Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Evaluering af vaskulære kontrolmekanismer udnytte Video mikroskopi af isolerede modstand arterierne af rotter

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

Dette manuskript beskriver in vitro- video mikroskopi protokoller til evaluering af vaskulære funktion i rotte cerebral modstand arterier. Håndskriftet beskriver også teknikker til evaluering af microvessel tæthed med fluorescently mærket lektin og væv perfusion ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry.

Abstract

Denne protokol beskriver brugen af in vitro- tv-mikroskopi til at evaluere vaskulære funktion i isolerede cerebral modstand arterier (og andre fartøjer), og beskriver teknikker til evaluering af væv perfusion ved hjælp af Laser Doppler Flowmetry (LDF ) og microvessel tæthed udnytter fluorescently mærket Griffonia simplicifola (GS1) lektin. Nuværende metoder til at studere isoleret modstand arterier på transmural pres stødt i vivo og i mangel af parenkymalt celle påvirkninger give en kritisk link mellem i vivo undersøgelser og oplysninger fra Molekylær reduktionistiske tilgange, som giver begrænset indsigt i Integrativ svar på den heldyrsniveau. LDF og teknikker til selektivt identificere arterioler og kapillærer med fluorescently mærket GS1 lektin giver praktiske løsninger for at aktivere efterforskerne at udvide den viden opnået fra undersøgelser af isolerede modstand arterier. Dette papir beskriver anvendelsen af disse teknikker til at opnå grundlæggende viden om vaskulære fysiologi og patologi i rotte som en generel eksperimentel model, og i en bred vifte af specialiserede manipuleret genetisk "designer" rotte stammer, der kan give vigtig indsigt i specifikke gener indflydelse på vigtige vaskulære fænotyper. Udnytte disse værdifulde eksperimenterende tilgange i rotte stammer udviklet af selektiv avl strategier og nye teknologier til fremstilling af genet knockout modeller i rat, vil udvide rigor af videnskabelige lokaler udviklet i knockout musemodeller og udvide denne viden til en mere relevant dyremodel, med et godt forstået fysiologiske baggrund og egnethed for fysiologiske undersøgelser på grund af dets større størrelse.

Introduction

De tidligste undersøgelser af vaskulær funktion i arterierne udnyttet conduit arterier, og i mange tilfælde aorta. Kraft generation i store arterier var generelt studerede ved at knytte en ring segment af arterien til en krafttransducer i et væv bad; i tilfælde af aorta, strimler ved at skære spiralformet af fartøjet så at den glatte muskelfibre blev orienteret i en langsgående retning mellem stopgarnets og krafttransducer, at give det bedste skøn over styrken genereret af sammentrækning af den glatte muskulatur langs sin længdeakse. Den standard teknik til at skære spiralformet strimler af aortas var at placere en glasstav i lumen af fartøjet, gøre et snit i karvæggen i den ønskede vinkel og holde til slutningen af den udsatte kant af karvæggen som cut blev udvidet til at producere en hel spiralformet bånd af fartøjet. På det tidspunkt i endothelial side af fartøjet var generelt renset for at fjerne snavs før vedhæftes krafttransducer fartøj strip og nedsænkning præparatet i en iltet og temperatur kontrolleret væv bad. Til sidst, afledt at tilgang har ført til en af de mest berømte og vigtige opdagelser i historien om fysiologi af Furchgott og Zawadski1, nemlig rollen af endotel afslappende faktor (EFRU), efterfølgende identificeret som nitrogenoxid, i regulering af vaskulær funktion. Den afgørende begivenhed, der fører til denne opdagelse var en situation, hvor efterforskerne opretholdt en intakt endotelet ved at undgå kontakt mellem i endothelial side af arterie med udenlandske overflader, og bemærket, at i aorta striben ikke udviser den forventede sammentrækning at acetylkolin (ACh), men i stedet afslappet svar på ACh. Baseret på observation, efterforskerne udviklet en "sandwich" forberedelse, hvor de knyttet en aorta segment med en intakt endotelet (men ikke i stand til at generere kontraktile force) til en standard spiralformet strimmel af aorta og konverteret ACh-induceret sammentrækning i en afslapning.

To store fremskridt på dette område, som er flittigt brugt i dag er udviklingen af forberedelserne til at måle aktiv kontraktile styrke i lille modstand arterier2,3 (som dem i den intestinale mesenterium3 ) og kanylerede modstand arterie præparater4,5,6. I en af de tidligste rapporter, Mulvany og Halpern3 beskrives brugen af wire myograph forberedelse at studere aktiv kontraktile styrke i isolerede modstand arterier fra tarm mesenterium fra spontant hypertensive rotter (SHR) og Normotensive WKY kontrol. Efter udviklingen af wire myograph system, blev kanylerede modstand arterie præparater udviklet for at tillade undersøgelser af fartøjer tættere i vivo betingelser4,5,6.  Mens begge metoder giver værdifulde resultater, har kanylerede arterie forberedelse tilføjet fordelene ved mere effektivt bevare iboende aktive tone i arterierne; og at tillade efterforskere at studere aktive myogenic svar på ændringer i transmural pres og fartøj svar på ændringer i strømningshastigheden og endotel shear stress (Se anmeldelse af Halpern og Kelley6).

Et vigtigt mål for den nuværende papir er at beskrive, hvordan du anvender de hævdvundne teknik video mikroskopi ved hjælp af isolerede, kanylerede modstand arterier for at få præcise oplysninger om de mekanismer, der regulerer aktive tone i disse afgørende fartøjer, uafhængig af neurale, humorale eller parenkymalt celle påvirkninger. Denne grundlæggende oplysninger, ansætte en standard rotte model og eksempler fra vores undersøgelser af nye genetisk manipuleret rotte stammer, vil give læseren en idé om typerne af indsigter om vaskulære funktion, der kan opnås med tv mikroskopi metoder, og som kan være ansat i undersøgelser, hvor enhver kontrol og eksperimentelle målsektorers investigators valg, herunder kraftfulde nye eksperimentel rotte modeller produceret af selektiv indavl og nyudviklet genetiske Engineering teknikker.

Takket være præcision af tv-mikroskopi metoder, kan måling af diameterændringer i kanylerede arterie præparater give værdifulde oplysninger om endotel-afhængig og endotel-uafhængig mekanismer af vaskulære afslapning, såvel som vigtige (og nogle gange uventede) ændringer i vaskulære kontrolmekanismer forekommende med hypertension, højt salt kost og andre eksperimenterende indgreb. Derudover måling af tryk-diameter relationer i isoleret og kanylerede modstand arterier, der maksimalt lempes ved behandling med Ca2 +-gratis løsning eller et farmakologisk karudvidende lægemiddel, tillader investigator at vurdere strukturændringer i arterierne på grund af vaskulær remodellering og til at beregne passiv stress-strain relationer7 , som kan give vigtig indsigt i ændringer i de passive mekaniske egenskaber af arterierne, der kan påvirke arteriel funktion uafhængig af (eller foruden) ændringer i aktive kontrolmekanismer. Det er også vigtigt at bemærke, at oplysninger fra undersøgelser af isolerede modstand arterier kan suppleres med oplysninger indhentet udnytte LDF, en praktisk metode til at vurdere væv perfusion på hele dyr niveau8,9 ,10, og af oplysninger fra vurderingen af microvessel tæthed ved hjælp af fluorescently mærket GS1 lektin, der specifikt binder til glycoprotein fraspaltning i basalmembranen af små arterioler og kapillærer11 , 12. den sidstnævnte metode giver en meget præcis vurdering af microvessel tæthed, der ikke er omfattet af de klassiske vanskeligheder i estimeringen af microvessel tæthed ved at tælle fartøjer i vivo, for eksempel mangler ikke perfunderet fartøjer, hvor blodgennemstrømningen er stoppet på grund af aktive lukning af arterioler. Når de bruges sammen, kan disse tilgange give vigtig indsigt for at korrelere funktionelle ændringer i isolerede modstand arterier til ændringer i væv perfusion på microcirculatory niveau; og nogle eksempler på brugen af disse værdifulde tilgange i forbindelse med kanylerede arterie teknikker vil også blive leveret i det foreliggende manuskript.

Den nuværende papir fokuserer på brug af video mikroskopi-teknikker til at vurdere vaskulære ændringer i arterierne af outbred Sprague-Dawley rotter. Det er dog vigtigt at bemærke, at disse teknikker har vist sig for at være meget værdifulde i belyse fænotypiske forandringer i højt specialiserede gensplejsede rotte stammer lavet af selektiv avl eller gen redigering bruger teknikker. I dette manuskript giver vi eksempler på hvordan video mikroskopi-teknikker har givet vigtige oplysninger om vaskulære funktion i en række værdifulde rotte-modeller, herunder Dahl salt-følsomme (SS) rotte-en indavlet rat stamme, der er den mest udbredte brugt eksperimentel model til at studere mekanismerne af salt følsomme hypertenson18,19,20,21,22,23; og consomic rotter skabt via selektiv avl af SS rotter med salt-ufølsom Brown Norge (BN) rat stamme. I panelerne consomic rotte har hvert kromosom fra Brown Norge rotte været introgressed individuelt i Dahl SS24,25,26 genetiske baggrund. Brug af consomic rotte paneler har leveret værdifulde fingerpeg om specifikke kromosomer, der bidrager til salt følsomhed af blodtryk og andre fænotyper, herunder vaskulære reaktivitet24,25,26 ,27,28.

Selektiv avl strategier udnytter SS rotter og consomic rotter transporterer individuelle BN kromosomer har også aktiveret generation af indsnævret congenic stammer med små segmenter af individuelle Brown Norge kromosomer introgressed i Dahl SS genetiske baggrund22,29. Disse kan give yderst værdifuldt input på specifikke gener eller smalle områder af kromosomer, der kan påvirke afgørende fysiologiske variable, som blodtryk, nyre skader og vaskulære reaktivitet22,29. En anden kraftfuld tilføjelse til rotte genetiske værktøjskassen er udviklingen af rotte gen knockout modeller udnytte avancerede gen redigering teknikker, herunder ZFNs, transcriptional activator-lignende-effektor nukleaser (TALENS), og senest CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Fremkomsten af disse kraftfulde teknikker, der aktiverer gener til at blive slået i rotten er en uhyre vigtig udvikling fordi gen knockout undersøgelser til dato har brugt (og fortsætte med at bruge) mus næsten udelukkende. En anden eksperimentel komponent i den nuværende papir viser værdien af kanylerede arterie teknikker og video mikroskopi til at evaluere fysiologiske mekanismer i knockout rotter mangler den master antioxidant og celle beskyttende transskription faktor, nukleare faktor (erythroid-afledte 2) - som - 2 (NRF2)30,31, der blev udviklet ved hjælp af TALEN teknologi i Sprague-Dawley genetiske baggrund17. I disse eksperimenter, blev in vitro- video mikroskopi teknikker brugt til at give funktionel kontrol af tabet af NRF2-gen og afprøve en potentielt værdifulde terapeutisk tilgang baseret på direkte opregulering af NRF2-medieret antioxidant forsvar. NRF-2 er af betydelig terapeutisk betydning i bekæmpelse af vaskulære oxidativt stress hos mennesker, i lyset af de skuffende resultater af kliniske forsøg med direkte administration af antioxidanter såsom vitamin C og E32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

College i Wisconsin institutionelle dyr lægebehandling og brug udvalg (IACUC) godkendt alle protokoller er beskrevet i dette dokument og alle procedurerne er i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) Office af laboratorium animalsk velfærd (OLAW) forordninger.

1. forberedelse af løsninger og fartøj kammer

  1. Før gennemførelse af en serie af eksperimenter, forberede 2 L 20 x koncentreret salt stamopløsning bestående af 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11.52 g/L MgSO4. 7H2O; og 9,4 g/L CaCl2. 2H2O. Også forberede 2 L 20 x koncentreret stødpudelager bestående af 80.8 g/L NaHCO3 og 0,4 g/L EDTA, og 2 L 20 x koncentreret Ca2 +-gratis stock løsning bestående af 281.6 g/L NaCl; 14 g/L KCl og 11.52 g/L MgSO4. 7H2O.
    Bemærk: 20 X stamopløsninger kan opbevares i køleskab indtil brug.
  2. På dagen for eksperimentet, forberede 2 L af fysiologiske saltopløsning (PSS) fra 20 x koncentreret stamopløsninger som følger: tilsættes 100 mL af 20 x salt materiel til 1.800 mL deioniseret vand i en 2 L Erlenmeyerkolben eller bægerglas på en motoriseret omrøring plade. Tilsættes 100 mL af 20 x stødpudelager mens kontinuerligt equilibrating løsningen med en gasblanding, som indeholder 21% O2, 5% CO2, balance Nielsen2, og under omrøring med en magnetisk omrøring bar. Langsomt tilføje 0,28 g NaH2PO4 mens overvågningen pH; justere efter behov til pH 7,4 ved at tilføje dråber 6 N HCl eller 6.5 N NaOH løsning fra Pasteur pipette. Efter PSS er forberedt og pH-værdien justeres, skal du tilføje 1,98 g glukose til PSS.
    Bemærk: Det er vigtigt at langsomt tilføje NaH2PO4 sidste mens overvågningen pH af PSS, fordi tilsætning af NaH2PO4 til en basisk opløsning (pH > 7.4) kunne danne en calciumphosphat bundfald, som angivet af den udseendet af en overskyet løsning eller et hvidt bundfald i bunden af beholderen.
    NOTE: Den endelige sammensætning af PSS er 119 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1.17 mM/L Mg2så4; 1,6 mM/L CaCl2; 1.18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0,03 mM/L EDTA; og 5,5 mM/L glukose. Selv om sammensætningen af PSS kan variere blandt laboratorier, er denne opskrift særdeles velegnet til vedligeholdelse af vaskulære tone, endotelfunktion og svar til vasoaktive agenter i isolerede modstand arterier.
  3. Til at bestemme den maksimale diameter og vurdere aktive tone i arterien ved at producere maksimal dilatation af fartøjet forberede 500 mL af Ca2 +-gratis PSS ved at tilføje 25 mL af den 20 X Ca2 +-gratis salt materiel til 450 mL deioniseret vand , efterfulgt af 25 mL af 20 x stødpudelager i en Erlenmeyerkolbe eller bægerglas svarende til trin 1.2 ovenfor. Tilføje 0,07 g af NaH2PO4 til løsningen samtidig overvåge og justere dine pH af løsningen. Ca2 +-gratis PSS er føjet til PSS reservoir og fartøj kammer i slutningen af forsøget at undgå nedbryder intracellulære Ca2 + butikker, der kan påvirke fartøjet svar i normal PSS. Fordi Ca2 +-gratis løsning er tilføjet i slutningen af forsøget til at producere maksimal afslapning af arterierne, der er ingen grund til at tilføje glukose til PSS.
    Bemærk: Når du er færdig, den endelige sammensætning af Ca2 +-gratis PSS er 120.6 mM/L NaCl; 4,7 mM/L KCl; 1.17 mM/L Mg2så4; 1.18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; og 0,03 mM/L EDTA.
    Bemærk: For mange undersøgelser der kræver maksimal dilatation af arterie, en calcium post blokker som verapamil (1 µM) og/eller en nitrogenoxid donorer som natrium nitroprusside (10 µM) kan føjes til løsningen, ud over at fjerne Ca2 + fra PSS.
  4. Opretholde PO2, PCO2og pH af PSS ved løbende equilibrating PSS flyder ind i fartøjet kammeret i en standard orgel bad bruges til at studere isolerede aorta ringe, intestinal glatte muskulatur eller andre væv (figur 1). Bruge syntetiske fluorpolymer af tetrafluorethylen slangen kan tilsluttes orgel bad gastank, fordi denne type af slangen er gas uigennemtrængeligt, i modsætning til mange andre former for slanger, f.eks., latex.
  5. Placer en lille luft sten tilsluttet ækvilibrering gasblandingen i fartøjet kammer til at hjælpe med at opretholde PSS gas sammensætning.
    Bemærk: Fartøj svar til ændringer i PO2 kan testes af equilibrating PSS i fartøjet kammer og luminale perfusate med gasblandinger indeholdende forskellige procentdele af O2, f.eks., 21% O2, 10% O2, 5% O2 , og 0% O2, med 5% CO2 og balance N233,34,35. For større arterier med tykkere mure, hvor diffusion af ilt ind i midten af karvæggen kan være en begrænsning, kan der anvendes en højere procentdel af ilt, f.eks., 95% O2 .
  6. Overvåge temperaturen i salen, fartøj, som enkelte kamre kan variere i deres varme overførsel karakteristika.
    Bemærk: Mange kommercielt tilberedt fartøj kamre bruges til undersøgelser af kanylerede modstand arterier udnytte en peristaltisk pumpe for at levere iltet PSS fra en gas-ekvilibreres reservoir og giver meget præcis styring af Bad temperatur og iltning af PSS.
  7. Placer PSS i en stor (2 L) Mariotte flaske med prop og centrale glasrør til at tjene som et reservoir til at levere løbende PSS i orgel badet, der varmer og gas-afbalanceres PSS flyder ind i fartøjet salen (figur 1A).
  8. Sted åbningen af centrale glasrør i Mariotte flaske på samme niveau som toppen af PSS i orgel badet, at opretholde en konstant hydrostatisk tryk hovedet for levering af PSS i orgel bad. Brug polyethylen slanger forbundet med en J-formet glas eller plastik rør til at levere PSS fra Mariotte flaske ind i orgel badet.
  9. For luminale perfusion (figur 1A), med polyethylen slanger tilsluttes indstrømning pipette til en PSS reservoiret består af en 60 cc plast sprøjte ophøjet til en position, der vedligeholder det ønskede indstrømning pres (normalt 80 mmHg for studier af rotte cerebral arterier), målt med et tryk transducer tilsluttet systemet via en stophane.
  10. Tilsluttes en polyethylen rør til at tillade PSS gennemstrømning fartøj som svar på en trykgradient udstrømning pipette, og tilsluttes et reservoir svarende til indstrømning reservoir linjen udstrømning. Bruge en lignende stophane og tryk transducer forbindelse til at måle udstrømning pres.
    Bemærk: Procedurer for at angive transmural pres og kontrollerer gennemstrømningen fartøjet er beskrevet i afsnit 2, nedenfor.
  11. I slutningen af forsøget, skyl grundigt kammer, leverancelinjer og reservoir systemer med destilleret vand. Med hyppige mellemrum, erstatte linjerne slanger og levering, ren eller erstatte stopcocks i systemet, og med jævne mellemrum er underlagt nogen glas PSS reservoirer en sure vaske til at forhindre vækst af bakterier og andre mikroorganismer, der forårsager forurening og påvirke fartøjet reaktivitet.

2. kanylerede arterie forberedelse

  1. Bedøver en Sprague-Dawley rotte med 5% isofluran og vedligeholde anæstesi ved hjælp af 1,5-2,5% medicinsk kvalitet ilt36. Alternativt kan du administrere en intramuskulær injektion indeholdende ketamin (75,0 mg/kg), Acepromazin (2,5 mg/kg) og xylazin (10,0 mg/kg). en intraperitoneal injektion med pentobarbital (50-60 mg/kg). eller enhver anden godkendt metode til anæstesi, afhængigt af protokoller og/eller investigator præferencer.
  2. Hug hovedet af rotte under dyb anæstesi og fjerne hjernen for undersøgelser af arterier, cerebrale modstand.
  3. Efter fjernelse af hjernen, omhyggeligt isolere den midterste cerebral arterien (MCA) (eller andre arterier af interesse, f.eks., basilar arterie eller posterior cerebral arterie)37,38. At isolere MCAs, placere hjernen liggende i et glas petriskål fyldt med iskolde PSS (figur 2).
  4. Brug markriyor saks og en Dumont #5 fin spids pincet til punktafgifter MCA fra hjernen.  Rens eventuelle resterende hjernevæv fra MCA med pincet og overføre arterien til en temperatur kontrolleret fartøj salen indeholdende PSS som tidligere beskrevet. 33 , 34  .
  5. For at overføre arterien til fartøj kammer, hold forsigtigt skåret fartøjet af ACA eller den posteriore kommunikere arterie segment og Anbring det forsigtigt ind i kammeret.
    Bemærk: Ud over MCA, kanylerede fartøj systemet er velegnet til en lang række små fartøj præparater, herunder skeletmuskulatur modstand arterier33,39,40, mesenteriallymfeknuderne modstand arterier 38 , 41 , 42og stor (første ordre) arterioler cremaster muskel43, samt menneskelige koronar arterioler og menneskelige arterioler fremstillet af subkutane fedtvæv under bagdelen biopsi44,45, 46,47.
  6. Vedhæfte arterien til indstrømning mikropipette ved at trække den mod pipette base, indtil spidsen forskud i lumen af MCA. Sikre pulsåre på indstrømning pipette ved at binde en sløjfe forberedt fra en enkelt streng fiber tidligere drillet fra 10-0 sutur omkring arterie (figur 1B). Sikre den modsatte ende af MCA til udstrømning pipette ved at stramme en anden sutur løkke omkring fartøj (figur 1B).
    Bemærk: Placer sutur sløjfer på Mikropipetter før montering fartøjet og placere dem tæt på den endelige punkt af vedhæftet fil, så de kan være let gled over arterien og hurtigt sikret når fartøjet er i position, som minimerer risikoen for den arterie glide af pipetter.
    Bemærk: Mikropipetter er fremstillet af borsilikatglas kapillær slanger (2 mm ydre diameter, 1 mm indre diameter, 10 cm lang) ved hjælp af en lodret mikropipette puller. Før montering arterie, matche tip diameteren af Mikropipetter så tæt som muligt for at undgå uoverensstemmelser i tilgangen og udstrømning modstand i perfusion system.
  7. Når arterie er sikkert bundet til Mikropipetter, bruge mikrometer tilsluttet indstrømning pipette indehaveren til at strække arterie til længden i situ .
  8. Tie off alle sidegrene med enkelt hårstrå drillet fra 10-0 sutur for at opretholde et konstant pres i arterien.
  9. Kontrollér fravær af lækager ved at sikre, at intraluminal (transmural) pres forbliver konstant efter midlertidigt at lukke indstrømning pipette. Tie off enhver grene eller tjek for huller i fartøjet, hvis trykket falder. Genoprette perfusion efter at have kontrolleret, at transmural pres forbliver konstant.
    Bemærk: Cannulation af isolerede modstand arterier kræver håndelag og praksis. De vigtigste forholdsregler overholdes er at undgå at bryde pipetter og for at sikre, at arterien ikke glider ud af pipetter. Det er vigtigt at være blid med de isolerede arterier under hele proceduren, da traumer til fartøjet kan beskadige endotelet og/eller forstyrre normale funktion af det vaskulære glatte muskulatur.
  10. Måle den indvendige diameter af arterie ved hjælp af en video mikroskopi setup (figur 1A) bestående af et videokamera knyttet til en dissekere mikroskop og tilsluttet en video mikrometer og tv-skærm (tal 1B, 1 C). Dette tillader observatør til at måle skibet diametre manuelt ved at placere bevægelige referencelinjer på indersiden af arterien og, hvis det ønskes, på den ydre væg af arteria samt, for at måle fartøj væggens tykkelse.
    Bemærk: Nogle video mikrometer tilbyder automatisk sporing af fartøjet dimensioner.
    Bemærk: Kalibrere den video mikrometer med et mikroskop objektsmikrometeret og tilstrømningen og udstrømning Tryktransducere med mercury manometer (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg og 200 mmHg) mellem eksperimenter for at sikre nøjagtige målinger af fartøj diameter og intraluminal pres.
    Bemærk: Standard kontrol transmural pres for rotte MCA eksperimenter er 80 mmHg. Kalibrering for højere og lavere tryk niveauer sikrer nøjagtighed for undersøgelser af myogenic svar på ændringer i transmural pres og passiv tryk-diameter kurver i maksimalt udvidede arterier.
  11. Justere højden på tilstrømning og udstrømning reservoirerne at opretholde det ønskede transmural pres på et konstant niveau. Hæve indstrømning reservoir af en lille mængde (< 5 mmHg) og sænke udstrømning reservoir af den samme mængde fastholder den gennemsnitlige transmural pres og skaber perfusion flow i fartøjet lumen6.
    Bemærk: Hæve indstrømning reservoir og sænke udstrømning reservoir af lige store mængder fastholder den samme gennemsnitlige transmural distending trykket i arterien, men genererer en hydrostatisk trykgradient, der forårsager flow og shear stress i beholderen, så den investigator at evaluere endotel-afhængig af reaktionerne på ændringer i intraluminal shear stress i forskellige eksperimentelle grupper48.
  12. For at vurdere myogenic svar og fartøj svar til vasodilatator stimuli, Sørg for, at arterien udstiller et passende niveau af aktive tone (ca. 40%) før eksperimentet. Kassér eventuelle arterier mangler aktive tone på resten undtagen fartøjer, f.eks., små mesenteriallymfeknuderne arterier, der ikke normalt udviser aktive hvile tone.
    Bemærk: For fartøjer, der ikke normalt udviser spontan tone, pre snøre arterierne med et tilsvarende beløb udnytter en vasokonstriktor agonist noradrenalin eller phenylephrin. En god tilgang til at vælge dosis af agonist anvendes pre snøre arterie er at udnytte et EF50 dosis af vasokonstriktor agent, fxnoradrenalin41,42. Farmakologiske vasokonstriktor agenser bør dog ikke anvendes på arterier, der udviser spontan aktive tone under hvile betingelser.
  13. Teste endotel-afhængig reaktivitet af arteria kanylerede modstand ved at måle fartøj diametre under tilsætning af stigende koncentrationer af ACh (10-10 M-10-5 M) til fartøj kammer. Teste endotel-uafhængig nitrogenoxid følsomhed af vaskulær glat muskulatur ved at måle fartøj diametre under tilsætning af stigende koncentrationer (10-10 M-10-5 M) af nitrogenoxid donor natrium nitroprusside til den fartøj kammer.
    Bemærk: Følsomhed over for vasokonstriktor agenter og andre karudvidende agonister kan testes på en lignende måde ved at tilføje stigende koncentrationer af agonist til fartøj kammer.
    Bemærk: Udover vasoaktive agenter, forskellige stoffer, hæmmere og andre farmakologiske stoffer kan føjes til væv bad og/eller til den luminale perfusate. Ændringer i PO2 (samt PCO2 og pH) kan selektivt gives til i endothelial side eller den ekstra-luminale side af arteria af separate ækvilibrering om det luminale perfusate med en air sten tilsluttet en kalibreret gasblandingen forskellige fra blandingen bruges til Reagensglasset PSS i væv bad33,34,49. Myogenic svar på ændringer i transmural pres kan studeres ved at lukke udstrømning pipette og hæve (eller sænke) højden af PSS reservoir tilsluttet indstrømning pipette49,50,51 til øge eller mindske intraluminal pres.
  14. Test af endotelet rolle i mægle fartøj reaktioner på bestemte stimuli, fjerne den vaskulære endotel og sammenligne fartøj reaktioner på disse stimuli i tilstedeværelse eller fravær af endotelet. Hvis du vil fjerne endotelet, forsigtigt løsne arterie fra udstrømning pipette og langsomt perfuse lumen af arterie med en air bolus (0,5-1,0 mL). Efter luft perfusion, gendanne PSS perfusion for at rydde den celleaffald før re binde fartøj til udstrømning pipette43.
    Bemærk: Efter i endothelial denudation procedure, det er vigtigt at kontrollere, endotelet er fjernet ved at teste vascular responses til en agonist (normalt ACh) kendt for at producere endotel afhængig vasodilatation i denne skibstype. Dog i visse patologiske betingelser, er endotel-afhængig vasoconstrictors frigivet, i hvilket tilfælde, det er vigtigt at kontrollere, at constrictor svar er elimineret efter endotel fjernelse.
  15. I slutningen af forsøget, bestemmer den maksimale diameter af arterie ved at tilføje Ca2 +-gratis PSS til perfusate og superfusate. Beregne aktive hvile tone (%) som ((Dmax-Dresten) / dmax) x 100, hvor Dmax er den maksimale diameter i overværelse af Ca2 +-gratis løsning og Dresten er den hvilende kontrol diameter.
    Bemærk: Diameter målinger af maksimalt afslappet arterier i forskellige eksperimentelle grupper er værdifulde i at sammenligne aktive hvile tone, strukturelle remodeling (dvs.ændringer i væg tykkelse og lumen diameter) og passiv mekaniske egenskaber (stress-strain relationer beregnet ud fra passiv diametre på forskellige niveauer af transmural pres).

3. evaluering af Cerebral Blood Flow svar med LDF

  1. Bedøver dyr med 5% isofluran og sikre rat i et stereotaxisk apparatur9,10.
  2. Vedligeholde dyret under konstant anæstesi mens overvågningen vejrtrækning frekvens, ende tidevandsenergi CO2og dybde af anæstesi med en tå knivspids36.
  3. Omhyggeligt tynde kraniet til gennemskinnelighed ved hjælp af en lav hastighed dental boremaskine og mineralsk olie til at give optisk kobling10. Udvis forsigtighed for at undgå at generere overdreven varme og undgå gennemtrængende knoglen.
    Bemærk: Udtynding af kraniet tillader laserlys at nå frem til det underliggende væv og skal afspejles tilbage til sonden for at måle den Doppler Skift, omfanget bestemmes af antallet af bevægelige partikler (dvs., røde blodlegemer) og deres hastighed.
  4. Sikre LDF sonden i en micromanipulator, og Placer den direkte over området tyndet af kraniet. Under eksperimentet er det meget vigtigt at forhindre bevægelse af enten LDF sonde eller forberedelsen, selv, som LDF er designet til at måle flow i et begrænset område af væv og er meget følsomme over for bevægelse artefakter.
    Bemærk: Enhver flytning af sonden væk fra sin oprindelige holdning vil give et skøn over blodgennemstrømning i et andet område af det væv, udelukker sammenligninger. Mens LDF giver ikke absolutte flowværdier og er ikke egnet til sammenligning mellem fag, er det en glimrende måde at noninvasively vurdere forandringer i væv perfusion i svar til eksperimenterende indgreb i enkelte fag; og relative ændringer i LDF signal fra kontrolværdierne kan gennemsnit og i forhold til ændringer i LDF signal fra kontrol i andre eksperimentelle grupper.
    Bemærk: LDF er en praktisk tilgang til at få indsigt i faktorer, der regulerer blodgennemstrømningen i forbindelse med hele vaskulære sengen i forskellige eksperimentelle grupper8,9,10. Evaluering af væv perfusion med LDF giver en praktisk tilgang for at tilegne sig viden opnået fra isolerede fartøj undersøgelser i en hel seng perspektiv. Spærring regionale forskelle i vaskulære kontrolmekanismer mellem modstand arterier og mikrocirkulationen giver målinger fremstillet med LDF en god indikation af væv blod flowkontrol, der er generelt i overensstemmelse med resultater, der opnås med kanylerede arterie præparater.

4. evaluering af skeletmuskulatur Microvessel tæthed med GS1 lektin

  1. Fjerne cremaster muskel fra en mandlig rotte ved at skære åbne pungen med standard fine kirurgisk saks og derefter bruge en Dumont #5 pincet til at forstå musklen.
    Bemærk: Tynde muskler (fx, cremaster muskel, samt de extensor digitorum longus og tibialis anterior muskler, der findes i både han- og hunrotter) er velegnet til brug som hele monteringer til lektin undersøgelser, selvom histologiske sektioner kan bruges til tykkere væv.
  2. Fjerne cremaster muskel fra testikel ved hjælp af et enkelt snit. Placere den i iskold PSS og pin det ud i en petriskål med en silikoneelastomer foring i bunden indeni overflade. Forsigtigt drille lager bindevæv bruger Dumont #5 pincet.
  3. Skyl muskel prøver med 2 mL "buffered" PSS og derefter nedsænke dem i rodamin-mærket GS1 lektin (20 µg/mL PSS) i 50 min. i en 12-godt celle kultur plade med 2 mL/godt der er pakket ind i aluminiumsfolie at udelukke lys.
  4. Fjern væv fra lektin løsning, skyl dem tre gange i PSS med 5 min "vaske" inkubationer på en rocker, og montere dem på objektglas. Sørg for at udruge væv i mørke og gemme diasene i mørke til at forhindre tab af fluorescens.
    Bemærk: Hvis dias ikke kan anvendes straks, de kan opbevares i køleskab uden tab af fluorescens. For længere opbevaring, kan dias opbevares i en fryser til at forhindre forringelse af11.
  5. Vurdere microvessel tæthed ved at tælle antallet af vejkryds af mærket microvessels med computer-genereret gitterlinjer overlejret over billede52, eller med en klar grid overlay overlejret over skærmen bruges til at få vist dias.
    Bemærk: GS1 lektin tilgange har været brugt til at demonstrere: salt-inducerede mikrovaskulære rarefaction53, den beskyttende virkning for at forhindre salt induceret angiotensin II undertrykkelse i genoprette microvessel tæthed i salt-fodret dyr17 ,53,54; NRF2 rolle mægle den beskyttende effekt af lavdosis angiotensin II infusion til at forhindre microvessel rarefaction i salt-fed rotter17; og også for at evaluere rollen af angiotensin II for opretholdelsen af angiogene svar til kroniske muskelstimulation i salt fodret rotter54,55. En fordel ved GS1 lektin teknik er, at det kan bruges til at vurdere microvessel tæthed i de samme dyr, der anvendes til undersøgelser af kanylerede modstand arterier eller LDF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vitro mikroskopi af kanylerede modstand arterier giver mulighed for undersøgelse af faktorer, der påvirker aktive tone i lille modstand arterier (og større arterioler) på normale i vivo transmural pres og i mangel af parenkymalt celle påvirkninger. Ud over vurderingen af reaktiviteten af fartøjerne til forskellige karudvidende og vasokonstriktor stimuli og myogenic svar til transmural pres elevation i normal PSS, Ca2 +-gratis PSS kan føjes til perfusate og superfusate for enden af eksperiment til at bestemme den maksimale fartøj diameter og væg tykkelse. De sidstnævnte målinger er meget værdifulde vurdering af vaskulære remodeling, dvs, ændringer i forholdet mellem væg/lumen, der kan opstå som reaktion på ændringer i blodtryk eller administration af farmakologiske midler. Målinger af diameteren af maksimalt forstørrede fartøjer i Ca2 +-gratis PSS er nyttige til at beregne iboende tone som ((Dmax-Dresten) / dmax) x 100, hvor Dmax og Dresten er maksimalt (Ca2 +- gratis PSS) og hviler diameter (PSS), henholdsvis ved kontrol ækvilibrering pres (normalt 80 mmHg for MCA). Vores erfaring gennemsnit aktive tone i MCA omkring 40% ved en transmural Tryk på 80 mmHg. Måle diameteren af maksimalt udvidede arterier er også en praktisk måde at evaluere de passive mekaniske egenskaber af skibe ved at måle diameteren af arterierne på forskellige niveauer af transmural distending pres og bruge resultaterne til beregne stress-strain relationer og andre mekaniske egenskaber ved fartøjer7,56.

Figur 3 er en skematisk gengivelse af tre indsnævret congenic stammer, der er afledt af SS.13BN rotte udnytte yderligere selektiv avl tilgange. I disse rotte stammer, de kromosomale segmenter omfatter enten brun Norge renin allel (Ren1-BN) eller er cut off lige over (Ren1-SSA) eller bare nedenfor (Ren1-SSB) renin gen locus (dermed bevarer SS renin allel). I denne undersøgelse29, den kromosomale målgruppe, der indeholder Brown Norge renin allel indeholdt kun 25 gener.

Figur 4 viser svar på endotel-afhængig vasodilatator ACh (1 µM) i isolerede MCAs fra mandlige Dahl SS rotter og tre indsnævret congenic stammer, der er vist i figur 3. Kombineret anvendelse af disse tre congenic stammer, der enten omfatter (Ren1-BN) eller skæres væk lige over (Ren1-SSA) eller nedenfor (Ren1-SSB) renin gen begrænset region af interesse (dvs., området omkring renin gen locus) til ca. 25 gener. I disse eksperimenter, dyrene var normotensive og fodret med et lavt saltindhold (0,4% NaCl) kost. I denne undersøgelse29 endotel-afhængig dilatation til ACh var fraværende i SS forældrenes stamme og i begge de congenic stammer bevare SS renin allel, men blev gendannet i den congenic stamme med BN renin allel i SS genetiske baggrund. Resultaterne af denne undersøgelse understøttes af resultaterne af tidligere undersøgelser udnytter SS.13BN consomic rotter57,58 og leveret stærke beviser at endotel dysfunktion er til stede i SS rotter, selv når de er normotensive og fodret en lav salt kost. Taget er sammen, resultaterne af disse undersøgelser29,57,58 støtter hypotesen at endotel dysfunktion i SS rotter på grund af nedsat regulering af renin gen, der medfører kronisk udsættelse for lave niveauer af angiotensin II i blodet.

En anden undersøgelse59, sammenfattet i figur 5, sammenlignet svar på endotel-afhængig vasodilatator ACh i isolerede MCAs (MCA) fra mandlige Dahl SS rotter og SS.5BN consomic rotter transporterer kromosom 5 (indeholdende Brown Norge gener for forskellige isoformer af cytokrom P450-4A ω-hydroxylase). I denne undersøgelse, var dyr fodres enten et lavt saltindhold (0,4% NaCl) eller høje salt (4% NaCl) kost. I modsætning til MCA fra SS rotter, blev endotel afhængig dilatation til ACh opretholdt i MCA fra SS.5BN consomic rotter fodres lav salt kost. Hertil kommer, (og i modsætning til resultaterne fra SS.13BN consomic rotter57,58, Sprague-Dawley rotter33,39,40,60og guldhamstere 61), en høj salt kost undladt at fjerne ACh-induceret dilatation i SS.5BN rotter, der angiver, at CYP450-4A ω-hydroxylase og 20-hydroxyeicosatetraenoic syre (20-HETE) er vigtige bidragydere til vaskulær oxidant stress og endotelceller dysfunktion i SS rotter og under stigninger i salt indtagelse i andre stammer. Fra en eksperimentel perspektiv, den høje salt kost manglende evne til at eliminere endotel-afhængig dilatation til ACh giver et eksempel på, hvordan undersøgelser af kanylerede modstand arterier kan frembringe uventede resultater, der afgår fra konventionelle visdom og kunne føre til en ny forståelse af komplekse mekanismer der påvirker funktionen af disse afgørende fartøjer.

Figur 6 viser svar af isolerede MCA til ACh (1 µM) i vildtype og Nrf2(- / -) knockout rotter fodres en lav salt kost (0,4% NaCl), høje salt kost (4% NaCl), eller en høj salt kost indeholdende en kendt NRF2 activator30,62 . I mangel af salt-induceret oxidativt stress var ACh-induceret dilatation ens i MCA fra vildtype og Nrf2(- / -) knockout rotter. I overensstemmelse med resultaterne af tidligere undersøgelser af Sprague-Dawley rotter, det høje salt kost elimineret ACh-induceret dilatation i vildtype og i Nrf2(- / -) knockout rotter. Tilsætning af NRF2-inducer til det høje salt kost restaureret endotel-afhængig dilatation til ACh vildtype rotter, men ikke i Nrf2(- / -) rotter, demonstrerer vellykket fjernelse af Nrf2 -genet i knockout rotter, og støtte brugen af NRF2 op-regulatorer som en terapeutisk tilgang til at forbedre vaskulær oxidativt stress.

Figur 7 opsummerer resultaterne af LDF målinger sammenligne besvarelserne af pial mikrocirkulationen progressiv reduktion af arterielle blodtryk produceret af successive blod volumen tilbagekøb i Sprague-Dawley rotter vedligeholdes på enten en normal salt (0,4% NaCl) kost eller et højt saltindhold (4% NaCl) kost for fire uger. I modsætning til rotter fodres en lav salt kost, fodres rotter høj salt kost udstille en nedsat evne til at opretholde en konstant blodgennemstrømning under reduktioner i perfusion pres, der angiver, at de mekanismer, der er ansvarlige for cerebral blood flow autoregulation er kompromitteret af langsigtet eksponering for et højt salt kost. Resultaterne af disse eksperimenter er i overensstemmelse med tilstedeværelsen af nedsat vaskulær afslapning mekanismer i isolerede cerebrale arterier salt-fed rotter60 og give et godt eksempel på hvordan LDF målinger kan anvendes til at understøtte og udvide den resultaterne af undersøgelser beskæftiger isoleret modstand arterier til niveauet for den hele vaskulære seng.

Ud over evaluering modstand arterie funktion ved hjælp af isolerede arterier og væv perfusion ved hjælp af laser-Doppler flowmetry, microvessel tætheden og angiogene reaktioner på forskellige stimuli som kroniske muskel stimulation54, 55 kan evalueres i de samme dyr udnytter fluorescently mærket GS1 lektin, som selektivt binder til glycoprotein fraspaltning i basalmembranen arterioler og kapillærer. Figur 8 viser typiske lektin farvning i cremaster muskel Sprague-Dawley rotter fodres en lav salt kost eller høje salt kost for 2 uger (Bemærk den lavere tæthed af microvessels i de høje salt fodret rotter). Microvessel tæthed er vurderet ved at tælle kryds af lektin-mærket microvessels med en computer-genereret reference gitter52, og giver en fremragende metode til at vurdere angiogene svar54,55 eller til påvise og kvantificere tabet af microvessels i sygdomme som forhøjet blodtryk og forhøjet salt indtagelse12,17,53.

Figure 1
Figur 1: In vitro video mikroskopi setup ansat til at studere isoleret, kanylerede modstand arterier (A). Kanylerede modstand arterie bundet til glas Mikropipetter (B) og video mikrometer display viser måling af lumen diameter i kanylerede modstand arterie (C). Skalalinjen i panelet B repræsenterer den indvendige diameter af den kanylerede arterie (µm), og 125 µm i panelet C er den video display af afstanden mellem de bevægelige referencelinjer placeret manuelt på de indvendige vægge af arteria observatøren gennemføre forsøget . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk diagram over proceduren for isolere den midterste cerebral arterie fra hjernen og forberedes cannulation med Mikropipetter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Skematisk diagram over indsnævret congenic rotte stammer at have små segmenter af Brown Norge kromosom 13 introgressed i Dahl salt følsomme genetiske baggrund. Kromosomale segmenter enten indeholdt Brown Norge renin allel (Ren1-BN) eller skæres væk lige over (Ren1-SSA) eller lige under (Ren1-SSB) renin gen locus og dermed bevare SS renin allel. Dette tal er blevet ændret og Genoptrykt fra Durand et al. 29 med tilladelse fra den amerikanske fysiologiske samfund. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Svar af isolerede, kanylerede MCAs af SS rotter og congenic rotte stammer (illustreret i figur 2) til 1 µM acetylcholin. Data er udtrykt som gennemsnitlig diameter ændring (Δ µm) ±SEM fra hvile kontrol diameter før acetylcholin og er replotted fra en original undersøgelse af Durand et al. 29 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Svar af isolerede, kanylerede MCAs af SS rotter og SS.5BN consomic rotter på 1 µM acetylcholin hos dyr fodret med lavt saltindhold (0,4% NaCl) eller høje salt (4% NaCl) kost. Data er udtrykt som gennemsnitlig diameter ændring (Δ µm) ±SEM fra hvile kontrol diameter før acetylcholin og er replotted fra et originalt studie af Lukaszewicz et al. 64 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Svar på 1 µM acetylcholin i isolerede, kanylerede MCAs Nrf2(- / -) knockout rotter og vildtype kontrol fodret lav salt kost (0,4% NaCl), høje salt kost (4% NaCl), eller høje salt kost indeholdende en kendt NRF2 activator30, 62. data er udtrykt som gennemsnitlig diameter ændring (Δ µm) ±SEM fra hvile kontrol diameter før acetylcholin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Cerebral blodgennemstrømning vurderet af LDF i pial mikrocirkulationen. Sprague-Dawley rotter bevares på et højt salt kost for fire uger udstillet en betydelig forringelse i deres evne til at opretholde blod flow konstant som arterielle blodtryk blev nedsat som reaktion på gentagne blod volumen udbetalinger. Data afbildes som gennemsnitlig procent af kontrol ±SEM * p < 0,05 vs lav salt kost samtidig betyde arterielt tryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Mikrograf af rotte cremaster muskler mærket med rodamin-mærket GS1 lektin at identificere arterioler og kapillærer til vurdering af microvessel tæthed. Cremaster muskler blev indhentet fra Sprague-Dawley rotter fodres lavt saltindhold (LS, 0,4% NaCl) eller høj salt (HS:4% NaCl) kost i 2 uger, og demonstrere mikrovaskulære rarefaction med HS-fodret dyr i forhold til LS kontrol. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nævnt i indledningen, dette papir beskriver brugen af tv-mikroskopi og isolerede modstand arterie tilgange til at vurdere vaskulære funktion ikke kun i standard rotte modeller (som ansat i videoen), men også i højt specialiserede genetisk manipuleret rotte stammer, som viser nye og kraftfulde indsigter, der kan opnås udnytte disse tilgange. Brugen af disse kraftfulde teknikker til at vurdere aktive tone og passive mekaniske egenskaber af lille modstand arterier kan give vigtige oplysninger om et bredt spektrum af vaskulære kontrolmekanismer herunder endotel-afhængig regulering aktive tone i modstand arterier, vaskulære glatte muskelceller funktion under normale og patofysiologiske forhold og passive egenskaber af arterierne relateret til vaskulær remodellering og ændringer i vaskulære væg mekanik. Endotel dysfunktion har vist sig at være en kraftfuld prognostiske indikator for flere hjerte-kar-bivirkninger i mennesker, herunder hjerte-kar-relaterede dødsfald63, og kanylerede modstand arterie forberedelserne er særligt værdifuldt i påvisning af endotel dysfunktion og øge vores forståelse af mekanismerne i endothelial dysfunktion.

For at illustrere effektiviteten af in vitro- video mikroskopi teknikker beskæftiger isolerede modstand arterier, givet vi eksempler på brug af disse teknikker i Dahl salt følsomme (SS) rotter og i romanen consomic rotte stammer, der udviser en reduceret salt følsomhed af blodtryk i forhold til SS forældrenes stamme24. Disse studier undersøgt vaskulære kontrolmekanismer relateret til gener på to kromosomer, der er af særlig interesse i at bidrage til salt følsomhed af blodtryk og vaskulære ændringer i SS rotte. Disse kromosomer er kromosom 13, transporterer renin gen18,22,29,57,58, og kromosom 5, bærer gener for isoformer af CYP450-4A ω-hydroxylase64 ,65— det enzym, der syntetiserer 20-HETE, som har store konsekvenser for nyrefunktionen og vaskulære reaktivitet66,67,68. En anden nylig og kraftfuld tilføjelse til rotte genetiske værktøjskassen er udviklingen af rotte gen knockout modeller udnytte avancerede gen redigering teknikker, herunder: ZFNs; transkriptionel activator-lignende-effektor nukleaser (TALENS), og senest CRISPR-Cas913,14,15,16,17. In vitro video mikroskopi udnytter disse teknikker for at studere isolerede MCAs fra en Nrf2(- / -) knockout rotte model, der mangler den vigtige antioxidant og celle beskyttende transskription faktor NRF2, har givet vigtige og tidligere ukendt indblik i mekanismerne i salt-induceret endotel dysfunktion i mangel af en forhøjet blod pres17. Specifikke resultater af eksperimenter udnytter disse specialiserede rotte modeller er beskrevet i en række tidligere rapporter17,29,57,58,59, 60 , 64 , 65 .

Mens det er klart, at undersøgelser af isolerede, kanylerede modstand arterier er meget værdifulde i at forstå de mekanismer, der regulerer funktionen af disse kritisk vigtige fartøjer under forskellige betingelser, det er meget vigtigt at udøve en antallet af forholdsregler for at sikre, nøjagtige og pålidelige resultater. Mens cerebrale arterier og modstand arterierne af mange andre vaskulære senge udstille iboende tone, skal nogle arterier (navnlig mesenteriallymfeknuderne modstand arterier) være forud aftalte med vasoconstrictors såsom noradrenalin for at evaluere svar til vasodilatator stimuli, og mere præcist simulere, i vivo betingelser, hvor fartøjerne, der er under indflydelse af neurale og humorale vasokonstriktor stimuli, såsom noradrenalin frigives fra adrenerge nerve terminaler. Som sådan, det er vigtigt at være fortrolig med de grundlæggende egenskaber for arterier skal undersøges, enten fra litteraturen eller fra omhyggeligt udført indledende eksperimenter. Fordi endotelet spiller en vigtig rolle i reguleringen af store arterier, små arterier og arterioler i mikrocirkulationen, er det vigtigt at udvise forsigtighed for at undgå at beskadige endotelet under isolation og cannulation af arterie. Den klassiske test for endotelet integritet er demonstration at ACh forårsager fartøj dilatation. En advarsel er, at betingelser, oxidativ stress, fartøj endotelet kan være intakt, men vasodilatation at ACh er fraværende fordi høje niveauer af superoxid skyllepumpetab nitrogenoxid forhindrer vasodilatator svar. I disse tilfælde, kan endotel integritet kontrolleres ved at gentage programmet ACh i overværelse af en superoxid skyllevæske såsom tempol, som skal genoprette vasodilation svar på ACh og andre endotel-afhængig vasodilatator stimuli. Også, i en række patologiske tilstande, endotelet kan frigive stoffer, der forårsager sammentrækning af de vaskulære glatte muskelceller og forsnævring af arterie; og i nogle tilfælde endotel-afhængig dilatation (eller konstriktion) er medieret via andre stoffer såsom cyclooxygenase metabolitter, H2O2, epoxygenase metabolitter, osv. Den klassiske test for en endotel-afhængig vasodilatator eller vasokonstriktor stof er at demonstrere at dilatation eller forsnævring af arterien er elimineret ved endotel fjernelse. Endelig kan identiteten af forskellige endotel-afhængig karudvidende og vasokonstriktor stoffer generelt konstateres ved administration af specifikke hæmmere eller skyllevæsker, såsom L-navn til at hæmme nitrogenoxid syntase, indomethacin at hæmme dannelsen af cyclooxygenase metabolitter, katalase til at skyllepumpetab H2O2, tromboxan syntase hæmmere, epoxygenase hæmmere og antagonister af CYP450-4A/20-HETE pathway.

Det er også vigtigt (og lærerigt) for at kvantificere mængden af aktive tone i slutningen af forsøget af perfusing og superfusing arterie med en Ca2 +-gratis PSS, eller administration af en maksimal dosis af en kraftfuld vasodilatator agent såsom papaverin. En typisk niveau af aktive hvile tone i MCA, beregnet som ((Dmax-Dresten) / dmax) x 100, er ca. 40%, hvor Dmax og Dresten er maksimalt (Ca2 +-gratis PSS) og hviler diameter (PSS), henholdsvis på kontrol ækvilibrering pres (normalt 80 mmHg for MCA). Fartøjer med væsentligt mindre aktive tone eller arterier viser segmental forsnævringer eller dilations er udelukket fra analyse, da disse tegn er vejledende for traumer til skibe. Måling af diameteren af maksimalt udvidede arterier i Ca2 +-gratis løsning giver også mulighed for investigator at evaluere de passive mekaniske egenskaber ved fartøjerne ved måling arteriel diameter og beregning af stress-strain relationer under sekventiel stigninger i transmural pres i den maksimalt udvidede fartøjer7,56. Disse passive stress-strain relationer opnås nemt, og giver en værdifuld angivelse af eventuelle ændringer i de mekaniske egenskaber af fartøjer.

Renholdelse af pipetter, stik og slanger leverer reservoirerne er helt afgørende for vellykket forsøg. I denne forbindelse er det vigtigt at skylle alle løsninger ud af slangen efter forsøget er afsluttet, og at skylle og rense væv bad, levering rør og alle reservoirer bruges til at gemme, varme og gas-reagensglasset PSS inden fartøjet kammer. Stopcocks og ventiler i leveringssystemet skal også rengøres og ændret med jævne mellemrum, da bør enhver rør transporterer PSS. Et klassisk tegn på forurenede slangen er en grå haze genereret af mug og bakterier; og disse ændringer er ledsaget af tab af normal reaktivitet af blodkar på grund af stoffer produceret af bakteriel forurening. Kontaminering af bakterier og andre mikroorganismer kan dog stadig være til stede i mangel af nogen synlige beviser.

Vi mener, at den nuværende papir giver et nyttigt eksempel for brugen af hævdvundne teknikker, der er særdeles velegnet til studier af de yderst vigtige lille modstand arterier af forskellige vaskulære senge. Når kombineret med standard metoder til evaluering af væv perfusion, LDF og GS1 lektin metode til evaluering af microvessel tæthed, in vitro- video mikroskopi af kanylerede modstand arterier giver en yderst værdifuld indsigt i den faktorer, der styrer væv perfusion og hvordan disse kan ændres i sygdomstilstande. Ud over at yde et kraftfuldt middel til at studere grundlæggende mekanismer i vaskulære glatte muskulatur og endotelfunktion i standard rotte modeller, kan brug af video mikroskopi til at studere individuelle modstand arterier anvendes til andre dyremodeller og menneskelige modstand arterier. Anvendelsen af video mikroskopi af isolerede modstand arterierne af roman gensplejsede rotte modeller åbner nye døre til forståelse fænotypiske forandringer, der sker som svar på ændret funktion af en lang (og stadigt voksende liste) af gener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne udtrykke deres oprigtige tak Katie Fink og Lynn Dondlinger for deres uvurderlige hjælp i forberedelsen af dette manuskript.

Tilskud: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; og #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

Medicin spørgsmål 130 modstand arterier endotel mikrocirkulationen salt hypertension cerebrale cirkulation
Evaluering af vaskulære kontrolmekanismer udnytte Video mikroskopi af isolerede modstand arterierne af rotter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter