Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

Bu el yazması sıçan beyin direnç arterlerin vasküler işlevinde değerlendirilmesinde vitro video mikroskobu iletişim kurallarını açıklar. El yazması da microvessel yoğunluğu fluorescently etiketli lektin ve doku perfüzyon lazer Doppler Flowmetry kullanarak değerlendirmek için teknikler açıklanır.

Abstract

Bu iletişim kuralı vitro televizyon mikroskobu damar fonksiyonu izole beyin direnç arterler (ve diğer gemilerin) değerlendirmek için kullanımını açıklar ve lazer Doppler Flowmetry (LDF kullanarak doku perfüzyon değerlendirmek için teknikler açıklanır ) ve microvessel yoğunluğu fluorescently kullanan etiketli griffona simplicifolia (GS1) lektin. Eğitim için geçerli yöntemleri direnç arterler transmural basınç karşılaştı vivo içinde izole ve parenkimal hücre etkileri yokluğunda in vivo çalışmalar ve moleküler üzerinden elde edilen bilgilerden arasında önemli bir bağlantı sağlamak Bütün hayvan düzeyinde bütünleştirici yanıt sınırlı içgörü sağlamak indirgemeci yaklaşımlar. LDF ve teknikleri ile GS1 lektin fluorescently etiketli arteriyoller ve kılcal seçmeli olarak tanımlamak için izole direnç arterler çalışmalardan elde bilgi genişletmek müfettişler etkinleştirmek için pratik çözümler sunuyor. Bu kağıt vasküler Fizyoloji ve genel bir deneysel model olarak fare patolojisi temel bilgi elde etmek için bu tekniklerin uygulanması açıklar ve özel çeşitli genetik olarak sağlayabilir "tasarımcı" sıçan suşları belirli genler etkisi önemli vasküler fenotipleri önemli içgörü. Sıçan suşları seçici üreme stratejileri ve rat, gen nakavt modellerinde üretimi için yeni teknolojiler tarafından geliştirilen bu değerli deneysel yaklaşımlar kullanarak bilimsel tesislerinde nakavt fare modellerinde geliştirilmiş rigor genişletmek ve Bu bilgi için bir iyi anlaşılan fizyolojik arka plan ve uygunluğu daha büyük boyutu nedeniyle fizyolojik Etütler ile daha alakalı bir hayvan modeli genişletir.

Introduction

Vasküler işlevi arterler kullanılan boru arterler ve pek çok erken çalışmaların aort durumda. Büyük arterler kuvvet oluşturma genellikle bir doku banyoda bir güç çevirici için bir yüzük kesimi arter ekleyerek incelenmiş; düz kas lifleri eki noktası ve daralma tarafından oluşturulan gücünün en iyi tahmin sağlamak için güç dönüştürücü arasındaki boyuna yönde odaklı böylece aorta durumunda kesme Helisel gemisini şeritler düz kas boyuna ekseni boyunca. Aortas Helisel şeritler kesme için standart teknik bir cam çubuk gemi Lümen içinde yer, istenen açıda damar duvarındaki bir kesim yapmak ve kesme gruplandırırken üretmek için genişletildi maruz damar duvar kenarına sonuna kadar basılı tutun yapıldı. gemi Helisel şerit. Bu noktada, damar endotel tarafında genellikle gemi strip güç dönüştürücü ekleyerek ve bir oksijenli hazırlanmasında batış önce enkaz kaldırmak için deyimiyle ve doku banyo ısı kontrollü. Sonunda, daha sonra nitrik oksit tanımlanan dinlendirici faktör (EDRF), yaklaşım Furchgott ve Zawadski1, yani endotel rolü fizyolojisi, tarihinin en ünlü ve önemli keşifler birine götürdü elde edilen Vasküler işlevini düzenleyen. Bu keşif için önde gelen önemli olay hangi müfettişler bir sağlam endotel yabancı yüzeyler ile damar endotel tarafına temas kaçınarak tarafından tutulan ve aort şerit beklenen sergilemek değil olduğunu fark bir durumdu kasılma asetilkolin (ACh), ama bunun yerine rahat ACh karşılık olarak için. Bu gözleme dayalı, müfettişler hangi onlar bir aort kesimini (ama yapamaz-contractile güç oluşturmak) bir sağlam endotel ile bağlı bir "sandviç" hazırlık aort bir çift sarmal şerit için geliştirilen ve ACh kaynaklı dönüştürülür kasılma bir rahatlama içine.

Bugün yaygın olarak kullanılır Bu alanda iki önemli gelişmeler vardır küçük direniş arterler2,3 ' te etkin contractile kuvvet ölçmek için hazırlıklar gelişimi (örneğin bağırsak bıçaklanmasından3 ) ve cannulated direnç arter hazırlıklar4,5,6. Bir erken raporları, Mulvany ve Halpern3 etkin contractile güç izole direnç arterler gelen kendiliğinden hipertansif sıçan (SHR) bağırsak bıçaklanmasından olarak çalışmaya tel myograph hazırlık kullanımı açıklanmıştır ve normotansif WKY kontrol eder. Tel myograph sisteminin geliştirilmesi sonraki cannulated direnç arter hazırlıklar çalışmalar damarlarının daha yakın vivo içinde koşullar4,5,6için izin vermek için geliştirilmiştir.  Her iki yaklaşımın değerli sonuçlar sağlarken, cannulated arter hazırlık daha etkili koruma arterlerde içsel etkin sesi ekledi avantajı vardır; ve Müfettişler transmural basınç ve gemi yanıt-e doğru akış hızı ve endotel kesme stres değişiklikleri değişiklikleri active myogenic yanıt çalışmaya izin (bkz: adli kullanici tarafindan goruntulendi Halpern ve Kelley6).

Mevcut kağıt ana amacı bu önemli etkin sesi düzenleyen mekanizmalar ile ilgili kesin bilgi elde etmek için izole, cannulated direnç arterler kullanarak video mikroskobu onur tekniği kullanırım nasıl tarif etmektir damarlar, sinir, humoral veya parenkima hücre etkileri bağımsız. Bu temel bilgi, yeni bir standart fare modeli ve bizim çalışmaları örneklerden genetik olarak istihdam sıçan suşları mühendislik, okuyucu ile televizyon elde edilebilir vasküler işlevi ile ilgili yorumlara türleri hakkında bir fikir verecektir mikroskopi yaklaşımlar ve hangi herhangi bir kontrol ve araştırmacı'nın seçme, deneysel grupları içeren çalışmalarda istihdam seçici akraba evliliği tarafından üretilen ve yeni genetik geliştirilmiş güçlü yeni deneysel fare modelleri de dahil olmak üzere mühendislik teknikleri.

Televizyon mikroskobu yaklaşımlar duyarlığını sayesinde, cannulated arter hazırlıklar değişimler çapı ölçümü vasküler endotel bağımlı ve endotel bağımsız mekanizmaları ile ilgili çok değerli bilgi sağlayabilir gevşeme yanı sıra hipertansiyon, yüksek tuz diyet ve deneysel diğer müdahaleler ile meydana gelen vasküler kontrol mekanizmalarının önemli (ve bazen beklenmeyen) değişiklik. Buna ek olarak, basınç-çapı ilişkilerde ölçümü izole ve cannulated tedavi ile Ca2 +tarafından sonuna kadar rahat direniş arterler-ücretsiz çözüm veya farmakolojik vazodilatör uyuşturucu değerlendirmek için Dedektif sağlar arterlerin vasküler remodeling nedeniyle ve Arteryel işlevini etkileyebilir arterler pasif mekanik özelliklerindeki değişiklikler önemli içgörü sağlayabilir pasif stres gerginlik ilişkiler7 hesaplamak için yapısal değişiklikler bağımsız olarak (veya ek olarak) aktif kontrol mekanizmaları değiştirir. İzole direnç arterler çalışmalardan elde edilen bilgilerden LDF, doku perfüzyon bütün hayvan düzey8,9 değerlendirmek için pratik bir yöntem kullanarak elde ettiği bilgileri tarafından desteklenebilir unutmamak önemlidir ,10, ve microvessel yoğunluğu fluorescently etiketli GS1 lektin kullanılarak değerlendirme elde edilen bilgilerden tarafından özel olarak hangi bağlar küçük arteriyoller ve kılcal11 membran glikoprotein moieties için , 12. ikinci yöntemi damarları vivo içindeörneğin sigara periosteum eksik, sayarak microvessel yoğunluk tahmini yaparken karşılaşılan klasik zorluklar tabi değildir microvessel yoğunluğu son derece doğru bir tahmin sağlar damarlarının kan akımı arteriyoller etkin kapatılması nedeniyle durduğu. Birlikte kullanıldığında, bu yaklaşımların izole direnç arterler doku perfüzyon microcirculatory düzeyinde değişiklikler için fonksiyonel değişiklikler ilişkilendirmek için önemli bilgiler sağlayabilir; ve bu değerli yaklaşımlar cannulated arter teknikleri ile birlikte kullanımı, bazı örnekler de içinde mevcut el yazması sağlanacaktır.

Mevcut kağıt outbred Sprague-Dawley Rat arterlerin vasküler değişiklikler değerlendirmek için video mikroskobu teknikleri üzerinde duruluyor. Ancak, bu teknikleri alanında son derece uzman genetiği sıçan suşları seçici ıslahı veya gen teknikleri kullanarak düzenleme tarafından oluşturulan fenotipik değişiklikler elucidating çok değerli olduğu kanıtlanmıştır unutmamak gerekir. Bu makale, biz nasıl video mikroskobu teknikleri örnekleri modelleri, en yaygın Dahl tuz-duyarlı (SS) doğuştan rat sıçan bir gerginlik de dahil olmak üzere değerli sıçan çeşitli damar fonksiyonu ile ilgili önemli bilgi vermişlerdir sağlar deneysel model tuz hassas hypertenson18,19,20,21,22,23mekanizmaları incelemek için kullanılır; ve SS sıçan tuz-duyarlı Brown Norveç (BN) fare zorlanma ile seçici ıslahı yoluyla oluşturulan consomic sıçanlar. Consomic fare panelleri her kromozom Dan Brown Norveç sıçan introgressed tek tek Dahl SS24,25,26 genetik arka plana olmuştur. Consomic fare paneller kullanımı ile ilgili kan basıncı ve vasküler reaktivite24,25,26 da dahil olmak üzere diğer fenotipleri tuz duyarlılığını katkıda belirli kromozomlar değerli ipuçları sağlamıştır ,27,28.

Seçici üreme stratejileri kullanmak SS fareler ve bireysel BN kromozomu taşıyan consomic fareler de genetik Dahl SS içine bireysel Brown Norveç kromozomlar introgressed küçük parçalarla daralmış congenic suşları nesil etkinleştirdiyseniz arka plan22,29. Bunlar son derece değerli giriş üzerinde belirli genler sağlamak veya tansiyon, böbrek hasarı ve vasküler reaktivite22,29gibi çok önemli fizyolojik değişkenler etkileyebilir kromozomlar bölgelerinde daraltabilirsiniz. Bir diğer güçlü yanı sıra sıçan genetik araç kutusu sıçan gene nakavt modelleri düzenleme teknikleri ZFNs, transkripsiyon harekete geçirmek-gibi-efektör enzimler (TALENS), dahil olmak üzere Gelişmiş gen kullanan bir gelişmedir ve en son CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Gen nakavt çalışmalar bugüne kullanılan (ve kullanmaya devam) fareler içinde sıçan nakavt genler etkinleştirmek bu güçlü teknikleri gelişiyle son derece önemli bir gelişme çünkü neredeyse sadece. Bugünkü gazetede başka bir deneysel bileşeni cannulated arter teknikleri ve fizyolojik kontrol mekanizmalarını ana antioksidan ve hücre koruyucu transkripsiyon eksik nakavt Sıçanlarda değerlendirmek için video mikroskobu değerini gösterir faktör, nükleer faktör (erythroid elde edilen 2) - gibi - Sprague-Dawley genetik arka plan17' TALEN teknolojisi kullanılarak geliştirilen 2 (NRF2)30,31. Bu deneylerin vitro video mikroskobu teknikleri NRF2 gen kaybı fonksiyonel doğrulama sağlamak için ve potansiyel olarak değerli bir tedavi yaklaşımı NRF2-aracılı antioksidan doğrudan upregulation üzerinde dayalı test etmek için kullanılmıştır Savunma. NATO Mukabele Gücü 2 mücadele vasküler oksidatif stres insanlarda klinik çalışmalarda antioksidan vitamin C ve E32gibi doğrudan yönetimi ile ilgili hayal kırıklığı yaratan sonuçlar ışığında önemli terapötik önemi var.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Medical College of Wisconsin kurumsal hayvan Care ve kullanım Komitesi (IACUC) tüm iletişim kuralları bu yazıda açıklanan onaylanıp tüm yordamları Ulusal kurumları Sağlık (NIH) Office, laboratuvar hayvan refahı (OLAW ile uyumlu) düzenlemeler.

1. hazırlık çözümler ve gemi odası

  1. Bir dizi deney gerçekleştirmeden önce yoğun tuz stok çözüm 278 g/L NaCl oluşan x 20 2 L hazırlamak; 14 g/L KCl; 11.52 g/L MgSO4. 7H2O; ve 9,4 g/L CaCl2. 2H2o Ayrıca 20 konsantre arabellek hisse senedi 80.8 g/L NaHCO3 ve 0.4 g/M EDTA oluşan x 2 L hazırlamak ve 20 x 2 lt konsantre Ca2 +-ücretsiz stok çözüm oluşan 281.6 g/L NaCl; 14 g/L KCl ve 11.52 g/L MgSO4. 7H2O.
    Not: 20 X hisse senedi çözümler kadar kullanmak buzdolabında saklanabilir.
  2. Deneme günü, fizyolojik tuz solüsyonu (PSS) 2 lt konsantre hisse senedi çözümleri x 20 aşağıdaki gibi hazırlamak: 1.800 mL deiyonize su 2 L Erlenmeyer şişesi veya motorlu karıştırma tabakta kabı 20 tuz stok x 100 mL ekleyin. N2ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırarak denge, sürekli olarak % 21 O2, % 5 CO2içeren bir gaz karışımı ile çözüm sıcaklığına süre 20 x arabellek stokunun 100 mL ekleyin. Yavaş 0,28 g NaH2PO4 pH izleme sırasında ekleyin; Pasteur pipet 6 N HCl veya 6.5 N NaOH çözüm damla ekleyerek pH 7.4 gerektiği gibi ayarlayın. PSS hazırlanır ve pH ayarlanır sonra 1,98 g glikoz PSS için ekleyin.
    Not: Yavaş NaH2PO4 son süre çünkü PSS pH izleme eklemek önemlidir NaH2PO4 alkalin çözümlerine ek (pH > 7,4) Kalsiyum fosfat çökelti tarafından belirtildiği şekilde formu bulutlu bir çözüm veya alt kapsayıcı bir beyaz çökelti görünümünü.
    Not: 119 mM/M NaCl PSS nihai bileşimi olduğunu; 4.7 mM/M KCl; 1.17 mM/M Mg2kadar4; 1.6 mM/M CaCl2; 1,18 mM/M NaH2PO4; 24 mM/M NaHCO3; 0,03 mM/M EDTA; ve 5.5 mM/M glikoz. PSS bileşimi laboratuvarlar arasında farklı olsa da, bu tarifi son derece vasküler sesi, endotel fonksiyonları ve yanıt izole direnç arterler vazoaktif acentelere korumak için uygundur.
  3. Maksimum çapı belirlemek ve geminin maksimum genişleme üreterek arter etkin sesi değerlendirmek için Ca2 +500 mL hazırlamak-PSS 20 X Ca2 +25 mL ekleyerek ücretsiz-ücretsiz 450 mL deiyonize su tuz stok , 20 x 1,2 yukarıdaki adım için bir Erlenmeyer şişesi veya ölçek benzer arabellek stokta 25 mL izledi. NaH2PO4 0,07 g izleme ve çözüm pH ayarlama ekleyin. Ca2 +-ücretsiz PSS normal PSS gemi yanıtları etkileyebilir intrasellüler Ca2 + depoları tüketen önlemek için deney sonunda PSS rezervuar ve gemi odası için eklenir. Çünkü Ca2 +-özgür eriyik için PSS glikoz eklemek gerek yoktur arterler, en fazla gevşeme üretmek için deney sonunda eklenir.
    Not: Otelde tamamlamak, Ca2 +son kompozisyon-ücretsiz PSS olduğunu 120.6 mM/M NaCl; 4.7 mM/M KCl; 1.17 mM/M Mg2kadar4; 1,18 mM/M NaH2PO4; 24 mM/M NaHCO3; 0 mM/M CaCl2; ve 0,03 mM/M EDTA.
    Not: maksimum genişleme arter gerektiren birçok çalışma için verapamil (1 µM) gibi bir kalsiyum giriş pencere engelleyicisi ve/veya sodyum nitroprusside (10 µM) gibi nitrik oksit donör Ca2 + kaldırma PSS yanı sıra çözüm, eklenebilir.
  4. PO2, PCO2ve PSS pH sürekli izole aort Yüzükler, bağırsak düz kas veya diğer dokularda (şekil 1) çalışma için kullanılan standart organ banyo gemi odasında akan PSS sıcaklığına tarafından korumak. Çünkü bu tür tüp gaz geçirmez, birçok diğer formları boru, örneğin, lateks aksine sentetik floropolimer tetrafluoroethylene boru gaz tankı organ Banyosu bağlanın.
  5. Küçük bir hava denge gaz karışımı PSS gaz kompozisyon korumaya yardımcı olmak için gemi odasında bağlı taş yerleştirin.
    Not: Gemi yanıt PO2 ' deki değişiklikler için PSS gemi odası ve luminal perfusate O2, örneğin, %21 O2, %10 O2, %5 O2 çeşitli oranlarda içeren gaz karışımları ile sıcaklığına tarafından test edilecek ve O %02, % 5 CO2 ve denge N233,34,35. Nerede gemi duvar ortasına içine Oksijen difüzyon bir sınırlama olabilir, daha kalın duvarlı büyük arterler için oksijen, örneğin, % 95'i O2 yüksek oranda kullanılabilir.
  6. Gemi oda sıcaklığında yakından izlemeniz bireysel odaları ısı transfer özellikleri içinde değişebilir.
    Not: cannulated direnç arterler çalışmaları için kullanılan birçok ticari olarak hazırlanan gemi chambers oksijenli PSS bir gaz equilibrated rezervuar ve banyo sıcaklığı çok hassas kontrol ve oxygenation sağlarız için Peristaltik pompa kullanmak. PSS.
  7. PSS bir tıpa ve sürekli ısıtır ve gaz Sakinleştiği-gemi Odası (şekil 1A) akan PSS organ Banyosu içine PSS sunmak için bir depo olarak hizmet için Merkez cam tüp ile büyük bir (2 L) Mariotte şişe yerleştirin.
  8. Merkez cam tüp açılışı bir sabit hidrostatik basınç kafa'PSS dır organ Banyosu içine korumak için PSS organ banyoda üst olarak aynı düzeyde Mariotte şişe yerleştirin. Kullanım polietilen boru J şeklinde cam veya plastik tüp PSS Mariotte şişeden organ banyo içine sunmak için bağlı.
  9. 60 cc plastik enjektör istenilen giriş basıncı (genellikle 80 mmHg sıçan beyin Etütler tutar bir konuma yükseltilmiş oluşan bir PSS rezervuar giriş akımı pipet bağlamak için polietilen boru (şekil 1A) luminal perfüzyon için kullanın arterler) bir basınç ile ölçüldüğü şekilde, dönüştürücü bir stopcock üzerinden sisteme bağlı.
  10. Yanıt olarak bir basınç gradyan gemi akışı için PSS izin vermek için polietilen boru çıkış pipet bağlanmak ve bir rezervuar giriş akımı havzanın benzer için çıkış hattı bağlayın. Çıkış basıncı ölçmek için benzer stopcock ve basınç detektörler bağlantı kullanın.
    Not: aşağıda bölüm 2, transmural basınç ayarlama ve gemi ile akışı denetlemek için yordamlar açıklanmıştır.
  11. Deney sonunda, odası, teslimat çizgileri ve rezervuar sistemleri distile su ile iyice durulayın. Sık aralıklarla boru ve dağıtım hatları, temiz yerine veya kesme muslukları sistemdeki yerini ve düzenli olarak herhangi bir cam PSS rezervuarlar bakteri ve kirlenme neden diğer mikroorganizmaların gelişimini önlemek için bir asit yıkama için konu ve gemi reaktivite etkiler.

2. cannulated arter hazırlık

  1. Sprague-Dawley rat ile %5 isoflurane anestezi ve % 1.5-2.5 tıbbi oksijen36kullanarak anestezi korumak. Alternatif olarak, ketamin (75.0 mg/kg), acepromazine (2.5 mg/kg) ve xylazine (10.0 mg/kg); içeren bir kas içi enjeksiyon yönetmek mayi enjeksiyonu Fentobarbital (50-60 mg/kg); ya da anestezi, iletişim kuralları ve/veya araştırmacı tercihleri bağlı olarak herhangi bir onaylanmış diğer yöntem.
  2. Fareyi derin anestezi altında başını kesmek ve beyin beyin direnç arterler çalışmaları için kaldırın.
  3. Beyin kaldırıldıktan sonra dikkatli bir şekilde orta serebral arter (MCA) (veya başka damarların faiz, örneğin, baziler arter veya posterior serebral arter) ayırma37,38. MCAs yalıtmak için beyin sırtüstü buz gibi PSS (Şekil 2) ile dolu cam Petri kabına yerleştirin.
  4. Kenasen makas ve Dumont #5 iyi ipucu forseps MCA beyin düşük tüketim için kullanın.  Forseps kullanarak MCA herhangi bir kalıntı beyin dokusundan temiz ve PSS daha önce açıklandığı gibi içeren bir sıcaklık kontrollü gemi odası arter aktarmak. 33 , 34  .
  5. Arter gemi odasına aktarmak için yavaşça ACA veya posterior iletişim arter kesimi tarafından çıkarılan gemi tutun ve dikkatli bir şekilde odanın içine yerleştirin.
    Not: ek olarak MCA, cannulated damar sistemi küçük gemi hazırlıklar, iskelet kas direnci arterler33,39,40, Mezenterik direnç arterler de dahil olmak üzere çok çeşitli için uygundur 38 , 41 , 42ve büyük (ilk sipariş) arteriyoller cremaster kas43, aynı zamanda insan koroner arteriyoller ve insan arteriyoller gluteal biyopsi44,45sırasında, deri altı Yağ dokusundan elde 46,47.
  6. Arter giriş akımı micropipette MCA Lümen belgili tanımlık uç gelişmeler kadar pipet Bankası doğru çekerek ekleyin. Arter giriş akımı pipet üzerinde daha önce üzerinden 10-0 dikişler arter (şekil 1B) çevresinde alay bir tek iplikçik lif hazırlanan bir döngü bağlayarak güvenli. MCA için çıkış pipet karşı tarafındaki diğer ucuna gemi (şekil 1B) çevresine ikinci bir dikiş daire sıkma tarafından güvenli.
    Not: gemi montaj öncesinde MİKROPİPETLER dikiş döngüler yerleştirin ve onları eki son noktaya yakın pozisyon, onları kolayca arter kaymış ve gemi konuma geldiğinde hızlı bir şekilde güvenli izin, hangi en aza indirir riskini arter Pipetler kayar.
    Not: MİKROPİPETLER borosilikat cam Kılcal Boru (2 mm dış çap; 1 mm iç çapı 10 cm uzunluğunda) üzerinden hazır mısın bir dikey micropipette çektirmenin kullanarak. Arter bağlama önce MİKROPİPETLER uç çapı perfüzyon sistemi giriş ve çıkış direnç uyuşmazlıkları önlemek için mümkün olduğunca yakından eşleşir.
  7. Arter MİKROPİPETLER için güvenli bir şekilde bağlı sonra giriş akımı pipet sahibine bağlı mikrometre arter, in situ uzunluğu ile germek için kullanın.
  8. Tüm yan dalları tek iplikçikler arter sabit bir basınç korumak için 10-0 dikişler alay ile kravat.
  9. Sızıntıları yokluğunda geçici olarak giriş akımı pipet kapattıktan sonra intraluminal (transmural) Basınç sabit kalır emin olarak doğrulayın. Herhangi bir şube kravat veya basınç düşerse gemi delikler için kontrol edin. Perfüzyon transmural basınç sabit kalır doğruladıktan sonra geri yükleme.
    Not: İzole direnç arter Cannulation el becerisi ve pratik gerektirir. Uyması gereken ana önlemler Pipetler bozulmaması için ve Arter Pipetler slayt değil emin olmak için vardır. Travma gemisine endotel zarar verebilir gibi bütün prosedür boyunca izole arter ile nazik olmak önemlidir ve/veya vasküler düz kas normal fonksiyonu ile müdahale.
  10. Bir video kamera diseksiyon mikroskop için bağlı ve bağlı bir video mikrometre ve televizyon İzleyicisi (rakamlar 1B, 1 C) oluşan bir video mikroskobu kurulumu (şekil 1A) kullanarak arter iç çapını ölçün. Bu gemi çapları el ile atardamar iç duvarında hareketli referans çizgileri yerleştirerek ölçmek gözlemci sağlar ve Arter de, dış duvarında damar duvar kalınlığı ölçmek için isterseniz,.
    Not: Bazı video mikrometre gemi boyutları otomatik izleme sunuyoruz.
    Not: video mikrometre mikroskop sahne mikrometre ve girişi ile kalibre ve basınç güç çeviriciler, doğru ölçümler amacıyla deneyler arasında bir cıva Manometre (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg ve 200 mmHg) ile çıkış Damar çapı ve intraluminal basınç.
    Not: Standart kontrol transmural basınç sıçan MCA deneyler için 80 mmHg dir. Yüksek ve düşük basınç düzeyleri için kalibrasyon doğruluk transmural değişikliklere myogenic tepkilerin Etütler sonuna kadar dilate arterlerin basınç ve pasif basınç-çapı eğrileri sağlar.
  11. İstenen transmural basınç sabit bir seviyede korumak için giriş ve çıkış rezervuarlar yüksekliğini ayarlayın. Giriş akımı rezervuar küçük bir miktar (< 5 mmHg) tarafından yetiştirme ve çıkış rezervuar aynı oranda düşürülmesi demek transmural basınç tutar ve gemi Lümen6' perfüzyon akımı oluşturur.
    Not: giriş akımı rezervuar yetiştirme ve çıkış rezervuar tarafından eşit tutarlar düşürücü aynı ortalama transmural basınç arter distending korur, ancak akışı ve yamultma stres gemi içinde neden olan hidrostatik basınç degrade oluşturur izin intraluminal kesme stres farklı deneysel grupları48yılında değişikliklere endotel bağımlı yanıtları değerlendirmek için dedektif.
  12. Myogenic yanıt-e doğru ve gemi yanıt vazodilatör uyaranlara için değerlendirmek için arter etkin sesi (yaklaşık % 40) uygun bir düzeyde önce deneme sergiler emin olun. Gemiler, örneğin, normalde aktif dinlenme sesi sergi değil küçük Mezenterik arterler hariç istirahat etkin sesi eksik herhangi bir damar atmak.
    Not: normal spontan sesi sergi değil kapları, damar norepinefrin veya phenylephrine gibi bir vasoconstrictor agonist kullanan bir eşdeğer miktarda önceden daraltır. İyi bir yaklaşım arter önceden sıkmak için kullanılan agonist doz seçimi bir vasoconstrictor aracı, örneğin, norepinefrin41,42EC50 doz kullanmaktır. Ancak, farmakolojik vasoconstrictor aracıları için koşullar istirahat altında spontan aktif sesi sergi arterler uygulanmamalıdır.
  13. ACh konsantrasyonları artan ek sırasında gemi çapları ölçülerek cannulated direnç arterin endotel bağımlı reaktivite testi (10-10 M-10-5 M) gemi Odası'na. Nitrik oksit donör sodyum nitroprusside için (10-10 M-10-5 M) konsantrasyonları artan eklenmesi sırasında gemi çapları ölçülerek vasküler düz kas ve endotel bağımsız nitrik oksit duyarlılık testi gemi odası.
    Not: Vasoconstrictor ajanları ve diğer vazodilatör agonistler duyarlılık benzer şekilde gemi odasına agonist artan konsantrasyonları ekleyerek test edilebilir.
    Not: vazoaktif aracıları yanı sıra çeşitli ilaçlar, inhibitörleri ve diğer farmakolojik ajanlar doku banyo ve/veya luminal perfusate için eklenebilir. PO2 (yanı sıra PCO2 ve pH) değişiklikleri seçerek endotel yan veya arter ekstra luminal tarafına luminal perfusate ayrı denge tarafından bir kalibre edilmiş gaz karışımı bağlı bir hava taşı ile yönetilemez duruma gelir karışımından farklı doku banyo33,34,49PSS equilibrate eskiden. Transmural basınç değişikliklere myogenic yanıt çalışılabilir çıkım pipet kapatma ve yetiştirme (veya düşürmek) PSS rezervuar yüksekliğini bağlı için giriş akımı pipet49,50,51 artırmanız veya azaltmanız intraluminal basınç.
  14. Gemi yanıt belirli uyaranlara için arabuluculuk endotel rolünü sınamak için vasküler endotel kaldırmak ve endotel içinde gemi yanıt bu uyaranlara karşı karşılaştırın. Endotel kaldırmak için dikkatli bir şekilde çıkış pipet arterin çöz ve yavaş yavaş arter ile bir hava bolus Lümen sıvı (0.5-1.0 mL). Hava perfüzyon sonra hücresel enkaz çıkım pipet43gemi yeniden bağlama önce temizlemek için PSS perfüzyon geri.
    Not: endotel denudation yordamı izleyerek bu endotel vasküler yanıt için bir agonist (genellikle ACh) endotel bağımlı vazodilatasyon o gemi türü üretmek için bilinen test ederek kaldırıldığını doğrulamak önemlidir. Ancak, patolojik belirli koşullarda endotel bağımlı vasoconstrictors, bu durumda, yılanı yanıtta endotel kaldırma aşağıdaki elenirse doğrulamak önemlidir serbest bırakılır.
  15. Deney sonunda, Ca2 +ekleyerek arter maksimum çapı belirlemek-PSS ücretsiz olarak perfusate ve superfusate. Aktif dinlenme sesi (%) olarak ((Dmax-Ddinlenme) / dmax) x 100 Dmax nerede huzurunda Ca2 +maksimum çapı, hesaplamak-ücretsiz çözüm ve Ddinlenme denetim çapı olduğunu .
    Not: Farklı deneysel gruplarındaki sonuna kadar rahat arter çapı ölçümleri aktif dinlenme sesi, yapısal modelleme (Yani, değişiklikleri duvar kalınlığı ve Lümen çapı) ve pasif mekanik özellikleri karşılaştırma değerli (stres gerginlik ilişkileri transmural basınç farklı düzeylerde pasif çapları hesaplanır).

3. serebral kan akımı yanıt LDF ile değerlendirilmesi

  1. %5 isoflurane hayvanla anestezi ve stereotaksik aparatı9,10köstebeğiyle güvenli.
  2. Hayvan sürekli anestezi altında nefes sıklığı, sonunda tidal CO2ve bir ayak çimdik36ile anestezi derinliği izleme sırasında korumak.
  3. Dikkatle optik bağlantı10sağlamak için bir düşük hızlı diş matkap ve mineral yağ kullanarak transparans kafatası ince. Aşırı ısı oluşturulmasını engellemek için ve kemik Penetran önlemek için dikkatli olun.
    Not: kafatası inceltme lazer ışık temel doku ulaşmak için ve hangi büyüklüğünü hareketli parçacıklar (Yani, kırmızı kan hücreleri) sayısına göre belirlenir Doppler kayması ölçmek amacıyla sondayı geri yansıması için izin verir ve onların hız.
  4. Bir micromanipulator LDF soruşturma güvenli ve doğrudan kafatası inceltilmiş alan üzerinde konumlandırın. Deneme sırasında LDF akışı dokunun bir kısıtlı alana ölçmek için tasarlanmıştır ve hareket eserler için son derece duyarlıdır LDF sonda veya hazırlık kendisi, hareketi önlemek çok önemlidir.
    Not: İlk konumuna uzak sonda herhangi bir hareketi kan akımı karşılaştırmalar iyileştirmelerden dokusunun farklı bir alanda bir tahmin sağlar. LDF mutlak akışı değerleri desteklemiyor ve konular arasında karşılaştırma için uygun değildir iken, Noninvazif doku perfüzyon yanıt olarak deneysel müdahaleler bireysel konularda değişiklikler değerlendirmek için mükemmel bir yoldur; ve ortalama ve deneysel diğer gruplardaki denetiminden LDF sinyal değişiklikleri göre göreli LDF sinyal kontrol değerlerden değişimler.
    Not: LDF farklı deneysel grupları8,9,10bütün vasküler yatağın düzeyinde kan akışını düzenleyen etkenler bir anlayış kazanmak için uygun bir yaklaşımdır. Doku perfüzyon LDF ile değerlendirilmesi tüm yatak perspektif içine izole kap çalışmalardan elde bilgi özümsemek için pratik bir yaklaşım sağlar. Bölgesel vasküler kontrol mekanizmaları arasında farklılıklar direnç arterler ve mikro, LDF ile elde edilen ölçümler genellikle ile elde edilen sonuçlar ile tutarlıdır doku kan akış denetimi iyi bir gösterge sağlar. cannulated arter hazırlıklar.

4. Kas iskelet Microvessel yoğunluğu GS1 lektin ile değerlendirilmesi

  1. Cremaster kas erkek bir sıçan gelen testis açık standart iyi Cerrahi makas ile kesme ve sonra kas kavramak için Dumont #5 forseps kullanarak kaldırın.
    Not: Bütün lektin çalışmaları için artarken ince kas (örneğin, cremaster kas, hem de hem erkek hem de dişi fareler içinde bulunan ekstansiyon digitorum longus ve tibialis anterior kaslar) ideal kullanım için her ne kadar histolojik uygundur bölümleri daha kalın doku için kullanılabilir.
  2. Cremaster kas kullanarak tek bir kesim testis kaldırın. Buz gibi PSS yerleştirin ve pin dışarı üstünde belgili tanımlık dip yüzeyi içinde silikon elastomer kaplı bir petri içinde. Yavaşça uzakta bağ dokusu Dumont #5 forseps kullanarak alay.
  3. Kas örnekleri 2 mL tamponlu PSS ile durulayın ve sonra onları rodamine etiketli GS1 lektin (20 µg/mL PSS) bir 12-şey hücre kültür plaka 2 mL ile 50 dakika bırakın/de bu ışık dışlamak için alüminyum folyo sarılır.
  4. Dokular lektin çözümden kaldırmak, 5 min incubations üzerinde bir rock'çı "yıkama" ile PSS içinde üç kez yıka ve mikroskop slaytlarda mount. Karanlık ve dokularda kuluçkaya ve slaytları Floresans kaybını önlemek için karanlıkta saklamak emin olun.
    Not: slaytlar hemen kullanılamıyorsa, onlar Floresans kaybı olmaksızın buzdolabında saklanır. Uzun süreli depolama için bozulma11önlemek için bir dondurucuya slaytlara tutulabilir.
  5. Microvessel yoğunluğu üzerinde görüntü52üst üste bilgisayar tarafından oluşturulan kılavuz çizgileri veya slaytları görüntülemek için kullanılan monitör üzerinde üst üste bir açık ızgara kaplaması ile Etiketlenmiş yüzdeki kavşak sayısı sayarak değerlendirin.
    Not: GS1 lektin yaklaşımlar göstermek için kullanılmıştır: mikrovasküler rarefaction tuz kaynaklı53, tuz engelleyen koruyucu etkisi indüklenen tuz beslenen hayvanlar17 microvessel dansitesi yeniden Anjiyotensin II bastırma ,53,54; NRF2 düşük doz Anjiyotensin II infüzyon tuz beslenen sıçanlar17microvessel rarefaction önlemek için koruyucu etkisi arabuluculuk rolü; ve ayrıca fareler54,55II anjiogenik yanıt tuz Kronik kas stimülasyonu için korumak anjiyotensin rolünü değerlendirmek için beslenir. GS1 lektin tekniği bir avantajı cannulated direnç arterler veya LDF çalışmaları için kullanılan aynı hayvanlar microvessel dansitesi değerlendirmek için kullanılabilir olması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vitro mikroskopi cannulated direnç arter normal vivo içinde transmural basınç ve parenkimal hücre yokluğu küçük direniş arterler (ve daha büyük arteriyoller) etkin sesi etkileyen faktörler çalışma sağlar etkiler. Reaktivite damarları çeşitli vazodilatör ve vasoconstrictor bizi canlı tutan ve myogenic yanıt transmural basınç yükselmesi normal PSS, Ca2 +içinde değerlendirilmesi yanı sıra-ücretsiz PSS perfusate ve sonunda superfusate eklendi en büyük damar çapı ve duvar kalınlığının belirlemek için deneme. İkinci ölçümleri vasküler remodeling, Yani, kan basıncı veya yönetim farmakolojik ajanların değişiklikler ortaya çıkabilir duvar/Lümen oranı değişiklikleri değerlendirirken son derece değerlidir. Ca2 +sonuna kadar genişlemiş damarlarının çapı ölçümleri-ücretsiz PSS x 100, iç sesi ((Dmax-Ddinlenme) / dmax) olarak hesaplamak yararlı Dmax ve Ddinlenme maksimum (Ca2 +- nerede PSS ücretsiz) ve çapı (PSS), sırasıyla, (MCA için genellikle 80 mmHg) denetim denge basınçta dinleniyor. Deneyim, MCA etkin sesi yaklaşık %40 80 mmHg transmural basınç ortalamasını alır. Sonuna kadar dilate arterlerin Çap ölçüm çapı ölçerek damarları pasif mekanik özelliklerini değerlendirmek için pratik bir yol da arter transmural basınç distending ve sonuçları kullanarak farklı düzeylerinde stres gerginlik ilişkileri ve damarları7,56diğer mekanik özellikleri hesaplayın.

Şekil 3 ek seçici ıslahı yaklaşımlar kullanarak SS.13BN sıçan gelen türetilen üç daralmış congenic suşları, şematik bir gösterimidir. Bu sıçan suşları kromozom segmentleri de Brown Norveç renin alleli (Ren1-BN) dahil veya hemen üstünde (Ren1-SSA) veya hemen altında (Ren1-SSB) renin gen locus kesik (böylece SS renin alleli istinat vardır). Bu29çalışma, Brown Norveç renin gen içeren kromozom segment sadece 25 genler yer.

Şekil 4 endotel bağımlı vazodilatör ACh cevaben gösterir (1 µM) izole MCAs erkek Dahl SS rats ve üç şekil 3' te gösterilen congenic suşları daralmış. (Ren1-BN) dahil etmek veya sadece (Ren1-SSA) kesilir veya (Ren1-SSB) renin gene faiz (Yani, çevresi renin gen locus) bölgenin yaklaşık 25 genler için sınırlı bu üç congenic suşları kombine kullanımı. Bu deneylerin hayvanlar normotansif ve düşük tuz beslenen (% 0,4 NaCl) diyet. Çalışma29 endotel bağımlı dilatasyon ACh için yapıldı yok SS ebeveyn zorlanma ve her iki congenic suşları SS renin alleli istinat, ancak SS genetik arka planda BN renin alleli taşıyan congenic zorlanma restore edildi. Bu çalışmanın sonuçları daha önceki çalışmalar SS.13BN consomic fareler57,58 kullanan bulguları desteklenen ve güçlü kanıtlar bu endotel disfonksiyonu sağlanan normotansif olduklarında bile SS fareler mevcuttur ve düşük tuz diyet beslenen. Alınan birlikte, bu çalışmalar29,57,58 sonuçlarını hipotezini disfonksiyon endotel SS Rat destek Engelli, düzenleme, kronik maruz kalma düşük sonuçlanan renin gen kaynaklanmaktadır Anjiyotensin II kan düzeyleri.

Şekil 5' te, özetlenen başka bir çalışma59, endotel bağımlı vazodilatör ACh izole MCAs (MCA) yanıt erkek Dahl SS rats ve kromozom 5 (içeren Brown Norveç genlerini taşıyan SS.5BN consomic rats karşılaştırıldığında çeşitli izoformlarının sitokrom P450-4A ω-hidroksilaz, için). Bu çalışmada, hayvanlar ya da düşük bir tuz beslenen edildi (% 0,4 NaCl) veya yüksek tuz (%4 NaCl) diyet. SS fareler gelen MCA aksine, endotel bağımlı dilatasyon ACh için düşük tuz diyet beslenen SS.5BN consomic sıçanlarından emir MCA içinde devam edildi. Buna ek olarak, (ve tersine SS.13BN consomic fareler57,58, Sprague-Dawley Rat33,39,40,60ve altın hamster sonuçları 61), yüksek tuz diyet ACh kaynaklı genişleme bu CYP450-4A ω-hidroksilaz gösteren SS.5BN Sıçanlarda ortadan kaldırmak başarısız oldu ve 20-hydroxyeicosatetraenoic asit (20-HETE) çoğu önemli katkıda bulunan damar oksidan stres ve endotel disfonksiyon SS fareler ve yükseklikler diğer suşların diyet tuz alımı sırasında. Deneysel bir bakış açısından, yüksek tuz diyet başarısızlık endotel bağımlı dilatasyon ACh için ortadan kaldırmak için nasıl çalışmalar cannulated direnç arter geleneksel bilgelik yola beklenmeyen bulgular üretebilir bir örnek sağlar ve karmaşık kontrol mekanizmalarını etkileyen çok önemli bu gemiler fonksiyonu yeni bir anlayış neden olabilir.

Şekil 6 ACh için izole MCA tepki gösterir (1 µM) vahşi türü ve Nrf2(- / -) nakavt fareler düşük tuz diyet beslenen (% 0,4 NaCl), yüksek tuz diyet (%4 NaCl), veya bilinen NRF2 harekete geçirmek30,62 içeren yüksek tuz diyet . Oksidatif stres tuz kaynaklı yokluğunda, ACh kaynaklı dilatasyon vahşi türü ve Nrf2(- / -) nakavt fareler MCA içinde benzer. Sprague-Dawley sıçan önceki çalışmaların sonuçları ile uyumlu, yüksek tuz diyet ACh kaynaklı dilatasyon vahşi türü ve Nrf2(- / -) nakavt fareler ortadan kaldırılmıştır. NRF2 uyarıcı yüksek tuz diyet yanı sıra endotel bağımlı dilatasyon vahşi türü fareler ama nakavt Sıçanlarda Nrf2 gen başarılı kaldırılması gösteren değil Nrf2(- / -) fareler, ACh için geri, ve vasküler oksidatif stres iyileştirmek için bir tedavi yaklaşımı olarak NRF2 up-düzenleyiciler kullanımını destekleyen.

Şekil 7 LDF ölçümleri pial mikrosirkülasyon yanıt-e doğru ikisinden biri üstünde tutulan Sprague-Dawley Rat art arda gelen kan hacmi para çekme tarafından üretilen arteryel kan basıncında ilerici indirimleri karşılaştırma sonuçlarını özetler normal tuz (% 0,4 NaCl) diyet ya da yüksek tuz (%4 NaCl) diyet dört hafta için. Düşük tuz diyet beslenen sıçanlar aksine, fareler yüksek tuz diyet sergi indirimleri mekanizmalarının serebral kan akımı autoregulation için sorumlu olduğunu belirten perfüzyon basıncındaki sırasında sürekli kan akışını korumak için Engelli bir yetenek beslenen uzun süreli maruz kalma yüksek tuz diyet tarafından ele geçirildi. Bu deneylerin sonuçlarını izole serebral arterler tuz beslenen sıçanlar60 Engelli vasküler gevşeme mekanizmalar varlığı ile uyumludur ve nasıl LDF ölçüleri desteklemek ve genişletmek için istihdam edilebilir iyi bir örnek sağlar istihdam çalışmaların bulguları direnç damar düzeyine kadar tüm vasküler yatağın izole.

Direnç arter işlevi değerlendirme ek olarak izole arter ve doku perfüzyon lazer-Doppler flowmetry, microvessel yoğunluğu ve kronik kas uyarımı54, gibi çeşitli uyaranlara karşı anjiogenik yanıt-e doğru kullanma kullanma 55 seçmeli olarak arteriyoller ve kapiller membran glikoprotein moieties bağlar fluorescently etiketli GS1 lektin, kullanan hayvanlarda değerlendirilebilir. Şekil 8 tipik lektin 2 hafta (Not yüzdeki yüksek tuz beslenen Sıçanlarda düşük yoğunluk) düşük tuz diyeti veya yüksek tuz diyet beslenen Sprague-Dawley Rat cremaster kas boyama gösterir. Microvessel yoğunluğu lektin etiketli yüzdeki bir bilgisayar tarafından oluşturulan başvuru kılavuz52ile Kavşakları sayarak değerlendirildiğini ve anjiogenik yanıt54,55 değerlendirmek için mükemmel bir yöntem sağlar veya algılamak ve yüzdeki hipertansiyon ve yükseltilmiş diyet tuz tüketiminizi12,17,53gibi koşullarda kaybı ölçmek.

Figure 1
Şekil 1: Vitro video mikroskobu Kur izole, cannulated direnç arterler(a)çalışmaya istihdam. Cannulated direnç arter cam MİKROPİPETLER (B) ve Lümen çapı ölçümü cannulated direnç arter (C) gösterilen video mikrometre ekran bağlı. Ölçek çubuğu Panel b cannulated arter (µm) iç çapı, ve Panel c 125 µm ekran görüntüsünü el ile atardamar iç duvarları üzerinde deney gözlemci tarafından yerleştirilen hareketli başvuru çizgiler arasındaki uzaklığı . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Beynin orta serebral arterin yalıtma ve cannulation ile MİKROPİPETLER hazırlanırken yordamı şematik diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Küçük kesimleri Brown Norveç kromozom 13 introgressed Dahl tuz hassas genetik arka plana sahip daralmış congenic sıçan suşları şematik diyagramı. Kromozom kesimleri Brown Norveç renin alleli (Ren1-BN) yer alan veya sadece (Ren1-SSA) kesilir veya sadece (Ren1-SSB) renin gen odağı ve böylece SS renin alleli korumak. Bu şekil değiştiren ve Durand vd. yayımlanmaktadır 29 Amerikan Fizyolojik Derneği izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: İzole, tepki cannulated SS MCAs fareler ve congenic sıçan suşları için 1 µM asetilkolin ( Şekil 2' de gösterilmektedir). Veri denetim çapı asetilkolin önce dinlenme--dan ortalama çapı değişiklik (Δ µm) ±SEM olarak ifade edilir ve orijinal bir çalışma Durand vd tarafından replotted 29 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: 1 µM asetilkolin içinde hayvan izole, cannulated SS MCAs fareler ve SS.5BN consomic fareler yanıt beslenen düşük tuz (% 0,4 NaCl) veya yüksek tuz (%4 NaCl) diyet. Veri denetim çapı asetilkolin önce dinlenme--dan ortalama çapı değişiklik (Δ µm) ±SEM olarak ifade edilir ve orijinal bir çalışma Lukaszewicz vd tarafından replotted 64 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: Yanıt-e doğru 1 µM asetilkolin izole, cannulated MCAs Nrf2(- / -) nakavt fareler ve vahşi türü denetimlerin içinde düşük tuz diyet beslenen (% 0,4 NaCl), yüksek tuz diyet (%4 NaCl), veya bilinen NRF2 harekete geçirmek30, içeren yüksek tuz diyet 62. veri denetimi çapı asetilkolin önce dinlenme--dan ortalama çapı değişiklik (Δ µm) ±SEM olarak dile getirdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Serebral kan akımı pial mikro LDF tarafından değerlendirildi. Yüksek tuz diyet dört hafta boyunca tutulan Sprague-Dawley Rat önemli bir bozulma olarak arteryel kan basıncı yanıt olarak art arda gelen kan hacmi para çekme düşürüldü kan akışı sabit korumak için yeteneklerini sergiledi. Veri denetim ±SEM ortalama yüzde çizilen * p < 0,05 aynı düşük tuz diyet vs demek arteriyel basınç. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: Test sıçan cremaster kas rodamine etiketli GS1 lektin arteriyoller ve kılcal microvessel yoğunluğu değerlendirilmesi için tanımlamak için taşır. Cremaster kaslar düşük tuz beslenen Sprague-Dawley sıçanlarından emir elde (LS; % 0,4 NaCl) ya da 2 hafta boyunca (HS:4% NaCl) diyet tuz ve mikrovasküler rarefaction LS kontrollere göre HS beslenen hayvanlarda göstermek yüksek. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Giriş bölümünde de belirtildiği gibi bu kağıt televizyon mikroskobu açıklar ve izole direnç arter sadece standart fare modelleri (istihdam video gibi) vasküler işlevin yaklaşımlar, ama aynı zamanda son derece genetik olarak uzmanlaşmış roman ve bu yaklaşımları kullanarak elde edilebilir anlayışlar güçlü göstermek mühendislik sıçan suşları. Etkin sesi değerlendirmek için bu güçlü teknikleri kullanımı ve pasif mekanik özellikleri küçük direniş arterlerin vasküler kontrol mekanizmalarını endotel bağımlı yönetmelik de dahil olmak üzere geniş bir yelpaze ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir direnç arterler etkin tonda, vasküler düz kas fonksiyonu normal ve patofizyolojik koşulları ve Arter pasif Özellikler altında vasküler remodeling için ilgili ve vasküler duvar mekaniğinin değiştirir. Disfonksiyon endotel birden çok kardiyovasküler advers kardiyovasküler bağlı ölüm63de dahil olmak üzere insanlar güçlü bir prognostik göstergesi olarak gösterilen ve cannulated direnç arter hazırlıkları içinde özellikle değerlidir endotel fonksiyon bozukluğu tespit ve endotel disfonksiyonu mekanizmaları anlayışımız artan.

Azaltılmış bir sergi sıçan suşları Dahl tuz duyarlı (SS) fareler ve roman consomic bu tekniklerin kullanım örnekleri verdiğimiz vitro video mikroskobu teknikleri izole direnç arterler istihdam etkinliğini göstermek için Tansiyon için SS ebeveyn zorlanma24göre tuz duyarlılığını. Bu çalışmalar kan basıncı ve vasküler değişiklikler SS fare tuz duyarlılığını katkıda bulunmak özel ilgi vardır iki kromozom üzerinde genlerle ilgili damar kontrol mekanizmalarını araştırdık. Kromozom 13, renin gen18,22,29,57,58, taşıyan ve CYP450-4A ω-hidroksilaz64 izoformlarının için gen taşıyan kromozom 5, bu kromozom vardır ,65— Böbrek fonksiyonları üzerine ve vasküler reaktivite66,67,68üzerinde önemli etkileri vardır 20-HETE sentezler enzim. Sıçan genetik araç kutusu başka bir son ve güçlü ek sıçan gene nakavt modelleri de dahil olmak üzere Gelişmiş gen düzenleme teknikleri kullanan bir gelişmedir: ZFNs; Transkripsiyon harekete geçirmek-gibi-efektör enzimler (TALENS) ve en son CRISPR-Cas913,14,15,16,17. Vitro video mikroskobu modelinden çok önemli antioksidan ve hücre koruyucu transkripsiyon faktörü NRF2, bir Nrf2(- / -) nakavt sıçan izole MCAs çalışmaya bu teknikleri kullanan önemli sağlamıştır ve daha önce bilinmeyen bir yükseltilmiş yokluğu endotel disfonksiyonu tuz kaynaklı mekanizmaları içgörü kan basıncı17. Bu özel fare modelleri kullanarak deneyler belirli sonuçların önceki raporlar17,29,57,58,59, bir dizi açıklanan 60 , 64 , 65 .

O izole, cannulated direnç arterler çalışmaların son derece değerli işlev koşulları çeşitli altında kritik düzeyde önemli bu gemilerin düzenleyen mekanizmalar anlamakta açık olmakla birlikte, egzersiz çok önemli bir doğru ve güvenilir sonuçlar elde edilen sağlamak için önlemler sayısı. Serebral arterler ve direnç arterler diğer vasküler yatak birçok iç sesi sergi, bazı arterler (özellikle Mezenterik direnç arterler) yanıt-e doğru değerlendirmek için vasoconstrictors norepinefrin gibi ile önceden anlaşmalı olması gerekir vazodilatör uyaranlara ve daha doğru bir şekilde vivo içinde koşullar, gemilerin nerede adrenergic sinir terminaller yayımlanan norepinefrin gibi sinirsel ve humoral vasoconstrictor uyaranların etkisiyle simülasyonu. Bu nedenle, damar belirlenmesi için temel özellikleri ile tanıdık olmanız gerekir, ya edebiyat veya dikkatle ön deneyler yaptı. Çünkü endotel büyük arterler, küçük arterlerin ve mikro arteriyoller düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, endotel yalıtım ve cannulation arter sırasında zarar görmesini önlemek için dikkatli esastır. Klasik endotel bütünlüğü için ACh gemi genişleme neden gösteri testidir. Bir uyarı olduğunu oksidatif stres koşullarında damar endotel bozulmamış olabilir, ancak kapakların ACh için yoktur, süperoksit aşırı düzeyde vazodilatör yanıt önleme nitrik oksit çöpçülük çünkü. Bu gibi durumlarda, endotel bütünlük süperoksit leş gibi vazodilatasyon ACh ve diğer endotel bağımlı vazodilatör uyaranlara yanıt kurtarmalısınız tempol huzurunda ACh uygulama tekrar ederek doğrulanabilir. Ayrıca, bir dizi patolojik koşul endotel vasküler düz kas hücreleri daralma ve daralma arter neden maddelerin serbest bırakabilirsiniz; ve bazı durumlarda, endotel bağımlı dilatasyon (veya daralma) Siklooksijenaz metabolitleri, H2O2, epoxygenase metabolitleri, vbgibi diğer maddeler ile aracılık ettiği. Klasik bir endotel bağımlı vazodilatör veya vasoconstrictor madde için dilatasyon veya daralma arterin endotel kaldırma tarafından elenirse göstermek için testidir. Son olarak, çeşitli endotel bağımlı vazodilatör ve vasoconstrictor maddelerin kimlik genellikle belirli inhibitörleri veya leş yiyiciler, nitrik oksit sentaz, İndometazin inhibe etkisizleştirmek için L-adı gibi yönetimi tarafından tespit edilebilir oluşumu Siklooksijenaz metabolitleri, katalaz H2O2, thromboxane sentaz inhibitörleri, epoxygenase inhibitörleri ve/veya antagonistleri CYP450-4A/20-HETE yolun çöpçülük edecek.

Önemli (ve öğretici) da ölçmek için aktif miktarı tonlama deneme sonunda Ventriküler tarafından ve superfusing arter ile bir Ca2 +-PSS ücretsiz veya papaverin gibi güçlü vazodilatör aracı maksimal doz yönetme. Aktif tipik bir düzeyde sesi MCA içinde dinlenme, ((Dmax-Ddinlenme) / dmax) olarak hesaplanan x 100, şehridir yaklaşık % 40, Dmax ve Ddinlenme en fazla olduğu (Ca2 +-PSS ücretsiz) ve çapı (PSS), dinlenme sırasıyla denetim denge basınç (MCA için genellikle 80 mmHg). Bu işaretlerin damarları travmanın göstergesidir gibi gemi ile önemli ölçüde daha az etkin sesi veya gelen bir segmental boğumların veya dilations gösteren arterler analizinden, dışarıda bırakılır. Ca2 +sonuna kadar dilate arterlerin çapı ölçümü-ücretsiz çözüm ölçüm arter çapı ve hesaplama stres gerginlik ilişkiler tarafından damarlar pasif mekanik özelliklerini değerlendirmek için Dedektif iþlevlere transmural basınç sonuna kadar genişlemiş damarlarının7,56yılında sıralı yükselmeler sırasında. Bu pasif stres gerginlik ilişkileri kolayca elde edilir ve gemilerin mekanik özellikleri herhangi bir değişiklik değerli bir gösterge sağlar.

Pipetler, konektörler ve rezervuarlar tedarik boru temizlik kesinlikle başarılı deneyler için önemlidir. Bu bağlamda, deney tamamlandıktan ve durulama ve doku temiz banyo, teslim boru ve depolamak için kullanılan tüm rezervuarlar sıcak ve PSS gemi ulaşmadan önce gaz equilibrate sonra tüp dışında tüm çözümler temizlemek önemlidir odası. Kesme muslukları ve vanalar gönderim sistemi içinde Ayrıca temizlenmesi ve PSS taşıyan herhangi bir boru gerektiği gibi düzenli olarak değiştirildi. Klasik kirlenmiş Boru döşeme kalıp ve bakteri tarafından oluşturulan bir gri sis işaretidir; ve bu değişiklikler normal reaktivite bakteriyel kirlenme tarafından üretilen maddeler nedeniyle kan damarlarının kaybı eşlik eder. Ancak, bakteri ve diğer mikroorganizmalar tarafından kirlenme hala görünür herhangi bir kanıt yokluğunda mevcut olabilir.

Bizce mevcut kağıt son derece farklı vasküler yatak tüm önemli küçük direniş arterler çalışmalar için uygundur onur tekniklerin kullanılması için yararlı bir örnek sağlar. LDF ve microvessel yoğunluğu, değerlendirilmesinde GS1 lektin yöntemi gibi doku perfüzyon değerlendirmek için standart yaklaşımları ile birleştirildiğinde vitro video mikroskobu cannulated direnç arter içine son derece değerli bilgiler sağlar doku perfüzyon ve nasıl bunlar hastalık durumlarında değişmiş olabilir kontrol faktörler. Vasküler düz kas ve endotel fonksiyonları standart fare modelleri temel mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç sağlamanın yanında, bireysel direnç arterler çalışmaya video mikroskobu kullanımı ve diğer hayvan modelleri için uygulanabilir insan direnç arterler. İzole direnç arter roman genetiği fare modelleri video mikroskobu uygulama yanıt genlerin bir çok (ve büyüyen listesi) değiştirilmiş işlevine oluşan fenotipik değişiklikler anlamak için yeni kapılarını açıyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Acknowledgments

Yazarlar onların çok değerli yardımlarını bu yazının hazırlanmasında için samimi Katie Fink ve Lynn Dondlinger sayesinde hızlı.

Hibe desteği: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; ve #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

Tıp sayı: 130 direnç arterler endotel mikro tuz hipertansiyon beyin dolaşımı
Sıçan izole direnç arter Video mikroskobu kullanan vasküler kontrol mekanizmalarının değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter