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Biology

Maintenir les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Les moustiques Aedes aegypti infectés par Wolbachia sont libérés dans les populations naturelles de supprimer la transmission des arbovirus. Nous décrivons des méthodes arrière Ae. aegypti Wolbachia infections en laboratoire pour des expériences et sortie de terrain, prendre des précautions pour réduire au minimum la sélection et l’adaptation de laboratoire.

Abstract

Les moustiques Aedes aegypti infectés expérimentalement par Wolbachia sont utilisés dans des programmes pour lutter contre la propagation des arbovirus telles que la dengue, chikungunya et Zika. Wolbachia-moustiques infectés peuvent être rejetées dans le champ soit réduire la taille des populations par le biais de croisements incompatibles ou de transformer les populations de moustiques qui sont réfractaires à la transmission du virus. Pour ces stratégies réussir, les moustiques libérées dans le domaine du laboratoire doivent être compétitives avec les moustiques indigènes. Cependant, maintenir les moustiques en laboratoire peut entraîner consanguinité, dérive génétique et l’adaptation de laboratoire qui peut réduire leur aptitude dans le domaine et peut-être entraîner des résultats d’expériences. Pour tester la pertinence des différentes infections de Wolbachia pour le déploiement sur le terrain, il est nécessaire de maintenir des moustiques dans un environnement de laboratoire contrôlées à travers plusieurs générations. Les auteurs décrivent un protocole simple pour maintenir les moustiques de l’Ae. aegypti dans le laboratoire, qui convient à la fois Wolbachia-moustiques infectés et sauvage. Les méthodes minimiser l’adaptation de laboratoire et mettre en œuvre les croisements pour améliorer la pertinence des expériences aux moustiques de champ. En outre, les colonies sont maintenus dans des conditions optimales afin de maximiser leur ADEQUATION a communiqués de plein champ.

Introduction

Les moustiques Aedes aegypti sont chargés de transmettre certains de l’arbovirus plus importants dans le monde, y compris la Zika, dengue et chikungunya1. Ces virus deviennent une menace croissante pour la santé mondiale comme la généralisation de l' Ae. aegypti dans les tropiques continue à s’étendre de2,3,4. Femelles Ae. aegypti préférentiellement se nourrissent de sang humain5 et donc ont tendance à vivre à proximité de l’homme, en particulier dans les zones urbaines où les populations sont plus denses. Grâce à cette étroite association avec les humains, ils se sont également adaptés pour se reproduire dans des habitats artificiels, y compris les pneus, les pots, les gouttières et les eau réservoirs6,7. AE. aegypti aussi facilement s’adapter à des environnements de laboratoire où elles peuvent être maintenues sans toute exigence particulière après recueillie directement dans le champ, à la différence d’autres espèces dans le genre Aedes la8, 9,10. Leur facilité d’entretien les a vus a étudié largement au laboratoire dans un large éventail de domaines, en fin de compte visant à contrôler les moustiques maladies peut-être transmettre.

Traditionnellement, les arbovirus contrôle s’appuie fortement sur l’utilisation d’insecticides pour réduire les populations de moustiques. Cependant, il y a un intérêt croissant dans les approches où les moustiques modifiés sont élevés en laboratoire et ensuite rejetés dans les populations naturelles. Libéré de moustiques peuvent être modifiés génétiquement11,12,13, biologiquement14,15, par irradiation16, traitement chimique17,18, ou pour l’ensemble des techniques de19 pour réprimer les populations de moustiques ou remplacez-les par des moustiques qui sont réfractaires à arbovirus transmission20.

Wolbachia sont des bactéries qui sont actuellement utilisés comme agent de lutte biologique pour les arbovirus. Plusieurs souches de Wolbachia ont été récemment introduits dans Ae. aegypti expérimentalement à l’aide de microinjection embryonnaires21,22,23,24. Ces souches réduisent la capacité des arbovirus à diffuser et à reproduire dans le moustique, diminuant leur transmission potentielle23,25,26,27,28 . Les infections de Wolbachia sont transmises de la mère à la progéniture, mais certaines souches induisent la stérilité, lorsque les hommes infectés s’accoupler avec les femelles infectées22. Wolbachia-mâles infectés peuvent donc être libérés en grande quantité pour réprimer les populations de moustiques naturels, comme l’a récemment démontrées à l’autre de15,espèces Aedes 29. Toutefois, étant donné que Wolbachia aussi inhiber la transmission arbovirue dans Ae. aegypti, moustiques peuvent être libérés pour remplacer les populations indigènes par les vecteurs les plus pauvres. Ae. aegypti infectés expérimentalement par Wolbachia sont maintenant libérés sur le terrain dans plusieurs pays à l’aide de cette dernière approche14,30,31.

Wolbachia-approches basées pour contrôle arboviru reposent sur une bonne compréhension des interactions entre le Wolbachia, les moustiques et l’environnement. Wolbachia sont présents naturellement dans un large éventail d’insectes, et les souches introduites dans les moustiques sont variés dans leurs effets32. Nouveaux types d’infection de Wolbachia sont introduit dans Ae. aegypti24, il est nécessaire de caractériser chaque souche pour leurs effets sur l’aptitude de moustique, de reproduction et de brouillage arboviru dans un éventail de conditions. Une expérimentation rigoureuse en laboratoire est donc nécessaire d’évaluer le potentiel des souches de Wolbachia réussir dans le domaine.

Rejets de plein champ de Ae. aegypti et les infections de Wolbachia peuvent souvent nécessiter des milliers, des dizaines de milliers de moustiques par zone de libération à être élevés chaque semaine14,30,31. Le succès des versions initiales peuvent être amélioré en libérant des moustiques d’une grande taille afin de maximiser leur fécondité33 et accouplement succès34,35. Les moustiques doivent également être adaptées aux conditions qu'ils vivront dans le champ, élevage de laboratoire cependant à long terme peut causer des changements dans le comportement et la physiologie qui pourrait avoir une incidence champ performance36,37, 38.

Les auteurs décrivent un protocole simple pour l’élevage des Ae. aegypti en laboratoire au moyen de l’équipement de base. Ce protocole est convenable pour les deux sauvage et Wolbachia-infectée de moustiques, laquelle peut nécessitent une attention particulière, comme certaines souches de Wolbachia ont des effets importants sur les moustiques démographiques caractéristiques39, 40. les conditions d’élevage éviter le surpeuplement et la compétition pour la nourriture produire des moustiques d’une taille cohérente, qui est cruciale pour la compétence vectorielle et expériences de remise en forme et veille à ce que les moustiques sont sains pour la libération de champ41 . Nous avons également prendre des précautions pour minimiser l’adaptation de laboratoire et d’endogamie en réduisant les pressions sélectives et veiller à ce que la prochaine génération est prélevé dans une grande piscine au hasard. Cependant, des environnements de laboratoire sont distinctement différentes de conditions sur le terrain, et une maintenance à long terme dans des conditions détendues pourrait réduire l’aptitude des moustiques leur libération dans la zone37,,42,43 . Nous traversons donc femelles de lignes laboratoire récoltés sur le terrain des mâles périodiquement, résultant dans les colonies qui sont génétiquement similaires pour les comparaisons expérimentales et qui sont adaptés à la population de zone cible39. Les méthodes ne requièrent pas de n’importe quel équipement spécialisé et peuvent évoluer vers le haut à l’arrière des dizaines de milliers de personnes par semaine pour les rejets de champ. Le protocole a aussi priorise l’aptitude des moustiques dans et entre les générations, une considération importante pour les insectes destinés à la mise en place dans les populations naturelles. Le protocole est adapté pour la plupart des laboratoires nécessitant une maintenance d' Ae. aegypti, en particulier pour les comparaisons expérimentales où la qualité uniforme de moustiques et narrabilité sur le terrain sont importantes.

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Protocol

Sang alimentant des moustiques sur des êtres humains a été approuvé par l’Université de Melbourne le Comité éthique humaine (approbation #: 0723847). Tous les bénévoles fournis a informé consentement écrit.

1. larvaire d’élevage

NOTE : Les moustiques sont maintenus à 26 ± 0,5 ° C et 50-70 % d’humidité relative, avec une photopériode de h (lumière : obscurité) 12:12 pour le protocole d’entretien de cette colonie. Ces conditions sont similaires aux conditions climatiques moyennes à Cairns, en Australie et au sein de la gamme thermique optimale pour la survie de l’Ae. aegypti et développement44,45,46. Des températures élevées peuvent entraîner la perte de Wolbachia infections des colonies de moustiques et devraient être évités47. Nous maintenons au moins 500 individus par population pour réduire au minimum la consanguinité ; maintien des colonies de petite taille peut avoir des conséquences de remise en forme [Ross et coll. inédit]. Dans ces conditions et en supposant une nutrition adéquate, le temps de production moyenne est de 28 jours (voir tableau 1).

  1. Plonger les oeufs sur le substrat dans les bacs (Figure 1 a) contenant 3 L d’eau (l’eau osmosée ou eau du robinet âgés, produite en laissant l’eau du robinet dans des plateaux pour 24 h avant son utilisation), ~ 300 mg de nourriture pour poissons (un écrasé tablet, voir Table des matières) et un quelques grains de levure sèche active pour provoquer l’éclosion48.
  2. Un jour après l’éclosion, utiliser une pipette de verre pour transférer environ 500 larves à plateaux contenant 4 L d’eau (Figure 1 b), compter à l’aide d’un compteur de clicker. Ajouter deux comprimés de nourriture poisson écrasé à chaque plateau. Si nécessaire, utiliser des contenants de différentes tailles pour l’élevage des larves (Figure 1 a), mais gardez la densité larvaire inférieures à 0,5 larves/mL afin d’éviter la surpopulation.
  3. Vérifier les plateaux de tous les jours afin que les larves aient suffisamment de nourriture ; Ajouter environ deux comprimés de nourriture pour les plateaux tous les deux jours. Fournir la nourriture ad libitum mais de faire en sorte que 0,5 mg/larve/jour est disponible pendant cette période afin d’assurer un développement est synchrone et la taille du corps est conforme, sinon les résultats des expériences peuvent être confondues (voir résultats représentant).
  4. Prendre soin d’éviter la suralimentation des larves, particulièrement dans des contenants plus petit élevage avec moins d’eau volume et surface. Si l’eau est trouble ou s’il y a une mortalité larvaire significative, remplacez-le par l’eau douce ; la mortalité doit être négligeable si les larves sont nourries de manière optimale.

2. adultes qui émergeait

Remarque : Les larves commenceront à se nymphoser cinq jours après l’éclosion si bien nourris et la majorité devrait se transforment en pupes de sept jours après l’éclosion. Adultes débutera émergent environ deux jours après la nymphose si maintenu optimale à 26 ° C (voir Résultats représentant). Le développement larvaire est généralement pas affecté par des infections de Wolbachia si ample alimentaire est offerte23,39,49.

  1. Sept jours après l’éclosion verser tout le contenu du bac à travers une maille fine (pore taille 0,4 mm). Garder l’eau filtrée larvaire pour une utilisation ultérieure dans ovicups (voir la section « Alimentation et Ponte sang »). Inverser le maillage et les tremper dans un récipient en plastique avec 200 mL d’eau pour transférer les pupes. Fournir de la nourriture supplémentaire si toutes les larves restent.
  2. Préparer les cages de l’émergence de l’adulte (Figure 1) en fournissant les deux tasses de solution de saccharose de 10 % (Figure 1F) et deux coupes d’ouate humide pour éviter la dessiccation (Figure 1E).
  3. Si les nymphes n’avez pas besoin d’être triés par sexe, placez les conteneurs à couvercle solidaire des nymphes dans la cage et laissez le couvercle légèrement entrouvert pour faire les adultes à émerger dans la cage. Vous pouvez également placer un entonnoir inversé sur le conteneur afin de minimiser la noyade. S’assurer que tous les adultes ont émergé avant d’enlever le conteneur de la cage afin d’éviter la sélection contre les développeurs lents.

3. nymphe sexage d’allogamie

  1. Si les nymphes avez besoin d’être triés par sexe (par exemple, pour l’allogamie), les pupes de plateaux de larves, déposer et séparer les deux sexes (Figure 2) dans des contenants en plastique (Figure 1 a) avec 200 mL d’eau toutes les 24 h jusqu'à ce que le nombre désiré de chaque sexe a été atteint. Placer les couvercles sur les récipients et les laisser fermé.
  2. Adultes émergeront dans les récipients ; confirmer leur sexe avant de la lâcher dans des cages (Figure 2). Supprimer n’importe quel adulte sexué incorrectement avec dispositif d’aspiration dans les 24h d’émergence avant qu’ils atteignent la maturité sexuelle. Une fois que les deux sexes ont été confirmés, libérer les adultes dans des cages toutes les 24 h.
  3. Pour obtenir de Wolbachia-colonies infectées d’un patrimoine génétique semblable à une population naturelle, croiser en ajoutant Wolbachia-infectés par les femelles des colonies de laboratoire aux cages des mâles non infectés provenant des œufs récoltés par ovitraps dans la zone39, maintenir la densité réglementaire de 500 individus par population.
    1. Répétez l’allogamie au moins trois générations consécutives produire des colonies qui sont similaires génétiquement à la population de zone39au moins de 87,5 %. Critique : Faire en sorte que les deux sexes sont corrects à ce stade (voir étape 3.1).
  4. Femelles Ae. aegypti sont généralement réfractaires aux autres insémination dans les heures suivant l’accouplement50. Lorsque le croisement des colonies, laisser les femelles et les mâles à maturité dans des cages séparées pendant deux jours et puis aspirer les femelles dans la cage du mâle à donner une chance égale à tous les hommes.

4. sang d’alimentation et la ponte

  1. Attendez au moins trois jours après que la dernière femelle a vu le jour avant le sang d’alimentation afin de permettre suffisamment de temps mûrir. Sang nourrit les femelles dans les deux semaines d’émergence pour prévenir la mortalité excessive, en particulier pour les moustiques avec des infections de Wolbachia qui altèrent la longévité22,24,49. Retirez les tasses de sucre la veille de l’alimentation afin d’améliorer le taux d’alimentation.
    1. Demandez à un volontaire pour insérer leurs avant-bras dans la cage pour permettre les moustiques femelles pour se nourrir. La plupart des femelles devraient se nourrit de réplétion en moins de 5 min, mais pour réduire la sélection contre les mangeoires lentes, laisser l’avant-bras dans la cage pendant 15 minutes, ou jusqu'à ce que toutes les femelles sont engorgées visiblement ; un gant en latex pour protéger la main contre les piqûres d’est facultative mais recommandée.
    2. Deux jours après le repas de sang, placer deux tasses en plastique contenant de l’eau d’élevage larvaire et bordée d’une bande de papier de verre (Figure 1) (ou papier filtre (Figure 1 H)) dans la cage pour les femmes à pondre des œufs. Partiellement submerger la bande de papier de verre dans l’eau pour le garder humide. Supprimer les autres sources d’eau pour empêcher les femelles de pondre leurs œufs à l’extérieur de la coupe de la ponte.
      Remarque : l’eau du robinet peut être utilisé dans les tasses, mais l’eau d’élevage larvaire encourage Ponte51,52 et les femelles pondront leurs oeufs plus synchrone.

5. oeuf Collection et conditionnement

  1. Les femelles pondront sur du papier de verre juste au-dessus de la ligne de flottaison ; recueillir et remplacer les bandes de papier de verre par jour jusqu'à ce qu’aucuns plus d’oeufs ne sont pondus. Notez que la ponte peut se poursuivre pendant une semaine.
  2. Le papier de verre partiellement secs bandes en les tamponnant doucement sur une serviette en papier pour 30 s, prenant soin de ne pas pour déloger les oeufs. Ensuite, enroulez les bandes dans une feuille d’essuie-tout sec et placez-le dans un sac de plastique refermable (Figure 1I).
  3. Vérifiez l’état des œufs sous un microscope à dissection (Figure 3). Si le papier de verre raies sont trop humides, oeufs peuvent éclore avant d’être immergé dans l’eau (Figure 3 b), mais si sèche trop sévèrement, les oeufs peuvent s’effondrer (Figure 3).
  4. Les oeufs peuvent être mis à couver à tout moment au-delà de collection après trois jours ; éclosent tous les œufs de chaque colonie, recueillis dans l’ensemble de tous les jours, dans le même conteneur d’eau pour s’assurer que la prochaine génération est prélevée d’une grande piscine au hasard des individus.
  5. Pour le stockage à long terme, conserver les oeufs dans un récipient hermétique à une humidité élevée (> 80 %) à environ 20 ° C. Dans ces conditions, les œufs sans Wolbachia peuvent être stockés pendant plusieurs mois tout en conservant la trappe haute taux53,54.
  6. Car certaines infections de Wolbachia diminuer la viabilité des oeufs avec âge49,55, éclore les oeufs de Wolbachia-infectés des lignes dans la collection afin d’éviter une mortalité excessive pour la semaine souches. Sang nourrissent les femelles après une semaine si plus de œufs sont nécessaires.
Journée Étape
0 Œufs éclosent
1 Nombre de larves dans des plateaux
7 Transfert de larves et pupes de cages de colonie
17 Sang se nourrissent des femmes adultes
21 Commencer la collecte des œufs
25 Terminer la collecte des œufs
28 Œufs éclosent

Tableau 1 : Vue d’ensemble du calendrier de maintenance Ae. aegypti colonie à 26 ° C. Le moment où le sang féminin-alimentation et de l’éclosion des œufs est flexible, mais longue durée à ces étapes doit être évitées, en particulier pour les moustiques infectés par Wolbachia, afin de minimiser la mortalité. Selon ce calendrier minimise la sélection contre les moustiques qui sont rapides ou lents à élaborer ou à maturité à tous les stades de la vie, à condition que les larves sont nourries de manière optimale.

Figure 1
Figure 1 : Équipements utilisés pour l’élevage des Ae. aegypti en laboratoire. (A) les contenants en plastique utilisés pour les oeufs à couver ou d’élevage des larves avec des volumes de 500, 750 et 5 000 mL (de gauche à droite). (B) les plateaux utilisés pour l’élevage des larves à une densité contrôlée, généralement de 500 larves dans 4 litres d’eau. (C) 19,7 L et (D) 3 L cages utilisées pour les adultes de logement. Une densité de 25 adultes ou moins par litre devrait être maintenue afin de fournir suffisamment d’espace. (E) 35 mL tasse avec de la laine de coton humide fourni comme une source d’eau pour les adultes. Coupe de 35 mL (F) avec une solution de saccharose fournie via un cordon ou une mèche dentaire comme une source de sucre. (G–H) Tasses remplies d’eau d’élevage larvaire et bordée d’un substrat de ponte du papier de verre ou papier filtre (G et H, respectivement). (j’ai) fermeture à glissière sac utilisé pour le stockage de bandes de papier de verre ou papier filtre. Taches noires sur papier de verre sont des œufs de moustiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Latérale (A) et dorsales (B) vues de nymphes et d’adultes Ae. aegypti (C) démontrant leur dimorphisme sexuel. Les hommes sont positionnés à gauche et à droite dans chaque panneau, les femelles. Lorsque alimenté de façon optimale, les nymphes mâles et femelles sont distinguent par la taille ; les femelles sont plus grandes que les mâles (A) et ont un céphalothorax relativement bulbeux, comparativement aux hommes qui ont des côtés plus plates (B). Adultes de sexe masculin sont facilement distingués des femelles dans toutes les conditions d’élevage, principalement par leurs antennes plumeuses et palpes longs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Oeufs de Ae. aegypti âgés de quatre jours dans des conditions différentes. (A) Intact des œufs sur des bandes de papier de verre maintenus un taux d’humidité élevé (> 80 %), mais sans n’importe quelle humidité visible. Taux d’éclosion devraient être supérieur à 90 % pour le type sauvage Ae. aegypti si maintenu correctement. (B) les œufs qui éclosent avant d’être immergé dans l’eau (éclosion précoce) sont distinguent par un capuchon détaché œuf et la larve visible. Cela indique que la bande de papier de verre a été maintenue trop humide. (C) les oeufs qui sont séchés trop sévèrement risque de s’effondrer et sont bien visibles par leur aspect concave. Si le papier de verre se raidit, cela indique aussi que les oeufs peuvent être trop secs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

Figure 4 illustre les effets de la nutrition sous-optimaux sur le développement des larves de Ae. aegypti . Quand conteneurs sont équipés de 0,25 mg de nourriture par larves par jour ou moins, le temps de développement augmente pour les mâles et les femelles, et est moins synchrone que dans des contenants fournie avec 0,5 mg de nourriture. Si une alimentation adéquate n’est pas fournie pendant toute la durée du développement larvaire, cela pourrait avoir un impact négatif sur le calendrier d’entretien. En développement lent de personnes courent un risque d’être retenu contre sang d’alimentation peut être retardé et il y a un risque plus élevé de mortalité chez les adultes avant la reproduction se fait.

La figure 5 illustre la longueur de l’aile (une estimation de la taille corporelle) de Ae. aegypti adultes élevés dans une variété de régimes de nutrition. Longueurs des ailes des mâles et des femelles diminuent de manière importante et devient plus variables lorsque la nutrition n’est pas optimale. Tailles de corps uniforme sont importants pour les comparaisons expérimentales comme taille de corps est positivement associée à la fécondité, et gros moustiques sont censés exposer une plus grande aptitude sous conditions de champ33,34,35 .

Les effets de Wolbachia infections sur les caractères ci-dessus sont décrits dans d’autres études, mais généralement, il y a peu ou aucun effet23,39,49.

Figure 4
Figure 4 : Proportion Cumulative de Ae.aegypti (A) les femmes et les hommes (B) pays en développement vers l’âge adulte dans des régimes alimentaires différents à 26 ° C. 100 larves ont été élevées dans des contenants de 500 mL d’eau (une densité larvaire de 0,2 larves / mL), fournis avec différents niveaux de nourriture (voir Table des matières) et ont marqué pour leur temps de développement. Seules les larves qui ont survécu à l’âge adulte ont été inclus. Barres d’erreur sont les erreurs-types, avec n = 4 répétitions par traitement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Longueur d’aile de Ae.aegypti (A) les femmes et les hommes (B) élaborer sous des régimes alimentaires différents à 26 ° C. 100 larves ont été élevées dans des contenants de 500 mL d’eau (une densité de larve de 0,2 larves / mL) et fournis avec différents niveaux de la nourriture. Un sous-ensemble des adultes a été ensuite mesuré pour la longueur de l’aile en utilisant les méthodes décrites précédemment,56. Barres d’erreur sont les écarts-types. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Selon le protocole présenté ici pour la maintenance de Wolbachia-infectés Ae. aegypti devraient garantir que les moustiques sains d’une qualité constante sont produites pour des expériences et ouvrir le champ communiqués. Contrairement aux autres protocoles qui donner la priorité à la production de grandes quantités de moustiques (voir référence57), les méthodes sont axés sur la maximisation de leur remise en forme, tant au sein des générations en mettant en place des conditions d’élevage détendues et à travers générations en minimisant l’adaptation de consanguinité, de sélection et de laboratoire. Ce protocole est conçu spécifiquement pour Ae. aegypti souffrant d’infections de Wolbachia mais doit être adapté à n’importe quel type de Ae. aegypti. Toutefois, il n’est pas adapté pour l’élevage des quantités de masse (de l’ordre des millions par semaine), qui peuvent s’avérer nécessaires pour des versions insectes stériles ou incompatibles qui nécessitent un nombre élevé d’atteindre la population suppression57,58.

Il y a certaines étapes critiques qui doivent être suivis attentivement. Il est important de nourrir les larves de façon optimale et d’éviter la surpopulation pendant la durée de leur développement. Cela garantira que les moustiques développent de façon synchrone et sont d’une taille uniforme. Soins spéciaux devraient également être franchie avec conditionnement oeufs ; les larves peuvent éclore très facilement trop tôt ou oeufs peuvent dessécher si les substrats de ponte sont trop humides ou secs, respectivement. À toutes les étapes du protocole, il est recommandé de laisser suffisamment de temps pour autant d’individus dans la colonie que possible pour terminer chaque étape. Sélection contre les individus qui sont lents à se développer, mature, le flux de sang, pondent leurs oeufs ou éclore conduira probablement à la perte de diversité génétique.

Nous notons quelques considérations supplémentaires pour l’entretien de Wolbachia-infectée de moustiques qui ne sont pas décrites dans le protocole ci-dessus. Il est possible pour les infections de Wolbachia à perdre des colonies de laboratoire, et il est donc recommandé que les colonies soient surveillées régulièrement pour leur statut infectieux de Wolbachia . Nous permet de tester au moins 30 personnes de chaque Wolbachiapolymérase quantitative PCR (qPCR)49,59 -infecté ligne toutes les générations. Si toute personne test est négatif pour l’infection de Wolbachia appropriée, colonies peuvent être épurées par isoler les femelles autant que possible de la colonie touchée et puis à l’aide de la progéniture de mères infectées uniquement, pour fonder la prochaine génération. La cause de la perte de certaines souches de Wolbachia de colonies de laboratoire est en grande partie inconnue, mais pourrait s’expliquer par le fait que les contrôles de température, que des températures élevées peuvent entraîner la perte de Wolbachia infections47, 60.

Colonies et expériences peuvent également être contaminés avec des individus de différentes lignes si les soins ne sont pas prises lors de l’élevage. Contamination peut résulter de pipetage imprudente des larves, mélange des lots d’oeufs, un étiquetage erroné de cages ou incorrectement sexage nymphes en croix. Il faut donc une attention particulière lors de la manipulation des colonies avec différents types d’infection de Wolbachia . Nettoyez soigneusement tout tasses de Ponte, élevage des bacs et des cages avant de le réutiliser, nettoyer les pipettes avant de manipuler chaque nouveau plateau des larves et nettoyer le maillage chaque fois lors du transfert de larves et pupes aux autres conteneurs. En outre, inspecter les doigts pour les oeufs lors de manipulation du papier de verre bandes et utilisez des essuie-tout frais lorsque le séchage chaque bande, veiller à ce que les adultes sont le sexe correct avant de les relâcher dans des cages et traiter rapidement les évadés. En prenant ces précautions devrait éviter la plupart de la contamination, mais colonies devraient encore être inspectés systématiquement à l’aide de méthodes diagnostiques59.

Femelle Ae. aegypti nécessitent un repas de sang afin de pondre des œufs, et les laboratoires du monde entier fournissent eux dans une variété de façons, de membrane alimentation systèmes57, animaux retenue61 et, dans une moindre mesure, sang artificiel62 . Cependant, les moustiques avec des infections expérimentales de Wolbachia améliorait le sang non humains souvent et peuvent montrer la fécondité réduite et taux d’éclosion et transmission incomplète de Wolbachia à leur progéniture63, 64 , 65. maintien de la réceptivité des femelles aux odeurs humaines est également importante pour les moustiques qui sortira dans le champ et les nourrir à travers les membranes ou d’autres animaux peuvent compromettre cette capacité37. Nous optons donc pour utiliser l’avant-bras de volontaires humains pour ce protocole de maintenance de colonie, bien que les autres méthodes sont nécessaires dans certaines circonstances. Sanguins doivent être fournies par d’autres moyens lorsque vous travaillez directement avec les arbovirus, et il faut veiller lorsque les colonies provenant de populations naturelles avec des charges virales élevées au transmission transovarienne des arbovirus peut se produire à66. Des volontaires humains devraient également pas les flux de sang s’ils ont récemment visité arbovirus pays d’endémie comme il peut y avoir un risque de transmission.

Notre entretien a pour but de minimiser l’adaptation de laboratoire et des pressions sélectives du protocole, mais il n’y a place à amélioration. Leftwich et al. 42 des recommandations supplémentaires pour maintenir l’aptitude des moustiques pour les rejets de plein champ, y compris l’utilisation de diètes larvaires plus diversifiés et naturelles, réduisant la densité des adultes dans des cages et fournissant un environnement complexe. Ces considérations pourraient accroître l’aptitude des Ae. aegypti à un niveau plus élevé, bien qu’il n’y a actuellement aucune preuve des changements de remise en forme en raison de l’adaptation de laboratoire au titre du protocole de maintenance décrite ici [Ross et coll. inédit]. Des mesures supplémentaires ne peuvent être réalisables pour les laboratoires avec peu d’espace et de ressources, mais sont néanmoins mérite d’être étudié. Maintenir la taille des populations de grand, en évitant les grandes pressions sélectives par le biais de protocoles d’élevage et de mise en oeuvre périodique allogamie aux moustiques de champ devrait aider pour assurer haute ADEQUATION de Ae. aegypti communiqués de plein champ. Les principes en jeu dans l’approche peuvent être appliqués à l’élevage d’autres espèces vectrices de la maladie pour la libération de manipuler ou de réprimer les populations naturelles.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous reconnaissons Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson et Clare Doig pour leur contribution au développement de méthodes d’entretien de notre colonie et trois évaluateurs anonymes pour leurs suggestions qui ont contribué à améliorer le manuscrit. Notre recherche est supporté par un programme de subventions et de bourses à l’AAH de la santé nationale et Conseil de recherches médicales et une traduction accordent du Wellcome Trust. NOMINALE est récipiendaire d’une bourse du programme formation de recherche gouvernement australien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

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