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Biology

आनुवंशिक आंत सामग्री के लिए प्रयोगशाला प्रोटोकॉल समूह विशिष्ट rDNA प्राइमरों का उपयोग जलीय Macroinvertebrates का विश्लेषण

Published: October 5, 2017 doi: 10.3791/56132
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

Summary

सबसे आम आंत सामग्री macroinvertebrates के विश्लेषण दृश्य हैं । शिकार जीवों की रूपात्मक विविधता के बारे में गहन ज्ञान की आवश्यकता होती है, वे नरम शरीर शिकार याद आती है और, शिकार की मजबूत comminution के कारण, amphipods सहित कुछ जीवों के लिए लगभग असंभव हैं । हम amphipods के आहार में macroinvertebrate शिकार पहचान के लिए विस्तृत, उपंयास आनुवंशिक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।

Abstract

खाद्य जाले का विश्लेषण पारिस्थितिकी प्रणालियों के एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, खाद्य वेब बातचीत गैर स्वदेशी प्रजातियों के आक्रमण की वजह से गंभीर परिवर्तन से गुजरना कर सकते हैं । हालांकि, क्षेत्र शिकारी की एक सटीक पहचान-शिकार बातचीत कई मामलों में मुश्किल है । ये विश्लेषण अक्सर आंत सामग्री का एक दृश्य मूल्यांकन या स्थिर आइसोटोप अनुपात के विश्लेषण के आधार पर कर रहे हैं (δ15एन और δ13सी). इस तरह के तरीकों के बारे में व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है, क्रमशः, सुघड़ विविधता या व्यक्तिगत शिकार जीवों से isotopic हस्ताक्षर, शिकार जीवों की सटीक पहचान में बाधाओं के लिए अग्रणी. दृश्य आंत सामग्री विश्लेषण विशेष रूप से नरम शरीर शिकार जीवों को मूल्यवान समझना, क्योंकि थकावट, घूस और शिकार जीवों के पाचन मुश्किल विशिष्ट प्रजातियों की पहचान बनाते हैं । इसलिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित रणनीतियों, उदाहरण के लिए समूह के उपयोग के विशिष्ट प्राइमर सेट, खाद्य वेब बातचीत की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं । यहां, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए समूह का उपयोग कर क्षेत्र से macroinvertebrate उपभोक्ताओं के आंत सामग्री की जांच करने के लिए परमाणु राइबोसोमल deoxyribonucleic एसिड (rDNA) के लिए विशिष्ट प्राइमर सेट । डीएनए या तो पूरे नमूनों से (छोटे taxa के मामले में) या बाहर क्षेत्र में एकत्र नमूनों की आंत सामग्री से निकाला जा सकता है । उपस्थिति और डीएनए टेंपलेट्स के कार्यात्मक दक्षता की जरूरत है परीक्षण व्यक्ति से सीधे की पुष्टि की यूनिवर्सल प्राइमर डीएनए के संबंधित उप इकाई को लक्षित सेट का उपयोग कर । हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि भस्म शिकार आगे नीचे एकल किनारा अनुरूप बहुरूपता (SSCP) polyacrylamide जैल का उपयोग विश्लेषण के साथ संयुक्त अनसंशोधित समूह विशिष्ट प्राइमरों के साथ पीसीआर के माध्यम से प्रजातियों के स्तर को नीचे निर्धारित किया जा सकता है । इसके अलावा, हम बताते है कि लेबल के रूप में विभिंन फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग विभिंन शिकार समूहों के डीएनए टुकड़े के लिए समानांतर स्क्रीनिंग स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से एकाधिक आंत सामग्री नमूने से सक्षम बनाता है ।

Introduction

शिकारी-शिकार बातचीत, जो पौष्टिकता बातचीत और खाद्य वेब गतिशीलता के बहुमत का गठन, महत्वपूर्ण पहलुओं के भीतर और पारिस्थितिकी प्रणालियों, जो पारिस्थितिकी के प्रमुख लक्ष्यों में से एक है के बीच खाद्य जाले भर में और ऊर्जा के प्रवाह की विशेषता है 1. स्रोत और कार्बन और पोषक तत्वों के प्रवाह के निर्धारण के पारिस्थितिकी प्रणालियों के बीच पारिस्थितिकी कनेक्टिविटी की समझ2आगे बढ़ रहा है । हालांकि, नदियों और उनके पकड़ने के रूप में पारिस्थितिकी प्रणालियों, जैविक पदार्थ और पोषक तत्वों के प्रवाह से ही नहीं बल्कि जीवों के आंदोलनों से भी जुड़े हैं3. इस प्रकार, आवास परिवर्तन संसाधनों के प्रवाह में दखल है कि उन प्रणालियों कड़ी दृढ़ता से दोनों पारिस्थितिकी प्रणालियों के खाद्य जाले बदल सकते हैं, न केवल सीधे, लेकिन भी अप्रत्यक्ष रूप से शिकारी शिकार समुदायों के संबंधित संरचना बदलकर । उदाहरण के लिए, खाद्य जाले के परिवर्तन के लिए एक शिकारी प्रजातियों के आंदोलनों (जैसे, इंद्रधनुष ट्राउट)4से जोड़ा जा दिखाया गया है । इस तरह के परिवर्तन संभावित जैव विविधता और जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के कामकाज की धमकी । इसलिए, क्षेत्र में शिकारी शिकार बातचीत का विश्लेषण, जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के देशी जैव विविधता पर, जल प्रबंधन प्रथाओं के रूप में मानव प्रेरित पर्यावरण परिवर्तन, के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए आवश्यक है ।

चूंकि ट्रैकिंग पौष्टिकता लिंकेज जटिल प्रणालियों में मुश्किल है, कई दृष्टिकोण स्थापित किया गया है कि क्षेत्र में बातचीत खिलाने के आकलन को सक्षम5। परंपरागत रूप से, क्षेत्र में बातचीत खिलाने की जांच शिकार के दृश्य पहचान के आधार पर कर रहे है विच्छेदित हिंमत में रहता है और सुघड़ शिकार विविधता के बारे में एक व्यापक ज्ञान की आवश्यकता है । दृश्य आंत सामग्री विश्लेषण उपभोक्ताओं के कई समूहों के संसाधन उपयोग में अंतर्दृष्टि प्रदान की है (जैसे, लॉबस्टर6 और मछली7के आहार में मौसमी भिंनता,8 या copepods के खिला वरीयताओं) । हालांकि, पाचन की शारीरिक प्रक्रिया दृश्य आंत सामग्री का विश्लेषण करता है मुश्किल है और आम तौर पर नरम शरीर शिकार-जीवों9याद करते हैं । तरल घूस से खिला प्रजातियों के लिए या कुछ invertebrate उपभोक्ताओं के लिए है कि गहन घूस से पहले अपने भोजन, amphipods की तरह, आंत सामग्री में शिकार प्रजातियों में से दृश्य पहचान असंभव है10। इन सीमाओं के कारण, आणविक विश्लेषण एक आशाजनक विकल्प प्रदान करता है ।

आणविक विश्लेषण अब एक आम आंत सामग्री में तेजी से और सटीक शिकार का पता लगाने की अनुमति उपकरण बन गए हैं । इस तरह की तकनीक की रेंज विविध है: मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (पीसीआर) पर आधारित रणनीतियों अक्सर उनकी उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के कारण,11का उपयोग किया जाता है । नए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के विकास के समय और लागत गहन है, इसलिए, अन्य आणविक तकनीकों के आवेदन अधिक उपयोगी है जब एंटीबॉडी पहले से ही11मौजूद नहीं है । एक अंय आम दृष्टिकोण deoxyribonucleic एसिड (डीएनए), राइबोसोमल ribonucleic एसिड (आरएनए) ज्यादातर प्रजातियों में मौजूद जीन की तरह के क्षेत्रों के प्रवर्धन, यूनिवर्सल प्राइमर सेट12,13का उपयोग कर रहा है । इस तकनीक का उपयोग करते समय, यह अक्सर डीएनए के मिश्रित स्रोतों के भीतर शिकार जीवों की पूरी श्रृंखला की पहचान करने के लिए संभव नहीं है14. इस तरह की एक खामी से बचने के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण आनुवंशिक आंत सामग्री विश्लेषण के लिए समूह विशेष प्राइमर सेट का उपयोग करने के लिए है । विशेष लक्ष्य समूहों के केवल डीएनए क्षेत्रों बढ़ाना और अंय सभी प्रजातियों के बाहर15,16, समूह विशिष्ट प्राइमरों के बिना निर्दिष्ट समूहों के वर्गीकरण स्तर पर शिकार जीवों की पहचान को सक्रिय करने के लिए डिज़ाइन समय और लागत गहन माध्यमिक विश्लेषण । हालांकि, सभी आंत सामग्री विश्लेषण की तरह, इस तरह के विश्लेषण केवल खिला व्यवहार का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । इसलिए, समय के विश्लेषण के साथ आणविक आंत सामग्री विश्लेषण के संयोजन प्राकृतिक अनुरेखकों को एकीकृत (जैसे, स्थिर आइसोटोप) लाभकारी माना जाता है1,2.

यहां, हम पीसीआर के लिए एक विस्तृत विधि-शिकारी शिकार बातचीत के लिए समूह-विशिष्ट प्राइमरी सेट का उपयोग कर का वर्णन परमाणु राइबोसोमल डीएनए (rDNA) क्षेत्रों के लिए एक ही नमूना के स्थिर आइसोटोप विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जाना है । हम agarose जेल ट्रो के माध्यम से एकल शिकार समूहों के डीएनए का पता लगाने का वर्णन । इसके अतिरिक्त, हम इस तरह के समूह विशिष्ट प्राइमरों की पीसीआर उत्पादों की आगे की बहाव के विश्लेषण के लिए एक अवसर प्रस्तुत जब भी प्राइमरों की विशिष्टता से एक उच्च वर्गीकरण संकल्प की आवश्यकता है । क्योंकि एकल असहाय डीएनए (ssDNA) टुकड़े तृतीयक अनुरूप है कि उनकी प्राथमिक अनुक्रम द्वारा निर्धारित कर रहे है17, इस तरह के समूह द्वारा परिलक्षित टुकड़ों में छोटे बदलाव-विशिष्ट प्राइमरों के गठन के परिवर्तन के लिए सीसा । इस तरह के परिवर्तन एकल किनारा क्षेऽ बहुरूपता (SSCP) polyacrylamide जैल17,18के साथ विश्लेषण द्वारा पता लगाया जा सकता है, शिकार जीवों की एक और अधिक सटीक पहचान को सक्षम करने (प्रजातियों के स्तर पर नीचे).

जबकि agarose जेल ट्रो डीएनए टुकड़े कल्पना और उनके अनुमानित लंबाई19निर्धारित करने के लिए एक आम और सस्ती उपकरण है, संकल्प डीएनए की मात्रा पर निर्भर करता है और दाग डाई20का इस्तेमाल किया । आमतौर पर, दृश्य सीधे आगे जब शुद्ध डीएनए के नमूनों के साथ काम कर रहा है, लेकिन संभावित रूप से उपभोक्ताओं की आंत सामग्री में शिकार डीएनए की कम मात्रा agarose जेल ट्रो परिणामों के स्कोरिंग जटिल कर सकते हैं । फिर भी, इस पद्धति का पता लगाने के लिए एक या कुछ शिकार समूहों के लिए क्षेत्र से उपभोक्ता नमूनों की एक कम संख्या स्क्रीन संभव है, लेकिन स्कोरिंग में जटिलता कई शिकार taxa के लिए नमूनों की एक उच्च संख्या की स्क्रीनिंग अत्यंत समय गहन और इस प्रकार बनाता है अव्यावहारिक. एक और अधिक संवेदनशील का पता लगाने विधि केशिका ट्रो, जो इसके अलावा टुकड़े की सही लंबाई के निर्धारण की अनुमति देता है के माध्यम से टुकड़ों के स्वचालित विश्लेषण है21। कई सट्रेक् आधारित अध्ययनों से पता चला है कि लेबल के रूप में अलग फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करके, यह पता लगाने और स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण द्वारा तुलनीय लंबाई के विभिंन टुकड़ों का निर्धारण22,23से संभव है, 24. इसलिए, हम भी एक स्वचालित sequencer के साथ स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से लेबल समूह विशिष्ट प्राइमर सेट और पता लगाने के साथ पीसीआर का उपयोग कई शिकार समूहों से डीएनए के समानांतर पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । इसके अतिरिक्त, हम एक मामले का अध्ययन का प्रदर्शन है कि स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से शिकार डीएनए का पता लगाने के परिणाम मौजूद एक दृष्टिकोण है जो भी घूस शिकार के एक रिश्तेदार ठहराव सक्षम बनाता है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. कलेक्ट & #160; फील्ड से Macroinvertebrates और जेनेटिक आंत कंटेंट जोडकर के लिए नमूने तैयार करें ।

  1. प्रत्येक साइट पर macroinvertebrates इकट्ठा, बाहर एकल ट्यूबों में ब्याज की उपभोक्ता प्रजातियों के व्यक्तियों तरह, और सीधे उंहें तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ में स्थिर करने के लिए आंत निकासी और डीएनए के क्षरण को रोकने के ।
    नोट: शराब में नमूनों के भंडारण से बचें, क्योंकि कुछ macroinvertebrates बहना करने के लिए पहले शराब उन्हें मारता है ।
  2. केवल पेट के मध्य आकार के गैस्ट्रो आंत्र पथ का उपयोग करें और बड़े (लगभग & #62; 3 mm) आनुवंशिक आंत सामग्री विश्लेषण के लिए macroinvertebrate प्रजातियों तो नमूना के शेष मामले अन्य प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( जैसे, स्थिर आइसोटोप विश्लेषण). ध्यान दें कि यह लागू नहीं है, जब पानी के कण की तरह बहुत छोटे taxa की जांच । इसलिए, 1.2.1 और 1.2.2 चरणों को छोड़ा जा सकता है ।
    1. थोड़ा एक व्यक्ति को और ध्यान से एक stereomicroscope ठीक स्टेनलेस स्टील संदंश का उपयोग कर के तहत अपने गैस्ट्रो आंत्र पथ टुकड़े । सुनिश्चित करें कि मामले के नुकसान से बचने के लिए गैस्ट्रो आंत्र पथ पंचर नहीं है ।
    2. स्वच्छ संदंश प्रत्येक गैस्ट्रो आंत्र पथ की तैयारी के बाद डीएनए और आरएनए संदूषणों को दूर करने के लिए दूषण समाधान का उपयोग कर । इसलिए, संक्रमण समाधान में 10 मिनट के लिए संदंश की मशीन । बाद में, उंहें बाँझ पानी के साथ कुल्ला करने के लिए अवशिष्ट निशान हटाने और उंहें एक एक प्रकार का वृक्ष मुक्त कागज तौलिया के साथ पोंछ ।
    3. एक २.० मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक प्रतिक्रिया ट्यूब करने के लिए विच्छेदित जठरांत्र पथ हस्तांतरण ४४० & #181; l (४५० & #181; l दोहराव पिपेट के उपयोग के लिए संभव) नमक निष्कर्षण बफर [एसईबी; ०.४ एम सोडियम क्लोराइड (NaCl), 10 एमएम Tris (hydroxymethyl)-aminomethane हाइडरोक्लॉराइड (Tris-एचसीएल) पीएच ८.०, और 2 एमएम ethylenediaminetetraacetic एसिड disodium साल्ट निर्जलीकरण (EDTA) पीएच ८.०] । दुकान तैयार नमूनों पर & #8722; 20 & #176; C तुरंत जब तक डीएनए की निकासी । सुनिश्चित करें कि डीएनए कुछ दिनों के भीतर निकाल दिया जाएगा ।
  3. एक संशोधित उच्च-लवण निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > २५ डीएनए निकालने के लिए.
    1. फ्रीजर से बाहर के नमूने ले । एक नमूना ट्यूब करने के लिए एक 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका जोड़ने के लिए संदंश का प्रयोग करें, और गल के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बेंच पर जमे हुए नमूने छोड़ दें । 15 हर्ट्ज पर 1 मिनट के लिए नमूने homogenize करने के लिए एक मनका मिल का प्रयोग करें.
    2. एक केंद्रापसारक के एक छोटे रन के साथ नमूनों नीचे स्पिन । उपयोग microliter पिपेट जोड़ने के लिए ९० & #181; l (१०० & #181; l दोहराव पिपेट के उपयोग के लिए संभव) 10% सोडियम dodecyl सल्फेट सॉल्यूशन (एसडीएस) और 5 & #181; l के 10 मिलीग्राम/एमएल proteinase K.
    3. भंवर नमूने अच्छी तरह से और 1 एच के लिए ६० & #176 पर मिश्रण गर्मी में एक thermomixer पर ४०० rpm पर लगातार मिलाते के साथ; सी । इसके अतिरिक्त, अच्छी तरह से भंवर नमूने हर 10 मिनट के लिए आगे को बढ़ावा देने के lysis.
    4. एक कम रन के साथ नमूनों नीचे स्पिन एक केंद्रापसारक, जोड़ें ३५० & #181; L 5 एम NaCl के एक microliter पिपेट और भंवर के साथ अच्छी तरह से के लिए लगभग ०.५-1 min. के लिए नमूनों को ४० मिनट पर १६,२०० x g पर 5 & #176; C.
      नोट: एक पंक्ति में एकाधिक सेट किया जाना है, तो तापमान की सेटिंग के लिए थोड़ा उठाया जाना चाहिए (से अधिक नहीं 10 & #160; & #176; ग) क्योंकि एसडीएस अगर तापमान बहुत कम है flocculate के लिए जाता है ।
    5. उपयोग microliter पिपेट लगभग ६०० & #181; L supernatant एक नई १.५ एमएल रिएक्शन ट्यूब में अंतरण । हो & #160; सावधान गोली से कुछ भी नहीं हटा ।
    6. टिप स्टेनलेस स्टील मोतियों की प्रतिक्रिया ट्यूबों से बाहर एक स्टेनलेस स्टील चाय छलनी में, उंहें चलाने के पानी के साथ साफ और उंहें एक पेट्री डिश में 10 मिनट के लिए दूषण समाधान के साथ गर्मी । अच्छी तरह से बाँझ के साथ विघटन समाधान कुल्ला इथेनॉल में पानी और स्टोर साफ मोती (& #62; ९९%, वार्षिक ग्रेड) या फिर से प्रयोग करने तक सूखी ।
      नोट: मोतियों की सफाई के लिए इस कदम में सीधे किया जा करने की जरूरत नहीं है, बल्कि किया जा सकता है जब भी निंनलिखित चरणों में प्रतीक्षा समय है ।
    7. Add ६०० & #181; बर्फ के एल-कोल्ड isopropanol (एक microliter पिपेट के साथ supernatant के लिए पी ग्रेड) और ध्यान से ट्यूब बार की एक जोड़ी पलटना । स्टोर नमूने रात में-20 & #176; C.
    8. के नमूने फ्रीजर से बाहर ले जाओ और उंहें १६,२०० & #215; जी और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक । ध्यान से supernatant त्यागें और ट्यूब को ध्यान से एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक कागज के साथ सूखी । ध्यान रहे कि यदि आसपास का तापमान ऊँचा हो (२५ से अधिक & #160; & #176; c), 5 & #160 पर केंद्रापसारक; & #176; सी supernatant को खारिज करते हुए फिसलते हुए छर्रों से बचने के लिए.
    9. धोने ७०% इथेनॉल के साथ डीएनए युक्त छर्रों । ऐसा करने के लिए, जोड़ें २०० & #181; बर्फ के एल-शीत इथेनॉल (७०%, वार्षिक ग्रेड) का उपयोग कर एक microliter पिपेट और 10 मिनट के लिए नमूने केंद्रापसारक पर १६,२०० x जी और कमरे के तापमान (या 5 & #176; C, यदि आवश्यक हो) । ध्यान से supernatant त्यागें और ट्यूब को ध्यान से एक प्रकार का वृक्ष-मुक्त ऊतक कागज के साथ सूखी । उपयोग क 10 & #181; l पिपेट समायोजित लगभग 8 & #181; l को सावधानी से पिपेट बंद कर शेष supernatant. सुनिश्चित करें कि गोली नहीं परेशान करने के लिए ।
    10. लगभग 5-20 मिनट के लिए गोली सूखी ६० & #176; सी या बेंच पर कमरे के तापमान पर जब तक सभी इथेनॉल काफूर है ।
    11. भंग गोली में 50-100 & #181; L nuclease-मुक्त (भाप निष्फल और DEPC स्वास्थ्यकर्मी) जल (ddH 2 O), कम से अधिक प्रतीक्षा करें 1 ज (हालांकि बेहतर परिणाम रातोंरात प्राप्त किया जाएगा 4 & #176; C).
    12. एक माइक्रो-वॉल्यूम spectrophotometer के साथ प्रत्येक नमूने में निहित डीएनए की मात्रा को मापने, निर्माता के अनुसार & #39; s निर्देश. लगभग 2-10 एनजी डीएनए वाले प्रत्येक नमूने के एक काम कमजोर पड़ने बनाओ/& #181; L. फ्रीजर में स्टॉक सॉल्यूशन रखें । काम कर रहे समाधान फ्रिज में रखें और सुनिश्चित करें कि आगे नमूना प्रसंस्करण शीघ्र ही किया जाता है ।
< p class = "jove_title" > 2. हाल ही में घूस शिकार के बाद का पता लगाने के लिए डीएनए निष्कर्षों की कार्यात्मक दक्षता की पुष्टि करें ।

  1. की उपस्थिति और कार्यात्मक दक्षता सुनिश्चित करने के लिए टेम्पलेट्स, प्रत्येक डीएनए निकालने का परीक्षण (कदम १.१ करने के लिए 1.3.11) यूनिवर्सल प्राइमर सेट का उपयोग संबंधित खाद्य स्रोत के लिए उपयुक्त ( उदा, अकशेरूकीय < सुप वर्ग = "xref" > १६ , < सुप वर्ग = "xref" > 26 ) जो समूह-विशिष्ट प्राइमरी के रूप में समान नाभिकीय उपइकाई को लक्षित कर रहे हैं, शिकार के अनुवर्ती जांच के लिए प्रयुक्त < सुप वर्ग = "xref" > 25 , < सुप वर्ग = "xref" > २७ . यूनिवर्सल प्राइमर सेट के उपयोग के लिए निंन चरणों का संदर्भ लें NSF1419/20 और NSR1642/16 < सुप वर्ग = "xref" > 16 व LSU & #160;D 1, d2 & #160; fw1 व LSU & #160;D 1, D2 & #160; rev2 या LSU & #160;D 1, D2 & #160; rev4 < सुप वर्ग = "xref" > 26 . यह साबित करने के लिए कि पीसीआर रिएक्शन सफल रहा है और कोई भी संक्रमण नहीं हुआ था, एक सकारात्मक नियंत्रण डीएनए है कि पहले से ही सफलतापूर्वक प्रवर्धित किया गया था और एक नियंत्रण नमूना युक्त ddH 2 हे प्रत्येक पीसीआर चलाने के भीतर डीएनए के बजाय का उपयोग करें ।
    1. प्राइमरी काम समाधान है कि एक अंतिम एकाग्रता शामिल तैयार करने के लिए 10 & #181; प्राइमरी के एम, पिपेट संबंधित प्राइमर स्टॉक समाधान और ddH 2 ओ की उचित मात्रा में (स्टॉक समाधान की एकाग्रता पर निर्भर करता है) में एक ताजा १.५ एमएल रिएक्शन ट्यूब का उपयोग कर micropipettes.
    2. ऐड प्राइमर्स, deoxynucleotide मिक्स (dNTPs), रिएक्शन बफर, Taq डीएनए पोलीमरेज़ और ddH 2 हे एक १.५ या २.० एमएल में (नमूनों की संख्या के आधार पर संसाधित किया जा करने के लिए) रिएक्शन ट्यूब, तो भंवर इस मिश्रण । एक 10 & #160 के लिए मानक प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए विस्तृत संस्करणों; & #181; L पीसीआर रिएक्शन टेबल में दिए गए हैं 1 (इस्तेमाल रसायनों के विवरण के लिए, सामग्री की तालिका देखें).
    3. उपयोग microliter पिपेट के प्रत्येक 1 & #181 का अंतरण; l डीएनए निकालने के 9 & #181; l के गुएक पीसीआर ट्यूब के भीतर ई मानक प्रतिक्रिया मिश्रण (या एक अच्छी तरह से एक पीसीआर प्लेट की) । रिएक्शन ट्यूब या प्लेट की रिएक्शन वेल्स (कैप धारियों के साथ) बंद करें ।
    4. प्रोग्राम thermocycler: NSF1419/20 और NSR1642/16 के लिए मानक प्रोटोकॉल < सुप वर्ग = "xref" > 16 प्राइमरी सेट है: ९४ & #176; ग के लिए 4 मिन (विकार), के बाद 30 के चक्र से ९४ & #176; ग के लिए 30 एस, ५० & #176; ग (एनीलिंग तापमान) के लिए 30 एस, ७२ & #176; ग के लिए ९० s, और अंतिम विस्तार पर ७२ & #176; c के लिए 10 min. LSU प्राइमर सेट के लिए < सुप वर्ग = "xref" > 26 , निम्न का उपयोग करें: ९४ & #176; ग के लिए 4 मिन, के बाद ४५ चक्र के ९४ & #176; ग के लिए 20 एस, ५२.५ & #176; ग के लिए 20 एस, ७२ & #176; ग के लिए ९० एस, और एक अंतिम विस्तार पर ७२ & #176; ग के लिए 8 min.
    5. जगह पीसीआर ट्यूब या प्लेटें thermocycler में, साइकिल चालक के ढक्कन बंद है, और संबंधित कार्यक्रम शुरू करते हैं ।
    6. Tris आधार, बोरिक एसिड और EDTA (TBE बफर), और agarose युक्त एक बफर समाधान का उपयोग कर एक १.५% agarose जेल तैयार करते हैं । एक १.५% agarose जेल की तैयारी के लिए, कुल आयामों के साथ एक जेल कास्टिंग ट्रे का उपयोग करना 10 cm & #215; ७.५ cm & #215; 3 cm, वज़न ०.४५ g agarose एक शंकु कुप्पी में, एक मापने वाले बेलन का उपयोग करके 30 एमएल का गेज TBE बफर (८९ & #160; mM & #160; Tris , & #160;p ज & #160; ७.६, ८९ & #160; mM & #160; बोरिक & #160; अम्ल व 2 & #160; mm & #160; EDTA, & #160;p h & #160; ८.०) और इसे शंकु कुप्पी में डालो । एक माइक्रोवेव का उपयोग कर मिश्रण गर्मी । माइक्रोवेव बंद करो जब भी वहां बड़े हवाई बुलबुले है और ध्यान से कुप्पी घूमता जब तक समाधान केवल एक चरण है ।
    7. को ठंडा करने के लिए लगभग ६० & #176; ग, एक पानी स्नान में कुप्पी घूमता है. तेजी से एक जेल कास्टिंग ट्रे में समाधान डालना, हवा के बुलबुले को हटाने, और कंघी डालें । जेल कठोर है जब तक लगभग 20 मिनट रुको ।
    8. agarose जेल से युक्त 0.5 x TBE और डालने जेल कास्टिंग ट्रे के साथ ट्रो इकाई भरें । सुनिश्चित करें कि जेल स्लॉट हवाई बुलबुले से मुक्त कर रहे हैं ।
    9. एक मिनी (प्लेट) के कम रन विकल्प का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों नीचे स्पिन केंद्रापसारक । प्रत्येक 3 & #181 मिश्रण करने के लिए एक microliter पिपेट का उपयोग करें; l के साथ पीसीआर & #160;p त्पाद 1 & #181; l के 6x लोडिंग डाई (४०% सुक्रोज और ०.२५% bromophenol नीला) और यह agarose जेल के जेल स्लॉट में लोड । पिपेट १.५ & #181; एल एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के आकार मानक के रूप में एक microliter पिपेट के साथ प्रत्येक पंक्ति के एक स्लॉट में । ट्रो इकाई के ढक्कन को ठीक से बदलें और एक बिजली की आपूर्ति करने के लिए सुराग से कनेक्ट । ३५ min.
      10. के लिए १०० V/cm पर जेल चलाएं
    10. एक दाग स्नान तैयार करने के लिए, एक वर्ग के आकार का प्लास्टिक बॉक्स अभेद्य प्रकाश में 1x TBE के १,००० मिलीलीटर डालना । Add ५० & #181; L of ethidium & #160; ब्रोमाइड एक microliter पिपेट के साथ, प्लास्टिक बॉक्स के ढक्कन बंद करें और इसे मिलाने के बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए ethidium & #160; ब्रोमाइड.
    11. ट्रो इकाई से जेल हटाने और यह लगभग 10 मिनट के लिए धुंधला स्नान में जगह है । फिर, दाग स्नान के बाहर जेल ले और यह एक जेल प्रलेखन प्रणाली पर जगह है और यह मैनुअल के अनुसार कल्पना ।
    12. हाल ही में घूस शिकार के बाद का पता लगाने के लिए टेम्पलेट्स की उपस्थिति और कार्यात्मक दक्षता के मामले में सकारात्मक परिणाम (agarose जेल में पर्याप्त आकार दृश्य के टुकड़े) दिखाया है कि केवल नमूनों का विश्लेषण.
< तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ-अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > पीसीआर-मिक्स एकाग्रता काम समाधान मिश्रण के लिए 10 & #181; l पीसीआर रिएक्शन पीसीआर में अंतिम एकाग्रता प्राइमरी परिवार कल्याण 10 & #181; मी ०.५ & #956; l ०.५ & #181; m प्राइमरी आरडब्ल्यू 10 & #181; M ०.५ & #956 ; l ०.५ & #181; M प्रतिक्रिया बफर (20 एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ८.५५, 16 मिमी (NH4) 2SO4 और 2 मिमी MgCl2 अंतिम सांद्रता) 1 & #181; m 1 & #956; l 1 & #181; मी dNTP 10 mm < t d > 0.25 & #956; l ०.२५ mM Taq पोलीमरेज़ 5 u ०.१ & #956; l ०.०५ u ddH 2 0 ६.६५ & #956; l < td colspan = "2" > < स्ट्रो एनजी > कुल राशि अभिक्रिया गाढा 9 & #956; l DNA 1 & #956; l < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहना । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 1: एक 10 & #181 के लिए मानक प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल; L पीसीआर रिएक्शन.

< p class = "jove_title" > 3. हाल ही में निगला शिकार/जेल ट्रो.

का उपयोग कर समूह-विशिष्ट प्राइमरी सेट्स के साथ खाद्य पदार्थों का पता लगाएं
  1. आचरण पीसीआर डीएनए निष्कर्षों के काम के समाधान का उपयोग (1.3.11 के लिए कदम १.१ के अनुसार तैयार) और समूह विशिष्ट प्राइमर सेट (unलेबल्ड, यानी, संशोधन के बिना ) में वर्णित की तरह लक्षित शिकार समूह के लिए उपयुक्त 2.1.3 करने के लिए 2.1.1 कदम (संबंधित प्राइमर सेट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण में बदलाव के लिए, 2 तालिका देखें) । चलाएं पीसीआर चरण 2.1.4 में दिए गए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग (संबंधित प्राइमर सेट के लिए एनीलिंग तापमान के लिए, तालिका 2 देखें) ।
    1. संबंधित लक्षित समूह (सकारात्मक नियंत्रण) और प्रत्येक पीसीआर चलाने में उपभोक्ता प्रजातियों में से शुद्ध डीएनए के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण से संबंधित एक नमूना से शुद्ध डीएनए के साथ एक नियंत्रण का उपयोग करें ।
  2. की सफलता की जांच करें पीसीआर रिएक्शन का उपयोग agarose जेल ट्रो 2.1.6 करने के लिए कदम 2.1.11 में वर्णित है । पीसीआर प्रतिक्रिया सफल रहा था यदि उपयुक्त लंबाई का एक टुकड़ा (देखें तालिका 2 ) सकारात्मक नियंत्रण के लिए नहीं बल्कि नकारात्मक नियंत्रण के लिए दृश्यमान है । यदि इन मानदंडों में से एक या दोनों अधूरे हैं, तो पीसीआर दोहराएं ।
  3. उपयोग agarose जेल ट्रो, के रूप में 2.1.11 के लिए 2.1.6 कदम में वर्णित है, का पता लगाने के लिए कि क्या शिकार समूह लक्षित अलग उपभोक्ता नमूनों द्वारा भस्म किया गया था का परीक्षण (के निर्णय के द्वारा कि उपयुक्त लंबाई के टुकड़ा या दिखाई नहीं है) । सुनिश्चित करें कि कम दृश्य रिज़ॉल्यूशन वाले अंशों को याद न रखें.
  4. स्टोर पीसीआर प्रोडक्ट्स पर 4 & #176; सी, यदि आगे का विश्लेषण अगले 24 ज के भीतर किया जाएगा, या at-20 & #176; ग यदि विश्लेषणों को बाद में किया जाना है ।
< p class = "jove_title" > 4. बाद में भस्म शिकार आगे बहाव Polyacrylamide जेल के माध्यम से SSCP विश्लेषण का उपयोग कर निर्धारित करें ।

  1. SSCP ट्रो के लिए 9% acrylamide जेल तैयार करते हैं । एक प्रयोगशाला हूड में काम समाधान तैयार करें ।
    1. एक २०० मिलीलीटर acrylamide काम समाधान तैयार करने के लिए, 10x TBE के 20 मिलीलीटर (Tris आधार के १०९ ग्राम के साथ एक मापने सिलेंडर भरें, ५५ g को बोरिक & #160; अम्ल और ४० एमएल के ०.५० एम EDTA, पीएच ८.० ddH 2 ओ) के १००० मिलीलीटर में भंग और ४५ मिलीलीटर की ४० एमएल के साथ एक और एक अन्य (29:1) acrylamide मिश्रण. एक एेसे कुप्पी (एक २०० मिलीलीटर चिह्न के साथ एक एेसे कांच की बोतल में TBE और acrylamide मिश्रण भी यहां उपयुक्त है) और जोड़ें ddH 2 O २०० एमएल मार्क करने के लिए । फ्रिज में वर्किंग सॉल्यूशन रखें (4 & #176; C) जब तक जरूरत न हो. एक सप्ताह से पुराने कार्य समाधान का उपयोग न करें ।
    2. का वजन ०.१ ग्राम अमोनियम persulfate (ए. पी. सी.) एक 1 मिलीलीटर volumetric में सटीकता के साथ एक संतुलन का उपयोग करें () कुप्पी और ddH 2 ओ को जोड़कर इसे भंग कर एक 10% एपीएस स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए । Transfer aliquots (लगभग ३५० & #181; L) in ताजी प्रतिक्रिया ट्यूबों.
      नोट: एक aliquot प्रत्येक polyacrylamide जेल के लिए आवश्यक है । शेष aliqu को संग्रहीतओटीएस में-20 & #176; सी और केवल aliquots की जरूरत पड़ने से पहले ही उसे तुरंत ही ठंढ से
    3. एक जेल कैसेट दो गिलास प्लेटें, एक खाली और एक पायदान कांच की थाली (प्रत्येक 20 सेमी x 20 सेमी), स्पेसर्स (१.५ मिमी मोटी) के साथ समझौता इकट्ठा उन दोनों के बीच कांच के पक्ष चल रहा है । प्रत्येक तीन गुना-पीछे क्लिप का उपयोग करें (३२ mm) सही और बाईं ओर से जेल कैसेट्स निर्धारण करने के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
    4. 2% agarose जेल के लिए समाधान तैयार करने के लिए एक शंकु कुप्पी में 1x TBE बफर की agarose और २५० मिलीलीटर की 5 ग्राम मिश्रण । गर्मी और बाद में नीचे ठंडा के रूप में कदम 2.1.6 और 2.1.7 में वर्णित मिश्रण । तेजी से एक वर्ग के आकार का प्लास्टिक बॉक्स में हल डालो (21 & #160; cm & #160; x ६.५ & #160; cm & #160; x 5 & #160; cm) और agarose समाधान में जेल कैसेट (step 4.1.3) के निचले छोर को रखें । जेल कैसेट के निचले छोर पर गुना-पीछे क्लिप को एक ऊंचाई तक समायोजित करें ताकि वे चौकोर आकार के प्लास्टिक बॉक्स के रिम पर बैठें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ). agarose प्लग पूरी तरह से कठोर है जब तक लगभग 20-30 मिनट रुको ।
    5. एक १०० मिलीलीटर मापने सिलेंडर के साथ acrylamide काम समाधान (कदम शुू) तक ६० मिलीलीटर निशान और एक चोंच में समाधान डालो । का प्रयोग करें एक micropipette जोड़ने के लिए ३०० & #181; अनुप स्टॉक समाधान (step 4.1.2) के एक aliquot के एल और बाद में जोड़ने के लिए ३७.५ & #181; l of tetramethylethylenediamine (TEMED). तेजी से, जेल कैसेट के गिलास प्लेटों के बीच समाधान डालो । वैकल्पिक रूप से, एक १,००० & #181 के साथ एक १०० मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज के साथ ग्लास प्लेटों के बीच समाधान इंजेक्षन; L पिपेट टिप सिरिंज के इंजेक्शन सिर करने के लिए समायोजित.
    6. ध्यान से ग्लास प्लेटों के बीच ऊपरी छोर पर एक १.५ mm मोटी मानक कंघी डालें । कंघी polyacrylamide समाधान से घिरा होना चाहिए । polyacrylamide जेल बहुलक है जब तक लगभग 1 घंटे रुको । जहां तक संभव हो बहुलकीकरण के दौरान वेंटिलेशन से बचें क्योंकि यह polymerize के लिए जेल के लिए समय की जरूरत बढ़ जाती है.
      नोट: यह 3 दिनों के लिए फ्रिज में एक गीले ऊतक के साथ सील प्लास्टिक बैग के भीतर डाली जैल स्टोर करने के लिए संभव है.
< p class = "jove_content" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: पाठ-संरेखित करें = "केंद्र" > < img alt = "चित्रा 1" वर्ग = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56132/56132fig1v2.jpg"/>
चित्रा 1: चित्र illustrating निर्माण polyacrylamide जैल डालो करने के लिए. < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56132/56132fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • जेल कैसेट प्लेस, polyacrylamide जेल तैयार युक्त, एक ऊर्ध्वाधर ट्रो इकाई में । ट्रो इकाई को उपयुक्त राशि के साथ भरें (ट्रो इकाई के प्रकार के आधार पर) 0.5 x TBE की और इकाई को ठंडा करने के लिए 10 & #176; C एक प्रशीतित परिचालित का उपयोग कर ।
    • डीएनए विकार के लिए
  • , कचौरी एक थर्मल-ब्लॉक/९६ & #176; C. ९५% formamide (९९.५% वार्षिक ग्रेड) के साथ विकार बफर तैयार करें और 5% जलीय समाधान जिसमें ०.२५% bromophenol नीला और ४०% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज.
  • पीसीआर प्रॉडक्ट्स को फ्रिज या फ्रीजर से बाहर निकालकर उन्हें उतारें । नीचे एक मिनी (प्लेट) के कम रन विकल्प का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को स्पिन केंद्रापसारक । फिर, प्रत्येक 4 & #181; l के साथ एक पीसीआर उत्पाद के 4 & #181; l के विकार बफर. ९६ पर 5 मिनट के लिए हीट मिश्रण & #176; सी तुरंत 10 मिनट के लिए ठंडी पानी में एक ठंडा कदम के बाद
    नोट: नमूने polyacrylamide जेल (चरण ४.५) पर इस के बाद तुरंत लोड किया जाना चाहिए ।
  • polyacrylamide जेल (चरण 4.1.6) से कंघी निकालें और एक जेल स्लॉट में एक नमूना पूरी तरह से लोड करने के लिए एक micropipette का उपयोग करें । 8 W प्रति जेल पर ट्रो चलाएं जबकि लगातार ठंडा करने के लिए ट्रो यूनिट को 10 & #176; C. आवश्यक समय चल रहा है अलग करने के लिए टुकड़ा के आकार पर निर्भर करता है । लगभग २१० bp के अंश आकारों के लिए, लगभग ३.५ h का चलित समय उपयुक्त माना जाता है ।
  • एक दाग स्नान तैयार करने के लिए, एक वर्ग के आकार का प्लास्टिक बॉक्स अभेद्य में 1x TBE के १,००० मिलीलीटर डाल करने के लिए प्रकाश और जोड़ 30 & #181; धुंधला डाई के एल (एक microliter पिपेट के साथ दाग एकल असहाय डीएनए के लिए उपयुक्त) । प्लास्टिक बॉक्स के ढक्कन बंद करो और यह धुंधला डाई के बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए हिला ।
  • ट्रो चैंबर से जेल कैसेट निकालें और सावधानी से निशाना ग्लास प्लेट जेल से अलग । धुंधला स्नान में खाली ग्लास प्लेट से polyacrylamide जेल स्लाइड । एक मिलाते हुए मंच पर दाग स्नान प्लेस और दाग जेल के लिए 20 & #160; को & #160; 30 & #160; मिनट लगातार मिलाने के साथ.
  • ध्यान से बाहर दाग स्नान के जेल ले लो और यह एक प्रलेखन प्रणाली के यूवी मेज पर जगह है ।
    नोट: जेल की अस्थिरता के कारण यह दो लोगों के साथ पहले कदम को संभालने के लिए सलाह दी जाती है । एक व्यक्ति यूवी मेज के बगल में धुंधला स्नान पकड़ और एक दूसरे को दोनों हाथों से जेल के नीचे तक पहुंचने चाहिए, इसे बाहर ले जाना चाहिए, और यह यूवी मेज पर स्लाइड ।
  • प्रलेखन प्रणाली के ढक्कन या दरवाजा बंद करें और निर्माता के अनुसार एक तस्वीर ले & #39; एस अनुदेश मैनुअल.
    • < p class = "jove_title" > 5. स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग कर समानांतर में कई हाल ही में घूस शिकार समूहों का पता लगाने ।

    1. आंत सामग्री डीएनए का विश्लेषण 16 समूह विशिष्ट प्राइमर तालिका 2 में दिए गए सेट का उपयोग कर अर्क, एक एक रंग के साथ संशोधन के कारण लेबल सेट का एक प्राइमर के साथ (तालिका 2 संशोधन शीर्षक कॉलम देखें), और समानांतर पता लगाने के तरीकों का उपयोग करें एक स्वचालित sequencer.
      1. डीएनए निष्कर्षों के काम के समाधान का उपयोग करें (1.3.11 करने के लिए कदम १.१ के अनुसार तैयार) और प्रत्येक प्राइमर के लिए कदम 2.1.1 में वर्णित की तरह सेट के लिए अलग पीसीआर आचरण 2.1.5 (मिश्रण में बदलाव तालिका 2 में दी जाती हैं) । संबंधित लक्षित समूह (सकारात्मक नियंत्रण) और प्रत्येक पीसीआर चलाने में उपभोक्ता प्रजातियों में से शुद्ध डीएनए के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण से संबंधित एक नमूना से शुद्ध डीएनए के साथ कम से कम एक नियंत्रण का उपयोग करें ।
      2. चरण 2.1.4 में दिए गए मानक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर thermocycler में पीसीआर चलाने के लिए, संबंधित एनीलिंग तापमान (और चक्र की संख्या) तालिका 2 .
        में दिए गए सेट के लिए प्रत्येक प्राइमरी के लिए समायोजित किया नोट: के साथ पीसीआर के लिए प्रतिक्रिया कुओं के एक ही डीएनए आवंटन का प्रयोग करें 16 अलग प्राइमर सेट में से प्रत्येक बैच स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के लिए पीसीआर उत्पादों के बाद पूलिंग को सरल बनाने के लिए ।
      3. स्टोर पीसीआर उत्पादों पर-20 & #176; C जब तक सभी पीसीआर स्वचालित अंश विश्लेषण के लिए एक बैच से संबंधित (देखें तालिका 2 ) समाप्त कर रहे हैं । अंधेरे में पीसीआर उत्पादों रखें और उंहें 1 सप्ताह से अधिक लंबे समय से पहले टुकड़ा विश्लेषण के लिए दुकान नहीं है ।
    < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "Table 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56132/56132tbl2.jpg"/>
    तालिका 2: 15 समूह के 2 बैचों के विशिष्ट प्राइमरी पेयर्स का विवरण Koester एट अल. द्वारा स्थापित (२०१३) और नव डिजाइन Jae28S प्राइमर जोड़ी 18S के क्षेत्रों को बढ़ाना या जलीय macroinvertebrates के 16 लक्ष्य समूहों से 28S rDNA । एफ, फॉरवर्ड प्राइमरों; आर, रिवर्स प्राइमरों; 18S, प्राइमर लक्ष्य 18S rDNA उपइकाई; 28S, प्राइमर लक्ष्य 28S rDNA उपइकाई. & #34; Hydrobiologia, Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a & #39; खूनी चिंराट & #39; नदी राइन प्रणाली में?, ७६८, २०१६, तालिका एस 1, अनुपूरक सामग्री पेज 2, Koester Meike, बायर Bastian, Gergs रेन & #233;, (& #169; स्प्रिंगर अंतर्राष्ट्रीय प्रकाशन स्विट्ज़रलैंड २०१५) & #34; स्प्रिंगर की अनुमति से । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56132/56132tbl2large.jpg" target = "blank" > इस तालिका का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

    < राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • सभी 16 प्राइमर सेट के प्रवर्धित टुकड़े का पता लगाने के लिए 2 तालिका 2 में दिए गए बैचों में स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण आचरण । एक आंतरिक आकार मानक का प्रयोग करें (डीएनए आकार मानक किट-४०० [बैच बी] और-६०० [बैच एक], क्रमशः) टुकड़ा लंबाई निर्धारित करने के लिए । निम्न चरणों में वर्णित के रूप में sequencing प्लेट और स्वचालित sequencer तैयार करें । ध्यान दें कि इस प्रक्रिया को यदि सामग्री तालिका में दिए गए से किसी अंय प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग कर समायोजित करना पड़ सकता है ।
    1. प्रत्येक बैच-नमूना चलाने के लिए, नमूना लोडिंग समाधान (SLS) और संबंधित आकार मानक युक्त एक मिश्रण तैयार करते हैं । पिपेट २१.६ & #160; & #181; l का SLS व ०.४ & #160; & #181; l के DNA & #160; Size & #160; standard & #160; संच & #160;-& #160; ६०० बैच के प्रति नमूना A और, क्रमश: २१.७ & #160; & #181; l का SLS और ०.३ & #160; & #181; l के DNA & #160; साइज & #160; मानक & #160; संच & #160;- & #160;
      2. बैच के प्रति नमूना ४००
    2. फ्रीजर से बाहर संबंधित बैच से संबंधित 8 पीसीआर के पीसीआर उत्पादों को ले और उन्हें ठंढ । सुनिश्चित करें कि वे अभी भी अंधेरे में रखा जाता है ।
    3. एक microliter पिपेट का उपयोग करने के लिए एक sequencing प्लेट की कुओं की संख्या को लोड करने की आवश्यकता (विश्लेषण करने के लिए नमूनों की संख्या) प्रत्येक के साथ 22 & #160; & #181; कदम 5.2.1 में वर्णित संबंधित मिश्रण के एल. एक मिनी (प्लेट) के कम रन विकल्प का उपयोग कर 8 पीसीआर में से प्रत्येक के पीसीआर उत्पादों नीचे स्पिन केंद्रापसारक । एक microliter पिपेट.
      4. के साथ अनुक्रमण प्लेट के संबंधित कुओं में 8 पीसीआर में से प्रत्येक के प्रति पीसीआर उत्पाद प्रत्येक 1 & #181; एल स्थानांतरण
    4. ध्यान से एक मिनी प्लेट के एक छोटे से चलाने के साथ sequencing थाली के भीतर इस मिश्रण नीचे स्पिन और खनिज तेल की एक बूंद के साथ प्रयोग किया जाता कुओं में से प्रत्येक ओवरले । एक बफर प्लेट के संबंधित रिएक्शन वेल्स भरें 250-300 & #181; डीएनए जुदाई बफर के एल.
    5. निर्माता & #39; s निर्देश के अनुसार एक नमूना सेटअप बनाने के लिए केशिका sequencer के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करें । नमूना सेट को नियंत्रित करने के लिए विधियाँ असाइन करें और डेटा को संसाधित करने के लिए उपयोग किया जा करने के लिए विधियों का अनुक्रम निर्धारित करें ( सामग्री तालिका में दिए गए आकार मानक के साथ उपयोग के लिए पर्याप्त शर्तों को चलाने के लिए तालिका 3 देखें) । ध्यान दें कि यह महत्वपूर्ण है कि नमूना सेटअप के भीतर नमूनों का आवंटन sequencing थाली में नमूना आबंटन से मेल खाता है (सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित, कदम 5.1.1 देखें) और विधि टुकड़ा विश्लेषण के लिए पर्याप्त के साथ संबंधित आकार मानक चुना जाता है.
    6. पानी के साथ एक गीला ट्रे को भरने और केशिका sequencer में अनुक्रमण प्लेट, बफर प्लेट और गीला ट्रे डालें । एक जेल कारतूस डालें ताजा डीएनए जुदाई जेल जो नमूना चलाने के लिए आवश्यक है की एक पर्याप्त राशि युक्त । तैयार नमूना सेटअप का उपयोग कर sequencing प्लेट चलाएँ.
    • < सारणी सीमा = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > < td colspan = "2" > स्वभाव < टीडी colspan = "2" > अलग केशिका < टीडी colspan = "2" > इंजेक्षन तापमान समय वोल्टेज समय वोल्टेज समय आकार मानक ६०० ९० & #176; ग १२० s ४.८ केवी ६० मिन ५० & #176; ग Temp के लिए प्रतीक्षा करें: यस २.० केवी 30 एस आकार मानक ४०० ९० & #176; c १२० s 6 केवी ४५ min ५० & #176; c Temp के लिए प्रतीक्षा करें: यस २.० केवी 30 एस < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर पृष्ठ = "1" > तालिका 3: सामग्री तालिका में दिए गए आकार मानकों का उपयोग कर स्वचालित sequencer पर टुकड़ा विश्लेषण के लिए विशिष्ट शर्तों.

    < राजभाषा प्रारंभ = "3" >
  • परिणाम का विश्लेषण करने के लिए अपुष्ट डेटा निर्यात और एक टुकड़ा विश्लेषण कार्यक्रम के लिए उन डेटा अपलोड करें । डाई रंग चैनल सेट करने के लिए संबंधित निर्माता के मानक डाई रंग आदेश चुनें.
    1. एक समूह द्वारा परिलक्षित टुकड़ा लंबाई की उंमीद की सीमा एक पैनल बनाएं-विशिष्ट प्राइमर एक बैच के भीतर सेट कार्यक्रम के उपयोगकर्ता पुस्तिका के अनुसार ।
    2. डेटा संसाधित करने के लिए, संबंधित पैनल, उचित आकार मानक, मानक रंग, और विश्लेषण के प्रकार और चलाने की प्रक्रिया का चयन करें । प्रत्येक डाई रंग के लिए एक एकल लाइन ट्रेस के रूप में केशिका ट्रो उपकरणों से फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता प्रदर्शित करने के लिए electropherogram विकल्प चुनें । मार्करों/प्राइमर सेट संबंधित टुकड़ा रेंज का संकेत प्रदर्शित किया जाएगा और प्रत्येक बुलाया चोटी के केंद्र के साथ जुड़े पता लगाया टुकड़ा की सटीक लंबाई (रंगाई या नाम सौंपा द्वारा सबसे कार्यक्रमों में) स्वचालित रूप से प्रकाश डाला जाएगा ।
      3. प्रत्येक नमूने के लिए
    3. , कैसे बारीकी से गणना नमूना & #39; एस आंतरिक आकार मानक चयनित आकार मानक से मेल खाता कॉलिंग की सफलता को आश्वस्त करने के लिए । अधिकांश अंश विश्लेषण प्रोग्रांस के लिए स्वचालित रूप से इस मेल की गणना और विज़ुअलाइज़ करने का विकल्प होता है । यदि आकार कॉलिंग विफल रहा, तो उन नमूनों के लिए अंश विश्लेषण दोहराएं ।
    4. नेत्रहीन प्रत्येक नमूने के electropherogram की जांच करें और पुष्टि/हर चोटी प्रत्येक मार्कर के लिए बुलाया/ मैन्युअल रूप से अनकॉलर चोटियों कि एक मार्कर/प्राइमर सेट के मानदंड फिट या गलत लोगों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम के उपयोगकर्ता पुस्तिका के अनुसार डालें. आधार युग्म आकार या बिन नाम लागू करें & #39; एलील लैबल & #39;. की गणना और पीक विनिर्देशों में प्रदर्शित करें & #39;P eak Table & #39;.

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    Representative Results

    हम सफलतापूर्वक विभिंन अध्ययनों के भीतर आहार विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित कदम का इस्तेमाल किया । इस अनुभाग में, हम प्रोटोकॉल के विभिंन वर्गों की प्रयोज्यता का वर्णन उदाहरण पेश करते हैं ।

    एक उदाहरण के रूप में, समूह-विशिष्ट प्राइमर लेखकों द्वारा स्थापित सेट की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए28 और SSCP विश्लेषण द्वारा पीसीआर उत्पादों के आगे बहाव के विश्लेषण की क्षमता, एक खिला प्रयोग आयोजित किया गया था । शिकारियों और Caenis एसपीपी के रूप में Dikerogammarus villosus के व्यक्तियों । शिकार के रूप में लार्वा नदी राइन और कार्ल्सृहे (जर्मनी) के पास नदियों में कब्जा कर लिया गया । प्रयोगशाला में, शिकारी और शिकार taxa 20 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर्ड धारा पानी में अलग से रखा गया था और ३६ घंटे के लिए भूखे थे । प्रयोग के लिए, amphipod नमूनों को फ़िल्टर किए गए स्ट्रीम वॉटर (१०० mL) के साथ यूरिन में रखा गया था, जो कि 30 मिनट के लिए दो से तीन Caenis लार्वा के साथ खिलाया जाता है, और बाद में तरल नाइट्रोजन में जम जाता है । प्रत्येक villosus के जठरांत्र संबंधी मार्ग और विच्छेदित डीएनए 1 प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में निकाला गया था । डीएनए निष्कर्षों Caep28S प्राइमर सेट के साथ परीक्षण किया गया Caenis एसपीपी का पता लगाने के लिए उपयुक्त । प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में उपयुक्त पीसीआर प्रोटोकॉल28 का उपयोग कर । विभिन्न Caenis प्रजातियों के प्रवर्धित अंशों के बीच अंतर को सत्यापित करने के लिए, पीसीआर को तीन Caenis संदर्भ प्रजातियों के आंत सामग्री नमूनों और शुद्ध डीएनए नमूनों के साथ आयोजित किया गया था । Agarose जेल ट्रो डबल फंसे डीएनए के एकल बैंड है, जो ट्रो (चित्रा 2a) के इस प्रकार के साथ विभिंन Caenis प्रजातियों के बीच प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है के नेतृत्व में । इसके विपरीत, SSCP जेल ट्रो द्वारा, के रूप में प्रोटोकॉल 4 में वर्णित है, यह संभव था प्रजातियों के स्तर पर शिकार जीवों की पहचान करने के लिए संदर्भ नमूनों के साथ आंत सामग्री के नमूनों की तुलना (चित्र 2 बी). तीन संदर्भ taxa के SSCP टुकड़ा पैटर्न Caenis beskidensis (चित्रा 2 बी, लेन 1), Caenis horaria (चित्रा 2 बी, लेन २), और Caenis luctuosa (चित्रा बी1, लेन 3) differentiable पैटर्न के साथ चार बैंड के शामिल थे । दो आंत सामग्री के नमूने (चित्र 2 बी, लेन 4 और 5) एक टुकड़ा पैटर्न सी. luctuosa (चित्रा 2 बी, लेन 3) के बराबर था । तीसरे आंत सामग्री नमूना (चित्रा 2 बी, लेन 6) के टुकड़े पैटर्न सी. horaria (चित्रा बी3, लेन २) की है कि समान था । दो आंत सामग्री नमूने के अनुक्रम विश्लेषण सी. luctuosa और सी. horaria के रूप में पहचान (चित्रा 2 बी, लेन 4 और 6) और संबंधित संदर्भ प्रजातियों इस परिणाम सत्यापित (इलेक्ट्रॉनिक पूरक संरेखण फसता फ़ाइल देखें) ।

    Figure 2
    चित्र 2: (ए) agarose जेल ट्रो की मूल छवि और (ख) Caep28S प्राइमर सेट के साथ परिवर्धित आंत सामग्री और संदर्भ नमूने के पीसीआर अंशों का SSCP विश्लेषण । गलियाँ 1-3 प्रजातियों के संदर्भ नमूने दिखाएं Caenis beskidensis (1), Caenis horaria (2) और Caenis luctuosa (3) । गलियों में 4-6, amphipod Dikerogammarus villosus के विभिंन आंत सामग्री नमूनों की टुकड़ा पैटर्न प्रस्तुत कर रहे हैं । लेन 7 एक १०० बीपी डीएनए सीढ़ी के टुकड़े पैटर्न से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    इसके अलावा, एक प्रयोगशाला प्रयोग में आयोजित किया गया था, जिसमें इस प्रजाति से संबंधित पानी के कण Hygrobates fluviatilis chironomid लार्वा पर खिलाया गया था न केवल यह निर्धारित करने के लिए कि chironomid भस्म व्यक्तियों का डीएनए जल के कण में पाया जा सकता है, लेकिन यह भी परीक्षण के लिए यदि डीएनए की राशि का पता चला शिकार की खपत के बाद से बीता समय पर निर्भर करता है29. लगभग एक सप्ताह के लिए कण भूखे के बाद, प्रत्येक घुन भोजन के रूप में एक chironomid लार्वा की पेशकश की थी । प्रत्येक 3-4 जल घुन व्यक्तियों आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इथेनॉल (निरपेक्ष) में तय की गई Chiro18S प्राइमर का उपयोग कर dipteran परिवार के लिए विशिष्ट सेट 1, 2, 3, 7, 9, 24, ३२ और ५० एच में28 Chironomidae के बाद29खिलाया जा रहा है । जल घुन व्यक्तियों द्वारा उपभोग की एक डिग्री के रूप में, संबंधित शिकार व्यक्तियों निम्नलिखित पांच खिला श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया: 1 = पूरी तरह से बाहर चूसा, झिल्ली पूरी तरह से खाली (& #62; ९०%), 2 = लगभग पूरी तरह से चूसा बाहर (& #62; 75-90%), 3 = अर्द्ध चूसा बाहर (& #62; 50-75%), 4 = केवल आंशिक रूप से बाहर चूसा (& #62; 5-50%), 5 = शिकार के शरीर की संरचना में कोई दृश्य परिवर्तन (≤ 5%)29। डीएनए में वर्णित के रूप में पानी के कण से निकाली गई प्रोटोकॉल 1 (बिना कदम 1.2.1 और 1.2.2) और 18S rDNA की उपस्थिति और टेंपलेट के कार्यात्मक दक्षता में प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में सत्यापित किया गया । शिकार डीएनए का पता लगाने 4 प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था केवल Chiro18S प्राइमर एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल आगे प्राइमर के साथ सेट का उपयोग ( तालिका 2देखें) और डीएनए आकार मानक किट-४०० । एक स्वचालित sequencer के विभिन्न रन के भीतर विश्लेषण नमूनों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए, नमूना पीक ऊंचाई और निकटतम आंतरिक मानक की पीक ऊँचाई (, इस मामले में ३६० bp) प्रत्येक नमूने की गणना की गई और के रूप में उपयोग किया गया के बीच अनुपात डीएनए की मात्रा के लिए एक प्रॉक्सी का पता चला । परिणामों से पता चला कि chironomid डीएनए वस्तुतः Hygrobates fluviatilis के सभी व्यक्तियों chironomid लार्वा29पर खिलाया में detectable था । (५० ज) दूध पिलाने के बाद सबसे लंबे समय तक की अवधि के लिए सबसे छोटा अंतराल (1 घंटे से) का पता लगाया शिकार डीएनए के सापेक्ष राशि काफी कम हो गया था (चित्र 3)29। इसके अलावा, भोजन और शिकार डीएनए की घूस राशि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में शिकार वर्गीकरण के बाद समय के बीच संबंध (चित्र बी)29की पुष्टि की जा सकती है । शिकार डीएनए की कमी भोजन के बाद बढ़ती समय के साथ पता चला सबसे अधिक संभावना पूरी तरह से डीएनए और शिकार के पाचन के क्षरण से परिलक्षित होता था, क्योंकि शिकार डीएनए के egestion अत्यधिक अकल्पनीय है पानी के कण में एक गुदा के अभाव के कारण29। ये परिणाम घूस शिकार के ठहराव के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता की पुष्टि करते हैं ।

    Figure 3
    चित्र 3: राष्ट्रीय ln ऊंचाई के बीच संबंध-अनुपात (नमूना पीक हाइट्स/मानक३६० पीक ऊंचाई) और (एक) कण और (ख) खिला श्रेणी (n = 23) की फीडिंग के बाद समय । "प्रायोगिक और एप्लाइड Acarology, शिकार डीएनए का पहला पता लगाने में Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): शिकारी का निर्धारण करने के लिए एक नया दृष्टिकोण-पानी के कण में शिकार रिश्ते, ६७, ३७६, पी मार्टिन, एम. Koester, एल Schynawa, आर Gergs, (© स्प्रिंगर इन्टरनेशनल पब्लिशिंग Switzerlऔर २०१५) "स्प्रिंगर की अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    क्षेत्र में इनवेसिव amphipod डी villosus द्वारा predation के महत्व की जांच करने के लिए, δ के गहन स्थिर आइसोटोप विश्लेषण13सी और δ के15एन डी. villosus और संभावित खाद्य संसाधनों आणविक द्वारा आगे थे सटीक एक ही व्यक्तियों के आंत सामग्री के भीतर हाल ही में घूस शिकार का पता लगाने । कुल में, विभिंन साइटों से २०६ D. villosus व्यक्तियों और एकत्र किए गए प्रत्येक व्यक्ति के जठरांत्र संबंधी मार्ग था और विच्छेदित डीएनए प्रोटोकॉल 1 के अनुसार निकाला गया था । प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में उपयोग किए गए टेंपलेट्स की उपस्थिति और कार्यात्मक दक्षता का आश्वासन दिया गया था । predation द्वारा हाल ही में कई macroinvertebrate शिकार taxa पर D. villosus व्यक्तियों द्वारा प्रोटोकॉल 4 में वर्णित के रूप में परीक्षण किया गया । कुल मिलाकर, केवल 16% D. villosus आंत सामग्री के डीएनए के लिए सकारात्मक परीक्षण 16 लक्षित macroinvertebrate शिकार taxa में से किसी से संबंधित है, और इसलिए स्थिर आइसोटोप विश्लेषण है कि एक कम predacious खिला व्यवहार संकेत के परिणाम का समर्थन क्षेत्र में इनवेसिव amphipod के27. जबकि, आनुवंशिक विश्लेषण के भीतर, 12 परीक्षण शिकार taxa के डीएनए में पाया गया था कम से कम 1 आंत सामग्री नमूना, 4 अंय शिकार taxa के डीएनए का पता नहीं था (चित्रा 4)27।

    Figure 4
    चित्र 4: हिस्टोग्राम सभी दस साइटों जिसका आंत सामग्री macroinvertebrate शिकार डीएनए के लिए सकारात्मक परीक्षण से संबंधित D. villosus व्यक्तियों की संख्या illustrating । पीसीआर 16 समूह विशिष्ट प्राइमर सेट के रूप में संकेत के साथ किया गया था । "Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) नदी राइन प्रणाली में एक ' हत्यारा चिंराट ' है?, ७६८, २०१६, ३१०, Koester Meike, बायर Bastian, Gergs रेने, (© स्प्रिंगर इंटरनेशनल पब्लिशिंग स्विट्जरलैंड २०१५)" की अनुमति के साथ springer. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

    यहां, हम पीसीआर के लिए एक आसान और लागत कुशल विधि-शिकारी के निर्धारण आधारित समूह के माध्यम से क्षेत्र के नमूनों से शिकार बातचीत rDNA क्षेत्रों के लिए विशिष्ट प्राइमरों, जो एक ही नमूनों के अंय गैर आणविक विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जा सकता है प्रस्तुत करते हैं । हालांकि, प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, इस्तेमाल किया प्राइमरों की विशिष्टता का आश्वासन आवश्यक है । दूसरे, यह दूषित और गैस्ट्रो आंत्र पथ की तैयारी के दौरान आंत सामग्री सामग्री की हानि और डीएनए के बाद निष्कर्षण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि पार नमूना संक्रमण शिकार डीएनए के झूठी सकारात्मक का पता लगाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, आंत सामग्री की हानि शायद ही कभी शिकार प्रजातियों की खपत लापता हो सकती है । संबंधित उपइकाई से संबंधित rDNA की उपस्थिति का सत्यापन और विश्लेषण (प्रोटोकॉल की धारा 2) के लिए इस्तेमाल किया टेंपलेट्स के कार्यात्मक दक्षता शिकार भस्म के बारे में प्रतिनिधि जानकारी जुटाने के लिए आवश्यक है । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, अगर शिकार समूहों के कोई डीएनए उपभोक्ता को फ़ीड माना जाता है पर25,27का पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, जब पीसीआर (कदम ३.१, 5.1.1 और 5.1.2) की तैयारी यह महत्वपूर्ण है कि मिश्रण और प्रोटोकॉल का इस्तेमाल बिल्कुल मानदंड है जिसमें संबंधित प्राइमर taxa के एक निश्चित समूह को निर्दिष्ट किया गया था फिट है । अंयथा, पीसीआर प्रतिक्रिया के भीतर डीएनए का प्रवर्धन पूरी तरह से विफल हो सकता है, या taxa के डीएनए के रूप में अच्छी तरह से परिलक्षित नहीं हो सकता है । इसलिए, प्रत्येक पीसीआर चलाने के भीतर सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करने के लिए आश्वस्त है कि पीसीआर प्रतिक्रिया काम किया है और कोई संक्रमण हुआ अनिवार्य है । इसके अतिरिक्त, यह आवश्यक है कि प्रत्येक पीसीआर चलाने के लिए नमूनों की सरणी वास्तव में संबंधित उपभोक्ता नमूना को भस्म शिकार के सही काम को सक्षम करने के लिए प्रलेखित किया गया है । इस कार्य के लिए, स्वचालित अंश विश्लेषण (step 5.2.3) के माध्यम से कई शिकार समूहों के समानांतर पता लगाने के लिए पीसीआर उत्पादों को पूलिंग करते समय विशेष सावधानी बरतने की जरूरत है ।

    agarose जेल ट्रो का उपयोग कर प्रवर्धित टुकड़े का पता लगाने के लिए (चरण ३.२ और ३.३) agarose जैल संभव के रूप में पतली होना चाहिए और देखभाल के लिए छवि के दृश्य निरीक्षण के दौरान लिया जा करने के लिए कम दृश्य संकल्प के साथ टुकड़े लापता से बचने के लिए किया जाना चाहिए । परिणाम के लिए और एक उपभोक्ता द्वारा शिकार की खपत के बारे में एक उचित निष्कर्ष के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि यहां तक कि शायद ही कभी शिकार taxa भस्म पहचाना जा रहा है । मोटी agarose जैल शिकार डीएनए की संभावित कम मात्रा की दृश्यता कम है और इस तरह शायद ही कभी शिकार का उपभोग याद आती है और विश्लेषण से तैयार निष्कर्ष में अनिश्चितताओं का परिचय कम संभावना है । इसके अलावा, एक स्वास्थ्य के नजरिए से, एक कम या गैर ethidium ब्रोमाइड से जैल दाग के लिए विषाक्त विकल्प का उपयोग कर उचित हो सकता है । polyacrylamide जैल का उपयोग SSCP विश्लेषण के माध्यम से प्रवर्धित टुकड़े के बाद आगे बहाव के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल कुछ कदम है कि विशेष रूप से सावधानी के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए शामिल हैं । यह महत्वपूर्ण है कि जेल कैसेट इकट्ठे लीक प्रूफ (step 4.1.3) है और polyacrylamide सॉल्यूशन को पूरी तरह से polymerize (step 4.1.6) करने के लिए पर्याप्त समय दिया जाता है । कैसेट खोलना भी जल्दी तरल acrylamide समाधान लीक करने के लिए नेतृत्व और, इस तथ्य यह है कि तैयारी शुरू से ही शुरू हो गया है के बावजूद, व्यापक सफाई की जरूरत के रूप में अच्छी तरह से किया जाएगा । इसके अलावा, धुंधला स्नान में polyacrylamide जेल स्थानांतरण (चरण ४.७) और वहां से यूवी मेज पर (कदम ४.८) बहुत सावधानी से इस तरह के जैल की अस्थिरता के कारण किया जाना चाहिए । अंयथा, जेल आंसू और टुकड़े बाधित हो सकता है, जो आवश्यकता के लिए प्रक्रिया को दोहराने की ओर जाता है हो सकता है ।

    एक सफलतापूर्वक स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण से प्राप्त डेटा प्रसंस्करण के लिए प्रमुख आवश्यकता है कि नमूना आंतरिक आकार मानक बारीकी से आकार मानक निर्माता द्वारा दिए गए पैटर्न से मेल खाता है (चरण 5.3.3) के निर्धारण को सक्षम करने के लिए उपयुक्त अंश लंबाई । यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि अंयथा, अलग टुकड़े, एक ही फ्लोरोसेंट धुंधला रंग के साथ लेबल, गलत शिकार taxa को सौंपा जा सकता है और इसलिए शिकारी की एक पूरी तरह से ंयाय शिकार बातचीत के लिए सीसा । इसके अलावा, electropherograms अक्सर पृष्ठभूमि शोर दिखाते हैं । व्याख्या में विश्वास स्थापित करने के लिए, यह आवश्यक है कि आंतरिक आकार मानक की चोटियों नमूना की पृष्ठभूमि शोर से काफी अधिक हैं । नतीजतन, प्रत्येक मार्कर/प्राइमर के लिए चोटियों केवल अगर वे पृष्ठभूमि शोर से काफी अधिक है गिना जाना चाहिए ।

    इस प्रोटोकॉल के हित के विभिंन उपभोक्ताओं के भीतर ब्याज की शिकार taxa के कई समूहों का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । बेशक, समूह विशिष्ट प्राइमरों हित के हर संभावित शिकार taxon के लिए पहले से ही उपलब्ध नहीं हो सकता है । फिर भी, समूह विशिष्ट प्राइमर न केवल कई मीठे पानी के लिए उपलब्ध है macroinvertebrate taxa28, बल्कि अंय taxa की एक व्यापक रेंज के लिए (जैसे, कई समुद्री macroinvertebrate taxa16,30 और उड़ने वाले कीड़ों की आम taxa31). इस प्रकार, समूह के चयन विशेष प्राइमर सेट एक दिया taxon के सभी शिकार प्रजातियों के डीएनए बढ़ाना उपयुक्त है, लेकिन इस taxon से संबंधित नहीं प्रजातियों से डीएनए के प्रवर्धन में असफल, आवश्यक है३२। कई समूह-विशिष्ट प्राइमरों कि अब उपलब्ध है taxa की एक सीमा के लिए निर्दिष्ट किया गया है (जैसे, मीठे पानी के १३० taxa macroinvertebrates नदी राइन प्रणाली में आम28) । इसलिए, झूठी नकारात्मक या झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए, ऐसे प्राइमरों की विशिष्टता के लिए ब्याज की पारिस्थितिकी तंत्र में taxa आम की सीमा के लिए फिर से जांच की जानी चाहिए लक्ष्य taxa और उपभोक्ताओं के लिए taxa की श्रेणी में शामिल नहीं करने के लिए अपने आवेदन से पहले जिसमें प्राइमरी की स्थापना हुई थी । इसके अलावा, अगर उन आणविक विश्लेषण करने के लिए सटीक एक ही व्यक्ति के अंय विश्लेषण के साथ संयुक्त नहीं कर रहे हैं, जठरांत्र संबंधी मार्ग के विच्छेदन छोड़ दिया जा सकता है ।

    फिर भी, बड़ा नमूनों के जठरांत्र संबंधी मार्ग विदारक, क्योंकि बहुत अधिक सामग्री के डीएनए निष्कर्षण की विफलता को रोकता है, और नमूना निकालने में उपभोक्ता डीएनए की उपस्थिति कम कर देता है । हालांकि, अध्ययनों से पता चला है कि विशिष्ट अवरुद्ध प्राइमरों का उपयोग कर, जो उपभोक्ता के डीएनए को देते है और इस तरह यह ब्लॉक, पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए प्रभावी रूप से मिश्रित नमूनों में दुर्लभ दृश्यों के प्रवर्धन को बढ़ा सकते है३३। इसलिए, जठरांत्र संबंधी मार्ग के विच्छेदन से बचा जा सकता है, यहां तक कि जब बड़ा उपभोक्ता नमूनों से निपटने, विशिष्ट ब्लॉकिंग प्राइमरों के उपयोग से । एकाधिक समूह से व्युत्पंन amplicons के समानांतर पता लगाने के लिए स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से विशिष्ट प्राइमर सेट, देखभाल लेबल के रूप में धुंधला डाई के चयन में लिया जाना चाहिए । इस प्रकार, प्राइमर लगभग एक ही लंबाई के टुकड़े बढ़ाना सेट स्पष्ट रूप से अलग फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल किया जाना चाहिए । इसके अलावा, वहां केशिका ट्रो कई निर्माताओं से उपलब्ध प्रणालियों की एक सीमा है । इन प्रणालियों में से कुछ माना जाता है भी विशिष्ट रंगों के माध्यम से कई टुकड़े के निर्धारण की अनुमति । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को आसानी से उन प्रणालियों में से किसी के साथ प्रवर्धित टुकड़ों का पता लगाने के लिए समायोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, टी के लिए समय की जरूरत को कम करने के लिएउन्होंने विश्लेषण किया, यह एकल मल्टीप्लेक्स-पीसीआर परख का अनुकूलन करने के लिए संभव होगा एक टुकड़ा विश्लेषण बैच के शिकार समूहों के डीएनए को बढ़ाना एक साथ (उदाहरण के लिए, 12 भृंग के शिकार जीवों के एक साथ प्रवर्धन३४ या अप करने के लिए छह फ्लाइंग कीट taxa31).

    सामांय में आंत सामग्री विश्लेषण का एक संभावित नुकसान है, और इसलिए भी इस प्रोटोकॉल में वर्णित विश्लेषण, कम लौकिक संकल्प है । इस तरह के तरीकों के साथ, यह केवल हाल ही में घूस जीवों की पहचान करने के लिए संभव है, जो एकल शिकार जीवों के महत्व में अनिश्चितताओं को जन्म दे सकता है2. हालांकि, हम इस प्रोटोकॉल के अनुसार आनुवंशिक विश्लेषण आसानी से स्थिर आइसोटोप के विश्लेषण के साथ संयुक्त किया जा सकता है कि प्रदर्शन (δ15एन और δ13सी) सटीक एक ही उपभोक्ता नमूनों की25,27. एक समय के रूप में-शिकारी के प्राकृतिक अनुरेखक का घालमेल शिकार बातचीत, स्थिर आइसोटोप विश्लेषण अक्सर इस खाद्य वेब संरचनाओं के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं1, लेकिन विभिन्न शिकार प्रजातियों में से संभावित अतिव्यापी isotopic मूल्यों अक्सर एक सटीक बाधा शिकारी की परिभाषा-शिकार बातचीत2. इसलिए, प्रत्येक विधि के नुकसान को दूर करने के लिए स्थिर आइसोटोप विश्लेषण के साथ संयोजन में आनुवंशिक विश्लेषण के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग खाद्य जाले की हमारी समझ और पोषक तत्वों या ऊर्जा प्रवाह के लिए उनके रिश्ते को और अधिक कर सकते हैं ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम पारिस्थितिकी तंत्र विश्लेषण और मूल्यांकन (gaiac) के लिए अनुसंधान संस्थान से सिल्क Classen धंयवाद, समूह की स्थापना में उसकी सहायता के लिए RWTH आकिन विशिष्ट प्राइमर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सेट । हम भी पीटर मार्टिन और लौरा Schynawa काइल विश्वविद्यालय से पानी के कण ' प्रयोगों में सहयोग के लिए धंयवाद । हम भी प्रयोगशाला सुचारू रूप से चल रहा है और कंपनियों और सूचीपत्र संख्या के रजिस्टर की तैयारी रखने के लिए तकनीकी प्रयोगशाला सहायकों का धंयवाद । यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG; प्रोजेक्ट जीई 2219/3-1) द्वारा समर्थित किया गया था ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    liquid nitrogen Any NA For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
    1.5 ml reaction tubes - Safelock Any NA For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
    Stereomicroscope Any NA Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
    Petri dishes Any NA To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
    Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 Bioform B40d This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
    Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 Bioform B40b This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
    DNA-ExitusPlus AppliChem A7409,1000RF Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
    fuzz-free paper towel Any NA
    Lab scale Any NA Precision needs to be at least 0.01 g.
    Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) Any NA
    Safe-Lock Tubes 2.0 ml VWR 211-2165 It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
    Safe-Lock Tubes 1.5 ml VWR 211-2164 It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
    Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO carlroth 3957.3 For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris carlroth 4855.2 For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
    Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) carlroth 8043.1 For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
    Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO carlroth 6943.2 For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) carlroth 4360.1 For extraction of DNA
    Proteinase K lyophil. carlroth 7528.1 Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
    TissueLyser II Quiagen 85300 Bead mill for homogenization of the samples.
    Stainless Steel Beads, 5 mm Quiagen 69989 For homogenization of samples.
    Heating Thermoshaker Any NA
    Vortex Mixer Any NA
    Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE Hitachi NA Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
    Isopropanol carlroth 6752.5
    Ethanol 99.8 %, p.a. Any NA
    Water Molecular biology grade (ddH2O) AppliChem A7398,1000 nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
    Unmodified Olegonucleotides Eurofins MWG Operon NA Primers unlabeled
    Modified olegonucleotides Metabion International AG NA Primers labelled
    peqGOLD Taq all inclusive VWR Peqlab 01-1000 Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
    Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient Peqlab NA Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
    Standard 96 Well PCR Plates VWR Peqlab 732-2879 Used for PCR reactions.
    Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes VWR Peqlab 732-3223 Cap stripes used to close the PCR plates.
    Agarose Peqlab 35-1020 Used for gel electrophoresis.
    Microwave Any NA
    Conical flask Any NA
    Measuring cylinder Any NA
    Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth Any NA For agarose gel electrophoresis.
    Electrophoresis Power Supply PS3002 Life Technologies NA
    Ethidium bromide solution 1 % carlroth 2218.1 Used to prepare staining bath for agarose gels.
    Formamide carlroth 6749.1 Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
    Bromphenol blue AppliChem A3640.0010 Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
    Sucrose carlroth 4621.1 Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
    100 bp-DNA-Ladder extended carlroth T835.1 As size standard for agarose gel electrophoresis.
    UV-Documentation system Any NA To visualize gel electrophoresis results.
    Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) carlroth A121.1 For the preparation of polyacrylamid gels.
    Ammonium peroxydisulphate carlroth 9592.2 For the preparation of polyacrylamid gels.
    foldback clips (32 mm) Any NA For the preparation of polyacrylamid gels.
    square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) Any NA For the preparation of polyacrylamid gels.
    Tetramethylethylenediamine (TEMED) carlroth 23.67.1 For the preparation of polyacrylamid gels.
    Beaker Any NA
    RC 10 Digital chiller VWR 462-0138 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) VWR 700-2361 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Notched glass plate VWR 730-0261 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Blank glass plate VWR 730-0260 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Spacers VWR 730-0262 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Comb with 25 teeth VWR 730-0294 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
    Shaking platform Any NA For constant shaking of the staining bath.
    GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) Biozym 850535 (50535) For staining of polyacrylamide gels.
    GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp AB Sciex 608098 For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
    GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp AB Sciex 608095 For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
    Sample Loading Solution (SLS) AB Sciex 608082 For automated fragment analyses.
    Sequenzing plate - 96 Well Polypropylene PCR Microplate Costar 6551 For automated fragment analyses.
    Plate centrifuge, PerfectSpin P VWR Peqlab NA mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
    Buffer plate - 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 9017 For automated fragment analyses.
    GenomeLab Seperation buffer AB Sciex 608012 For automated fragment analyses.
    Separation Gel - LPAI AB Sciex 608010 For automated fragment analyses.
    Sequenzer - CEQ8000 Genetic Analysis System Beckman Coulter NA For automated fragment analyses.
    GeneMarker V1.95 Softgenetics NA To analyze results of automated fragment analyses.

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    References

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    सेलुलर जीवविज्ञान अंक १२८ आहार विश्लेषण मिश्रित डीएनए-सूत्रों का macroinvertebrates शिकार पहचान 18S rDNA 28S rDNA पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एकल कतरा क्षेऽ बहुरूपता (SSCP) स्वचालित टुकड़ा विश्लेषण
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    Koester, M., Gergs, R. Laboratory… More

    Koester, M., Gergs, R. Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers. J. Vis. Exp. (128), e56132, doi:10.3791/56132 (2017).

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