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संवहनी नियंत्रण चूहों के पृथक प्रतिरोध धमनियों के वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग तंत्र का मूल्यांकन

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

इस पांडुलिपि का वर्णन इन विट्रो में चूहे मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों में संवहनी समारोह के मूल्यांकन के लिए वीडियो माइक्रोस्कोपिक प्रोटोकॉल । पांडुलिपि भी फ्लोरोसेंट लेबल लेक्टिन और ऊतक छिड़काव लेजर डॉपलर Flowmetry का उपयोग कर के साथ microvessel घनत्व के मूल्यांकन के लिए तकनीक का वर्णन ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का उपयोग इन विट्रो टेलीविजन माइक्रोस्कोपी का वर्णन करने के लिए अलग मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों (और अन्य जहाजों) में संवहनी समारोह का मूल्यांकन, और लेजर डॉपलर Flowmetry का उपयोग कर ऊतक छिड़काव के मूल्यांकन के लिए तकनीकों का वर्णन (एलडीएफ ) और microvessel घनत्व का उपयोग फ्लोरोसेंट लेबल Griffonia simplicifolia (GS1) लेक्टिन । transmural दबाव पर अलग प्रतिरोध धमनियों का अध्ययन करने के लिए वर्तमान तरीके vivo में सामना करना पड़ा और parenchymal सेल के प्रभाव के अभाव में vivo में अध्ययन और आणविक से प्राप्त जानकारी के बीच एक महत्वपूर्ण कड़ी प्रदान गुटबंदी दृष्टिकोण है कि पूरे पशु स्तर पर एकीकृत प्रतिक्रियाओं में सीमित अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । एलडीएफ और तकनीक चुनिंदा धमनियों और केशिकाओं की पहचान करने के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल GS1 लेक्टिन व्यावहारिक समाधान प्रदान करने के लिए जांचकर्ताओं अलग प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन से प्राप्त ज्ञान का विस्तार करने के लिए सक्षम करें । यह कागज इन तकनीकों के आवेदन का वर्णन करने के लिए एक सामांय प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में चूहे में संवहनी शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के मौलिक ज्ञान प्राप्त है, और विशेष आनुवंशिक रूप से इंजीनियर "डिजाइनर" चूहे उपभेदों कि प्रदान कर सकते है की एक किस्म में महत्वपूर्ण संवहनी phenotypes पर विशिष्ट जीन के प्रभाव में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि । चूहे में इन मूल्यवान प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग चयनात्मक प्रजनन रणनीतियों और चूहे में जीन नॉकआउट मॉडल के उत्पादन के लिए नई प्रौद्योगिकियों द्वारा विकसित, वैज्ञानिक नॉकआउट माउस मॉडल में विकसित परिसर की कठोरता का विस्तार होगा और एक और अधिक प्रासंगिक पशु मॉडल के लिए है कि ज्ञान का विस्तार, क्योंकि इसके बड़े आकार के शारीरिक अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से समझा शारीरिक पृष्ठभूमि और उपयुक्तता के साथ ।

Introduction

धमनियों में संवहनी समारोह के प्रारंभिक अध्ययनों नाली धमनियों का उपयोग, और कई मामलों में महाधमनी. बड़ी धमनियों में बल पीढ़ी आम तौर पर एक ऊतक स्नान में एक बल transducer करने के लिए धमनी की एक अंगूठी खंड संलग्न द्वारा अध्ययन किया गया था; महाधमनी के मामले में, पोत के पेचदार स्ट्रिप्स काटने से इतना है कि चिकनी मांसपेशी फाइबर लगाव के बिंदु और बल transducer के बीच एक अनुदैर्ध्य दिशा में उंमुख थे, के संकुचन द्वारा उत्पंन बल का सबसे अच्छा अनुमान प्रदान करने के लिए इसके अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ चिकनी मांसपेशी । aortas के पेचदार स्ट्रिप्स को काटने के लिए मानक तकनीक पोत के लुमेन में एक गिलास रॉड जगह थी, इच्छित कोण पर पोत दीवार में कटौती करने के लिए, और पोत दीवार के उजागर किनारे के अंत करने के लिए पर पकड़ के रूप में कटौती के लिए एक पूरा उत्पादन बढ़ाया गया था पोत की पेचदार पट्टी । उस समय, पोत के endothelial पक्ष आम तौर पर blotted बल transducer के लिए पोत पट्टी संलग्न करने और एक oxygenated और तापमान नियंत्रित ऊतक स्नान में तैयारी के विलय से पहले मलबे को हटाने के लिए किया गया था । अंत में, कि दृष्टिकोण Furchgott और Zawadski द्वारा फिजियोलॉजी के इतिहास में सबसे प्रसिद्ध और महत्वपूर्ण खोजों में से एक के नेतृत्व में1, अर्थात् endothelium व्युत्पंन आराम कारक (EDRF), बाद में नाइट्रिक ऑक्साइड के रूप में की पहचान की भूमिका, में संवहनी समारोह को विनियमित. महत्वपूर्ण है कि खोज के लिए अग्रणी घटना एक स्थिति में जांचकर्ताओं विदेशी सतहों के साथ धमनी के endothelial पक्ष के संपर्क से बचने के द्वारा एक बरकरार endothelium बनाए रखा था, और देखा कि महाधमनी पट्टी की उंमीद प्रदर्शन नहीं किया acetylcholine (पीटीएच) के लिए संकुचन, लेकिन बजाय के जवाब में आराम से । उस अवलोकन के आधार पर, जांचकर्ताओं एक "सैंडविच" तैयारी जिसमें वे एक बरकरार endothelium के साथ एक महाधमनी खंड संलग्न विकसित (लेकिन सिकुड़ा बल उत्पंन करने में असमर्थ) महाधमनी के एक मानक पेचदार पट्टी के लिए और में परिवर्तित कर दिया--प्रेरित एक छूट में संकुचन ।

इस क्षेत्र है कि बड़े पैमाने पर आज उपयोग किया जाता है में दो प्रमुख अग्रिम तैयारियों के विकास के लिए छोटे प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय सिकुड़ा बल2,3 (जैसे आंतों अन्त्रपेशी 3 में उन के रूप में ) और cannulated प्रतिरोध धमनी की तैयारी4,5,6. प्राचीनतम रिपोर्टों में से एक में, Mulvany और Halpern3 में सहज अन्त्रपेशी चूहों (ग्रस्त) के आंतों SHR से पृथक प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय सिकुड़ा बल का अध्ययन करने के लिए तार myograph तैयारी के उपयोग का वर्णन किया गया है और normotensive WKY नियंत्रण होते. तार myograph प्रणाली के विकास के बाद, cannulated प्रतिरोध धमनी की तैयारी के लिए जहाजों के अध्ययन की अनुमति के लिए करीब vivo शर्तों4,5,6 में विकसित किया गया ।  जबकि दोनों दृष्टिकोण मूल्यवान परिणाम प्रदान करते हैं, cannulated धमनी तैयारी अधिक प्रभावी ढंग से धमनियों में आंतरिक सक्रिय टोन के संरक्षण के अतिरिक्त लाभ है; और जांचकर्ताओं को transmural दबाव और पोत प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन करने के लिए सक्रिय myogenic प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रवाह की दर और endothelial कतरनी तनाव में परिवर्तन की अनुमति (Halpern और Kelley द्वारा समीक्षा देखें6) ।

वर्तमान कागज का एक प्रमुख लक्ष्य का वर्णन कैसे समय-वीडियो माइक्रोस्कोपी के संमानित तकनीक का उपयोग करने के लिए अलग, cannulated प्रतिरोध धमनियों में आदेश सटीक तंत्र है कि इन महत्वपूर्ण में सक्रिय टोन को विनियमित के बारे में जानकारी हासिल करने के लिए काम करने के लिए है जहाजों, तंत्रिका, विनोदी, या parenchymal सेल प्रभाव से स्वतंत्र । यह बुनियादी जानकारी, एक मानक चूहे मॉडल और उदाहरण के नए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे उपभेदों के हमारे अध्ययन से रोजगार, संवहनी समारोह है कि टेलीविजन के साथ प्राप्त किया जा सकता है के बारे में अंतर्दृष्टि के प्रकार के एक विचार के साथ पाठक प्रदान करेगा सूक्ष्म दृष्टिकोण, और जो किसी भी नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह (ओं) को शामिल करने के अध्ययन में नियोजित किया जा सकता है अंवेषक का चयन, शक्तिशाली नए प्रयोगात्मक चूहे चयनात्मक द्वारा उत्पादित मॉडल सहित और नए आनुवंशिक विकसित इंजीनियरिंग तकनीक ।

टीवी माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण की परिशुद्धता के लिए धन्यवाद, cannulated धमनी की तैयारी में व्यास परिवर्तन की माप अत्यधिक मूल्यवान endothelium के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं-निर्भर और endothelium-संवहनी स्वतंत्र तंत्र विश्राम, के रूप में अच्छी तरह के रूप में महत्वपूर्ण (और कई बार अप्रत्याशित) उच्च रक्तचाप, उच्च नमक आहार, और अंय प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के साथ होने वाली संवहनी नियंत्रण तंत्र में परिवर्तन । इसके अलावा, अलग और cannulated प्रतिरोध धमनियों में दबाव व्यास संबंधों की माप है कि अधिक से अधिक सीए के साथ उपचार द्वारा आराम कर रहे हैं2 +-मुक्त समाधान या एक औषधीय vasodilator दवा, अंवेषक का आकलन करने की अनुमति देता है संवहनी remodeling के कारण धमनियों में संरचनात्मक परिवर्तन और निष्क्रिय तनाव की गणना करने के लिए7 कि धमनियों के निष्क्रिय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि धमनियों समारोह को प्रभावित कर सकते हैं स्वतंत्र के (या इसके अलावा में) सक्रिय नियंत्रण तंत्र में परिवर्तन । यह भी ध्यान रखें कि जानकारी अलग प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन से प्राप्त की जानकारी के द्वारा पूरक किया जा सकता है महत्वपूर्ण है, पूरे पशु स्तर8पर ऊतक छिड़काव के मूल्यांकन के लिए एक व्यावहारिक विधि का उपयोग एलडीएफ,9 ,10, और जानकारी के द्वारा फ्लोरोसेंट लेबल GS1 लेक्टिन, जो विशेष रूप से छोटे moieties और केशिकाओं11 की तहखाने झिल्ली में ग्लाइकोप्रोटीन धमनियों को बांध का उपयोग कर microvessel घनत्व का आकलन करने से प्राप्त , 12. उत्तरार्द्ध विधि microvessel घनत्व का एक बहुत सटीक अनुमान है कि क्लासिक कठिनाइयों के अधीन नहीं है प्रदान करता है vivo मेंजहाजों की गिनती से microvessel घनत्व का आकलन करने में सामना करना पड़ा, उदाहरण के लिए गैर लापता-perfused जहाजों जहां रक्त प्रवाह धमनियों के सक्रिय बंद होने के कारण बंद कर दिया है । जब एक साथ इस्तेमाल किया, इन तरीकों microvasculature स्तर पर ऊतक छिड़काव में परिवर्तन करने के लिए अलग प्रतिरोध धमनियों में कार्यात्मक परिवर्तनों को सहसंबंधी करने के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं; और cannulated धमनी तकनीक के साथ संयोजन के रूप में उन मूल्यवान दृष्टिकोण के उपयोग के कुछ उदाहरण भी वर्तमान पांडुलिपि में प्रदान किया जाएगा ।

वर्तमान कागज वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीक के उपयोग पर केंद्रित Sprague-Dawley चूहों की धमनियों में संवहनी परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए । हालांकि, यह ध्यान दें कि इन तकनीकों को अत्यधिक विशिष्ट आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे चयनात्मक प्रजनन या जीन तकनीक का उपयोग कर संपादन के द्वारा बनाई गई उपभेदों में elucidating phenotypic परिवर्तन में अत्यधिक मूल्यवान साबित किया है महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि में, हम कैसे वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीक महत्वपूर्ण Dahl नमक सहित मूल्यवान चूहे मॉडल की एक संख्या में संवहनी समारोह के बारे में जानकारी प्रदान की है के उदाहरण देते हैं, संवेदनशील (एसएस) चूहा-एक नस्ल चूहा तनाव है कि सबसे व्यापक रूप से है प्रयुक्त प्रायोगिक मॉडल नमक संवेदनशील hypertenson के तंत्र का अध्ययन करने के लिए18,19,20,21,22,23; और consomic चूहों नमक असंवेदनशील ब्राउन नॉर्वे (बीएन) चूहे तनाव के साथ एसएस चूहों के चयनात्मक प्रजनन के माध्यम से बनाया । consomic चूहा पैनलों में, ब्राउन नॉर्वे चूहे से हर गुणसूत्र Dahl एसएस24,25,26 आनुवंशिक पृष्ठभूमि में व्यक्तिगत रूप से introgressed किया गया है । consomic चूहे पैनलों का उपयोग विशिष्ट गुणसूत्रों कि रक्तचाप और संवहनी जेट सहित अन्य phenotypes के नमक संवेदनशीलता में योगदान के बारे में बहुमूल्य सुराग प्रदान की गई है24,25,26 ,27,28.

चयनात्मक प्रजनन रणनीति एसएस चूहों और consomic व्यक्तिगत बीएन गुणसूत्रों ले जाने चूहों का उपयोग भी Dahl एसएस आनुवंशिक में व्यक्तिगत भूरे रंग नॉर्वे गुणसूत्रों के छोटे खंडों के साथ संकुचित congenic उपभेदों की पीढ़ी को सक्षम किया है पृष्ठभूमि22,29। ये विशिष्ट जीन या गुणसूत्रों के संकीर्ण क्षेत्रों है कि ऐसे रक्तचाप, गुर्दे की क्षति के रूप में महत्वपूर्ण शारीरिक चर, को प्रभावित कर सकते है पर अत्यंत मूल्यवान इनपुट प्रदान कर सकते हैं, और संवहनी जेट22,29। चूहे के लिए एक और शक्तिशाली इसके अलावा आनुवंशिक toolbox चूहा जीन नॉकआउट मॉडल ZFNs सहित उंनत जीन संपादन तकनीक का उपयोग, transcriptional उत्प्रेरक की तरह-प्रभाव nucleases (TALENS), और सबसे हाल ही में CRISPR-Cas9 13 के विकास है ,14,15,16,17. इन शक्तिशाली तकनीक के आगमन कि जीन को सक्षम करने के लिए चूहे में दस्तक दी हो एक बेहद महत्वपूर्ण है क्योंकि जीन पीटकर अध्ययन तिथि करने के लिए इस्तेमाल किया है (और उपयोग करने के लिए जारी) लगभग विशेष रूप से चूहों । वर्तमान कागज में एक और प्रयोगात्मक घटक cannulated धमनी तकनीक और वीडियो माइक्रोस्कोपी के मूल्य को पीटकर चूहों में शारीरिक नियंत्रण तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए मास्टर एंटीऑक्सीडेंट और सेल सुरक्षात्मक प्रतिलेखन की कमी दर्शाता है कारक, नाभिकीय कारक (erythroid-व्युत्पंन 2)-जैसे-2 (NRF2)30,31, जो Sprague-Dawley आनुवंशिक पृष्ठभूमि17में तलेन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विकसित किए गए थे । उन प्रयोगों में, इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोपी तकनीकों में NRF2 जीन की हानि के कार्यात्मक सत्यापन प्रदान करने के लिए और एक संभावित मूल्यवान चिकित्सीय NRF2 के प्रत्यक्ष विनियमन के आधार पर मध्यस्थता एंटीऑक्सीडेंट का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया ठोंकी. एनआरएफ-2 मानव में combatting संवहनी oxidative तनाव में पर्याप्त चिकित्सीय महत्व का है, नैदानिक विटामिन सी और ई३२जैसे antioxidants के प्रत्यक्ष प्रशासन को शामिल परीक्षणों के निराशाजनक परिणाम के प्रकाश में ।

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Protocol

विस्कॉंसिन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के मेडिकल कॉलेज के इस पत्र में वर्णित सभी प्रोटोकॉल को मंजूरी दी और सभी प्रक्रियाओं स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) प्रयोगशाला पशु कल्याण के कार्यालय (OLAW) के अनुपालन में हैं नियमों.

1. समाधान और पोत चैंबर की तैयारी

  1. प्रयोगों की एक श्रृंखला का आयोजन करने से पहले, 20x केंद्रित नमक शेयर समाधान के 2 एल तैयार २७८ g/l NaCl से मिलकर; 14 g/L KCl; ११.५२ g/L MgSO4. 7H२हे; और ९.४ g/L CaCl2. 2H२हे. इसके अलावा ८०.८ g/l NaHCO3 और ०.४ g/l EDTA से मिलकर 20x केंद्रित बफर स्टॉक के 2 l तैयार करें, और 20x केंद्रित सीए के 2 l को2 +-नि: शुल्क स्टॉक समाधान जिसमें २८१.६ g/l NaCl शामिल हैं; 14 g/l KCl, और ११.५२ g/l MgSO4. 7H२हे.
    नोट: 20X स्टॉक समाधान फ्रिज में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक उपयोग करें ।
  2. प्रयोग के दिन पर, 2 l तैयार शारीरिक नमक समाधान (PSS) से 20x केंद्रित स्टॉक समाधान के रूप में निम्नानुसार: 20x नमक स्टॉक के १०० मिलीलीटर एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी या चोंच में एक मोटर चालित सरगर्मी थाली पर पानी की १,८०० मिलीलीटर जोड़ें । 20x बफर स्टॉक के १०० मिलीलीटर जोड़ें जबकि लगातार एक गैस 21% ओ2, 5% CO2, शेष N2, और यह एक चुंबकीय सरगर्मी बार के साथ सरगर्मी युक्त मिश्रण के साथ समाधान equilibrating । धीरे जोड़ें ०.२८ g णः2पीओ4 जबकि पीएच निगरानी; एक पाश्चर पिपेट से 6 एन एचसीएल या ६.५ एन NaOH समाधान की बूंदों को जोड़कर पीएच ७.४ के रूप में आवश्यक समायोजित करें । pss तैयार किया गया है और पीएच समायोजित है, के बाद जोड़ें १.९८ ग्लूकोज के pss करने के लिए g ।
    नोट: यह धीरे से जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है2पीओ4 पिछले जबकि एक क्षारीय समाधान करने के लिए2पीओ4 के अलावा एक alkaline हल करने के लिए, क्योंकि PSS के पीएच की निगरानी कर रहे हैं एक बादल समाधान या कंटेनर के तल में एक सफेद वेग की उपस्थिति ।
    नोट: PSS की अंतिम संरचना है ११९ mM/L NaCl; ४.७ mM/L KCl; १.१७ mM/L मिलीग्राम2तो4; १.६ mM/L CaCl2; १.१८ mM/L णः2PO4; 24 mM/L NaHCO3; ०.०३ mM/L EDTA; और ५.५ mM/एल ग्लूकोज । PSS की संरचना प्रयोगशालाओं के बीच अलग कर सकते हैं, हालांकि यह नुस्खा संवहनी टोन, endothelial समारोह, और अलग प्रतिरोध धमनियों में vasoactive एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने के लिए अत्यधिक उपयुक्त है ।
  3. अधिकतम व्यास का निर्धारण करने के लिए और पोत के अधिकतम फैलाव का उत्पादन करके धमनी में सक्रिय टोन का आकलन करने के लिए, सीए की ५०० मिलीलीटर2 +-मुक्त PSS को जोड़कर 20X ca के 25 मिलीलीटर2 +-मुक्त नमक स्टॉक को ४५० मिलीलीटर पानी की , एक Erlenmeyer कुप्पी या चोंच में 20x बफर स्टॉक के 25 मिलीलीटर के बाद ऊपर कदम १.२ के समान । समाधान के पीएच की निगरानी और समायोजन करते समय2पीओ4 का ०.०७ g णः जोड़ें । ca2 +-मुक्त pss pss जलाशय और पोत चैंबर को समाप्त intracellular ca2 + स्टोर सामांय pss में पोत प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता से बचने के लिए प्रयोग के अंत में जोड़ा जाता है । Ca2 +-मुक्त समाधान धमनियों की अधिकतम छूट का उत्पादन करने के लिए प्रयोग के अंत में जोड़ा जाता है, क्योंकि PSS करने के लिए ग्लूकोज जोड़ने की कोई जरूरत नहीं है ।
    नोट: जब पूर्ण, Ca के अंतिम संरचना2 +मुक्त PSS है १२०.६ mM/L NaCl; ४.७ mM/L KCl; १.१७ mM/L मिलीग्राम2तो4; १.१८ mM/L णः2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; और ०.०३ mM/L EDTA.
    नोट: कई अध्ययनों के लिए धमनी के अधिकतम फैलाव की आवश्यकता होती है, verapamil (1 µ m) और/या एक नाइट्रिक ऑक्साइड दाता जैसे सोडियम nitroprusside (10 µ m) के रूप में एक कैल्शियम प्रविष्टि अवरोधक समाधान करने के लिए जोड़ा जा सकता है, PSS से Ca2 + हटाने के अलावा ।
  4. पीओ2, पीसीओ2, और लगातार equilibrating द्वारा pss का पीएच बनाए रखने के एक मानक अंग स्नान अलग महाधमनी के छल्ले, आंत्र चिकनी मांसपेशी, या अंय ऊतकों का अध्ययन करने के लिए प्रयुक्त में पोत चैंबर में बह (चित्रा 1) । tetrafluoroethylene टयूबिंग के सिंथेटिक फ्लोरो का प्रयोग करें अंग स्नान के लिए गैस टैंक कनेक्ट क्योंकि टयूबिंग के इस प्रकार है गैस अभेद्य, टयूबिंग के कई अंय रूपों के विपरीत, जैसे, लेटेक्स ।
  5. PSS गैस संरचना को बनाए रखने में मदद करने के लिए पोत चैंबर में equilibration गैस मिश्रण से जुड़ा एक छोटा सा एयर स्टोन रखें ।
    नोट: PO2 में परिवर्तन के लिए पोत प्रतिक्रियाओं equilibrating द्वारा पोत चैंबर में PSS का परीक्षण किया जा सकता है और चमकदार perfusate O2के विभिन्न प्रतिशत युक्त गैस मिश्रण के साथ, उदा, २१% हे२, १०% हे२, ५% हे२ , और 0% O2, 5% कं2 और शेष N2३३,३४,३५के साथ । मोटा दीवारों, जहां पोत दीवार के केंद्र में ऑक्सीजन के प्रसार के साथ बड़ा धमनियों के लिए एक सीमा हो सकती है, ऑक्सीजन का एक उच्च प्रतिशत, जैसे, ९५% हे2 इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  6. पोत चैंबर में तापमान बारीकी से निगरानी, व्यक्तिगत मंडलों के रूप में अपनी गर्मी हस्तांतरण विशेषताओं में भिंन हो सकते हैं ।
    नोट: cannulated प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया कई व्यावसायिक रूप से तैयार पोत कक्षों एक गैस equilibrated जलाशय से oxygenated PSS देने और स्नान के तापमान और ऑक्सीजन की बहुत सटीक नियंत्रण प्रदान करने के लिए एक सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग PSS ।
  7. एक बड़ी (2 एल) Mariotte बोतल में pss प्लेस, एक डाट और सेंट्रल ग्लास ट्यूब के साथ लगातार pss वितरित करने के लिए एक जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए कि तपता है और गैस-equilibrates पोत चैंबर (आंकड़ा 1a) में बह ।
  8. अंग स्नान में pss के शीर्ष के रूप में एक ही स्तर पर Mariotte बोतल में केंद्रीय ग्लास ट्यूब के उद्घाटन प्लेस, अंग स्नान में pss की डिलीवरी के लिए एक निरंतर हीड्रास्टाटिक दबाव सिर बनाए रखने के लिए । Mariotte बोतल से PSS को अंग स्नान में वितरित करने के लिए एक J-आकार के कांच या प्लास्टिक ट्यूब से जुड़े पॉलीथीन टयूबिंग का प्रयोग करें ।
  9. चमकदार छिड़काव के लिए (चित्र 1a), पॉलीथीन टयूबिंग का उपयोग करने के लिए एक PSS एक ६० सीसी प्लास्टिक सिरिंज की रचना की एक स्थिति है कि वांछित प्रवाह दबाव (आमतौर पर ८० mmHg के अध्ययन के लिए ऊपर उठाया एक पिपेट जलाशय से कनेक्ट करने के लिए चूहा सेरेब्रल धमनियों), के रूप में एक दबाव transducer प्रणाली से जुड़ा एक टोंटी के माध्यम से मापा ।
  10. एक पॉलीथीन ट्यूब के लिए बहिर्वाह पिपेट कनेक्ट करने के लिए PSS एक दबाव ढाल के जवाब में पोत के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति है, और एक बहिर्वाह जलाशय के समान जलाशय को बहिर्वाह लाइन कनेक्ट । एक समान टोंटी और दबाव transducer कनेक्शन का उपयोग करने के लिए बहिर्वाह दबाव उपाय ।
    नोट: transmural दबाव स्थापित करने और पोत के माध्यम से प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए प्रक्रियाओं के नीचे खंड 2 में वर्णित हैं ।
  11. प्रयोग के अंत में, अच्छी तरह से कक्ष, वितरण लाइनों कुल्ला, और जलाशय प्रणालियों आसुत जल के साथ । अक्सर अंतराल पर, टयूबिंग और वितरण लाइनों की जगह, साफ या प्रणाली में stopcocks की जगह है, और समय पर एक एसिड धोने के लिए किसी भी गिलास PSS जलाशयों विषय बैक्टीरिया और अंय सूक्ष्मजीवों के विकास को रोकने के लिए कि संक्रमण का कारण है और पोत जेट को प्रभावित ।

2. Cannulated धमनी की तैयारी

  1. 5% isoflurane के साथ एक Sprague-Dawley चूहा Anesthetize और 1.5-2.5% मेडिकल ग्रेड ऑक्सीजन३६का उपयोग संज्ञाहरण बनाए रखने । वैकल्पिक रूप से, एक इंट्रामस्क्युलर ketamine युक्त इंजेक्शन प्रशासन (७५.० मिलीग्राम/किग्रा), acepromazine (२.५ मिलीग्राम/किग्रा), और xylazine (१०.० मिलीग्राम/ pentobarbital का एक intraperitoneal इंजेक्शन (50-60 मिलीग्राम/ या संज्ञाहरण के किसी भी अन्य अनुमोदित विधि प्रोटोकॉल और/या अन्वेषक वरीयताओं पर निर्भर करता है.
  2. गहरी संज्ञाहरण के तहत चूहे Decapitate और मस्तिष्क प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन के लिए दिमाग को हटा दें ।
  3. मस्तिष्क को हटाने के बाद, ध्यान से मध्य मस्तिष्क धमनी (एमसीए) को अलग (या ब्याज की अन्य धमनियों, उदा, basilar धमनी या पीछे मस्तिष्क धमनी)३७,३८. MCAs को अलग-थलग करने के लिए मस्तिष्क लापरवाह को एक गिलास पेट्री डिश में बर्फ-कोल्ड PSS (figure 2) से भर कर रखें ।
  4. एमसीए को दिमाग से एक्साइज करने के लिए Vannas कैंची और एक Dumont #5 फाइन टिप संदंश का इस्तेमाल करें ।  संदंश का उपयोग कर एमसीए से किसी भी अवशिष्ट मस्तिष्क ऊतक साफ और पहले वर्णित के रूप में PSS युक्त एक तापमान नियंत्रित पोत चैंबर के लिए धमनी हस्तांतरण । ३३ , ३४  .
  5. पोत चैंबर के लिए धमनी हस्तांतरण, धीरे ऐका या पीछे धमनी खंड संचार और ध्यान से यह कक्ष में जगह से उत्पादेड पोत पकड़ ।
    नोट: एमसीए के अलावा, cannulated पोत प्रणाली कंकाल मांसपेशी प्रतिरोध धमनियों३३,३९,४०, mesenteric प्रतिरोध धमनियों सहित छोटे पोत की तैयारी की एक विस्तृत विविधता के लिए उपयुक्त है ३८ , ४१ , ४२, और बड़े (पहला आदेश) cremaster मांसपेशी४३के धमनियों, साथ ही मानव कोरोनरी धमनियों और मानव धमनियों वसा बायोप्सी के दौरान उपचर्म gluteal ऊतक से प्राप्त४४,४५, ४६,४७.
  6. यह पिपेट आधार की ओर खींच कर micropipette को धमनी में संलग्न करें जब तक कि एमसीए के लुमेन में प्रगति टिप । पहले धमनी (चित्र 1b) के आसपास 10-0 टांके से छेड़ा एक एकल किनारा फाइबर से तैयार एक पाश बांधने से बहिर्वाह पिपेट पर धमनी सुरक्षित. पोत के चारों ओर एक दूसरे सीवन पाश कस द्वारा बहिर्वाह पिपेट के लिए एमसीए के विपरीत अंत सुरक्षित (आंकड़ा 1b) ।
    नोट: पोत बढ़ते और उंहें अनुलग्नक के अंतिम बिंदु के करीब की स्थिति से पहले micropipettes पर सीवन छोरों प्लेस, उंहें आसानी से धमनी पर फिसल गया और जल्दी से सुरक्षित जब पोत की स्थिति में है, जो जोखिम को कम करने की अनुमति पिपेट बंद धमनी फिसलने ।
    नोट: Micropipettes borosilicate ग्लास केशिका ट्यूबिंग (2 मिमी बाहरी व्यास; 1 मिमी भीतरी व्यास; 10 सेमी लंबे) एक ऊर्ध्वाधर micropipette खींचने का उपयोग कर से तैयार कर रहे हैं । पहले धमनी संलग्न करने के लिए, micropipettes के टिप व्यास मैच के रूप में निकटता के रूप में संभव के रूप में और छिड़काव प्रणाली में बहिर्वाह प्रतिरोध के बेमेल को रोकने के लिए ।
  7. धमनी के micropipettes से सुरक्षित रूप से बंधा होने के बाद धमनी को अपनी सीटू की लम्बाई में फैलाने के लिए बहिर्वाह पिपेट धारक से जुड़े माइक्रोमीटर का प्रयोग करें ।
  8. एक किस्में 10-0 टांके से छेड़ा क्रम में धमनी में लगातार दबाव बनाए रखने के साथ सभी पक्ष शाखाओं से टाई ।
  9. intraluminal (transmural) दबाव अस्थाई रूप से प्रवाह पिपेट को बंद करने के बाद स्थिर रहता है कि सुनिश्चित करके लीक के अभाव की जांच करें । किसी भी शाखाओं से टाई या पोत में छेद के लिए जांच अगर दबाव पड़ता है । छिड़काव को पुनर्स्थापित करने के बाद सत्यापित करें कि transmural दबाव निरंतर रहता है ।
    नोट: पृथक प्रतिरोध धमनियों के Cannulation मैनुअल निपुणता और अभ्यास की आवश्यकता है । मनाया जा करने के लिए मुख्य सावधानियों पिपेट तोड़ने से बचने और धमनी बंद पिपेट स्लाइड नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए कर रहे हैं । यह पूरी प्रक्रिया में अलग धमनियों के साथ कोमल होना महत्वपूर्ण है, के रूप में पोत को आघात endothelium और/या संवहनी चिकनी मांसपेशी के सामांय समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते है नुकसान ।
  10. एक वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप (चित्र 1a) एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप से जुड़ी एक वीडियो कैमरा से मिलकर और एक वीडियो माइक्रोमीटर और टेलीविजन मॉनिटर (आंकड़े 1b, 1C) से जुड़े का उपयोग कर धमनी के आंतरिक व्यास को मापने । यह पर्यवेक्षक के भीतर की दीवार पर चल संदर्भ लाइनें रखकर स्वयं पोत व्यास को मापने के लिए अनुमति देता है और, अगर वांछित, धमनी की बाहरी दीवार पर के रूप में अच्छी तरह से, क्रम में पोत दीवार मोटाई को मापने के लिए ।
    नोट: कुछ वीडियो micrometers पोत आयामों की स्वचालित ट्रैकिंग की पेशकश करते हैं ।
    नोट: एक खुर्दबीन स्टेज माइक्रोमीटर और बहिर्वाह के साथ वीडियो माइक्रोमीटर जांचना और बहिर्वाह दबाव ट्रांसड्यूसर एक पारा नापने के साथ (0 mmHg, ५० mmHg, १०० mmHg, १५० mmHg, और २०० mmHg) प्रयोगों के बीच के लिए सही माप का बीमा करने के लिए पोत व्यास और intraluminal दबाव ।
    नोट: चूहा एमसीए प्रयोगों के लिए मानक नियंत्रण transmural दबाव ८० mmHg है । उच्च और निचले दबाव के स्तर के लिए अंशांकन transmural दबाव में परिवर्तन करने के लिए myogenic प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए सटीकता का आश्वासन दिया और निष्क्रिय दबाव-अधिक से अधिक फैली हुई धमनियों में व्यास घटता.
  11. एक निरंतर स्तर पर वांछित transmural दबाव बनाए रखने के लिए बहिर्वाह और बहिर्वाह जलाशयों की ऊंचाई समायोजित करें । एक छोटी सी राशि (< 5 mmHg) द्वारा बहिर्वाह जलाशय को ऊंचा करना और एक ही राशि से बहिर्वाह जलाशय को कम करना मतलब transmural दबाव रखता है और पोत लुमेन में छिड़काव प्रवाह को6बनाता है ।
    नोट: बहिर्वाह जलाशय स्थापना और बराबर मात्रा से बहिर्वाह जलाशय कम एक ही मतलब transmural धमनी में दबाव इरादा रखता है, लेकिन एक हीड्रास्टाटिक दबाव ढाल उत्पंन करता है कि प्रवाह और पोत में कतरनी तनाव का कारण बनता है, की अनुमति जांचकर्ता endothelium-निर्भर प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए intraluminal कतरनी तनाव में विभिन्न प्रायोगिक समूहों में परिवर्तन करने के लिए४८।
  12. vasodilator उत्तेजनाओं के लिए myogenic प्रतिक्रियाओं और पोत प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए, सुनिश्चित करें कि धमनी सक्रिय टोन का एक उपयुक्त स्तर प्रदर्शित करता है (लगभग ४०%) प्रयोग करने से पहले । जहाजों के अपवाद के साथ आराम में सक्रिय टोन कमी किसी भी धमनियों को त्यागें, उदा, छोटे mesenteric धमनियों कि आम तौर पर सक्रिय आराम टोन प्रदर्शित नहीं करते ।
    नोट: जहाजों है कि आम तौर पर सहज टोन प्रदर्शित नहीं करते के लिए, पूर्व एक समकक्ष राशि जैसे norepinephrine या phenylephrine के रूप में एक vasoconstrictor एगोनिस्ट का उपयोग करके धमनियों कसना । एगोनिस्ट की खुराक का चयन करने के लिए पूर्व-कसना धमनी के लिए इस्तेमाल एक अच्छा दृष्टिकोण vasoconstrictor एजेंट की एक चुनाव आयोग५० खुराक का उपयोग करने के लिए है, उदा, norepinephrine४१,४२. हालांकि, औषधीय vasoconstrictor एजेंटों धमनियों कि आराम की स्थिति के तहत सहज सक्रिय टोन प्रदर्शन करने के लिए लागू नहीं किया जाना चाहिए ।
  13. cannulated प्रतिरोध धमनी के endothelium-निर्भर प्रतिक्रिया के लिए जहाज के चैंबर के लिए (10- 10 एम-10-5 एम) की बढ़ती सांद्रता के अलावा पोत व्यास को मापने के द्वारा । परीक्षण endothelium-स्वतंत्र नाइट्रिक ऑक्साइड संवहनी चिकनी मांसपेशी की संवेदनशीलता के अलावा के दौरान पोत व्यास को मापने के द्वारा (10- 10 एम – 10-5 एम) नाइट्रिक ऑक्साइड दाता सोडियम nitroprusside के पोत चैंबर ।
    नोट: vasoconstrictor एजेंटों और अंय vasodilator एगोनिस्ट के लिए संवेदनशीलता पोत चैंबर के लिए एगोनिस्ट की बढ़ती सांद्रता जोड़कर एक समान फैशन में परीक्षण किया जा सकता है ।
    नोट: vasoactive एजेंटों के अलावा, विभिन्न दवाओं, अवरोधकों, और अन्य औषधीय एजेंटों ऊतक स्नान और/या चमकदार perfusate करने के लिए जोड़ा जा सकता है । पीओ2 में परिवर्तन (साथ ही पीसीओ2 और पीएच) चुनिंदा endothelial पक्ष या एक हवा पत्थर के साथ चमकदार perfusate के अलग equilibration द्वारा धमनी के अतिरिक्त चमकदार पक्ष के लिए प्रशासित किया जा सकता है एक नपे गैस मिश्रण से जुड़े ऊतक स्नान३३,३४,४९में PSS equilibrate करने के लिए इस्तेमाल मिश्रण से अलग है । Myogenic प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन करने के लिए transmural दबाव बहिर्वाह पिपेट बंद करके अध्ययन किया जा सकता है और स्थापना (या कम करने) PSS जलाशय से जुड़े की ऊंचाई बहिर्वाह पिपेट४९,५०,५१ करने के लिए intraluminal दबाव बढ़ाएं या घटाएं ।
  14. विशिष्ट उत्तेजनाओं के लिए पोत प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता में endothelium की भूमिका का परीक्षण करने के लिए, संवहनी endothelium को हटाने और endothelium की उपस्थिति या अनुपस्थिति में उन उत्तेजनाओं के लिए पोत प्रतिक्रियाओं की तुलना. endothelium को दूर करने के लिए, ध्यान से धमनी को बहिर्वाह पिपेट से खोल और धीरे से एक एयर बोल्स (0.5-1.0 एमएल) के साथ धमनियों के लुमेन perfuse । एयर छिड़काव के बाद, PSS छिड़काव पुनर्स्थापित करने से पहले सेलुलर मलबे स्पष्ट करने के लिए बहिर्वाह पिपेट४३के लिए पोत बांधना ।
    नोट: endothelial अनाच्छादन कार्यविधि के बाद, यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि endothelium उस पोत प्रकार में endothelium निर्भर vasodilation का उत्पादन करने के लिए जाना जाता है (आमतौर पर एक एगोनिस्ट) संवहनी प्रतिक्रियाओं का परीक्षण करके हटा दिया जाता है । हालांकि, कुछ रोग स्थितियों में, endothelium-निर्भर vasoconstrictors जारी कर रहे हैं, जो मामले में, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कसना प्रतिक्रिया endothelial हटाने के बाद समाप्त हो गया है ।
  15. प्रयोग के अंत में, perfusate और superfusate के लिए Ca2 +-मुक्त PSS जोड़कर धमनी का अधिकतम व्यास निर्धारित करें । सक्रिय आराम टोन की गणना (%) ((डीमैक्स-डीरेस्ट)/Dमैक्स) x १००, जहां डीमैक्स Ca2 +मुक्त समाधान और डीआराम की उपस्थिति में अधिकतम व्यास है आराम नियंत्रण व्यास है ।
    नोट: विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों में अधिक से अधिक आराम धमनियों के व्यास माप सक्रिय आराम टोन की तुलना में मूल्यवान हैं, स्ट्रक्चर रिमॉडलिंग (यानी, दीवार मोटाई और लुमेन व्यास में परिवर्तन), और निष्क्रिय यांत्रिक गुण (तनाव transmural दबाव के विभिंन स्तरों पर निष्क्रिय व्यास से गणना संबंधों) ।

3. एलडीएफ के साथ सेरेब्रल रक्त प्रवाह प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन

  1. Anesthetize 5% isoflurane के साथ पशु और एक stereotaxic उपकरण9,10में चूहे को सुरक्षित ।
  2. लगातार संज्ञाहरण के तहत पशु को बनाए रखने जबकि निगरानी श्वास आवृत्ति, अंत ज्वारा सह2, और एक पैर की अंगुली चुटकी३६के साथ संज्ञाहरण की गहराई ।
  3. ध्यान से एक कम गति दंत ड्रिल और खनिज तेल का उपयोग करने के लिए ऑप्टिकल युग्मन10प्रदान translucency खोपड़ी पतली । अत्यधिक गर्मी पैदा करने से बचने के लिए और हड्डी मर्मज्ञ से बचने के लिए सावधानी बरतें ।
    नोट: खोपड़ी के thinning लेजर प्रकाश अंतर्निहित ऊतक तक पहुँचने के लिए और जांच करने के लिए वापस परिलक्षित हो क्रम में डॉपलर शिफ्ट को मापने के लिए अनुमति देता है, जो की भयावह कणों (यानीजाने की संख्या द्वारा निर्धारित किया जाता है, लाल रक्त कोशिकाओं) और उनके वेग ।
  4. एक micromanipulator में एलडीएफ जांच को सुरक्षित और यह खोपड़ी के पतले क्षेत्र पर सीधे स्थिति । प्रयोग के दौरान, यह बहुत महत्वपूर्ण है या तो एलडीएफ जांच या तैयारी ही के आंदोलन को रोकने के लिए, के रूप में एलडीएफ ऊतक के एक प्रतिबंधित क्षेत्र में प्रवाह को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है और बहुत गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है ।
    नोट: जांच के किसी भी आंदोलन के प्रारंभिक स्थिति से दूर ऊतक, precluding तुलना के एक अलग क्षेत्र में रक्त के प्रवाह का एक अनुमान प्रदान करेगा । जबकि एलडीएफ निरपेक्ष प्रवाह मूल्यों प्रदान नहीं करता है और विषयों के बीच तुलना के लिए उपयुक्त नहीं है, यह एक शानदार तरीका है इनवेसिव ऊतक छिड़काव में परिवर्तन व्यक्तिगत विषयों में प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के जवाब में मूल्यांकन करने के लिए है; और नियंत्रण मूल्यों से एलडीएफ संकेत में सापेक्ष परिवर्तन और औसत किया जा सकता है अंय प्रयोगात्मक समूहों में नियंत्रण से एलडीएफ संकेत में परिवर्तन की तुलना में ।
    नोट: एलडीएफ एक सुविधाजनक दृष्टिकोण के लिए विभिंन प्रायोगिक समूहों8,9,10में पूरे संवहनी बिस्तर के स्तर पर रक्त के प्रवाह को विनियमित कारकों में अंतर्दृष्टि हासिल है । एलडीएफ के साथ ऊतक छिड़काव का मूल्यांकन एक व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रदान करता है ज्ञान को आत्मसात एक पूरे बिस्तर परिप्रेक्ष्य में पृथक पोत अध्ययन से प्राप्त की । प्रतिरोध धमनियों और microcirculation के बीच संवहनी नियंत्रण तंत्र में क्षेत्रीय मतभेदों को छोड़कर, एलडीएफ के साथ प्राप्त की माप ऊतक रक्त प्रवाह नियंत्रण का एक अच्छा संकेत है कि आम तौर पर के साथ प्राप्त परिणामों के साथ संगत है प्रदान cannulated धमनी की तैयारी ।

4. GS1 लेक्टिन के साथ कंकाल की मांसपेशी Microvessel घनत्व का मूल्यांकन

  1. मानक ठीक शल्य कैंची के साथ खुला अंडकोश की थैली काटने के द्वारा एक पुरुष चूहे से cremaster मांसपेशी निकालें और फिर एक Dumont #5 संदंश का उपयोग करने के लिए मांसपेशियों को समझ ।
    नोट: पतली मांसपेशियों (जैसे, cremaster मांसपेशी, साथ ही प्रसारक digitorum लंग्स और tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों कि दोनों पुरुष और मादा चूहों में पाए जाते हैं) आदर्श के रूप में उपयोग के लिए अनुकूल है पूरे लेक्टिन अध्ययन के लिए mounts, हालांकि ऊतकीय वर्गों मोटा ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  2. एक ही कट का उपयोग कर अंडकोष से cremaster मांसपेशी निकालें । यह बर्फ ठंडा PSS में प्लेस और एक पेट्री डिश में एक सिलिकॉन elastomer सतह के अंदर तल पर अस्तर के साथ बाहर पिन । धीरे Dumont #5 संदंश का उपयोग कर संयोजी ऊतक चिढ़ाते हैं ।
  3. बफर pss के 2 मिलीलीटर के साथ मांसपेशियों के नमूनों कुल्ला और फिर उंहें rhodamine में विसर्जित-GS1 लेक्टिन (20 µ g/एमएल PSS) ५० मिनट के लिए एक 12-well सेल संस्कृति प्लेट में 2 मिलीलीटर के साथ/अच्छी तरह से है कि एल्यूमीनियम पंनी में लपेटा है प्रकाश को बाहर करने के लिए ।
  4. लेक्टिन समाधान से ऊतकों को दूर, एक घुमाव पर 5 मिनट "धो" गर्मी के साथ PSS में उन्हें तीन बार कुल्ला, और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उन्हें माउंट. करने के लिए अंधेरे में ऊतकों को गर्मी और अंधेरे में स्लाइड स्टोर करने के लिए प्रतिदीप्ति के नुकसान को रोकने के लिए सुनिश्चित करें ।
    नोट: यदि स्लाइडों का तुरंत उपयोग नहीं किया जा सकता है, तो उन्हें प्रतिदीप्ति का कोई नुकसान न हो इसके साथ फ्रिज में रखा जा सकता है । लंबे समय तक भंडारण के लिए, स्लाइड एक फ्रीजर में गिरावट को रोकने के लिए रखा जा सकता है11।
  5. कंप्यूटर द्वारा जेनरेट की गई ग्रिड लाइनों के साथ लेबल किए गए microvessels के चौराहों की संख्या की गणना करके microvessel घनत्व का मूल्यांकन करें, छवि५२पर आरोपित, या स्लाइड देखने के लिए उपयोग की जा रही मॉनीटर पर आरोपित एक स्पष्ट ग्रिड ओवरले के साथ ।
    नोट: GS1 लेक्टिन दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है: नमक-प्रेरित microvascular rarefaction५३, नमक में एन्जियोटेन्सिन घनत्व बहाल करने में प्रेरित microvessel द्वितीय दमन को रोकने के सुरक्षात्मक प्रभाव-पशु खिलाया17 ,५३,५४; नमक में microvessel rarefaction को रोकने के लिए कम खुराक एन्जियोटेन्सिन द्वितीय अर्क के सुरक्षात्मक प्रभाव मध्यस्थता NRF2 की भूमिका17-चूहों खिलाया; और भी नमक खिलाया चूहों५४,५५में पुरानी मांसपेशी उत्तेजना को angiogenic प्रतिक्रियाओं को बनाए रखने में एन्जियोटेन्सिन द्वितीय की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए । GS1 लेक्टिन तकनीक का एक फायदा यह है कि यह cannulated प्रतिरोधक धमनियों या एलडीएफ के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए गए एक ही जानवरों में microvessel घनत्व का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

इन विट्रो में cannulated प्रतिरोध धमनियों की माइक्रोस्कोपी छोटे प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय टोन को प्रभावित करने वाले कारकों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है (और बड़ा धमनियों) vivo transmural दबाव में सामान्य पर और parenchymal सेल के अभाव में प्रभावों. विभिन्न vasodilator और vasoconstrictor उत्तेजनाओं और myogenic प्रतिक्रियाओं को सामान्य PSS में transmural दबाव उन्नयन के लिए जहाजों की प्रतिक्रिया का आकलन करने के अलावा, Ca2 +-मुक्त PSS perfusate और superfusate के अंत में जोड़ा जा सकता है प्रयोग अधिकतम पोत व्यास और दीवार मोटाई निर्धारित करने के लिए । बाद माप संवहनी remodeling का आकलन करने में अत्यधिक मूल्यवान हैं, यानी, दीवार/लुमेन अनुपात है कि रक्तचाप या औषधीय एजेंटों के प्रशासन में परिवर्तन के जवाब में हो सकता है में परिवर्तन । सीए में अधिक से अधिक फैली हुई जहाजों के व्यास की माप2 +-मुक्त PSS आंतरिक टोन की गणना करने के लिए उपयोगी होते हैं ((डीमैक्स-डीरेस्ट)/Dमैक्स) x १००, जहां dmax और dबाकी अधिकतम है (Ca2 +- मुक्त pss) और विश्राम व्यास (pss), क्रमशः नियंत्रण equilibration दबाव में (आमतौर पर ८० mmHg एमसीए के लिए) । हमारे अनुभव में, ४०% के आसपास एमसीए औसत में सक्रिय टोन ८० mmHg के एक transmural दबाव में । अधिक से अधिक फैली हुई धमनियों के व्यास को मापने भी transmural के विभिन्न स्तरों पर धमनियों के व्यास को मापने के द्वारा जहाजों के निष्क्रिय यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका है दबाव और परिणामों का उपयोग करने के लिए तनाव और जहाजों के अन्य यांत्रिक गुणों7,५६के दबाव से रिश्तों की गणना.

चित्रा 3 तीन संकुचित congenic एस. 13बीएन चूहा अतिरिक्त चयनात्मक प्रजनन दृष्टिकोण का उपयोग से व्युत्पंन उपभेदों के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है । इन चूहे उपभेदों में, गुणसूत्र खंडों या तो भूरे रंग नॉर्वे रेनिन एलील (Ren1-बीएन) या बस (Ren1-SSA) के ऊपर या बस के नीचे (Ren1-एसएसबी) रेनिन जीन लोकस (इस प्रकार एसएस रेनिन एलील को बनाए रखने) काट रहे है शामिल हैं । उस अध्ययन में29, भूरे रंग नॉर्वे रेनिन एलील युक्त गुणसूत्र खंड केवल 25 जीन समाहित ।

चित्रा 4 पुरुष Dahl एसएस चूहों से पृथक MCAs में endothelium-निर्भर vasodilator (1 µ एम) के लिए प्रतिक्रिया दिखाता है और तीन संकुचित congenic उपभेदों चित्रा 3में दिखाया गया है । इन तीन congenic उपभेदों के संयुक्त उपयोग कि या तो शामिल है (Ren1-बीएन) या काट रहे है बस के ऊपर (Ren1-SSA) या नीचे (Ren1-एसएसबी) रेनिन जीन सीमित ब्याज के क्षेत्र (यानी, रेनिन जीन लोकस आसपास के क्षेत्र में) लगभग 25 जीन के लिए । उन प्रयोगों में जानवरों को normotensive गया और कम नमक (०.४% NaCl) आहार खिलाया गया । उस अध्ययन में29 endothelium-पर निर्भर फैलाव के लिए एसएस माता पिता के तनाव और दोनों congenic एसएस रेनिन एलील को बनाए रखने उपभेदों में अनुपस्थित था, लेकिन congenic एसएस आनुवंशिक पृष्ठभूमि में बीएन रेनिन एलील ले जाने के तनाव में बहाल किया गया था । कि अध्ययन के परिणामों के पहले एसएस 13बीएन consomic चूहों५७,५८ का उपयोग अध्ययन के निष्कर्षों का समर्थन किया और मजबूत सबूत है कि endothelial शिथिलता एसएस चूहों में मौजूद है, यहां तक कि जब वे normotensive है प्रदान की है और एक कम नमक आहार खिलाया । एक साथ ले लिया, उन अध्ययन29के परिणाम,५७,५८ परिकल्पना का समर्थन है कि एसएस चूहों में endothelial शिथिलता रेनिन जीन के बिगड़ा विनियमन के कारण है, पुराने जोखिम में कम करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप रक्त में एन्जियोटेन्सिन द्वितीय का स्तर ।

एक अंय अध्ययन५९, चित्रा 5में संक्षेप में, endothelium-निर्भर vasodilator के जवाब की तुलना में अलग MCAs (एमसीए) में पुरुष Dahl एसएस चूहों और ss. 5 सेबीएन consomic 5 गुणसूत्र ले चूहों (भूरे रंग नॉर्वे जीन युक्त cytochrome P450-4a ω-hydroxylase) के विभिंन isoforms के लिए । उस अध्ययन में, पशुओं या तो एक कम नमक (०.४% NaCl) या उच्च नमक (4% NaCl) आहार खिलाया गया । एसएस चूहों से एमसीए के विपरीत, endothelium आश्रित फैलाव के लिए एसएस. 5बीएन consomic चूहों फेड कम नमक आहार से एमसीए में बनाए रखा गया था । इसके अलावा, (और एसएस .13 से परिणाम के विपरीतबीएन consomic चूहों५७,५८, Sprague-Dawley चूहों३३,३९,४०,६०, और गोल्डन हंसटर ६१), एक उच्च नमक आहार को समाप्त करने में विफल रहा है, एस 5बीएन चूहों में एक-प्रेरित फैलाव को खत्म करने का संकेत है कि CYP450-4a ω hydroxylase और 20-hydroxyeicosatetraenoic एसिड (20-िेते) संवहनी ऑक्सीडेंट तनाव और endothelial के लिए महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं एसएस चूहों में शिथिलता और अन्य उपभेदों में आहार नमक के सेवन में उंनयन के दौरान । एक प्रयोगात्मक परिप्रेक्ष्य से, उच्च नमक आहार की विफलता के लिए endothelium निर्भर फैलाव को खत्म करने के लिए है cannulated प्रतिरोध धमनियों का कैसे अध्ययन अप्रत्याशित निष्कर्ष है कि पारंपरिक ज्ञान से विदा का उत्पादन कर सकते है का एक उदाहरण प्रदान करता है और जटिल नियंत्रण इन महत्वपूर्ण जहाजों के समारोह को प्रभावित तंत्र की एक नई समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।

चित्रा 6 अलग एमसीए की प्रतिक्रिया से पता चलता है (1 µ m) जंगली प्रकार और Nrf2 में(-/ पीटकर चूहों एक कम नमक आहार खिलाया (०.४% NaCl), उच्च नमक आहार (4% NaCl), या एक उच्च नमक एक ज्ञात Nrf2 उत्प्रेरक से युक्त आहार30,६२ . नमक-प्रेरित oxidative तनाव के अभाव में, एक प्रकार का Nrf2-प्रेरित फैलाव वाइल्ड टाइप से एमसीए में इसी तरह की थी और (-/ Sprague-Dawley चूहों के पहले के अध्ययनों के परिणामों के अनुरूप, उच्च लवण आहार जंगली प्रकार में और Nrf2 में-प्रेरित फैलाव का सफाया (-/ पीटकर चूहों । उच्च नमक आहार के लिए NRF2 उत्प्रेरण के अलावा endothelium-निर्भर फैलाव करने के लिए जंगली प्रकार के चूहों में, लेकिन नहीं NRF2 में(-/ चूहों, नॉकआउट चूहों में NRF2 जीन के सफल उंमूलन का प्रदर्शन में नहीं, और NRF2 के उपयोग का समर्थन एक चिकित्सीय दृष्टिकोण संवहनी oxidative तनाव उंनति के रूप में नियामकों ।

चित्रा 7 एलडीएफ के परिणाम pial microcirculation की प्रतिक्रियाओं की तुलना धमनी रक्तचाप में उत्तरोत्तर कटौती करने के लिए Sprague-Dawley चूहों में क्रमिक रक्त मात्रा निकासी द्वारा उत्पादित या तो पर बनाए रखा संक्षेप एक सामान्य नमक (०.४% NaCl) आहार या चार सप्ताह के लिए एक उच्च नमक (4% NaCl) आहार । चूहों के विपरीत एक कम नमक आहार खिलाया, चूहों उच्च नमक आहार एक बिगड़ा छिड़काव दबाव में कटौती के दौरान एक निरंतर रक्त प्रवाह को बनाए रखने की क्षमता का प्रदर्शन खिलाया, यह दर्शाता है कि तंत्र मस्तिष्क रक्त प्रवाह को विनियमित करने के लिए जिंमेदार है एक उच्च नमक आहार के लिए दीर्घकालिक जोखिम से समझौता । उन प्रयोगों के परिणाम नमक की अलग मस्तिष्क धमनियों में बिगड़ा संवहनी विश्राम तंत्र की उपस्थिति के साथ संगत कर रहे हैं६० और कैसे एलडीएफ माप का समर्थन और विस्तार करने के लिए नियोजित किया जा सकता का एक अच्छा उदाहरण प्रदान अध्ययन के निष्कर्षों पूरे संवहनी बिस्तर के स्तर पर अलग प्रतिरोध धमनियों को रोजगार ।

प्रतिरोध धमनी समारोह का मूल्यांकन करने के अलावा अलग धमनियों और ऊतक छिड़काव लेजर डॉपलर flowmetry, microvessel घनत्व और जीर्ण मांसपेशी उत्तेजना५४के रूप में विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए angiogenic प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर का उपयोग कर, ५५ एक ही फ्लोरोसेंट का उपयोग जानवरों में मूल्यांकन किया जा सकता है-लेबल GS1 लेक्टिन, जो चुनिंदा धमनियों और केशिकाओं के तहखाने झिल्ली में ग्लाइकोप्रोटीन moieties को बांध । चित्रा 8 Sprague के cremaster मांसपेशी में विशिष्ट लेक्टिन धुंधला-Dawley चूहों से पता चलता है एक कम नमक आहार या उच्च नमक आहार 2 सप्ताह के लिए खिलाया (उच्च नमक खिलाया चूहों में microvessels के निचले घनत्व ध्यान दें) । Microvessel घनत्व लेक्टिन-लेबल microvessels के चौराहों की गिनती द्वारा एक कंप्यूटर जनित संदर्भ ग्रिड५२के साथ मूल्यांकन किया है, और एक उत्कृष्ट विधि angiogenic प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान करता है५४,५५ या करने के लिए का पता लगाने और उच्च रक्तचाप और ऊंचा आहार नमक का सेवन12,17,५३के रूप में की स्थिति में microvessels की हानि को बढ़ाता है ।

Figure 1
चित्र 1: इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोपी सेटअप में अलग अध्ययन करने के लिए कार्यरत, cannulated प्रतिरोध धमनियों (ए). Cannulated प्रतिरोध धमनी ग्लास से बंधा micropipettes (ख) और वीडियो माइक्रोमीटर प्रदर्शन Cannulated प्रतिरोध धमनी (सी) में लुमेन व्यास की माप दिखा । पैनल बी में स्केल बार cannulated धमनी (µm) के आंतरिक व्यास का प्रतिनिधित्व करता है, और १२५ µm पैनल सी में जंगम संदर्भ लाइनों के बीच की दूरी के वीडियो प्रदर्शन है की धमनियों की भीतरी दीवारों पर मैन्युअल रूप से रखा प्रयोग प्रेक्षक द्वारा . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: मस्तिष्क से मध्य मस्तिष्क धमनी को अलग करने और micropipettes के साथ cannulation के लिए तैयार करने के लिए प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: संकुचित congenic चूहे की योजनाबद्ध आरेख ब्राउन नार्वे गुणसूत्र 13 introgressed के छोटे खंडों Dahl नमक संवेदनशील आनुवंशिक पृष्ठभूमि में होने । गुणसूत्र खंड या तो ब्राउन नॉर्वे रेनिन एलील (Ren1-बीएन) या बस के ऊपर (Ren1-SSA) या बस के नीचे काट रहे है (Ren1-एसएसबी) रेनिन जीन लोकस और इस तरह एसएस रेनिन एलील बनाए रखने शामिल हैं । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और डूरंड एट अल से पुनर्मुद्रित । अमेरिकी शारीरिक सोसायटी की अनुमति के साथ 29 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: पृथक की प्रतिक्रिया, SS चूहों और congenic चूहा उपभेदों के cannulated MCAs ( चित्रा 2में सचित्र) 1 µ एम acetylcholine । डेटा acetylcholine से पहले नियंत्रण व्यास आराम से व्यास परिवर्तन (Δ µm) ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और डूरंड एट अल द्वारा एक मूल अध्ययन से फिर से रची गई हैं । 29 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: पृथक की प्रतिक्रिया, एसएस चूहों और ss .5 के cannulated MCAsबीएन consomic चूहों में 1 µ m acetylcholine को खिलाया कम नमक (०.४% NaCl) या उच्च नमक (4% NaCl) आहार. डेटा acetylcholine से पहले नियंत्रण व्यास आराम से व्यास परिवर्तन (Δ µm) ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, और Lukaszewicz एट अल द्वारा एक मूल अध्ययन से फिर से रची गई हैं । ६४ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: उत्तर में 1 µ m acetylcholine में पृथक, cannulated MCAs के Nrf2(-/-) पीटा चूहों और जंगली प्रकार नियंत्रण फेड कम नमक आहार (०.४% NaCl), उच्च नमक आहार (4% NaCl), या उच्च नमक एक ज्ञात Nrf2 उत्प्रेरक30युक्त आहार, ६२. डेटा acetylcholine से पहले नियंत्रण व्यास आराम से व्यास परिवर्तन (Δ µm) ± SEM मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7: मस्तिष्क रक्त pial microcirculation में एलडीएफ द्वारा मूल्यांकन प्रवाह । Sprague-Dawley चूहों चार सप्ताह के लिए एक उच्च नमक आहार पर बनाए रखा अपनी क्षमता में रक्त के प्रवाह को बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण हानि का प्रदर्शन के रूप में धमनी का रक्तचाप लगातार रक्त मात्रा निकासी के जवाब में कम किया गया था । डेटा एक ही मतलब धमनी दबाव पर नियंत्रण ± SEM * p < 0.05 बनाम कम नमक आहार का प्रतिशत मतलब के रूप में रची जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8: लेक्टिन घनत्व के आकलन के लिए धमनियों और केशिकाओं की पहचान के लिए rhodamine-लेबल GS1 microvessel के साथ लेबल किए गए चूहे cremaster की मांसपेशियों की Micrograph । Cremaster मांसपेशियों Sprague-Dawley चूहों फेड कम नमक से प्राप्त किया गया (ls; ०.४% NaCl) या उच्च नमक (एच एस: 4% NaCl) आहार 2 सप्ताह के लिए, और एलएस नियंत्रण की तुलना में एच एस खिलाया जानवरों में microvascular rarefaction प्रदर्शन । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

के रूप में परिचय में उल्लेख किया है, इस कागज टीवी माइक्रोस्कोपी और पृथक प्रतिरोध धमनी का उपयोग करने के लिए मानक चूहे मॉडल में ही नहीं संवहनी समारोह का मूल्यांकन दृष्टिकोण का वर्णन (के रूप में वीडियो में कार्यरत), लेकिन यह भी अत्यधिक विशेष आनुवंशिक रूप में इंजीनियर चूहे उपभेदों, जो उपंयास और शक्तिशाली अंतर्दृष्टि है कि इन तरीकों का उपयोग प्राप्त किया जा सकता है दिखाओ । इन शक्तिशाली तकनीकों का उपयोग करने के लिए सक्रिय टोन और छोटे प्रतिरोध धमनियों के निष्क्रिय यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन महत्वपूर्ण endothelium-निर्भर विनियमन सहित संवहनी नियंत्रण तंत्र की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते है प्रतिरोध धमनियों में सक्रिय टोन के, सामान्य और pathophysiological शर्तों के तहत संवहनी चिकनी मांसपेशी समारोह, और संवहनी remodeling और संवहनी दीवार यांत्रिकी में परिवर्तन करने के लिए संबंधित धमनियों के निष्क्रिय गुण । Endothelial शिथिलता हृदय से संबंधित मृत्यु६३सहित मानव में एकाधिक प्रतिकूल हृदय की घटनाओं के एक शक्तिशाली शकुन संकेतक होना दिखाया गया है, और cannulated प्रतिरोध धमनी की तैयारी में विशेष रूप से मूल्यवान हैं endothelial शिथिलता का पता लगाने और endothelial शिथिलता के तंत्र की हमारी समझ में वृद्धि.

इन विट्रो वीडियो सूक्ष्म तकनीक अलग प्रतिरोध धमनियों को रोजगार के प्रभाव को समझाने के लिए, हम Dahl नमक संवेदनशील में इन तकनीकों के उपयोग के उदाहरण प्रदान की (एसएस) चूहों और उपंयास consomic चूहा उपभेदों में एक कम प्रदर्शन एसएस माता पिता का तनाव24की तुलना में नमक रक्तचाप की संवेदनशीलता । उन अध्ययनों से जांच संवहनी नियंत्रण दो गुणसूत्रों है कि रक्तचाप और एसएस चूहा में नाड़ी परिवर्तन की संवेदनशीलता नमक में योगदान करने में विशेष रुचि के है पर जीन से संबंधित तंत्र । उन गुणसूत्रों 13 गुणसूत्र हैं, रेनिन जीन18,22,29,५७,५८, और गुणसूत्र 5 ले, CYP450 के isoforms के लिए जीन ले-4a ω-hydroxylase६४ ,६५-एंजाइम कि 20 संश्लेषित करता है-िेते, जो गुर्दे समारोह पर प्रमुख प्रभाव है और संवहनी जेट६६,६७,६८। चूहा आनुवंशिक toolbox के लिए एक और हाल ही में और शक्तिशाली इसके अलावा चूहे जीन नॉकआउट मॉडल सहित उन्नत जीन संपादन तकनीक का उपयोग के विकास है: ZFNs; transcriptional उत्प्रेरक की तरह-effecter nucleases (TALENS), और सबसे हाल ही में CRISPR-Cas913,14,15,16,17। इन विट्रो वीडियो माइक्रोस्कोपी में एक Nrf2 से अलग MCAs अध्ययन करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग (-/ नॉकआउट चूहे मॉडल है कि महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट और सेल सुरक्षात्मक प्रतिलेखन कारक Nrf2 का अभाव है, महत्वपूर्ण प्रदान की गई है और नमक के तंत्र में पहले से अज्ञात अंतर्दृष्टि-एक उच्च रक्तचाप के अभाव में प्रेरित endothelial शिथिलता17। इन विशेष चूहे मॉडल का उपयोग प्रयोगों के विशिष्ट परिणाम पिछले रिपोर्टों की एक संख्या में वर्णित हैं17,29,५७,५८,५९, ६० , ६४ , ६५ .

हालांकि यह स्पष्ट है कि अध्ययन अलग, cannulated प्रतिरोध धमनियों की स्थितियों की एक किस्म के तहत इन महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण जहाजों के समारोह को विनियमित तंत्र को समझने में अत्यंत मूल्यवान हैं, यह बहुत व्यायाम करने के लिए महत्वपूर्ण है सटीक और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए सावधानियों की संख्या । जबकि कई अन्य संवहनी बिस्तरों के मस्तिष्क धमनियों और प्रतिरोध धमनियों आंतरिक टोन प्रदर्शन, कुछ धमनियों (विशेष रूप से mesenteric प्रतिरोध धमनियों) के लिए प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के क्रम में norepinephrine के रूप में vasoconstrictors के साथ पूर्व अनुबंधित होना चाहिए vasodilator उत्तेजनाओं, और अधिक सही vivo स्थितियों में अनुकरण करने के लिए, जहां जहाजों एड्रीनर्जिक तंत्रिका टर्मिनलों से जारी norepinephrine के रूप में तंत्रिका और विनोदी vasoconstrictor उत्तेजनाओं, के प्रभाव में हैं । जैसे, यह अध्ययन किया जा करने के लिए धमनियों के बुनियादी गुणों से परिचित होना महत्वपूर्ण है, या तो साहित्य से या सावधानीपूर्वक किए गए प्रारंभिक प्रयोगों से. क्योंकि endothelium बड़ी धमनियों, छोटी धमनियों, और microcirculation में धमनियों को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, यह अलगाव और धमनी की cannulation के दौरान endothelium को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए सावधानी व्यायाम करने के लिए आवश्यक है । endothelium अखंडता के लिए क्लासिक परीक्षण प्रदर्शन है कि के लिए पोत फैलाव का कारण बनता है । एक चेतावनी यह है कि, oxidative तनाव की शर्तों के तहत, पोत endothelium बरकरार हो सकता है, लेकिन vasodilatation से कम है, क्योंकि सुपरऑक्साइड के अत्यधिक स्तर नाइट्रिक ऑक्साइड vasodilator प्रतिक्रिया को रोकने के लिए सफाई से अधिक है । उन मामलों में, endothelial अखंडता एक सुपरऑक्साइड मेहतर की उपस्थिति में इस तरह के tempol के रूप में, जो vasodilation और अंय endothelium-निर्भर vasodilator उत्तेजनाओं के जवाब में बहाल करना चाहिए के रूप में इस प्रकार के पीटीएच आवेदन दोहरा द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । इसके अलावा, रोग की स्थिति की एक संख्या में, endothelium पदार्थ है कि संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं और धमनी की कसना के संकुचन का कारण जारी कर सकते हैं; और कुछ मामलों में, endothelium-निर्भर फैलाव (या कसना) अन्य पदार्थों जैसे साइक्लोऑक्सीजिनेज चयापचयों, H2O2, epoxygenase चयापचयों, आदिके माध्यम से मध्यस्थता की जाती है । एक endothelium-निर्भर vasodilator या vasoconstrictor पदार्थ के लिए क्लासिक परीक्षण को प्रदर्शित करना है कि धमनी के फैलाव या कसना endothelial हटाने से समाप्त हो जाता है । अंत में, विभिंन endothelium-निर्भर vasodilator और vasoconstrictor पदार्थ की पहचान आम तौर पर विशिष्ट अवरोधकों या मेहतरों के प्रशासन द्वारा पता लगाया जा सकता है, जैसे एल-नाम नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस को बाधित करने के लिए, indomethacin को बाधित करने के लिए साइक्लोऑक्सीजिनेज चयापचयों के गठन, catalase ज2हे2, thromboxane सिंथेस अवरोधकों, epoxygenase अवरोधकों, और/CYP450-4a/20-िेते मार्ग के विरोधी को सफ़ाई के लिए ।

यह भी महत्वपूर्ण है (और शिक्षाप्रद) perfusing द्वारा प्रयोग के अंत में सक्रिय टोन की मात्रा यों तो और एक Ca2 +मुक्त PSS, या जैसे papaverine के रूप में एक शक्तिशाली vasodilator एजेंट के एक अधिक से अधिक खुराक प्रशासन के साथ धमनी superfusing । एमसीए में सक्रिय आराम टोन के एक ठेठ स्तर, ((डीमैक्स-डीरेस्ट)/Dमैक्स) एक्स १०० के रूप में परिकलित, लगभग ४०% है, जहां डीमैक्स और डीआराम कर रहे हैं अधिकतम (Ca2 +मुक्त PSS) और विश्राम व्यास (pss), क्रमशः नियंत्रण equilibration दबाव में (आमतौर पर एमसीए के लिए ८० mmHg). काफी कम सक्रिय टोन या खंड के कसना या फैलाव दिखा धमनियों के साथ जहाजों विश्लेषण से बाहर रखा गया है, के रूप में उन संकेतों जहाजों को आघात का संकेत कर रहे हैं । सीए में अधिक से अधिक फैली हुई धमनियों के व्यास का माप2 +-नि: शुल्क समाधान भी अन्वेषक धमनी व्यास को मापने और तनाव से दबाव रिश्तों की गणना करके जहाजों के निष्क्रिय यांत्रिक गुणों का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है 7,५६में अधिक से अधिक फैली हुई वाहिकाओं में transmural दबाव में क्रमिक उंनयनकेदौरान । इन निष्क्रिय तनाव संबंधों को आसानी से प्राप्त कर रहे हैं, और जहाजों की यांत्रिक विशेषताओं में किसी भी परिवर्तन का एक मूल्यवान संकेत प्रदान करते हैं ।

पिपेट, connectors की सफाई, और जलाशयों की आपूर्ति टयूबिंग सफल प्रयोगों के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, यह प्रयोग पूरा होने के बाद टयूबिंग से बाहर सभी समाधान फ्लश करने के लिए महत्वपूर्ण है, और कुल्ला और ऊतक स्नान साफ करने के लिए, वितरण टयूबिंग, और सभी जलाशयों की दुकान करने के लिए इस्तेमाल किया, गर्म, और गैस-equilibrate पोत तक पहुंचने से पहले PSS चैंबर. Stopcocks और वाल्व वितरण प्रणाली में भी साफ किया जाना चाहिए और समय पर बदल गया है, के रूप में किसी भी ट्यूबिंग PSS ले जाना चाहिए । दूषित टयूबिंग की एक क्लासिक हस्ताक्षर एक ग्रे मोल्ड और बैक्टीरिया द्वारा उत्पंन धुंध है; और उन परिवर्तनों को बैक्टीरियल संदूषण द्वारा उत्पादित पदार्थों के कारण रक्त वाहिकाओं के सामान्य जेट की हानि के साथ कर रहे हैं । हालांकि, बैक्टीरिया और अन्य सूक्ष्मजीवों द्वारा संदूषण अभी भी किसी भी दिखाई सबूत के अभाव में मौजूद हो सकता है ।

हमें विश्वास है कि वर्तमान कागज के उपयोग के लिए एक उपयोगी उदाहरण प्रदान करता है समय का संमान तकनीक है कि असाधारण अच्छी तरह से कर रहे है सभी महत्वपूर्ण विभिंन संवहनी बिस्तरों के छोटे प्रतिरोध धमनियों के अध्ययन के लिए अनुकूल । जब ऐसे एलडीएफ और microvessel घनत्व के मूल्यांकन के लिए GS1 लेक्टिन विधि के रूप में ऊतक छिड़काव, मूल्यांकन के लिए मानक दृष्टिकोण के साथ संयुक्त, इन विट्रो में cannulated प्रतिरोध धमनियों के वीडियो माइक्रोस्कोपी में अत्यंत मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कारकों है कि नियंत्रण ऊतक छिड़काव और कैसे इन रोग राज्यों में बदला जा सकता है । मानक चूहे मॉडल में संवहनी चिकनी मांसपेशी और endothelial समारोह के मौलिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करने के अलावा, व्यक्तिगत प्रतिरोध धमनियों का अध्ययन करने के लिए वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग अन्य पशु मॉडलों के लिए लागू किया जा सकता है और मानव प्रतिरोध धमनियों । उपंयास आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहे मॉडल के अलग प्रतिरोध धमनियों के वीडियो माइक्रोस्कोपी के आवेदन phenotypic परिवर्तन है कि एक भीड़ का बदल समारोह के जवाब में होते है समझने के लिए नए दरवाजे खोलता है (और कभी सूची बढ़ती) जीन की ।

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Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि की तैयारी में अपनी अमूल्य सहायता के लिए केटी फिंक और लिन Dondlinger को अपनी भावभीनी धन्यवाद व्यक्त करते हैं ।

अनुदान सहायता: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; और #R01-HL128242 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

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Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

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