Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Behoud van Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes aegypti muggen geïnfecteerd met Wolbachia worden vrijgegeven in natuurlijke populaties te onderdrukken van de overdracht van arboviruses. We worden methoden beschreven aan achterzijde Ae. aegypti met Wolbachia infecties in het laboratorium voor experimenten en veld release, voorzorgsmaatregelen nemen om laboratorium aanpassing en selectie te minimaliseren.

Abstract

Aedes aegypti muggen experimenteel geïnfecteerd met Wolbachia zijn in de verspreiding van arboviruses zoals dengue en chikungunya Zika-programma's wordt gebruikt. Wolbachia-geïnfecteerde muggen kunnen worden vrijgegeven in het veld te ofwel verminderen bevolking maten door incompatibele verparingen of te transformeren van populaties met muggen die vuurvaste tot overdracht van het virus. Deze strategieën om te slagen, moeten de muggen vrijkomen in het veld van het laboratorium kunnen concurreren met inheemse muggen. Echter, behoud van de muggen in het laboratorium kan leiden tot inteelt en genetische drift laboratorium aanpassing die kan verminderen hun fitness in het veld en de resultaten van experimenten kan verwarren. Om te testen de geschiktheid van verschillende Wolbachia infecties voor implementatie in het veld, is het noodzakelijk om muggen in een gecontroleerde laboratoriumomgeving over meerdere generaties. Beschrijven we een eenvoudig protocol voor het handhaven van Ae. aegypti muggen in het laboratorium, geschikt voor beide Wolbachia is-besmette en wild-type muggen. De methoden minimaliseren laboratorium aanpassing en uitvoering outcross te verhogen van de relevantie van de experimenten aan veld muggen. Bovendien worden kolonies bijgehouden onder optimale omstandigheden te maximaliseren hun geschiktheid voor open veld releases.

Introduction

Aedes aegypti muggen zijn verantwoordelijk voor het overbrengen van enkele van de belangrijkste arboviruses in de wereld, met inbegrip van Zika, dengue en chikungunya1. Deze virussen worden een steeds ernstiger bedreiging vormt voor de gezondheid van de mondiale zoals de wijdverspreide distributie van Ae. aegypti in de tropen blijft uitbreiden van2,3,4. Vrouwelijke Ae. aegypti netcongestieproblemen voeden met menselijk bloed5 en dus de neiging om te leven dicht bij de mens, met name in stedelijke gebieden waar populaties dichtste zijn. Door deze nauwe samenwerking met de mens hebben ze ook aangepast om te broeden in kunstmatige habitat, inclusief banden, potten, dakgoten en water tanks6,7. AE. aegypti ook gemakkelijk aan te passen aan laboratorium omgevingen waar zij kunnen worden gehandhaafd zonder speciale eisen na wordt verzameld rechtstreeks uit het veld, in tegenstelling tot sommige andere soorten in de Aedes geslacht8, 9,10. Hun gemak van onderhoud ze wijd studeerde in het laboratorium in een brede waaier van velden heeft gezien, uiteindelijk gericht op het bepalen van de ziekten muggen kan doorgeven.

Traditioneel, afhankelijk arboviral controle sterk van het gebruik van insecticiden te verminderen mug populaties. Echter, er is steeds meer belangstelling in benaderingen waar gemodificeerde muggen zijn gekweekt in het laboratorium en vervolgens vrijgelaten in natuurlijke populaties. Vrijgegeven muggen kunnen genetisch gewijzigd worden11,12,13, biologisch14,15, door middel van bestraling16, chemische behandeling17,18, of met gecombineerde technieken19 onderdrukken van de bevolking van muggen of vervang ze door muggen die vuurvaste arboviral transmissie20.

Wolbachia zijn bacteriën die momenteel worden gebruikt als een agent van de biologische bestrijding voor arboviruses. Verschillende stammen van Wolbachia werden onlangs binnengebracht Ae. aegypti experimenteel met behulp van embryonale microinjection21,22,23,24. Deze stammen verminderen de capaciteit van de arboviruses te verspreiden en te repliceren in de mug, het afnemen van hun transmissie potentiële23,25,26,27,28 . Wolbachia infecties worden doorgegeven van moeder aan nakomelingen, maar bepaalde spanningen steriliteit induceren wanneer geïnfecteerde mannen met niet geïnfecteerde vrouwen22 paren. Wolbachia-geïnfecteerde mannen kunnen daarom worden vrijgegeven in grote hoeveelheden natuurlijke mug populaties, zoals onlangs is aangetoond in andere Aedes -soorten15,29te onderdrukken. Nochtans, aangezien Wolbachia ook remmen arboviral transmissie in Ae. aegypti, muggen kunnen ook worden vrijgegeven ter vervanging van de inheemse bevolking met armere vectoren. Ae. aegypti experimenteel geïnfecteerd met Wolbachia worden nu vrijgegeven in het veld in verschillende landen met behulp van deze laatste benadering14,30,31.

Wolbachia-gebaseerde benaderingen voor arboviral besturingselement afhankelijk van een goed begrip van de interacties tussen Wolbachia, de mug en het milieu. Wolbachia van nature in een breed scala van insecten, en de stammen binnengebracht muggen zijn divers in hun effecten32. Als nieuwe Wolbachia infectie typen in Ae. aegypti24worden binnengebracht, is het noodzakelijk te karakteriseren van elke stam voor hun effecten op de mug fitness, voortplanting en arboviral storing onder een aantal voorwaarden. Strenge experimenten in het laboratorium is dus vereist voor het beoordelen van het potentieel voor Wolbachia stammen om te slagen in het veld.

Open veld releases van Ae. aegypti met Wolbachia infecties kunnen vereisen vaak duizenden tot tienduizenden muggen per release zone worden gehouden elke week14,30,31. Het succes van de eerste releases kan worden verbeterd door het vrijgeven van muggen van een groot formaat om hun vruchtbaarheid33 en paring succes34,35te maximaliseren. Muggen moeten ook worden aangepast aan de omstandigheden die ze in het veld beleeft, maar op lange termijn laboratorium fokken kan er wijzigingen optreden in gedrag en fysiologie die veld prestaties36,37beïnvloeden kon, 38.

Beschrijven we een eenvoudig protocol voor het opfokken van Ae. aegypti in het laboratorium met behulp van basisuitrusting. Dit protocol is geschikt voor zowel wild-type en Wolbachia-besmette muggen, de laatste speciale aandacht vereisen kan omdat sommige Wolbachia spanningen aanzienlijke gevolgen voor de mug levensgeschiedenis traits39, hebben 40. de steigerend voorwaarden voorkomen dat overbevolking en concurrentie voor voedsel te produceren muggen met een consistent formaat, die essentieel is voor de vector competentie en fitness experimenten en zorgt ervoor dat de muggen gezond voor veld release41 zijn . Wij ook voorzorgsmaatregelen te nemen om laboratorium aanpassing en inteelt te minimaliseren door selectieve druk te verminderen en ervoor te zorgen dat de volgende generatie is gesampled uit een grote, random pool. Laboratorium omgevingen zijn duidelijk verschilt van veldomstandigheden echter, en op lange termijn onderhoud ontspannen omstandigheden kan verminderen de geschiktheid van muggen op introductie in het veld37,42,43 . Daarom steken wij vrouwtjes uit laboratorium lijnen voor veld-verzameld mannetjes regelmatig, wat resulteert in kolonies die genetisch vergelijkbaar voor experimentele vergelijkingen en die zijn aangepast aan de doelgroep veld bevolking39. De methoden vereisen geen speciale apparatuur en kunnen worden opgeschaald tot achterzijde tientallen van duizenden personen per week voor veld releases. Het protocol wordt ook de geschiktheid van muggen binnen en tussen generaties, een belangrijke overweging voor insecten die bestemd zijn voor de inrichting in natuurlijke populaties prioriteit. Het protocol is geschikt voor de meeste laboratoria die vereisen onderhoud van Ae. aegypti, met name voor experimentele vergelijkingen waar een consistente kwaliteit van muggen en relatability naar het veld zijn belangrijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bloed voederen van muggen op menselijke proefpersonen werd goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne menselijke ethische Commissie (goedkeuring #: 0723847). Alle vrijwilligers die op de hoogte gesteld schriftelijke toestemming.

1. de larvale fokken

Opmerking: Muggen worden gehouden op 26 ± 0,5 ° C en 50-70% relatieve vochtigheid, met een 12:12 h (licht: donker) fotoperiode voor dit onderhoudsprotocol kolonie. Deze voorwaarden zijn vergelijkbaar met de gemiddelde klimatologische omstandigheden in Cairns, Australië en binnen de optimale thermische bereik voor Ae. aegypti overleving en ontwikkeling44,45,46. Hoge temperaturen kunnen resulteren in het verlies van Wolbachia infecties van mug kolonies en moeten vermeden47. Wij behouden ten minste 500 exemplaren per bevolking om te minimaliseren van inteelt; behoud van kolonies van een kleinere omvang kan fitness gevolgen [Ross et al. ongepubliceerde] hebben. Onder deze omstandigheden en uitgaande adequate voeding is de gemiddelde generatietijd 28 dagen (Zie tabel 1).

  1. Onderdompelen van de eieren op substraat in bakjes (figuur 1A) met 3 L water (omgekeerde osmosewater of leeftijd leidingwater, gegenereerd door het verlaten van leidingwater in bakjes voor 24 h vóór gebruik), ~ 300 mg visvoer (een geplet tablet, Zie Tabel van materialen) en een enkele korrels voor actieve droge gist voor het opwekken van broedeieren48.
  2. Een dag na het uitkomen, kunt een glazen pipet ongeveer 500 larven overbrengen in bakjes met 4 L water (figuur 1B), rekenen met behulp van een clicker counter. Twee gemalen vis eten tabletten toevoegen aan elke lade. Indien nodig, gebruik van containers van verschillende maten voor het opfokken van larven (figuur 1A), maar houden van larvale dichtheden lager dan 0.5 larven/mL om te voorkomen dat overbevolking.
  3. Dagelijks de schaaltjes controleren om ervoor te zorgen dat de larven voldoende voedsel; om de twee dagen ongeveer twee tabletten van voedsel aan de schaaltjes toevoegen. Verstrekken van voedsel ad libitum maar zorgen dat 0,5 mg/larve/dag is beschikbaar gedurende deze periode om ontwikkeling is synchroon en lichaam grootte strookt, anders kunnen de resultaten van experimenten worden verward (Zie vertegenwoordiger resultaten).
  4. Zorg om te voorkomen dat het overfeeding van larven, met name in kleinere steigerend containers met minder water oppervlakte en volume. Als het water ziet er troebel of als er belangrijke larvale sterfte, vervangt het door vers water; sterfte moet te verwaarlozen als larven zijn optimaal gevoed.

2. erotische opkomst

Opmerking: Larven zullen beginnen te verpoppen vanaf vijf dagen na het uitkomen als goed gevoed en de meerderheid moet verpoppen door zeven dagen na het uitkomen. Volwassenen zal beginnen ongeveer twee dagen na verpopt opkomende als optimaal op 26 ° C gehouden (Zie Vertegenwoordiger resultaten). Larvale ontwikkeling wordt meestal beïnvloed door Wolbachia infecties als voldoende voedsel beschikbaar is23,39,49.

  1. Zeven dagen na het uitkomen giet de hele inhoud van de lade door een fijn gaas (porie-grootte 0,4 mm). Houd de larvale gefilterd water voor later gebruik in ovicups (zie "Bloed voeden en Oviposition" sectie). Omkeren van de Maas en dompel het in een plastic container met 200 mL water over te dragen van de poppen. Zorgen voor extra voedsel als larven blijven.
  2. De volwassen opkomst kooien (Figuur 1 c) voor te bereiden door middel van twee kopjes 10% sacharoseoplossing (figuur 1F) en twee kopjes vochtige watten ter voorkoming van uitdroging (figuur 1E).
  3. Als de poppen niet hoeft te worden gesorteerd op geslacht, plaats de hardplastic containers van poppen in de kooi en laat het deksel licht kier om de volwassenen te ontstaan in de kooi. U kunt ook plaats een omgekeerde trechter over de container om te minimaliseren van verdrinking. Zorgen dat alle volwassenen zijn ontstaan voordat u de container verwijdert uit de kooi om te voorkomen dat tegen trage ontwikkelaars selecteren.

3. pop Sexing voor kruising

  1. Als de poppen hoeft te worden gesorteerd op seks (bijvoorbeeldvoor outcross), de poppen vanuit larvale lade Pipetteer en scheiden de geslachten (Figuur 2) in kunststof containers (figuur 1A) met 200 mL water elke 24 h tot het gewenste aantal van elk geslacht is bereikt. Plaats van deksels op de recipiënten en laat hen gesloten.
  2. Volwassenen zal ontstaan in de containers; bevestigen hun geslacht voordat het vrijgeven van in kooien (figuur 2C). Verwijder alle volwassenen sexed ten onrechte met een aspirator binnen de 24u van opkomst voordat ze geslachtsrijp. Zodra de seksen hebben bevestigd, laat de volwassenen in kooien elke 24 h.
  3. Verkrijgen van Wolbachia-besmette kolonies van een vergelijkbare genetische achtergrond op een natuurlijke populatie, genenoverdracht door toe te voegen Wolbachia-besmet vrouwtjes uit laboratorium koloniën te kooien van niet geïnfecteerde mannen afgeleid van eieren die zijn verzameld door ovitraps in het veld39, behoud van de voorgeschreven dichtheid van 500 exemplaren per bevolking.
    1. Herhaal de outcross voor ten minste drie opeenvolgende generaties tot kolonies die ten minste 87,5% genetisch vergelijkbaar aan de veld bevolking39. Kritische: Ervoor zorgen dat de seksen correct in dit stadium zijn (zie stap 3.1).
  4. Vrouwelijke Ae. aegypti zijn meestal vuurvaste aan verdere inseminatie binnen enkele uren na de paring50. Als outcross kolonies, kunnen de vrouwtjes en de mannetjes om te rijpen in aparte kooien voor twee dagen en dan de vrouwtjes in de mannelijke kooi gecombineerd om een gelijke kans voor alle mannetjes.

4. bloed voeden en Oviposition

  1. Wacht ten minste drie dagen nadat het laatste vrouwtje gekomen voordat bloed voeding zodat u voldoende tijd om te rijpen. Bloed voeden de vrouwtjes binnen twee weken na opkomst om te voorkomen dat buitensporige sterfte, met name voor muggen met Wolbachia infecties die levensduur22,24,49nadelig te beïnvloeden. Verwijder de kopjes suiker de dag voorafgaand aan voeding ter verbetering van de voeding tarieven.
    1. Vraag een vrijwilliger hun onderarm invoegen in de kooi om de vrouwelijke muggen te voeden. De meeste vrouwtjes moeten voeden naar herverpakking binnen 5 min, maar om selectie tegen trage feeders, laat de onderarm in de kooi gedurende 15 minuten of totdat alle vrouwtjes zijn zichtbaar overvuld; een latex handschoen ter bescherming van de hand van beten is optioneel maar aanbevolen.
    2. Twee dagen na het voederen van bloed, plaats twee plastic bekers waarin larvale steigerend water en bekleed met een strook van schuurpapier (figuur 1G) (of filtreerpapier (Figuur 1 H)) in de kooi voor vrouwen om eieren te leggen. Gedeeltelijk dompelen de schuurpapier-strip in het water het om vochtig te houden. Verwijder andere bronnen van water om te voorkomen dat de vrouwtjes hun eieren te leggen buiten de oviposition cup.
      Opmerking: leidingwater kan worden gebruikt in de cups, maar water larvale-fokken moedigt oviposition51,52 en vrouwtjes zullen leggen hun eieren meer synchroon.

5. de eicelpunctie en conditionering

  1. De vrouwtjes zal eieren leggen op het schuurpapier net boven de waterlijn; verzamelen en vervang de stroken schuurpapier dagelijks totdat er geen meer eieren worden gelegd. Merk op dat oviposition kan blijven voor maximaal een week.
  2. Gedeeltelijk droog het schuurpapier stroken door blotting hen zachtjes op een papieren handdoek voor 30 s, verzorgen niet te verjagen van de eieren. Vervolgens wikkel de strips in een blad van droog papieren handdoek en leg deze in een afsluitbare plastic zak (figuur 1I).
  3. Controleer de toestand van de eieren onder een ontleden Microscoop (Figuur 3). Als het schuurpapier stroken zijn te nat, eitjes kan voordat het wordt ondergedompeld in water (figuur 3B), maar als gedroogd te hard, eieren afglijdt (Figuur 3 c).
  4. De eieren kunnen worden geleverd op elk gewenst moment na drie dagen na collectie; alle eieren uit elke kolonie, verzameld over alle dagen, in dezelfde container van water om ervoor te zorgen dat de volgende generatie van een grote, random pool van individuen wordt bemonsterd uitkomen.
  5. Voor langdurige opslag, houden de eieren in een verzegelde container op een hoog (> 80%) luchtvochtigheid rond de 20 ° C. Onder deze omstandigheden kunnen de eieren zonder Wolbachia maandenlang met behoud van hoge hatch tarieven53,54worden opgeslagen.
  6. Zoals sommige Wolbachia infecties sterk de levensvatbaarheid van de eieren met leeftijd49,55 verminderen, komen de eieren uit Wolbachia-besmet lijnen binnen een week na collectie om te voorkomen dat buitensporige sterfte voor de relevante stammen. Bloed voeden de vrouwtjes weer na één week als meer eieren nodig zijn.
Dag Stap
0 Hatch eieren
1 Aantal larven in trays
7 Larven en poppen overbrengen naar de kolonie kooien
17 Bloed voeden vrouwelijke volwassenen
21 Beginnen met het verzamelen van eieren
25 Afwerking, verzamelen van eieren
28 Hatch eieren

Tabel 1: Overzicht van het onderhoudsschema van de kolonie Ae. aegypti op 26 ° C. De timing van de vrouwelijke bloed-voeding en het uitbroeden van de eieren is flexibel, maar de lange duur in deze fasen moeten worden vermeden, met name voor muggen geïnfecteerd met Wolbachia, om te minimaliseren van sterfte. Na dit schema minimaliseert selectie tegen muggen die snel of langzaam te ontwikkelen of oudere in alle levensstadia, mits de larven zijn optimaal gevoed.

Figure 1
Figuur 1: Apparatuur die wordt gebruikt voor het opfokken van Ae. aegypti in het laboratorium. (A) Plastic recipiënten die worden gebruikt voor broedeieren of fokken larven met volumes van 500, 750 en 5.000 mL (van links naar rechts). (B)-vak gebruikt voor het opfokken van larven bij een gecontroleerde dichtheid, gewoonlijk 500 larven in 4 L water. (C) 19,7 L en (D) 3 L kooien gebruikt voor huisvesting volwassenen. Een dichtheid van 25 volwassenen of minder per liter moet worden gehandhaafd om te bieden voldoende ruimte. (E) 35 mL beker met vochtige watten geleverd als een bron van water voor volwassenen. (F) 35 mL beker met sacharoseoplossing geboden door middel van een koord of tandheelkundige wick als een bron van suiker. (G-H) Bekers gevuld met larvale steigerend water en bekleed met een oviposition substraat van schuurpapier of filtreerpapier (G en H, respectievelijk). (ik) Zip-lock zak gebruikt voor opslag van schuurpapier stroken of filtreerpapier. Zwarte vlekken op schuurpapier zijn mug eieren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Laterale (A) en dorsale (B) uitzicht op poppen en volwassen Ae. aegypti (C) aan te tonen hun seksueel dimorfisme. Mannetjes zijn geplaatst aan de linkerzijde en de vrouwtjes aan de rechterkant in elk deelvenster. Wanneer optimaal gevoed, mannelijke en vrouwelijke poppen onderscheiden zich door grootte; vrouwtjes worden groter dan mannetjes (A) en hebben een relatief bolvormige kopborststuk in vergelijking met mannen hebben platter zijden (B). Mannelijke volwassenen zijn gemakkelijk onderscheiden van de vrouwtjes onder alle steigerend omstandigheden, vooral door hun plumose antennes en lange ook. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Vier dagen oude Ae. aegypti eieren onder verschillende omstandigheden. (A) Intact eieren op schuurpapier stroken gehandhaafd op een hoog (> 80%) luchtvochtigheid, maar zonder zichtbaar vocht. Hatch tarieven moet boven 90% voor wild-type Ae. aegypti als goed onderhouden. (B) eieren, die uitkomen voor wordt ondergedompeld in water (vroegrijp broedeieren) worden gekenmerkt door een vrijstaande ei GLB en zichtbaar larve. Dit geeft aan dat de strip schuurpapier te vochtige werd gehouden. (C) eieren die zijn gedroogd te hard afglijdt, en door hun holle verschijning duidelijk zichtbaar zijn. Als het schuurpapier stijf wordt betekent dit ook dat de eieren mogelijk te droog. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4 toont de gevolgen van suboptimaal voeding voor de ontwikkeling van het larven Ae. aegypti . Wanneer containers beschikbaar met 0,25 mg voedsel per larve per dag of minder, de ontwikkeltijd verhoogt voor zowel mannen als vrouwen, en is minder synchrone dan in recipiënten voorzien van 0.5 mg van voedsel. Als voldoende voedsel niet gedurende de looptijd van larvale ontwikkeling wordt geleverd, kan dit een negatief effect hebben op het onderhoudsschema. Langzaam-ontwikkeling van individuen dreigen tegen wordt geselecteerd, bloed voeden kan vertraging oplopen en bestaat een hoger risico van volwassen sterfte voordat reproductie plaatsvindt.

Figuur 5 toont de lengte van de vleugel (een schatting van de lichaamsgrootte) van Ae. aegypti volwassenen gefokt onder een verscheidenheid van voeding regimes. Vleugel lengtes van zowel mannen als vrouwen aanzienlijk verminderen en worden meer variabele wanneer voeding suboptimaal is. Uniforme lichaam maten zijn belangrijk voor experimentele vergelijkingen als lichaamsgrootte positief geassocieerd met vruchtbaarheid is, en grote muggen worden verwacht om te exposeren meer fitness onder veld voorwaarden33,34,35 .

De effecten van Wolbachia infecties op de eigenschappen die hierboven worden beschreven in andere studies, maar over het algemeen is er weinig tot geen effect23,39,49.

Figure 4
Figuur 4: Cumulatieve deel van Ae.aegypti (A) vrouwen en (B) mannen ontwikkeling naar volwassenheid onder andere voeding regimes bij 26 ° C. 100 larven zijn gefokt in recipiënten met 500 mL water (een larvale dichtheid van 0,2 larven per mL), verschillende niveaus van voedsel voorzien (Zie tabel van materialen) en scoorde voor hun ontwikkelingstijd. Alleen larven die tot volwassenheid overleefde werden opgenomen. Foutbalken zijn standaardfouten, met n = 4 wordt gerepliceerd per behandeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Wing lengte van Ae.aegypti (A) vrouwen en (B) mannen ontwikkelen onder andere voeding regimes bij 26 ° C. 100 larven werden gefokt in recipiënten met 500 mL water (een larvale dichtheid van 0,2 larven per mL) en verschillende niveaus van voedsel voorzien. Een subset van volwassenen was dan voor hun vleugel lengte gemeten met behulp van de eerder beschreven methoden56. Foutbalken zijn standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Volgens het protocol hier gepresenteerd voor het onderhoud van Wolbachia-besmette Ae. aegypti moeten ervoor zorgen dat gezonde muggen van een constante kwaliteit worden geproduceerd voor experimenten en veld releases open. In tegenstelling tot andere protocollen die het prioriteren van de productie van massale hoeveelheden muggen (zie referentie57), zijn de methoden gericht op het maximaliseren van hun fitness, zowel binnen de generaties door ontspannen steigerend uitvoeringsvoorwaarden en over generaties door het minimaliseren van inteelt, selectie en laboratorium aanpassing. Dit protocol is ook speciaal ontworpen voor Ae. aegypti met Wolbachia infecties maar moet geschikt zijn voor elk type Ae. aegypti. Het is echter niet geschikt voor het fokken van grote hoeveelheden (in volgorde van miljoenen per week), die noodzakelijk zijn voor steriele of incompatibele insect releases waarvoor hoge aantallen tot57,58van de onderdrukking van de bevolking kunnen zijn.

Er zijn enkele essentiële stappen die moeten zorgvuldig worden gevolgd. Het is belangrijk om te voeden van de larven optimaal en te voorkomen dat overbevolking voor de duur van hun ontwikkeling. Dit zal ervoor zorgen dat de muggen synchroon ontwikkelen en van een consistent formaat zijn. Speciale zorg moet ook worden genomen wanneer de conditionering van de eieren; larven kunnen heel gemakkelijk te vroeg uitkomen of eieren kunnen droog als de oviposition substraten te nat of droog, respectievelijk. Bij alle stappen in het protocol, is het raadzaam de waardoor genoeg tijd voor zo veel mensen in de kolonie mogelijk bij het voltooien van elke fase. Selectie tegen personen die langzaam te ontwikkelen, rijpen, bloed van diervoeders, oviposit of uitkomen zal waarschijnlijk leiden tot het verlies van genetische variatie.

Wij constateren dat sommige verdere overwegingen voor het onderhoud van Wolbachia-besmette muggen die niet zijn beschreven in het bovenstaande protocol. Het is mogelijk voor Wolbachia infecties verloren uit laboratorium koloniën, en daarom is het raadzaam dat de kolonies routinematig worden gecontroleerd op hun Wolbachia infectie status. Wij kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR)49,59 gebruiken om te testen van ten minste 30 personen uit elke Wolbachia-besmet lijn elke generatie. Als individuele negatief voor de juiste Wolbachia infectie test, kunnen kolonies worden gezuiverd door isoleren van zoveel vrouwen zoveel mogelijk uit de getroffen kolonie en vervolgens met behulp van nakomelingen van besmette moeders alleen gevonden van de volgende generatie. De oorzaak van het verlies van sommige Wolbachia virusstammen uit laboratorium kolonies is grotendeels onbekend, maar kon worden verklaard door het falen van thermostaten schakelt, zoals hoge temperaturen leiden het verlies van Wolbachia infecties47tot kunnen, 60.

Koloniën en experimenten kunnen ook besmet raken met personen uit verschillende lijnen als zorg niet genomen is wanneer het fokken. Besmetting kan voortvloeien uit het onzorgvuldig pipetteren van larven, mengen kunt u batches van eieren, beleidseenheden kooien of onjuist sexing poppen in kruist. Speciale zorg moet daarom worden genomen bij de behandeling van de kolonies met verschillende Wolbachia infectie. Grondig schoon elke oviposition bekers, kweek trays en kooien voor hergebruik van hen, schoon uit pipetten vóór de behandeling van elke nieuwe lade van larven en reinigen van de Maas, elke keer bij het overbrengen van larven en poppen naar andere containers. Bovendien, inspecteren vingers voor eieren wanneer schuurpapier stroken en gebruik van verse papieren handdoeken bij het drogen elk strip, ervoor zorgen dat volwassenen het juiste geslacht voordat ze in kooien en elke ontsnapte snel behandelen. Deze voorzorgsmaatregelen nemen moet de meeste besmetting te voorkomen, maar kolonies moeten nog steeds worden regelmatig gecontroleerd met behulp van diagnostische testen59.

Vrouwelijke Ae. aegypti een bloed-maaltijd nodig leggen eieren, en laboratoria over de hele wereld bieden hen in een verscheidenheid van manieren, membraan voeding systemen €57, ingetogen dieren61 en, in mindere mate, kunstmatig bloed62 . Echter, muggen met experimentele Wolbachia infecties vaak slecht presteren op het bloed van niet-menselijke, en kunnen vertonen verminderde vruchtbaarheid en gearceerde tarieven en onvolledige overdracht van Wolbachia op hun nakomelingen63, 64 , 65. behoud van de ontvankelijkheid van de vrouwtjes aan menselijke geuren is ook belangrijk voor muggen te zijn vrijgegeven in het veld, en door middel van membranen of andere dieren te voederen kan deze mogelijkheid37in gevaar brengen. We kiezen daarom voor het gebruik van de onderarm van menselijke vrijwilligers voor deze kolonie onderhoudsprotocol, hoewel andere methoden zijn vereist onder bepaalde omstandigheden. Bloed moet worden geleverd door andere middelen wanneer u rechtstreeks werkt met arboviruses en zorg moet worden genomen wanneer kolonies zijn afkomstig uit veld populaties met hoge virale loads als transovarial overdracht van arboviruses66kan optreden. Menselijke vrijwilligers moeten ook niet bloed diervoeders als ze arboviral endemische landen onlangs bezocht hebt omdat er mogelijk een risico op overdracht.

Ons onderhoud protocol is gericht op het minimaliseren van de aanpassing van het laboratorium en selectieve druk hebben, maar er is ruimte voor verbetering. Leftwich et al. 42 bieden verdere aanbevelingen voor het handhaven van de geschiktheid van muggen voor open veld releases, met inbegrip van het gebruik van meer divers en natuurlijke larvale diëten, vermindering van de dichtheid van volwassenen in kooien en een complexe omgeving. Deze overwegingen kunnen verbeteren de geschiktheid van Ae. aegypti naar een hoger niveau, hoewel op dit moment er geen bewijs van fitness veranderingen als gevolg van de aanpassing van het laboratorium van de onderhoudsprotocol met de hier beschreven [Ross et al. niet gepubliceerd is]. Enkele aanvullende maatregelen kunnen niet haalbaar zijn voor laboratoria met beperkte ruimte en middelen, maar zijn toch moeite waard te onderzoeken. Het onderhouden van grote populatie maten, het vermijden van grote selectieve druk door middel van kweek van protocollen en uitvoering van moet periodieke outcross aan veld muggen helpen om ervoor te zorgen de hoge geschiktheid van Ae. aegypti voor open veld releases. De beginselen die betrokken zijn bij de aanpak kunnen worden toegepast op het fokken van andere ziekte vector soorten voor release te manipuleren of onderdrukken van natuurlijke populaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Wij erkennen Heng Lin Yeap, Chris Paton Petrina Johnson en Clare Doig voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van onze kolonie onderhoud methoden en drie Anoniem reviewers voor hun suggesties die bijgedragen aan een verbetering van het manuscript. Ons onderzoek wordt ondersteund door een programma grant en de fellowship te AAH van de National Health en Medical Research Council en een vertaling van de Wellcome Trust verlenen. PAR is een ontvanger van een Australische regering onderzoek opleiding programma beurs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Tags

Basisprotocol kwestie 126 insecten kweek mosquito Aedes aegypti knokkelkoorts Zika Wolbachia fitness bloed voeden
Behoud van <em>Aedes aegypti</em> muggen geïnfecteerd met <em>Wolbachia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, P. A., Axford, J. K.,… More

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter