Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

Abstract

פרוטוקול זה המתאר את השימוש במבחנה טלוויזיה מיקרוסקופ כדי להעריך את תפקוד כלי הדם ההתנגדות מוחי מבודד העורקים (ובכל כלי אחר), ומתאר שיטות להערכת זלוף רקמות באמצעות לייזר דופלר Flowmetry (LDF ) ומתויגים צפיפות microvessel ניצול fluorescently Griffonia simplicifolia (GS1) לקטין. שיטות לימוד מבודד התנגדות העורקים בזמן transmural לחצים נתקל ויוו , בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות ומספקות לך קישור קריטי בין ויוו מחקרים ומידע שנרכשו מ מולקולרית הרדוקציוניסטית המספקים מוגבל תובנה תגובות אינטגרטיבית ברמת כל בעלי חיים. LDF וטכניקות רבים לזהות באופן סלקטיבי נימים עם fluorescently-ידי לקטין GS1 לספק פתרונות מעשיים כדי לאפשר חוקרים כדי להרחיב את הידע שנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים. מאמר זה מתאר את היישום של טכניקות אלה כדי לצבור ידע בסיסי של כלי הדם פיזיולוגיה, פתולוגיה בחולדה כמודל ניסויי כללי, במגוון מיוחדים מהונדסים גנטית זנים "מעצבים" עכברוש יכול לספק תובנה חשובה השפעת גנים ספציפיים על חשוב פנוטיפים כלי הדם. ניצול גישות ניסיוניות יקרי ערך אלה בעכברוש הזנים שפותחו על ידי אסטרטגיות מלאכותית וטכנולוגיות חדשות לייצור מודלים נוקאאוט גנטי בחולדה, יתרחב הקשיחות של המקומי המדעי פיתח במודלים נוקאאוט של העכבר, להרחיב את הידע הזה כדי במודל חיה רלוונטי יותר, עם רקע פיזיולוגי הבין היטב, התאמתם מחקרים פיזיולוגיים בגלל הגודל שלה גדול יותר.

Introduction

המחקרים המוקדמים של תפקוד כלי הדם העורקים מנוצל conduit עורקים, וכן רבים במקרים אבי העורקים. יצירת כח בעורקים גדולים נחקר בדרך כלל על ידי הצמדת קטע טבעת של העורק מתמר כוח באמבט רקמות; במקרה של אבי העורקים, על ידי חיתוך לוליינית רצועות של כלי השיט כך סיבי שריר חלק היו אוריינטציה בכיוון האורך בין הנקודה החזקה המתמר בכוח, כדי לספק את האומדן הטוב ביותר של הכוח שנוצר על ידי שריר חלק לאורך ציר האורך. הטכניקה הסטנדרטי לחיתוך רצועות לוליינית aortas היה למקם את מוט זכוכית לומן של כלי השיט, עושים חתך על הקיר כלי בזווית הרצויה של תחזיק בקצה של הקצה החשוף של הקיר כלי כמו גזירה הוארך כדי לייצר שלמה רצועת הסליל של כלי השיט. בשלב זה, הצד אנדותל של כלי השיט כלל נמוג ונעלם להסרת פסולת לפני הצמדת רצועת כלי מתמר כוח, השוקע ההכנה ב חמצן, טמפרטורה מבוקרת רקמות אמבט. בסופו של דבר, כי הגישה בראשות לאחת התגליות החשוב והמפורסם ביותר בהיסטוריה של פיזיולוגיה Furchgott ו- Zawadski1, כלומר את התפקיד של אנדותל נגזר גורם מרגיע (EDRF), לאחר מכן זוהה תחמוצת החנקן, ב ויסות תפקוד כלי הדם. האירוע מכריע שמוביל שגילוי היה מצב שבו החוקרים המתוחזקים של אנדותל ללא פגע על ידי הימנעות קשר של הצד אנדותל של העורק במשטחים זרים, והבחנתי כי רצועת אבי העורקים לא להפגין את הצפוי הציר כדי אצטילכולין (ACh), אבל במקום רגוע, בתגובה ACh. בהתבסס על המידע החיוני, החוקרים פיתח הכנה "כריך" שבו חיברו מקטע אבי העורקים עם אנדותל שלם (אך אין אפשרות ליצור כוח כויץ) לקבל רצועה לוליינית סטנדרטי של אבי העורקים, המרה של ACh-induced התכווצות לתוך הרפיה.

שני התקדמות גדולה באזור זה הנמצאים בשימוש נרחב כיום הם ההתפתחות של ההכנות למדוד פעיל כויץ כוח התנגדות קטן העורקים2,3 (כגון אלה של מצע המעי המעי3 ) ו לצינוריות עמידות העורק ההכנות4,5,6. באחד הדיווחים המוקדמים, Mulvany ו הלפרן3 תיאר את השימוש ההכנה myograph תיל ללמוד פעיל כויץ כוח מבודדים התנגדות העורקים מ מצע המעי המעי באופן ספונטני עם יתר לחץ דם העכברים (שומר), פקדים WKY normotensive. לאחר הפיתוח של מערכת myograph תיל, פותחו לצינוריות עמידות העורק ההכנות להתיר מחקרים של כלי קרוב ל ויוו 5,4,התנאים6.  בעוד שתי הגישות לספק תוצאות יקר, הכנת לצינוריות בעורק יש את היתרונות הוסיף יותר ביעילות שמירה על הטון פעיל מהותי בעורקים; ומאפשר החוקרים ללמוד תגובות myogenic הפעיל לשינויים תגובות הלחץ ואת כלי transmural שינויי קצב הזרימה ואת אנדותל גזירה (ראו סקירה על ידי הלפרן, קלי6).

יעד מרכזי של המאמר הנוכחי היא לתאר כיצד להעסיק את הטכניקה ששורשיה של מיקרוסקופ וידאו באמצעות התנגדות מבודדת, לצינוריות העורקים על מנת לקבל מידע מדויק לגבי המנגנונים המווסתים טון פעילים אלה חיוני . כלי, עצמאית של השפעות עצביות, ההורמונאלית או parenchymal תא. מידע בסיסי זה, העסקת דגם עכבר סטנדרטי ודוגמאות מן המחקרים שלנו של חדש גנטית זני עכברים מהונדסים, תספק את הקורא עם רעיון של סוגי לתובנות לגבי תפקוד כלי דם שניתן להשיג עם טלוויזיה גישות מיקרוסקופ, אשר יכול להיות מועסק ב מחקרים שכללו כל שליטה, בקבוצות ניסיוני של החוקר בוחר, כולל דגמים עכברוש ניסיוני חדש חזק המיוצר על ידי הרבעה סלקטיבית ולא מחדש פיתח גנטי טכניקות הנדסה.

בזכות הדיוק של גישות מיקרוסקופ טלוויזיה, במדידת קוטר שינויים בהכנות לצינוריות עורק יכול לספק מידע רב ערך מאוד לגבי מנגנונים תלויי-אנדותל ועצמאי אנדותל של כלי הדם הרפיה, כמו גם שינויים חשובים (וגם לפעמים בלתי צפויות) מנגנוני בקרה וסקולרית המתרחשים עם יתר לחץ דם, תזונה מלח גבוהה של התערבויות אחרות ניסיוני. בנוסף, מדידה של הלחץ-קוטר היחסים מבודדים, לצינוריות עורקים עמידות מקסימאלית רגועות על ידי טיפול עם Ca2 +-ללא פתרון או תרופה תרופתי מרחיב כלי דם, מתירה לחוקר להעריך ביצוע שינויים מבניים העורקים בשל שיפוץ כלי הדם, כדי לחשב יחסים מתח פאסיבי-זן7 שיכול לספק תובנה חשובה שינויים במאפייני מכני פסיבי של העורקים אשר יכולים להשפיע על תפקוד עורקי עצמאית של (או בנוסף) שינויים מנגנוני בקרה פעילה. חשוב גם לציין כי המידע הנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים ניתן להשלים על ידי מידע שהושג ניצול LDF, שיטה מעשית להערכת רקמות זלוף-כל בעלי החיים ברמה8,9 ,10, ומאגד לפי מידע שנרכש מתוך הערכת הצפיפות microvessel באמצעות fluorescently שכותרתה GS1 לקטין, אשר במפורש גליקופרוטאין moieties ב קרום המרתף של רבים, נימים קטנים11 , 12. השיטה השנייה מספק הערכה מאוד מדויקת של צפיפות microvessel שאינו כפוף הקשיים קלאסי באומדן צפיפות microvessel על ידי ספירת כלי ויוו, לדוגמה חסרים שאינם perfused כלי שבו זרימת הדם מופסק עקב סגירת פעילים רבים. כאשר נעשה שימוש יחד, גישות אלה יכולים לספק תובנה חשוב לתאם שינויים פונקציונליים העורקים מבודד התנגדות לשינויים רקמות זלוף ברמת microcirculatory; כמה דוגמאות לשימוש גישות יקרי ערך אלה בשילוב עם טכניקות עורק לצינוריות יסופקו בכתב היד הנוכחי.

המאמר הנוכחי מתמקד השימוש של טכניקות במיקרוסקופ וידאו כדי להעריך שינויים בכלי הדם העורקים של חולדות ספראג-Dawley outbred. עם זאת, חשוב לציין כי שיטות אלה הוכיחו להיות בעלי ערך גבוה ב שחקרתי שינויים פנוטיפי זני עכברים מהונדסים גנטית מאוד מיוחדים שנוצרו על ידי ברירה מלאכותית או ג'ין עריכה תוך שימוש בטכניקות. כתב יד זה, אנו מספקים דוגמאות איך וידאו טכניקות במיקרוסקופ סיפקו מידע חשוב לגבי תפקוד כלי הדם במספר של עכברוש יקר דגמים, כולל דאל רגיש מלח (הה) עכברים, עכברושים המפגרים המתח הוא נרחב ביותר משמש דגם ניסיוני ללמוד על מנגנוני מלח hypertenson רגיש18,19,20,21,22,23; חולדות consomic שנוצרו באמצעות ברירה מלאכותית של האס. אס חולדות עם המתח מלח-רגישות של עכברוש בראון נורבגיה (בסון). הלוחות עכברוש consomic, בכל כרומוזום מהחולדה נורבגיה בראון כבר introgressed בנפרד לרקע דאל SS24,25,26 גנטי. השימוש פנלים עכברוש consomic סיפקה ערך רמזים לגבי כרומוזומים מסוימים שתורמים מלח הרגישות של לחץ הדם ואת פנוטיפים אחרים, כולל תגובתיות וסקולרית24,25,26 27, ,28.

אסטרטגיות רבייה סלקטיבית ניצול SS עכברים וחולדות consomic נושא כרומוזומים בודדים בסון אפשרו גם הדור של זנים הצרת congenic עם מקטעים קטנים של הפרט בראון נורבגיה כרומוזומים introgressed לתוך האס דאל גנטי 22,רקע29. אלה יכולים לספק יקרי קלט על גנים ספציפיים או לצמצם אזורים של כרומוזומים אשר יכולים להשפיע על משתנים פיזיולוגיים קריטי, כגון לחץ דם, כליות נזק לכלי הדם תגובתיות22,29. בנוסף חזק אחר הכלים גנטית עכברים היא הפיתוח של עכברוש ג'ין נוקאאוט דגמי ניצול גנים מתקדם עריכה כולל ZFNs, מפעיל-כמו-אפקטור תעתיק nucleases (TALENS), שיטות, לאחרונה CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. כניסתו של טכניקות אלה עוצמה המאפשרים גנים לנוק אאוט בחולדה הוא פיתוח שלמוזיקה יש חשיבות מרובה כי מחקרים נוקאאוט גנטי עד כה השתמשו (ועכברים להמשיך להשתמש) כמעט באופן בלעדי. רכיב נסיוני נוסף בעיתון הנוכחי מדגים את הערך של העורק לצינוריות וטכניקות מיקרוסקופ וידאו כדי להעריך את מנגנוני הבקרה פיזיולוגיים בחולדות נוקאאוט חסר בסיס נוגד חמצון ותא שעתוק מגן פקטור, גרעיני גורם (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 (NRF2)30,31, אשר פותחו באמצעות טכנולוגיית TALEN הרקע הגנטי של ספראג-Dawley17. בניסויים האלה, במבחנה טכניקות במיקרוסקופ וידאו שימשו כדי לספק אימות פונקציונלי של אובדן של הגן NRF2, כדי לבדוק את ערך פוטנציאלי גישה טיפולית המבוססת על קולטנים upregulation ישירה של נוגדי חמצון בתיווך NRF2 הגנות. ה-NRF-2 יש חשיבות טיפולית משמעותית ב הייהוד שלה סטרס חמצוני וסקולרית בבני אדם, לאור תוצאות מאכזבות של ניסויים קליניים הכוללים ניהול ישיר של נוגדי חמצון כגון ויטמינים C ו- E32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המכללה של ויסקונסין מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (IACUC) אישרה כל הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה, כל ההליכים הם בהתאם נבחרת מכונים לבריאות (NIH) במשרד של מעבדה חיה רווחה (OLAW) תקנות.

1. הכנת כלי קאמרית והפתרונות

  1. לפני ביצוע סדרה של ניסויים, להכין 2 ל' של 20 x תמיסת מלח מניות מרוכזת בהיקף של 278 g/L NaCl; אשלגן כלורי 14 g/L; 11.52 g/L MgSO4. 7 שעות2O; 9.4 g/L CaCl2. 2H2O. גם להכין 2 ל' של 20 x מלאי מאגר מרוכז המורכב 80.8 g/L NaHCO3 ו 0.4 g/L EDTA, 2 ל' של 20 x מרוכז Ca2 +-פתרון מלאי חינם המורכב 281.6 g/L NaCl; אשלגן כלורי 14 g/L ו- 11.52 g/L MgSO4. 7 שעות2O.
    הערה: 20 X פתרונות מניות ניתן לאחסן במקרר עד לשימוש.
  2. ביום של הניסוי, להכין 2 ל' של תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) 20 x מרוכזים פתרונות מניות כדלקמן: להוסיף 100 מ של 20 x מניות מלח 1,800 מ ל מים יונים 2 ל' Erlenmeyer בקבוק או כוס כימית על צלחת מלהיב ממונע. להוסיף 100 מ של מלאי מאגר x 20 תוך ברציפות equilibrating הפתרון עם תערובת גז המכיל 21% או2, 5% CO2, איזון N2, לדבר על זה עם בר מלהיב מגנטי. לאט לאט להוסיף 0.28 g2PO NaH4 תוך ניטור pH; להתאים לפי הצורך כדי pH 7.4 על-ידי הוספת טיפות של 6 N HCl או פתרון N NaOH 6.5 מ פיפטה פסטר. לאחר מוכן PSS ה-pH מכוונן, להוסיף 1.98 גר' גלוקוז PSS.
    הערה: חשוב להוסיף לאט את2PO NaH4 אחרונה תוך ניטור pH של PSS כי התוספת של2PO NaH4 כדי פתרון אלקליין (pH > 7.4) יכולים להוות את התמיסה סידן פוספט, כפי שמציין המראה של פתרון מעוננים או של התמיסה לבן בתחתית המיכל.
    הערה: ההרכב הסופי של PSS זה 119 מ מ/L NaCl; אשלגן כלורי 4.7 מ מ/ליטר; 1.17 מ מ/L מ ג2אז4; 1.6 מ מ/L CaCl2; מ מ 1.18/L NaH2PO4; 24 מ מ/L NaHCO3; מ מ 0.03 נקודות/L EDTA; 5.5 מ מ/L גלוקוז. למרות ההרכב של PSS יכולים להיות שונים בין מעבדות, המתכון הזה מתאים מאוד לשמירה על הטון וסקולרית פונקציה אנדותל, התגובות סוכנים vasoactive מבודדים התנגדות העורקים.
  3. כדי לקבוע את הקוטר המרבי וכדי להעריך את הטון פעיל בעורק על ידי ייצור מקסימלית התרחבות של כלי השיט, הכנת 500 מ"ל של Ca2 +-חינם PSS על-ידי הוספת 25 מיליליטר 20 X Ca2 +-ללא מניות מלח 450 מ של מים יונים , ואחריו 25 מ ל 20 x מלאי מאגר Erlenmeyer בקבוק או כוס כימית דומה לשלב 1.2 לעיל. להוסיף 0.07 גר' NaH2PO4 הפתרון תוך פיקוח והתאמה של ה-pH של התמיסה. Ca2 +-PSS חינם מתווסף PSS המאגר ואת כלי התא בסוף הניסוי כדי להימנע depleting תאיים Ca2 + חנויות העלולה להשפיע על כלי השיט תגובות ב PSS נורמלי. כי Ca2 +-פתרון ללא תשלום נוסף בסוף הניסוי כדי לייצר הרפיה מקסימלית של העורקים, אין צורך להוסיף גלוקוזה PSS.
    הערה: כאשר להשלים, ההרכב הסופי של Ca2 +-PSS חינם הוא מ"מ 120.6/L NaCl; אשלגן כלורי 4.7 מ מ/ליטר; 1.17 מ מ/L מ ג2אז4; מ מ 1.18/L NaH2PO4; 24 מ מ/L NaHCO3; 0 מ מ/L CaCl2; מ מ 0.03 נקודות/L EDTA.
    הערה: למחקרים רבים הדורשים התארכות המרבי של העורק, חוסם ערך סידן כגון verapamil (1 מיקרומטר) ו/או תורם תחמוצת החנקן כגון חמצן (10 מיקרומטר) ניתן להוסיף את הפתרון, בנוסף להסרת Ca2 + (pss).
  4. לשמר את פו2PCO2, ה-pH של PSS על-ידי ברציפות equilibrating של PSS זורם אל החדר כלי באמבט רגיל איברים חקר טבעות אבי העורקים מבודד, שריר חלק המעי או רקמות אחרות (איור 1). להשתמש fluoropolymer סינתטי של אבובים tetrafluoroethylene כדי להתחבר למיכל הדלק לאמבטיה איברים מפני סוג זה של צינורות גז אטום, בניגוד צורות רבות אחרות של אבובים, למשל, ב- latex.
  5. המקום אבן אוויר קטן המחובר תערובת גז equilibration בבית הבליעה כלי כדי לסייע בשמירה על הרכב גז PSS.
    הערה: כלי התגובות לשינויים פו2 יכול להיבדק על-ידי equilibrating של PSS כלי תא, luminal perfusate עם תערובות גז המכיל אחוזים שונים של O2, למשל, 21% O2, 10% או2, 5% O2 , ו- 0% או2, עם 5% CO2 ואיזון N233,34,35. עבור עורקים גדולים יותר עם קירות עבים, שבו דיפוזיה של חמצן לתוך המרכז של הקיר כלי עשוי להיות מגבלה, אחוז גבוה יותר של חמצן, למשל, 95% O2 יכול לשמש.
  6. לפקח על הטמפרטורה בחדר כלי מקרוב, כפי צ'יימברס בודדים עשוי להשתנות ב המאפיינים העברת החום שלהם.
    הערה: רבים צ'יימברס מסחרית איך מכינים כלי המשמש ללימודי לצינוריות התנגדות העורקים לנצל משאבה סחרור לספק חמצן PSS מאגר גז-equilibrated ולספק שליטה מדויקת מאוד של טמפרטורת אמבטיה, חמצון של PSS.
  7. מקם את PSS בבקבוק גדול (2 ליטר) אדם, עם פקק, מבחנה מרכזי כדי לשמש מאגר ברציפות לספק PSS לאמבטיה איבר, אשר מחמם גז-equilibrates של PSS זורם אל החדר כלי (איור 1 א').
  8. מקום לפתיחת הצינור זכוכית המרכזי הבקבוק אדם באותה רמה כמו העליון של PSS באמבטיה איברים, כדי לשמור על ראש לחץ הידרוסטטי קבוע עבור משלוח של PSS לאמבטיה איברים. צינורות פוליאתילן לשימוש מחובר זכוכית בצורת J או צינור פלסטיק כדי לספק את PSS מהבקבוק אדם לתוך האמבט איברים.
  9. זלוף luminal (איור 1 א'), להשתמש צינורות פוליאתילן להתחבר פיפטה תזרים את מאגר PSS מורכב 60 cc פלסטיק מזרק מוגברות למיקום המתחזק את הלחץ הרצוי תזרים (בדרך כלל 80 מ מ כספית ללימודים של עכברוש מוחי מתמר העורקים), כפי שנמדד עם לחץ קשורים למערכת דרך צימוד.
  10. להתחבר פיפטה תזרים את צינור פוליאתילן כדי לאפשר את PSS לזרום דרך הכלי בתגובה הדרגתי לחץ, להתחבר לקו יצוא מאגר דומה המאגר תזרים. להשתמש בחיבור רגשי דומה, צימוד ולחץ כדי למדוד את הלחץ יצוא.
    הערה: נהלי הגדרת לחץ transmural ובקרת זרימה דרך הכלי שיפורטו בסעיף 2, להלן.
  11. בסוף הניסוי, שטפים היטב את החדר, מסירה קווים ומערכות מאגר עם מים מזוקקים. במרווחים תכופים, להחליף את הקווים אבובים ואספקה, נקי או להחליף את stopcocks במערכת ולאחר מעת לעת לחשוף כל מאגרי PSS זכוכית ושטוף חומצה כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים לגרום זיהום, משפיעים על קיבול תגובתיות.

2. לצינוריות עורק הכנה

  1. עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley עם 5% איזופלוריין ולתחזק את ההרדמה באמצעות חמצן רפואי כיתה 1.5-2.5%36. לחלופין, לניהול זריקה תוך שרירית המכילה קטמין (75.0 מ"ג/ק"ג), איזופרומאזין (2.5 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10.0 מ"ג/ק"ג); זריקה בקרום הבטן של פנטוברביטל (50-60 מ"ג/ק"ג); או כל שיטה אחרת המאושרת של הרדמה, תלוי פרוטוקולים ו/או החוקר העדפות.
  2. לערוף את החולדה תחת הרדמה עמוקה, מסירים את המוח ללימודי מוחי התנגדות העורקים.
  3. לאחר ההסרה של המוח, בזהירות לבודד עורק המוח התיכון (MCA) (או העורקים אחרים מעניינים, למשל, בעורק או עורק המוח האחורי)37,38. כדי לבודד את MCAs, במקום את המוח פרקדן בצלוחית זכוכית מלאים PSS כקרח (איור 2).
  4. השתמש Vannas מספריים ומלקחיים עצה בסדר דומונט #5 לסלק את MCA מהמוח.  לנקות את כל רקמת המוח שיורית מ MCA עם המלקחיים ולהעביר את העורק תא כלי מבוקר טמפרטורה המכיל PSS כפי שתואר לעיל. 33 , 34  .
  5. כדי להעביר את העורק אל התא כלי השיט, בעדינות להחזיק את כלי הקיבול נכרת על ידי כן או על קטע עורק המקיימים תקשורת האחורי, הניחו בזהירות לתוך החדר.
    הערה: בנוסף MCA, מערכת כלי לצינוריות מתאימה למגוון רחב של ההכנות כלי קטן, לרבות שרירי השלד התנגדות העורקים33,39,40, העורקים ההתנגדות מצע המעי העליון 38 , 41 , 42, גדול (מסדר ראשון) רבים של שריר cremaster43, וכן רבים כלילית אנושי, אנושי רבים המתקבל רקמת השומן התת עורית במהלך ביופסיה gluteal44,45, 46,47.
  6. לצרף את העורק micropipette תזרים על-ידי משיכתו כלפי הבסיס פיפטה עד הקצה מקדמות לתוך לומן של MCA. אבטח את העורק על פיפטה תזרים על ידי קשירת לולאה מוכנה מסיב יחיד סטרנד בעבר התגרו מ 10-0 התפרים סביב העורק (איור 1B). לאבטח בצד השני של MCA על פיפטה יצוא על ידי הידוק לולאה התפר השני סביב הספינה (איור 1B).
    הערה: מניחים את לולאות התפר על micropipettes לפני הרכבה את כלי הקיבול, למקם אותם קרוב הנקודה הסופית של הקובץ המצורף, לאפשר להם להיות החליקה בקלות מעל העורק ומאובטחים במהירות כאשר הספינה נמצא במצב אשר ממזער את הסיכון של עורק להתקלף מדי סוכר.
    הערה: Micropipettes מוכנים מ זכוכית בורוסיליקט צינורות קפילר (2 מ מ קוטר חיצוני; הקוטר הפנימי של 1 מ"מ; 10 ס מ) תוך שימוש של פולר micropipette אנכי. לפני צירוף העורק, להתאים על הקוטר עצה של micropipettes ככל האפשר כדי למנוע אי-התאמות של תזרים והתנגדות יצוא במערכת זלוף.
  7. לאחר העורק קשורה היטב micropipettes, להשתמש את מיקרומטר מחובר למחזיק פיפטה תזרים למתוח יכול להגיע אורכו של באתרו .
  8. תקשור כל בצד סניפים עם הגדילים יחיד התגרו מ 10-0 תפרים על מנת לשמור על לחץ קבוע בעורק.
  9. ודא היעדר נזילות על-ידי בדיקה כי הלחץ intraluminal (transmural) נשאר קבוע לאחר סוגר זמנית על פיפטה תזרים. . תקשור בכל הסניפים או לחפש חורים בתוך הכלי אם הלחץ נופל. שחזור זלוף לאחר וידוא כי הלחץ transmural נשאר קבוע.
    הערה: תעלות מבודד התנגדות העורקים דורשת מיומנות ידנית ותרגול. אמצעי הזהירות העיקריים שחלים הם כדי למנוע פריצה של מדי סוכר כדי לוודא כי העורק לא להחליק את מדי סוכר. זה חשוב להיות עדין עם העורקים מבודד לאורך ההליך כולו, כמו טראומה לכלי השיט עלול לגרום נזק של אנדותל ו/או להפריע תפקוד תקין של השריר החלק בכלי הדם.
  10. למדוד את קוטר פנימי של העורק באמצעות מלכודת מיקרוסקופ וידאו (איור 1 א') בהיקף של מצלמת וידאו מצורף מיקרוסקופ ויבתר ומחובר מיקרומטר וידאו וצג הטלוויזיה (דמויות 1B, 1c). פעולה זו מאפשרת לצופה למדידת קיבול קטרים באופן ידני על ידי הנחת קווי הפניה להזזה על החומה הפנימית של העורק ובמידת הצורך, על הקיר החיצוני של העורק, על מנת למדוד את עובי הקיר כלי השיט.
    הערה: מיקרומטר וידאו מסוימים מציעים מעקב אוטומטי אחר מידות קיבול.
    הערה: לכייל את הסרטונים מיקרומטר עם מיקרומטר הבמה מיקרוסקופ, מהזרימה, יצוא לחץ מתמרים עם manometer כספית (0 מ מ כספית, 50 מ מ כספית, 100 מ מ כספית, 150 מ מ כספית, ו- 200 מ מ כספית) בין ניסויים כדי להבטיח מדידות מדויקות של כלי קוטר הלחץ intraluminal.
    הערה: הלחץ transmural שליטה רגיל לניסויים MCA עכברוש הוא 80 מ מ כספית. כיול עבור רמות גבוהות ונמוכות הלחצים מבטיח דיוק ללימודים של תגובות myogenic לשינויים transmural הלחץ והן פסיביות עקומות לחץ בקוטר העורקים מורחבים מקסימאלית.
  11. להתאים את הגובה של המאגרים תזרים, יצוא כדי לשמור על הלחץ הרצוי transmural ברמה קבועה. העלאת המאגר תזרים עד כמות קטנה (< 5 מ מ כספית) והורדת המאגר יצוא באותה מידה שומר על הלחץ transmural רשע ויוצר זרימה זלוף ב לומן כלי6.
    הערה: העלאת המאגר תזרים והורדת המאגר יצוא על ידי כמויות שוות שומרת את transmural רשע באותה distending הלחץ בעורק, אך יוצרת מעבר צבע בלחץ הידרוסטטי שגורמת זרימה, גזירה הכלי, המאפשר החוקר להעריך תגובות אנדותל תלוית לשינויים intraluminal גזירה בקבוצות שונות ניסיוני48.
  12. כדי להעריך תגובות myogenic ואת כלי תגובות לגירויים מרחיב כלי דם, ודא כי העורק תערוכות רמה מתאימה של הטון פעיל (כ-40%) לפני הניסוי. למחוק את כל העורקים חסר הטון הפעילים במנוחה למעט כלי, למשל, עורקים מצע המעי העליון קטנים זה לא מוצג בדרך כלל הטון מנוחה פעילה.
    הערה: עבור כלי זה לא מוצג בדרך כלל הטון ספונטנית, מתכווצים מראש את העורקים על ידי כמות שווה ניצול אגוניסט מצר את כלי הדם כגון נוראדרנלין או phenylephrine. גישה טובה לבחירת המינון של אגוניסט נהגה מראש מתכווצים העורק זה לנצל את המינון50 EC של מצר את כלי הדם סוכן, למשל, נוראדרנלין41,42. עם זאת, סוכנים תרופתי מצר את כלי הדם לא צריך להיות מוחל על העורקים כי התערוכה הטון פעיל ספונטנית תחת נח תנאים.
  13. מבחן אנדותל תלוית תגובתיות של העורק לצינוריות ההתנגדות על ידי מדידת הקיבול קטרים במהלך התוספת של הגדלת ריכוזים של ACh (10-10 M-10-5 מ') לתא כלי השיט. מבחן רגישות תחמוצת החנקן אנדותל עצמאית השריר החלק בכלי הדם על ידי מדידת הקיבול קטרים במהלך התוספת של ריכוז (10-10 M-10-5 מ') תורם חנקן חמצן כלי קאמרית.
    הערה: רגישות סוכנים מצר את כלי הדם, אגוניסטים מרחיב כלי דם אחרים יכול להיבדק באופן דומה על-ידי הוספת הגדלת ריכוזים של אגוניסט לתא כלי השיט.
    הערה: בנוסף vasoactive סוכנים, תרופות שונות, מעכבי, וסוכני תרופתי אחרים ניתן להוסיף לאמבטיה רקמות ו/או את perfusate luminal. שינויים פו2 (כמו גם PCO2 ו pH) יכול באופן סלקטיבי ינוהלו הצד אנדותל או הצד luminal-תוספת של העורק על ידי נפרדים equilibration של perfusate luminal עם אבן אוויר מחובר תערובת דלק מכויל שונה מן התערובת נהגה equilibrate של PSS ב34,4933,אמבט רקמות. תגובות myogenic שינויים בלחץ transmural ניתן יהיה ללמוד על ידי סגירת פיפטה תזרים את העלאת (או הנמכת) הגובה של המאגר PSS מחובר תזרים פיפטה49,50,51 ל להגדיל או להקטין את הלחץ intraluminal.
  14. כדי לבחון את התפקיד של אנדותל מתווכים כלי תגובות לגירויים ספציפיים, להסיר את אנדותל כלי הדם והשווה כלי תגובות לגירויים אלו נוכחות או העדר אנדותל. כדי להסיר את אנדותל, בזהירות להתיר את העורק של פיפטה תזרים, לאט perfuse לומן של העורק עם בולוס אוויר (0.5-1.0 מ"ל). לאחר אוויר זלוף, שחזר PSS זלוף כדי לנקות את הלכלוך הסלולר לפני הקשירה מחדש את כלי-קיבול פיפטה של יצוא43.
    הערה: בעקבות ההליך חסיפה אנדותל, חשוב לוודא כי אנדותל הוסר על-ידי בדיקת כלי הדם התגובות אגוניסט (בדרך כלל ACh) ידוע לייצר אנדותל vasodilation תלויים בסוג זה כלי הקיבול. עם זאת, בתנאים מסוימים פיפטות, תלויי-אנדותל vasoconstrictors משתחררים, בכל מקרה, חשוב לוודא כי התגובה μ חוסלה בעקבות הסרת אנדותל.
  15. בסוף הניסוי, לקבוע הקוטר המרבי של העורק על ידי הוספת2 +Ca-חינם PSS perfusate ו- superfusate. לחשב פעיל מנוחתו טון (%) כמו ((Dמקס-Dמנוחה) /Dמקסימום) x 100, כאשר Dmax הוא הקוטר המרבי בנוכחות Ca2 +-ללא פתרון ו- Dמנוחה הוא בקוטר שליטה בזמן מנוחה.
    הערה: מידות קוטר העורקים מקסימאלית רגועה לקבוצות שונות ניסיוני יקרים בהשוואה בין פעיל בגוון מנוחתו, שיפוץ מבניות (קרי, שינויים בקוטר עובי ו לומן קיר) ובאופן פסיבי תכונות מכניות (מתח-זן יחסים שמחושבים קטרים פסיבי ברמות שונות של לחץ transmural).

3. הערכה של תגובות זרימת דם מוחי עם LDF

  1. עזים ומתנגד החיה עם 5% איזופלוריין ולאבטח את החולדה9,מכשיר stereotaxic10.
  2. לשמור על החיה תחת הרדמה מתמדת תוך ניטור נשימה תדר, סוף גאות CO2ועומק של הרדמה עם קמצוץ הבוהן36.
  3. בזהירות דק הגולגולת כדי המוגבהת באמצעות מהירות נמוכה מקדחת שיניים שמן מינרלי לספק צימוד אופטי10. בזהירות כדי למנוע יצירת חום עודף וכדי למנוע חדירה לעצם.
    הערה: דילול של הגולגולת מאפשר אור הלייזר להגיע הרקמה הבסיסית, יבוא לידי ביטוי בחזרה אל המכשיר על מנת למדוד את דופלר, שסדר נקבעת על ידי מספר חלקיקים נעים (קרי, כדוריות דם אדומות), המהירות שלהם.
  4. לאבטח את המכשיר LDF micromanipulator ומקמו אותו ישירות על האזור ורקמת של הגולגולת. במהלך הניסוי, חשוב מאוד למנוע תנועת החללית LDF או ההכנה עצמה, כמו LDF נועד למדוד את זרימת באזור מוגבל אחד של הרקמה, הוא רגיש מאוד חפצים תנועה.
    הערה: כל תנועה של המכשיר הרחק מעמדה הראשונית תספק הערכה של זרימת הדם באיזור שונה של הרקמה, מסלק השוואות. בעוד LDF אינו מספק ערכים זרימה מוחלטת ואינה מתאימה לשם השוואה בין הנבדקים, זה דרך מצוינת להעריך noninvasively לשינויים רקמות זלוף בתגובה התערבויות ניסיוני במקצועות בודדים; יחסית לשינויים LDF האיתות ערכי בקרה ניתן בממוצע, בהשוואה לשינויים LDF אות מ שליטה בקבוצות אחרות ניסיוני.
    הערה: LDF היא גישה נוחה כדי לזכות בתובנה גורמי ויסות זרימת הדם ברמה של המיטה כל כלי הדם קבוצות שונות ניסיוני8,9,10. הערכה של רקמות זלוף עם LDF מספק גישה פרקטית להטמיע ידע שנרכש ממחקרים כלי מבודד בפרספקטיבה כל המיטה. אלא אם כן יהיו הבדלים אזוריים מנגנוני בקרה כלי הדם בין התנגדות העורקים את microcirculation, מדידות שהושג עם LDF לספק סימן טוב של בקרת זרימה של דם רקמות כי הוא בדרך כלל בקנה אחד עם התוצאות המתקבלות עם ההכנות לצינוריות העורק.

4. הערכה של שרירי השלד צפיפות Microvessel עם GS1 לקטין

  1. הסר את השריר cremaster חולדה זכר על ידי חיתוך פתוח האשכים עם מספריים כירורגיים בסדר רגיל ולאחר מכן באמצעות מלקחיים דומונט #5 להבין את השריר.
    הערה: שרירי רזה (למשל, שריר cremaster, כמו גם את פושט האצבעות הארוך השוקתי הקדמי שרירי שנמצאו אצל חולדות גם זכר וגם נקבה) מתאימים באופן אידיאלי לשימוש כמו כל mounts ללימודים לקטין, למרות היסטולוגית סעיפים יכול לשמש בשביל לרקמות עבה יותר.
  2. הסר את השריר cremaster האשך בעזרת חתך אחד. מניחים אותה PSS כקרח ולהדק אותו בצלוחית עם בטנה elastomer סיליקון בתחתית בתוך השטח. בעדינות להקניט משם רקמת חיבור באמצעות מלקחיים דומונט #5.
  3. לשטוף את דגימות שריר עם 2 מ של PSS במאגר, ואז לטבול אותם התווית על-ידי rhodamine GS1 לקטין (20 µg/mL PSS) למשך 50 דקות בצלחת התרבות התא. ובכן 12 עם 2 מ"ל/טוב זה עטופה רדיד אלומיניום כדי לא לכלול אור.
  4. הסרת הרקמות הפתרון לקטין, לשטוף אותם שלוש פעמים ב PSS עם 5 דקות incubations "לשטוף" על כיסא נדנדה, והר אותם על שקופיות מיקרוסקופ. ודא דגירה הרקמות בחושך ולאחסן את השקופיות בחושך כדי למנוע אובדן של זריחה.
    הערה: אם אין אפשרות להשתמש השקופיות באופן מיידי, הם ניתן לשמור במקרר ללא אובדן של זריחה. לאחסון ממושך, השקופיות ניתן לשמור במקפיא כדי למנוע הידרדרות11.
  5. הערכת microvessel בצפיפות על ידי ספירת מספר הצטלבויות של microvessels שכותרתו עם קווי רשת שנוצרו על-ידי המחשב נקודות המגע המוצגים על התמונה52, או עם כיסוי הרשת ברור נקודות המגע המוצגים על המסך בשימוש להצגת השקופיות.
    הערה: GS1 לקטין גישות שימשו כדי להדגים: מלח-induced rarefaction microvascular53, ההשפעה המגנה של מניעת מלח המושרה אנגיוטנסין II דיכוי עבור שחזור microvessel צפיפות שלצאן מלח17 ,53,54; תפקידו של NRF2 תיווכה ההשפעה המגנה של מינון נמוך אנגיוטנסין II אינפוזיה למנוע microvessel rarefaction מלח-fed חולדות17; גם להעריך את התפקיד של אנגיוטנסין II בשמירה על תגובות האנגיוגנזה גירוי השריר במלח האכלת חולדות54,55. אחד היתרונות של הטכניקה לקטין GS1 הוא כי ניתן להשתמש כדי להעריך את צפיפות microvessel החיות באותה המשמש ללימודי לצינוריות התנגדות העורקים או LDF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במבחנה מיקרוסקופ לצינוריות התנגדות העורקים מאפשר חקר הגורמים המשפיעים על הטון הפעיל התנגדות קטן העורקים (ובכל רבים גדולים יותר) נורמלי ויוו transmural לחצים, בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות. בנוסף מעריכים את תגובתיות של כלי לגירויים שונים מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם, תגובות myogenic transmural העלאת הלחץ ב- PSS נורמלי, Ca2 +-PSS חינם ניתן להוסיף את perfusate ואת superfusate בסוף הניסוי כדי לקבוע את עובי קוטר וקיר קיבול מקסימלית. המדידות האחרון הם בעלי ערך גבוה בהערכת שיפוץ כלי דם, כלומר, שינוי היחס קיר/לומן שעלולות להתרחש כתגובה לשינויים בלחץ הדם או ניהול של סוכנים תרופתי. מדידות של הקוטר של כלי מקסימאלית מורחבים ב Ca2 +-PSS חינם שימושיים לחישוב הטון מהותי כמו ((Dmax-Dמנוחה) /Dמקס) x 100, כאשר Dmax ו- Dכל השאר הם המרבי (Ca2 +- חינם PSS) נחה קוטר (PSS), בהתאמה, על הלחץ equilibration הבקרה (בדרך כלל 80 מ מ כספית עבור MCA). מניסיוננו, הטון פעיל ב- MCA הממוצע בסביבות 40%, בלחץ transmural של 80 מ מ כספית. מדידת הקוטר של העורקים מורחבים מקסימאלי היא גם דרך מעשית כדי להעריך את תכונות מכאניות פסיבית של כלי על ידי מדידת הקוטר של העורקים ברמות שונות של transmural distending ללחץ ושימוש את התוצאות לחשב יחסים מתח-זן אחרים תכונות מכניות של7,כלי56.

איור 3 היא ייצוג סכמטי של שלושה זנים congenic הצרת נגזר העכברוש SS.13בסון ניצול גישות נוספות ברירה מלאכותית. זנים אלו עכברים, המקטעים כרומוזומלית גם לכלול אלל רנין בראון נורבגיה (Ren1-בסון) או לחתוך רק מעל (Ren1-SSA) או פשוט מתחת (Ren1-חלטורה) מיקומה ג'ין רנין (ובכך תמך אלל רנין האס. אס). זה לומדים29, קטע כרומוזומלית המכיל אלל רנין בראון נורבגיה הכיל רק 25 גנים.

איור 4 מדגימה בתגובה מרחיב כלי דם אנדותל תלוית ACh (1 מיקרומטר) ב- MCAs מבודדים של חולדות דאל SS זכר ושלושת הצטמצם זנים congenic המוצגת באיור3. להשתמש בשילוב זנים אלה congenic שלושה כוללים (Ren1-בסון) או מנותקים מעל (Ren1-SSA) או מתחת (Ren1-חלטורה) הרנין ג'ין מוגבל לאזור של הריבית (כלומר, האזור הסובב את מיקומה ג'ין רנין) כ 25 גנים. בניסויים אלו, החיות היו normotensive והאכיל מלח נמוכה (0.4% NaCl) דיאטה. באותו מחקר29 אנדותל תלוית התארכות ל ACh היה נעדר המתח הורים האס. אס, שני זנים congenic על שמירה אלל רנין האס. אס, אך שוחזר בשנת המתח congenic נושאת אלל רנין בסון ברקע גנטי של האס. אס. תוצאות המחקר הזה נתמך על הממצאים של מחקרים מוקדמים יותר ניצול SS.13בסון consomic חולדות57,58 וסיפק ראיות חזקות בתפקוד אנדותל הזה קיים אצל חולדות האס. אס, אפילו כאשר הם normotensive, נמאס דיאטה דלת מלח נמוכה. נלקח יחד, שתוצאות אלה57,29,מחקרים58 תומכים בהשערה הזו בתפקוד אנדותל בחולדות SS הוא בהתאם לתקנה לקוי של הגן רנין, וכתוצאה מכך חשיפה כרונית נמוך רמות של אנגיוטנסין II בדם.

עוד מחקר59, מסוכמות באיור 5, לעומת התגובה מרחיב כלי דם אנדותל תלוית ACh ב MCAs מבודדים (MCA) של חולדות דאל SS זכר וחולדות consomic SS.5בסון נושאת כרומוזום 5 (נורבגיה בראון המכיל גנים עבור שונים איזופורמים של ציטוכרום P450-4A ω-hydroxylase). במחקר הזה, חיות הואכלו מלח או נמוך (0.4% NaCl) או מלח גבוהה (4% NaCl) דיאטה. בניגוד MCA מן האס. אס חולדות, התארכות התלויים אנדותל ל ACh נשמר ב- MCA מן החולדות consomic SS.5בסון האכיל דיאטה מלח נמוכה. בנוסף, (ובניגוד נובע SS.13בסון consomic חולדות57,58, ספראג-Dawley חולדות33,39,40,60ו אוגרים הזהב 61), דיאטה דלת מלח גבוהה נכשלה לחסל את התארכות ACh-induced בחולדות SS.5בסון , המציין את CYP450-4A ω-hydroxylase, 20-hydroxyeicosatetraenoic חומצה (20-HETE) הם חשובים התורמים ללחץ חמצון הדם, אנדותל תפקוד בחולדות האס. אס, ובמהלך הגבהים תזונתיים צריכת מלח ב זנים אחרים. מנקודת מבט ניסיוני, בכישלון הדיאטה מלח גבוהה כדי למנוע התרחבות אנדותל תלוית ל ACh מספק דוגמה של איך מחקרים לצינוריות התנגדות העורקים יכול להפיק ממצאים בלתי צפוי היוצאים המקובלת, עלול להוביל הבנה חדשה של מנגנוני שליטה מורכבים המשפיעים על הפונקציה של אלו כלי חיוני.

איור 6 מראה את התגובה של MCA מבודד ACh (1 מיקרומטר) ב- wild type, Nrf2(- / -.) נוקאאוט חולדות האכיל דיאטה דלת מלח נמוכה (0.4% NaCl) גבוהה, מלח תזונה (4% NaCl), או דיאטה מלח גבוהה המכילה ידוע NRF2 activator30,62 . בהיעדרו של מלח-induced סטרס חמצוני, התארכות ACh-induced היה דומה ב- MCA פראי סוג ו עכברים knockout Nrf2(- / -.) . בקנה אחד עם התוצאות של מחקרים מוקדמים יותר של חולדות ספראג-Dawley, הדיאטה מלח גבוהה חיסלה ACh-induced התארכות בסוג הפרוע ואת בחולדות נוקאאוט Nrf2(- / -.) . תוספת של משרן NRF2 לדיאטה מלח גבוהה לשחזר אנדותל תלוית התארכות ACh העכברושים פראי סוג, אך לא את החולדות Nrf2(- / -.) , להפגין חיסול מוצלח של הגן Nrf2 בחולדות נוקאאוט, ותמיכה של השימוש של NRF2 ומעלה-בקרי גישה טיפולית המשלבת וסקולרית סטרס חמצוני.

איור 7 המסכם את תוצאות מדידות LDF השוואת התגובות של microcirculation pial מתקדמת הפחתות לחץ דם עורקי המיוצר על ידי משיכות נפח הדם רצופים בחולדות ספראג-Dawley שמרו על אחת מלח רגיל (0.4% NaCl) דיאטה או מלח גבוהה (4% NaCl) דיאטה במשך ארבעה שבועות. בניגוד עכברים דיאטה דלת מלח נמוכה, האכלת חולדות התערוכה דיאטה מלח גבוהה יכולת ראייה כדי לשמור על זרימת דם קבוע במהלך הפחתה בלחץ זלוף, המציין כי המנגנון האחראי על autoregulation זרימת דם מוחי הם נפגעת על ידי חשיפה לטווח ארוך דיאטה דלת מלח גבוהה. התוצאות של הניסויים האלה הם עקביים עם הנוכחות של מנגנונים לקוי הרפיה כלי הדם העורקים המוחיים מבודד של חולדות מלח-fed60 ולספק דוגמה טובה של מה מדידות LDF יכול להיות מועסק תומך ולהרחיב ממצאים של מחקרים העסקת מבודדים התנגדות העורקים לרמה של המיטה כל כלי הדם.

בנוסף להערכת עמידות העורק פונקציה באמצעות העורקים מבודד זלוף רקמות באמצעות לייזר-דופלר flowmetry, צפיפות microvessel האנגיוגנזה תגובות לגירויים שונים כגון גירוי השריר54, 55 ניתן להעריך את החיות באותו ניצול לקטין GS1 שכותרתו fluorescently, אשר נקשר באופן סלקטיבי גליקופרוטאין moieties ב קרום המרתף של רבים, נימים. איור 8 מראה אופייני לקטין מכתים בשריר cremaster של ספראג-Dawley עכברים של דיאטה מלח נמוך או גבוה דיאטה מלח 2 שבועות (שים לב הצפיפות נמוכה יותר של microvessels בחולדות הפדרציה מלח גבוהה). צפיפות Microvessel מוערך על ידי ספירת את הצטלבויות של התווית על-ידי לקטין microvessels עם רשת הפניה שנוצרו על-ידי המחשב52, והוא מספק שיטה מצוינת להעריך האנגיוגנזה תגובות54,55 או ל לזהות ולכמת את אובדן microvessels במצבים כגון יתר לחץ דם, מוגבה צריכת המלח תזונתיים12,17,53.

Figure 1
איור 1: במבחנה מיקרוסקופ וידאו כיוונון המועסקים ללמוד מבודדת, לצינוריות התנגדות העורקים (A). ההתנגדות לצינוריות עורק קשור זכוכית micropipettes (B) ולהציג מיקרומטר וידאו מציג מדידה של לומן קוטר בעורק לצינוריות ההתנגדות (C). סולם בר לוח ב' מייצג את הקוטר הפנימי של העורק cannulated (מיקרומטר), 125 µm לוח ג' היא בתצוגת הווידאו של המרחק בין השורות בהפניה ניד מניחים באופן ידני על הקירות הפנימיים של העורק על ידי המתבונן עורכים את הניסוי . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרשים סכמטי של ההליך עבור בידוד עורק המוח התיכון מהמוח והסדרתה לביקור תעלות עם micropipettes. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תרשים סכמטי של זנים עכברוש congenic הצרת יש מקטעים קטנים של נורבגיה בראון introgressed כרומוזום 13 לתוך דאל מלח רגישות גנטית הרקע. מקטעי כרומוזומלית או הכילה אלל רנין בראון נורבגיה (Ren1-בסון) או מנותקים מעל (Ren1-SSA) או מתחת (Ren1-חלטורה) מיקומה ג'ין רנין, ובכך שומרים על אלל רנין האס. אס. איור זה שונה, מכתב דוראנד. et al. 29 עם הרשאה של האגודה האמריקנית פיזיולוגיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: התגובה של בודדים, לצינוריות חולדות MCAs של האס. אס וללחצים congenic חולדה (מאויר באיור2) כדי 1 מיקרומטר אצטילכולין. נתונים מבוטא ±SEM שינוי (Δ מיקרומטר) כלומר קוטר מ נח בקרה בקוטר לפני אצטילכולין, הם replotted של המחקר המקורי על ידי דוראן. et al. 29 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: תגובתה של חולדות MCAs של האס. אס מבודדת, לצינוריות וחולדות consomic SS.5בסון 1 מיקרומטר אצטילכולין בבעלי חיים ניזונים מלח נמוכה (0.4% NaCl) או מלח גבוהה (4% NaCl) דיאטה. נתונים מבוטא ±SEM שינוי (Δ מיקרומטר) כלומר קוטר מ נח בקרה בקוטר לפני אצטילכולין, הם replotted של המחקר המקורי על-ידי. Lukaszewicz et al. 64 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: תגובה ל 1 מיקרומטר אצטילכולין ב MCAs מבודדת, לצינוריות של עכברים knockout Nrf2(- / -.) ופקדים פראי סוג האכיל דיאטה מלח נמוכה (0.4% NaCl), גבוהה מלח תזונה (4% NaCl), או דיאטה מלח גבוהה המכילה ידוע NRF2 activator30, 62. נתונים מבוטא ±SEM שינוי (Δ מיקרומטר) כלומר קוטר מ נח בקרה בקוטר לפני אצטילכולין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: זרימת דם מוחי לאומדן LDF ב microcirculation pial. חולדות ספראג-Dawley שמרו על דיאטה דלת מלח גבוהה במשך ארבעה שבועות באורה של לקות משמעותית את היכולת שלהם לשמור על זרימת דם קבוע כמו לחץ דם עורקי צומצם בתגובה משיכות נפח הדם רצופים. נתונים מותוות אחוזים רעים של שליטה ±SEM * p < 0.05 לעומת דיאטה מלח נמוכה בבית אותו מתכוונת לחץ הדם בעורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: Micrograph של השרירים cremaster חולדה עם התווית על-ידי rhodamine לקטין GS1 לזהות רבים נימים עבור הערכה של צפיפות microvessel תוויות. השרירים Cremaster, התקבלו עכברים ספראג-Dawley מלח נמוכה (LS; 0.4% NaCl) או גבוהה מלח תזונה (HS:4% NaCl) למשך שבועיים, ומדגימים rarefaction microvascular את החיות HS-fed לעומת שולט LS. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאמור במבוא, מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ הטלוויזיה ואת ההתנגדות מבודד עורק גישות להעריך את תפקוד כלי הדם לא רק במודלים עכבר סטנדרטי (כמו המועסקים וידאו), אבל גם ב שהתשתית גנטית זני עכברים מהונדסים, אשר מציגות את הרומן ואת התובנות עוצמה שניתן להשיג ניצול גישות אלה. השימוש של טכניקות עוצמה אלה כדי להעריך את הטון פעיל פסיבי תכונות מכניות של העורקים התנגדות קטן יכול לספק מידע חשוב לגבי קשת רחבה של מנגנוני הבקרה כלי דם כולל תקנה אנדותל תלוית של טון פעיל בהתנגדות העורקים, השריר החלק בכלי הדם הפונקציה תחת נורמלי ותנאי pathophysiological ומאפיינים פסיבי של העורקים הקשורים שיפוץ כלי הדם ומשנה ב מכניקה קיר כלי הדם. בתפקוד אנדותל הוכח להיות מחוון prognostic עוצמה של מספר אירועי לב וכלי דם שלילית אצל בני אדם לרבות מוות לב וכלי דם הקשורות63, התנגדות לצינוריות עורק ההכנות נמצאות יקר במיוחד ב איתור בתפקוד אנדותל של הגברת ההבנה שלנו על מנגנוני בתפקוד אנדותל.

כדי להדגים את היעילות של במבחנה טכניקות במיקרוסקופ וידאו העסקת מבודד התנגדות העורקים, סיפקנו דוגמאות לשימוש של טכניקות אלה בחולדות רגיש מלח (הה) דאל, תוך consomic רומן זני עכברים כי התערוכה מופחתת רגישות מלח של לחץ דם בהשוואה את המתח הורים SS24. מחקרים אלה חקר מנגנוני בקרה כלי הדם הקשורים גנים על שני כרומוזומים המהווים עניין מיוחד בתרומה רגישות מלח של לחץ דם, שינויים בכלי הדם בחולדה האס. אס. הכרומוזומים הללו הן כרומוזום 13, נושאת את רנין ג'ין18,22,29,57,58, כרומוזום 5, נושאת גנים של איזופורמים של CYP450-4A ω-hydroxylase64 ,65– אנזים מסנתז 20-HETE, שבו יש השפעות משמעותיות על תפקוד הכליות ועל כלי הדם תגובתיות-66,-67,-68. בנוסף לאחרונה ורב עוצמה אחר הכלים גנטית עכברים היא הפיתוח של עכברוש ג'ין נוקאאוט דגמי ניצול טכניקות עריכה מתקדם הגן כולל: ZFNs; activator-כמו-אפקטור תעתיק nucleases (TALENS), ולאחרונה CRISPR-Cas913,14,15,16,17. במבחנה מיקרוסקופ וידאו ניצול טכניקות אלה ללמוד MCAs מבודדים ממודל Nrf2(- / -.) נוקאאוט העכברוש חסר את חמצון חיוני ואת גורם שעתוק מגן תא NRF2, סיפקה חשוב ו בעבר לא ידוע תובנה במנגנונים של מלח-induced בתפקוד אנדותל בהיעדר עם הרשאות מלאות דם לחץ17. תוצאות ספציפיות של ניסויים ניצול מודלים עכברים מיוחדים אלה מתוארים במספר הקודם דוחות17,29,57,58,59, 60 , 64 , 65 .

אמנם זה ברור כי מחקרים מבודדת, לצינוריות התנגדות העורקים יקרים מאוד בהבנת המנגנונים המסדיר את הפונקציה של אלו כלי חשובה ביותר תחת מגוון תנאים, זה מאוד חשוב להתאמן מספר אמצעי זהירות על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות מתקבלים. בעוד העורקים המוחיים וצירי ההתנגדות של רבים מיטות כלי דם אחרות, תערוכה הטון מהותי כמה עורקים (בעיקר מצע המעי העליון בהתנגדות העורקים) צריך להיות חוזה מראש עם vasoconstrictors כגון נוראדרנלין על מנת להעריך תגובות גירויים מרחיב כלי דם, יותר מדויק לעורו ויוו תנאים, איפה כלי תחת השפעת גירויים עצביים, ההורמונאלית מצר את כלי הדם, כגון נוראדרנלין שוחררו adrenergic קצות עצבים. ככזה, חשוב להכיר המאפיינים הבסיסיים של העורקים להילמד, גם בספרות או בקפידה ערכה ניסויים מוקדמים. כי אנדותל ממלאת תפקיד מרכזי בוויסות עורקים גדולים, עורקים קטנים רבים ב- microcirculation, חשוב לנקוט משנה זהירות כדי למנוע נזק של אנדותל במהלך בידוד, תעלות של העורק. מבחן קלאסי לתקינות אנדותל הוא ההפגנה כי ACh גורם התארכות כלי השיט. קודם הוא, בתנאים של עקה, אנדותל כלי עשוי להיות שלמים, אבל vasodilatation ל ACh נעדר בגלל רמות מוגזמות של סופראוקסיד נקה את תחמוצת החנקן מניעת התגובה מרחיב כלי דם. במקרים אלה, שלמות אנדותל ניתנת לאימות כמקורית חוזרות היישום ACh בנוכחות מנבלות סופראוקסיד כגון tempol, אשר אמורה לשחזר vasodilation בתגובה ACh גירויים אנדותל תלוית מרחיב כלי דם אחרים. כמו כן, במספר מצבים פתולוגיים, אנדותל יכול לשחרר חומרים שגורמים להתכווצות של תאי השריר החלק בכלי הדם, כיווץ של העורק; במקרים מסוימים, התארכות תלויי-אנדותל (או כיווץ) מתווך באמצעות חומרים אחרים כגון cyclooxygenase מטבוליטים, H2O2, epoxygenase מטבוליטים, וכו '. הבדיקה קלאסי אנדותל תלוית מרחיב כלי דם או חומר מצר את כלי הדם היא להדגים התארכות או ההתכווצות של העורק חוסלה על ידי הסרת אנדותל. בסופו של דבר, הזהות של חומרים מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם אנדותל תלוית שונים ניתן בדרך כלל לקביעה על-ידי מינהל מעכבי ספציפי או אוכלי. נבלות, כגון L-שם כדי לעכב סינתאז ניטריק אוקסיד, indomethacin לעכב היווצרות של מטבוליטים cyclooxygenase, קטלאז למצוא2O H2, thromboxane סינתאז מעכבי, מעכבי epoxygenase, ו/או היריבים של הנתיב CYP450-4A/20-HETE.

זה גם חשוב (ולא מאלף) לכמת כמות פעילה טון בסוף הניסוי על ידי פרפוזיה, superfusing את העורק עם Ca2 +-חינם PSS, או מתן מינון מקסימלי של סוכן עוצמה מרחיב כלי דם כגון papaverine. רמה טיפוסי של פעיל נח טון ב- MCA, x 100 מחושב כמו ((Dמקס-Dמנוחה) /Dמקסימום), הוא כ-40%, כאשר Dmax ו- Dכל השאר הם המרבי (Ca2 +-חינם PSS) נחה קוטר (PSS), בהתאמה, על הלחץ equilibration הבקרה (בדרך כלל 80 מ מ כספית עבור MCA). כלי עם פעילות באופן משמעותי פחות צלילים או העורקים מראה constrictions סגמנטלי או dilations אינם נכללים ניתוח, כל הסימנים האלה מעידים על פגיעה בכלי הדם. מדידה של הקוטר של העורקים מורחבים מקסימאלית Ca2 +-פתרון חינם מאפשרת גם החוקר להעריך את תכונות מכאניות פסיבית של כלי על ידי מדידת קוטר העורקים ויחסים חישוב מתח-זן במהלך הגבהים רציפים בלחץ transmural ב7,בכלי מקסימאלית מורחבים56. מערכות היחסים הללו מתח פאסיבי-זן מתקבלים בקלות, לספק ציון ערך על שינויים במאפיינים מכני של כלי.

ניקיון של מדי סוכר, מחברים, צינורות אספקת המאגרים היא חיונית עבור ניסויים מוצלחים. בהקשר זה, חשוב לשטוף כל הפתרונות מתוך הצנרת לאחר השלמת הניסוי, לשטוף ולנקות את הרקמה אמבט, הצנרת משלוח, כל מאגרים המשמשים לאחסון, חם ואת גז-equilibrate של PSS לפני שהגיע את כלי הקיבול . תא Stopcocks ושסתומים במערכת המסירה צריך גם להיות מנקים את משתנה מעת לעת, כפי צריך צינורות בכל נושא PSS. סימן קלאסי של אבובים מזוהמים היא ערפל אפור שנוצר על ידי עובש וחיידקים; שינויים אלה מלווים על ידי אובדן של תגובתיות נורמלית של כלי הדם עקב חומרים המיוצרים על ידי לזיהום חיידקי. עם זאת, זיהום על ידי חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים עדיין שיימצאו בהיעדר ראיות גלוי.

אנו מאמינים כי המאמר הנוכחי מספק דוגמה מועילה לשימוש של טכניקות ששורשיה במיוחד לסביבות לימודים של העורקים חשיבות עליונה התנגדות קטן של מיטות כלי דם שונים. בשילוב עם גישות סטנדרט להערכת זלוף רקמות, כגון LDF ושיטת לקטין GS1 להערכת microvessel צפיפות, במבחנה מיקרוסקופ וידאו לצינוריות התנגדות העורקים מספק תובנה יקרי הפקטורים רקמות זלוף ועל איך אלה עשויים להשתנות במצבי מחלה. בנוסף מתן אמצעים רבי עוצמה כדי לחקור מנגנונים הבסיסית של השריר החלק בכלי הדם ותפקוד אנדותל במודלים עכבר סטנדרטי, השימוש של מיקרוסקופ וידאו ללמוד בודדים התנגדות העורקים ניתן להחיל מודלים בבעלי חיים אחרים . העורקים התנגדות אנושית היישום של מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של מודלים מהונדס גנטית עכברים הרומן פותח דלתות חדשות להבנת פנוטיפי שינויים שמתרחשים בתגובה פונקציה שונה של ריבוי (וכן רשימת ההולכת) של גנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים אקספרס שלהם כנה תודה קייטי פינק ולין Dondlinger עבור שלהם בפז סיוע בהכנת כתב היד הזה.

תמיכה גרנט: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

רפואה גיליון 130 התנגדות העורקים אנדותל מנתחי מיקרו מלח יתר לחץ דם מוחין תפוצה
הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter