos por Leishmania em o campo39, mantendo a densidade prescrita de 500 indivíduos por população.
    1. Repeti o cruzamento há pelo menos três gerações consecutivas produzir colônias que estão pelo menos 87,5% geneticamente semelhante a população de campo39. Crítica: Certifique-se de que os sexos estão corretos nesta fase (ver passo 3.1).
  4. Feminino Ae. aegypti são geralmente refratários a inseminação mais horas de acasalamento50. Quando o cruzamento de colônias, permitir que as fêmeas e machos amadurecer em gaiolas separadas por dois dias e depois Aspire as fêmeas para a gaiola do macho fornecer uma oportunidade igual para todos os homens.

4. sangue alimentação e oviposição

  1. Espere pelo menos três dias após a última fêmea surgiu antes sangue alimentando para permitir tempo suficiente amadurecer. As fêmeas de alimentação de sangue dentro de duas semanas de emergência para evitar a mortalidade excessiva, particularmente para os mosquitos com Wolbachia infecções que afectam negativamente a longevidade22,24,49. Remova as xícaras de açúcar o dia antes da alimentação para melhorar as taxas de alimentação.
    1. Pedir um voluntário para inserir a gaiola para permitir que os mosquitos fêmeas alimentar seu antebraço. A maioria das fêmeas devem alimentar para repletion dentro de 5 min, mas para reduzir a seleção contra alimentadores lentas, deixe o antebraço na gaiola por 15 min, ou até que todas as fêmeas são visivelmente ingurgitadas; uma luva de látex para proteger a mão de mordidas é opcional mas recomendado.
    2. Dois dias após a alimentação de sangue, coloque dois copos de plástico contendo água criação larval e revestidas com uma fita de lixa (Figura 1) (ou papel de filtro (Figura 1 H)) dentro da gaiola para as fêmeas que põem ovos. Parcialmente, mergulhe a tira de lixa na água para mantê-lo úmido. Remova outras fontes de água para evitar que as fêmeas botando seus ovos fora da Copa de oviposição.
      Nota: água da torneira pode ser usado nos copos, mas incentiva a criação de larvas de água oviposição51,52 e fêmeas colocarão seus ovos mais sincronicamente.

5. ovo coleção e condicionamento

  1. As fêmeas colocarão ovos sobre a lixa apenas acima da linha de água; recolher e substituir as tiras de lixa diariamente até que não mais ovos. Observe que a oviposição pode continuar por mais uma semana.
  2. Tiras de lixa parcialmente seco borrando-los delicadamente sobre uma toalha de papel por 30 s, tomando cuidado para não deslocar os ovos. Em seguida, enrole as tiras em uma folha de toalha de papel seca e coloque-o em um saco plástico vedável (Figura 1I).
  3. Verifique o estado dos ovos sob um microscópio dissecação (Figura 3). Se a folha de lixa tiras são muito molhada, os ovos podem eclodir antes de ser submerso em água (Figura 3B), mas se secado muito duramente, ovos podem entrar em colapso (Figura 3).
  4. Os ovos podem ser incubados a qualquer momento, além da coleção pós três dias; pôr todos os ovos em cada colônia, coletados através de todos os dias, no mesmo recipiente de água para garantir que a próxima geração é amostrada de uma grande piscina aleatória de indivíduos.
  5. Para armazenamento a longo prazo, mantenha os ovos em um recipiente selado em uma umidade alta (> 80%) a cerca de 20 ° C. Nestas condições, os ovos sem Wolbachia podem ser armazenados por vários meses, mantendo a escotilha altas taxas53,54.
  6. Como algumas infecções Wolbachia reduzem a viabilidade dos ovos com idade49,55, chocar os ovos de Wolbachia-infectados linhas dentro de uma semana de coleta para evitar mortalidade excessiva para o relevante estirpes. Sangue alimenta as fêmeas novamente depois de uma semana, se são necessários mais ovos.
Dia Passo
0 Ovos de escotilha
1 Contagem de larvas em bandejas
7 Transferência de larvas e pupas para gaiolas de colônia
17 Sangue alimenta adultos femininos
21 Começar a coleta de ovos
25 Terminar a coleta de ovos
28 Ovos de escotilha

Tabela 1: Visão geral do programa de manutenção de colônia Ae. aegypti em 26 ° C. O momento da sangue feminina-alimentação e a eclosão dos ovos é flexível, mas longas durações nestas fases devem ser evitadas, particularmente para os mosquitos infectados com Wolbachia, a fim de minimizar a mortalidade. Seguindo esta agenda minimiza seleção contra mosquitos que são rápidos ou lentos para desenvolver ou amadurecem em todas as fases da vida, desde que as larvas são alimentadas de forma otimizada.

Figure 1
Figura 1: Equipamento utilizado para a criação de Ae. aegypti em laboratório. Recipientes de plástico (A) usados para ovos para incubação ou criação de larvas com volumes de 500, 750 e 5.000 mL (da esquerda para a direita). (B) bandejas utilizadas para a criação de larvas em uma densidade controlada, geralmente 500 larvas 4 litros de água. (C) 19,7 L e (D) L 3 gaiolas utilizadas para adultos de habitação. Uma densidade de 25 adultos ou menos por litro deve ser mantido para proporcionar espaço suficiente. (E) 35 mL do copo com lã de algodão úmido fornecido como uma fonte de água para adultos. (F) 35 mL do copo com solução de sacarose fornecida através de um cabo ou pavio dental como uma fonte de açúcar. (G–H) Copos cheios de água criação larval e forrado com um substrato de oviposição de lixa ou papel de filtro (G e H, respectivamente). (eu) Zip-lock saco usado para armazenamento de tiras de lixa ou papel de filtro. Manchas pretas na lixa são os ovos do mosquito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Lateral (A) e dorsal (B) vista de pupas e adultos Ae. aegypti (C) demonstrando seu dimorfismo sexual. Os machos estão posicionados à esquerda e as fêmeas à direita de cada painel. Quando otimamente alimentados, pupas masculinas e femininas distinguem-se pelo tamanho; as fêmeas são maiores que os machos (A) e tem um cefalotórax relativamente bulbosa, em comparação com os machos que têm partes planas (B). Adultos do sexo masculino são facilmente distinguidos das fêmeas sob todas as condições de criação, principalmente pelos seus plumose antenas e palpos longos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Quatro dias de idade Ae. aegypti ovos sob diferentes condições. (A) Intact ovos em tiras de lixa, mantidas em uma umidade alta (> 80%), mas sem qualquer umidade visível. Taxas de hachura devem ser acima de 90% para o selvagem-tipo Ae. aegypti se mantida corretamente. (B) ovos que eclodem antes de ser submerso em água (incubação precoce) distinguem-se por uma tampa isolada de ovo e larva visível. Isso indica que a tira de lixa foi mantida muito úmida. (C) ovos que são secas muito duramente podem entrar em colapso e são claramente visíveis pela aparência côncava. Se a folha de lixa torna-se duro também indica que os ovos podem ser muito secos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

A Figura 4 demonstra os efeitos da nutrição de qualidade inferior no desenvolvimento de larvas de Ae. aegypti . Quando recipientes são fornecidos com 0,25 mg de alimento por larvas por dia ou menos, o tempo de desenvolvimento aumenta para machos e fêmeas, e é menos síncrona do que em recipientes munida de 0,5 mg de comida. Se não for fornecida para uma alimentação adequada durante toda a duração do desenvolvimento larval, isto poderia ter um impacto adverso sobre o agendamento de manutenção. Lento-desenvolvendo indivíduos estão em risco de ser selecionado contra, alimentação de sangue pode ser adiada, e há um maior risco de mortalidade adulta antes de reprodução ocorre.

A Figura 5 mostra o comprimento da asa (uma estimativa do tamanho corporal) do Ae. aegypti adultos criados sob uma variedade de regimes de nutrição. Comprimentos de asa de machos e fêmeas diminuem substancialmente e tornam-se mais variáveis quando a nutrição é suboptimal. Tamanhos de corpo uniforme são importantes para comparações experimentais como tamanho do corpo está positivamente associado à fecundidade, e esperam-se grandes mosquitos que apresentam maior aptidão sob condições de campo a33,34,35 .

Os efeitos de infecções Wolbachia sobre as características acima são descritos em outros estudos, mas geralmente há pouco ou nenhum efeito23,39,49.

Figure 4
Figura 4: Proporção cumulativa de fêmeas (A) Ae.aegypti e (B) os machos desenvolver até à idade adulta sob regimes de diferentes alimentos a 26 ° C. 100 larvas foram criadas em recipientes de 500 mL de água (densidade larval de 0,2 larvas por mL), fornecidos com diferentes níveis de alimentos (ver tabela de materiais) e marcou para o seu tempo de desenvolvimento. Somente as larvas que sobreviveram até à idade adulta foram incluídas. Barras de erro são erros-padrão, com n = 4 repetições por tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Comprimento de asa de fêmeas (A) Ae.aegypti e (B) os machos desenvolvendo sob regimes de diferentes alimentos a 26 ° C. 100 larvas foram criadas em recipientes de 500 mL de água (densidade larval de 0,2 larvas por mL) e fornecidas com níveis diferentes de comida. Um subconjunto de adultos então foi medido por seu comprimento de asa usando métodos anteriormente descritos,56. Barras de erro são desvios-padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Seguindo o protocolo aqui apresentado para a manutenção de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deverão assegurar que mosquitos saudáveis de uma qualidade consistente são produzidos para experimentos e abrir campo de lançamentos. Em contraste com outros protocolos que priorizem a produção de grandes quantidades de mosquitos (ver referência57), os métodos estão focados em maximizar sua aptidão, tanto dentro de gerações implementando relaxadas condições de criação e do outro lado gerações, minimizando a adaptação de endogamia, seleção e laboratório. Este protocolo também é projetado especificamente para Ae. aegypti com Wolbachia infecções, mas deve ser adequado para qualquer tipo de Ae. aegypti. No entanto, não é apropriado para a criação de grandes quantidades (na ordem de milhões por semana), que podem ser necessárias para lançamentos de inseto estéril ou incompatíveis que requerem números elevados atingir a população supressão57,58.

Existem alguns passos essenciais que devem ser seguidos com cuidado. É importante alimentar as larvas de forma otimizada e evitar superlotação para a duração do seu desenvolvimento. Isso garantirá que os mosquitos desenvolvem de forma síncrona e são de um tamanho consistente. Especial deve também ter cuidado ao acondicionamento dos ovos; larvas podem muito facilmente chocar muito cedo ou ovos podem desidratar-se os substratos de oviposição são demasiado húmidos ou secos, respectivamente. Em todas as etapas do protocolo, recomendamos permitindo tempo suficiente para tantas pessoas na colônia quanto possível para completar cada fase. Seleção contra os indivíduos que são lentos para desenvolver, amadurecem, alimentação de sangue, ovipositar ou chocar provavelmente causará a perda de variação genética.

Notamos algumas considerações adicionais para a manutenção de Wolbachia-infectados mosquitos que não são descritos no protocolo acima. É possível para infecções de Wolbachia a perda de colônias de laboratório, e, por conseguinte, recomendamos que colônias ser monitorado rotineiramente para seu status de infecção Wolbachia . Nós usamos quantitativa do polymerase reação em cadeia (qPCR)49,59 para testar pelo menos 30 indivíduos de cada Wolbachia-infectados linha a cada geração. Se todos os indivíduos teste negativo para a infecção de Wolbachia apropriada, colônias podem ser purificadas isolando tantas mulheres quanto possível da colônia afetada e usando progênie de mães infectadas apenas, para fundar a próxima geração. A causa da perda de algumas estirpes de Wolbachia de colônias de laboratório é desconhecida, mas poderia ser explicada pela falha de controles de temperatura, como as altas temperaturas podem causar a perda de Wolbachia infecções47, 60.

Colônias e experiências também podem ser contaminadas com indivíduos de diferentes linhas se não é tomado quando criação. Contaminação pode resultar de pipetagem descuidado de larvas, mistura-se lotes de ovos, tachar gaiolas ou incorretamente sexagem pupas em cruzes. Especiais, portanto, tenha cuidado ao manusear as colónias com diferentes tipos de infecção de Wolbachia . Limpar completamente qualquer copos de oviposição, bandejas e jaulas de criação antes de reutilizar, limpar pipetas antes de manusear cada bandeja nova de larvas e limpar a malha cada vez quando a transferência de larvas e pupas para outros recipientes. Além disso, inspecione os dedos para ovos quando tiras de lixa de manipulação e usar toalhas de papel fresca quando secar cada tira, certifique-se de que os adultos sejam o sexo correto antes de liberá-los em gaiolas e lidar rapidamente com qualquer fugitivos. Tomar estas precauções deve evitar mais contaminação, mas colônias devem ainda ser rotineiramente monitoradas utilizando ensaios diagnóstico59.

Feminino Ae. aegypti necessitam de uma refeição de sangue para colocar ovos, e laboratórios em todo o mundo fornecem-los em uma variedade de maneiras, de membrana alimentação sistemas57, comedido animais61 e, em menor medida, o sangue artificial62 . No entanto, mosquitos com infecções experimentais Wolbachia frequentemente executam mal no sangue não-humano e podem apresentar redução da fecundidade e taxas de escotilha e transmissão incompleta de Wolbachia a sua prole63, 64 , 65. mantendo a receptividade das fêmeas de odores humanos é igualmente importante para mosquitos para ser lançado no campo, e alimentá-los através de membranas ou outros animais pode comprometer esta capacidade37. Portanto, optamos por usar o antebraço de voluntários humanos para este protocolo de manutenção de colônia, embora outros métodos são necessários em algumas circunstâncias. Sangue deve ser fornecido através de outros meios ao trabalhar diretamente com arbovírus, e deve ter cuidado quando colônias originam populações de campo com cargas virais elevadas, transmissão transovariana de arbovírus pode ocorrer66. Voluntários humanos devem também não alimentação de sangue se eles visitaram recentemente arboviral países endêmicos como pode haver um risco de transmissão.

Nossa manutenção tem como objetivo minimizar a adaptação de laboratório e pressões selectivas de protocolo, mas não há espaço para melhorias. Et al . Leftwich 42 fornecer recomendações adicionais para manter a aptidão dos mosquitos para lançamentos de campo aberto, incluindo o uso de dietas larvas mais diversificados e naturais, reduzindo a densidade de adultos em gaiolas e proporcionando um ambiente complexo. Estas considerações podem melhorar a aptidão dos Ae. aegypti para um nível maior, embora atualmente não há nenhuma evidência de mudanças de adequação devido à adaptação do laboratório no âmbito do protocolo de manutenção descrita aqui [Ross et al não publicado]. Algumas medidas adicionais podem não ser viáveis para laboratórios com espaço limitado e recursos, mas são, no entanto, vale a pena investigar. Mantendo os tamanhos de grande população, evitando grandes pressões selectivas através de protocolos de criação e execução periódica de cruzamento para mosquitos de campo deve ajudar em garantindo alta aptidão do Ae. aegypti para lançamentos de campo aberto. Os princípios envolvidos na abordagem podem ser aplicados a outras espécies de vetor de doenças para a liberação para manipular ou suprimir populações naturais de criação.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Reconhecemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig por suas contribuições para o desenvolvimento dos nossos métodos de manutenção de colônia e três revisores anônimos pelas suas sugestões que ajudaram a melhorar o manuscrito. Nossa pesquisa é suportada por um programa grant e comunhão para AAH do saúde nacional e Conselho de pesquisa médica e uma tradução concedem partir Wellcome Trust. PAR é um destinatário de um bolsa de programa de treinamento de investigação australiano governo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

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