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Medicine

Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133

Summary

Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.

Abstract

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie television in vitro pour évaluer la fonction vasculaire dans les artères isolées de résistance cérébrale (et d’autres bateaux) et décrit les techniques permettant d’évaluer la perfusion tissulaire en utilisant le Laser Doppler débitmétrie (LDF ) et densité microvaisseaux utilisant fluorescent étiqueté lectine de Griffonia simplicifolia (GS1). Les méthodes actuelles pour l’étude isolement des artères de résistance au transmurale pressions rencontrées en vivo et en l’absence de cellules parenchymateuses influences fournissent un lien essentiel entre les études in vivo et les renseignements obtenus à partir de moléculaire approches réductionnistes qui donnent un aperçu limité de réponses intégratives au niveau animaux. LDF et techniques pour identifier sélectivement les artérioles et capillaires avec fluorescent marqué GS1 lectine fournissent des solutions pratiques pour permettre aux enquêteurs d’étendre les connaissances tirées de l’étude des artères de résistance isolée. Cet article décrit l’application de ces techniques d’acquérir des connaissances fondamentales de la physiologie vasculaire et de la pathologie chez le rat comme modèle expérimental général et dans une variété de spécialisées génie les souches de rats « designer » qui peuvent fournir important aperçu de l’influence des gènes spécifiques sur les phénotypes vasculaires importants. Utilisant ces approches expérimentales précieux dans les souches de rats mis au point par des stratégies de reproduction sélective et nouvelles technologies de production de modèles de knock-out du gène chez le rat, élargira la rigueur des scientifiques locaux mis au point dans les modèles de souris knock-out et étendre cette connaissance à un modèle animal plus pertinent, avec un contexte physiologique bien compris et les qualités d’études physiologiques en raison de sa plus grande taille.

Introduction

Les premières études de la fonction vasculaire dans les artères de conduit artères utilisées et dans de nombreux cas, l’aorte. Mise sur pied dans les grosses artères a été généralement étudiée en attachant un segment de l’anneau de l’artère d’un capteur de force dans un bain de tissu ; dans le cas de l’aorte, par une coupe hélicoïdale bandes du navire afin que les fibres musculaires lisses étaient orientés dans la direction longitudinale entre le point d’attache et le capteur de force, de fournir la meilleure estimation de la force générée par la contraction de le muscle lisse le long de son axe longitudinal. La technique standard pour la découpe de bandes hélicoïdales d’aortes consistait à placer une baguette de verre dans la lumière du vaisseau, faire une incision dans la paroi des vaisseaux sur l’angle désiré et accrochez-vous à la fin du bord de la paroi des vaisseaux exposé comme la coupe a été étendue afin de produire l’intégralité d’une bande hélicoïdale du navire. À ce moment-là, la face endothéliale du navire était généralement effacée afin d’éliminer les débris avant de fixer la bande du navire pour le capteur de force et submergeant la préparation dans une oxygéné et préparation tissulaire à température contrôlée. Finalement, qu’approche conduit à une des découvertes plus célèbres et importants dans l’histoire de la physiologie par Robert Furchgott et Zawadski1, à savoir le rôle de l’endothélium dérivé facteur relaxant (EDRF), par la suite identifié comme l’oxyde nitrique, dans régulation de la fonction vasculaire. L’événement crucial ayant mené à cette découverte est une situation dans laquelle les enquêteurs maintient un endothélium intact en évitant le contact du côté de l’artère avec surfaces étrangères endothélial et remarqué que les bandes d’aortes ne montrent pas les attendus contraction à l’acétylcholine (ACh), mais plutôt détendu en réponse à l’ACh. Basé sur cette observation, les enquêteurs ont mis au point une préparation « sandwich » dans laquelle ils ont attachaient un segment aortique avec un endothélium intact (mais il est incapable de générer une force contractile) sur une bandelette hélicoïdale standard de l’aorte et converti induite par l’ACh contraction dans une détente.

Deux avancées majeures dans ce domaine qui sont largement utilisées aujourd'hui sont le développement de préparations pour mesurer la force contractile active dans la résistance petites artères2,3 (comme dans le mésentère intestinal3 ) et canulé résistance artère préparations4,5,6. Dans un des premiers rapports, Mulvany et Halpern3 décrit l’utilisation de la préparation de myographe fil pour étudier la force contractile active dans les artères de résistance isolée du mésentère intestinal des rats spontanément hypertendus (SHR) et contrôles WKY normotendus. À la suite de l’élaboration du système fil myographe, préparations d’artères de résistance canulés ont été développées afin de permettre des études des vaisseaux plus près en vivo conditions4,5,6.  Alors que les deux approches fournissent des résultats précieux, la préparation de l’artère canulées a l’avantage supplémentaire de plus effectivement préserver tonus actif intrinsèque dans les artères ; et en permettant aux chercheurs de l’étude actives myogènes réactions aux changements transmurale pression et navire réponses aux variations de débit et endothéliale contrainte de cisaillement (voir examen de Halpern et Kelley6).

Des principaux objectifs du présent document sont de décrire comment employer la technique séculaire des artères de résistance isolés, canulées microscopie vidéo afin d’obtenir des informations précises quant aux mécanismes qui régulent la tonalité active dans ces crucial navires, indépendantes des influences de cellules neurales, humorale ou parenchymateux. Cette information de base, utilisant un modèle de rat standard et des exemples de nos études de nouveau génétiquement machiné des souches de rats, fournira au lecteur une idée des types de la perspicacité au sujet de la fonction vasculaire qui peut être obtenu avec la télévision méthodes de microscopie, et qui peuvent être utilisés dans les études impliquant n’importe quel contrôle et expérimentales ou les groupes de choix de l’enquêteur, y compris les puissants nouveaux modèles expérimentaux rat produit par consanguinité sélective et nouvellement développé génétique techniques d’ingénierie.

Grâce à la précision des méthodes de microscopie de télévision, mesure des changements de diamètre dans des préparations d’artères canulées peut fournir des informations très utiles concernant les mécanismes de l’endothélium-dépendante et indépendante de l’endothélium de vasculaire relaxation, ainsi que des modifications importantes (et parfois inattendues) dans les mécanismes de contrôle vasculaire survenant avec l’hypertension, régime hypersodé et autres interventions expérimentales. En outre, mesure des relations pression-diamètre en isolé et canulé artères de résistance qui sont détendus au maximum par un traitement avec Ca2 +-gratuit solution ou un médicament vasodilatateur pharmacologique, permet à l’enquêteur d’évaluer changements structurels dans les artères en raison de remodelage vasculaire et pour calculer la contrainte passive relations7 qui peut donner un aperçu important de changements des propriétés mécaniques passives des artères qui peuvent affecter la fonction artérielle autonome de (ou en plus) changements dans les mécanismes de contrôle actif. Il est également important de noter qu’information tirée des études des artères de résistance isolée peut être complétée par les informations obtenues utilisant LDF, une méthode pratique pour l’évaluation de la perfusion tissulaire à l’animal tout niveau8,9 ,10, et de l’information obtenue grâce à l’évaluation des microvaisseaux de densité à l’aide de fluorescent étiqueté lectine de GS1, qui se lie spécifiquement aux portions de glycoprotéine dans les membranes basales des petites artérioles et capillaires11 , 12. la dernière méthode fournit une estimation très précise des microvaisseaux densité qui ne relève pas des classiques difficultés rencontrées dans l’estimation de densité des microvaisseaux en comptant les navires en vivo, par exemple manquant non perfusés navires où le débit sanguin est arrêté en raison de la fermeture active des artérioles. Utilisés ensemble, ces approches peuvent fournir un aperçu important pour mettre en corrélation les altérations fonctionnelles dans les artères isolées de résistance aux changements de perfusion tissulaire au niveau microcirculatoire ; et quelques exemples de l’utilisation de ces approches précieux conjointement avec artère canulées techniques seront également fournis dans le présent manuscrit.

Le présent document met l’accent sur l’utilisation des techniques de microscopie vidéo pour évaluer des changements vasculaires dans les artères des rats Sprague-Dawley non consanguins. Cependant, il est important de noter que ces techniques se sont avérés pour être très utiles dans l’élucidation des altérations phénotypiques de souches hautement spécialisés rat génétiquement créés par reproduction sélective ou de gène en utilisant des techniques d’édition. Dans ce manuscrit, nous fournir des exemples des techniques de microscopie vidéo comment ont fourni des renseignements importants au sujet de la fonction vasculaire dans un certain nombre de rat précieux modèles, dont la souche de rat-an consanguins rat Dahl sensibles au sel (SS) qui est le plus largement modèle expérimental permettant d’étudier les mécanismes du sel hypertenson sensible18,19,20,21,22,23; et les rats de tendance créés par reproduction sélective des rats SS avec la souche de rat Brown Norway (BN) sel-insensible. Dans les panneaux de rat tendance, chaque chromosome chez le rat Brown Norway a été introduits individuellement dans le bagage génétique Dahl SS24,25,26 . Utilisation de panneaux de rat tendance a fourni des indices précieux sur les chromosomes spécifiques qui contribuent au sel sensibilité de la pression artérielle et d’autres phénotypes, y compris la vasoréactivité24,25,26 ,27,28.

Stratégies de reproduction sélective utilisant SS rats et rats de toutes porteuses de chromosomes individuels de BN ont également permis la génération de souches congéniques rétrécie avec petits segments d’individuels Brown Norvège chromosomes introduits dans la SS Dahl génétique fond22,29. Ceux-ci peuvent fournir des gènes spécifiques extrêmement précieux d’entrée sur ou réduire leur régions des chromosomes qui peuvent affecter les variables physiologiques essentiels, tels que l’hypertension, lésions rénales et réactivité vasculaire22,29. Un autre plus puissant à la boîte à outils génétique du rat est le développement de modèles de rats gène knockout utilisant avancée gène édition techniques y compris ZFNs, transcriptionnelles activator-like-effecteur nucléases (TAPS) et plus récemment CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. L’avènement de ces techniques puissantes qui permettent des gènes d’être assommé chez le rat est une évolution extrêmement importante parce que le gène knockout études à ce jour ont utilisé (et continuent à utiliser) souris presque exclusivement. Une autre composante expérimentale dans le présent document démontre la valeur des techniques de l’artère canulés et microscopie vidéo afin d’évaluer les mécanismes de contrôle physiologique chez les rats knockout manque la transcription de protection antioxydante et cellule maître facteur, facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 (NRF2)30,31, qui ont été développés à l’aide de la technologie TALEN dans le bagage génétique de Sprague-Dawley17. Dans ces expériences, techniques de microscopie vidéo in vitro ont été utilisés pour assurer la vérification fonctionnelle de la perte du gène NRF2 et tester une approche thérapeutique potentiellement précieuse basée sur directe upregulation de NRF2-mediated antioxidant défenses. NRF-2 est de grande importance thérapeutique dans la lutte contre le stress oxydant vasculaire chez les humains, à la lumière des résultats décevants des essais cliniques portant sur l’administration directe d’antioxydants comme les vitamines C et E,32.

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Protocol

Le Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care et à l’utilisation Comité (IACUC) a approuvé tous les protocoles décrits dans le présent document et toutes les procédures sont en conformité avec les National Institutes of Health (NIH) Office de laboratoire Animal Welfare (OLAW) règlement d’exécution.

1. préparation des Solutions et chambre de navire

  1. Avant d’effectuer une série d’expériences, préparer 2 L de 20 x concentré salin stock composé de 278 g/L de NaCl ; 14 g/L KCl ; 11,52 g/L MgSO4. 7H2O ; et 9,4 g/L de CaCl2. 2H2O. Aussi préparer 2 L de 20 x stock tampon concentré composé de 80,8 g/L de NaHCO3 et EDTA de 0,4 g/L et 2 L de 20 x concentré Ca2 +-gratuite solution stock comprenant 281,6 g/L de NaCl ; 14 g/L KCl et 11,52 g/L MgSO4. 7H2O.
    Remarque : 20 X solutions mères peuvent être stockés dans le réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.
  2. Le jour de l’expérience, préparer 2 L de solution saline physiologique (PSS) de 20 x solutions concentrées de stock comme suit : ajouter 100 mL de 20 x stock sel à 1 800 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L ou un bécher sur un plateau vibrant motorisé. Ajouter 100 mL de stock de réserve x 20 tout en équilibre en permanence la solution avec un mélange gazeux contenant 21 % O2, 5 % de CO2, équilibre N2et en remuant avec un barreau d’agitateur magnétique. Ajouter lentement 0,28 g NaH2PO4 tout en contrôlant le pH ; ajuster au besoin à pH 7,4 en ajoutant des gouttes de HCl N 6 ou 6,5 solution de NaOH N d’une pipette Pasteur. Une fois le PSS est établi et le pH est ajusté, ajouter 1,98 g de glucose à la PSS.
    Remarque : Il est important d’ajouter lentement le NaH2PO4 dernière tout en contrôlant le pH du SSP, parce que l’ajout de NaH2PO4 à une solution alcaline (pH > 7,4) pourraient former un précipité de phosphate de calcium, comme en témoigne le apparition d’une solution trouble ou un précipité blanc dans le fond du récipient.
    Remarque : La composition finale du PSS est 119 mM/L de NaCl ; 4. 7 mM/L KCl ; 1,17 mM/L Mg2SO4; 1,6 mM/L CaCl2; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0,03 mM/L EDTA ; et 5,5 mM/L de glucose. Bien que la composition du PSS peut différer entre les laboratoires, cette recette est parfaitement adaptée au maintien du tonus vasculaire, la fonction endothéliale et réponses aux agents vasoactifs dans les artères de résistance isolée.
  3. Pour déterminer le diamètre maximal et d’évaluer le tonus actif dans l’artère en produisant une dilatation maximale du bateau, préparer 500 mL de Ca2 +-gratuits PSS en ajoutant 25 mL de la 20 X Ca2 +-free stock sel à 450 mL d’eau désionisée , puis 25 mL 20 x stock régulateur dans une fiole Erlenmeyer ou un bécher similaire à l’étape 1.2 ci-dessus. Ajouter 0,07 g de NaH2PO4 à la solution tout en surveillance et en ajustant le pH de la solution. Le Ca2 +-PSS gratuit est ajouté à la chambre PSS de réservoir et le navire à la fin de l’expérience pour éviter l’épuisement de Ca2 + des réserves intracellulaires qui pourraient affecter les réponses de navire en PSS normal. Parce que la Ca2 +-solution gratuite est ajouté à la fin de l’expérience pour produire une détente maximum des artères, il n’y a pas besoin d’ajouter le glucose pour le SSP.
    Remarque : Lorsque terminé, la composition finale du Ca2 +-PSS gratuit est 120,6 mM/L de NaCl ; 4. 7 mM/L KCl ; 1,17 mM/L Mg2SO4; 1,18 mM/L NaH2PO4; 24 mM/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; et 0,03 mM/L EDTA.
    Remarque : Pour de nombreuses études nécessitant une dilatation maximum de l’artère, un bloqueur d’entrée de calcium comme le vérapamil (1 µM) et/ou un donneur de monoxyde d’azote comme le nitroprussiate de sodium (10 µM) peut être ajouté à la solution, en plus de retirer Ca2 + le SSP.
  4. Maintenir les PO2et BCP2pH du SSP par équilibration continuellement le PSS qui se jettent dans la chambre du bateau dans un bain d’orgue standard utilisé pour étudier les anneaux aortiques isolés, muscle lisse intestinal ou autres tissus (Figure 1). Synthétique polymère fluoré de tétrafluoroéthylène tube permet de raccorder le réservoir d’essence à la préparation car ce type de tube est imperméable, contrairement à beaucoup d’autres formes de tubes, par exemple, latex de gaz.
  5. Placer un petit air Pierre connecté pour le mélange de gaz d’équilibration dans la chambre de navire pour aider à maintenir la composition des gaz PSS.
    NOTE : Réactions de navire aux changements PO2 peuvent être testées par équilibration le PSS dans la chambre de navire et le perfusat luminal avec des mélanges de gaz contenant des pourcentages différents d’O2, par exemple, 21 % O2, 10 % O2, 5 % O2 et 0 % O2, avec 5 % CO2 et équilibre N233,34,35. Pour les plus grandes artères avec des murs plus épais, où la diffusion de l’oxygène dans le centre de la paroi des vaisseaux peut-être être une limitation, un pourcentage plus élevé d’oxygène, par exemple, 95 % O2 peut être utilisé.
  6. Suivre de près, la température de la chambre de navire comme chambres individuelles peuvent varier dans leurs caractéristiques de transfert de chaleur.
    Remarque : Plusieurs chambres de navire préparés commercialement utilisées pour l’étude des artères de résistance canulées utilisent une pompe péristaltique pour livrer PSS oxygéné provenant d’un réservoir de gaz-équilibrés et fournir un contrôle très précis de la température du bain et l’oxygénation du le SSP.
  7. Placer le PSS dans une grande bouteille de Mariotte (2 L), avec un bouchon et un tube de verre central pour servir de réservoir à continuellement offrir PSS dans le bain d’orgue qui chauffe et gaz-équilibre le PSS qui se jettent dans la chambre de navire (Figure 1 a).
  8. Placez l’ouverture du tube central de verre dans la bouteille de Mariotte au même niveau que le dessus du SSP dans le bain de l’orgue, de maintenir une tête de pression hydrostatique constante pour la livraison du PSS dans la préparation. Tuyaux en polyéthylène utilisation connecté à un verre en forme de J ou tube en plastique pour livrer le SSP de la bouteille de Mariotte dans le bain de l’orgue.
  9. Pour perfusion luminale (Figure 1 a), utilisez en polyéthylène pour connecter la pipette d’entrée à un réservoir PSS composé d’une seringue de 60 cc plastique élevé à une position qui maintient la pression d’entrée souhaitée (généralement 80 mmHg pour l’étude de rat cérébrale transducteur (artères), telle que mesurée avec une pression connecté au système via un robinet d’arrêt.
  10. Branchez la pipette de sortie dans un tube de polyéthylène pour permettre le PSS s’écouler à travers le navire en réponse à un gradient de pression et la ligne de sortie jusqu'à un réservoir similaire vers le réservoir de l’afflux. Utiliser une connexion de capteur pression et robinet d’arrêt similaire pour mesurer la pression de sortie.
    NOTE : Procédures de réglage de la pression transmurale et contrôle du flux dans le vaisseau sont décrites à l’article 2 ci-dessous.
  11. À la fin de l’expérience, bien rincer la chambre, lignes de livraison et les systèmes de réservoir avec de l’eau distillée. À intervalles réguliers, remplacer les lignes tubes de production et de livraison, propres ou remplacer les robinets d’arrêt du système et périodiquement sous réserve des réservoirs PSS de verre un lavage acide pour empêcher la croissance des bactéries et autres micro-organismes qui causent la contamination et affecter la réactivité de navire.

2. canulées artère préparation

  1. Anesthésier un rat Sprague-Dawley avec 5 % isoflurane et maintenir l’anesthésie à l’aide de 1,5 à 2,5 % de l’oxygène de qualité médicale36. Vous pouvez également administrer une injection intramusculaire contenant acépromazine (2,5 mg/kg), la kétamine (75,0 mg/kg) et xylazine (10,0 mg/kg) ; une injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 à 60 mg/kg) ; ou toute autre méthode approuvée de l’anesthésie, selon des protocoles ou des préférences de l’enquêteur.
  2. Décapiter le rat sous anesthésie profonde et enlever le cerveau pour l’étude des artères de résistance cérébral.
  3. Après l’ablation du cerveau, soigneusement isoler l’artère cérébrale moyenne (MCA) (ou autres artères d’intérêt, par exemple, artère basilaire ou artère cérébrale postérieure)37,38. Pour isoler les MCAs, placer le cerveau en décubitus dorsal dans une boîte de Pétri verre rempli de PSS glacee (Figure 2).
  4. Ciseaux de Vannas utilisation et une pince Dumont #5 de pointe fine d’annexer le MCA du cerveau.  Nettoyer n’importe quel tissu de cerveau résiduelle de l’ACM à l’aide de la pince et transférer l’artère dans une chambre de navire contrôlées de température contenant PSS comme décrit précédemment. 33 , 34  .
  5. Pour transférer l’artère à la chambre de navire, tenez délicatement le navire excisé de l’ACA ou le segment postérieur de l’artère communicante et placez-le soigneusement dans la chambre.
    NOTE : En plus de la MCA, le système canulé navire convient pour une grande variété de préparations de petit bateau, y compris le muscle squelettique résistance artères33,39,40, artères mésentériques résistance 38 , 41 , 42et du grand (premier ordre) artérioles muscle cremaster43, ainsi que des artérioles coronaires humains et artérioles humaines provenant du tissu adipeux sous-cutané au cours de la biopsie fessier44,45, 46,47.
  6. Fixez l’artère à la micropipette afflux en le tirant vers la base de la pipette jusqu'à ce que la pointe des avances dans la lumière de la MCA. Fixez l’artère sur la pipette de l’afflux en attachant une boucle préparée à partir d’une fibre simple brin précédemment taquinée de 10-0 sutures autour de l’artère (Figure 1 b). Fixez l’extrémité opposée de la MCA à la pipette de l’écoulement en serrant une deuxième boucle de suture autour du navire (Figure 1 b).
    NOTE : Placer les boucles de suture sur les micropipettes avant de monter le navire et positionnez-les à proximité du point final de l’attachement, ce qui leur permet d’être facilement glissé sur l’artère et rapidement obtenu lorsque le navire est en position, qui minimise le risque de la artère en faisant glisser les pipettes.
    NOTE : Micropipettes sont préparés de tubes capillaires de verre borosilicate (diamètre intérieur de 1 mm, 2 mm de diamètre extérieur ; 10 cm de long) à l’aide d’une verticale de micropipettes. Avant de fixer l’artère, correspondent les diamètres de la pointe des micropipettes autant que possible pour éviter les incompatibilités de la résistance d’entrée et de sortie dans le système de perfusion.
  7. Après que l’artère est solidement amarrée aux micropipettes, utilisez le micromètre connecté à la titulaire de pipette afflux d’étirer l’artère pour sa longueur in situ .
  8. Attacher toutes les branches latérales avec simples brins taquinés de sutures de 10-0 afin de maintenir une pression constante dans l’artère.
  9. Vérifier l’absence de fuites en veillant à ce que la pression intraluminale (transmurale) reste constante après avoir fermé temporairement la pipette afflux. Attacher les branches ou recherchez les trous dans la cuve si la pression chute. Restauration de perfusion après avoir vérifié que la pression transmurale reste constante.
    Remarque : Le cathétérisme des artères de résistance isolée nécessite le pratique et dextérité manuelle. Les principales précautions à observer sont pour éviter de casser les pipettes et pour s’assurer que l’artère ne glisse pas hors les pipettes. Il est important d’être doux avec les artères isolées pendant toute la procédure, comme un traumatisme au navire peut endommager l’endothélium et/ou interférer avec la fonction normale du muscle lisse vasculaire.
  10. Mesurer le diamètre interne de l’artère en utilisant une configuration de microscopie vidéo (Figure 1 a) composé d’une caméra vidéo associé à un microscope à dissection et connecté à un micromètre vidéo et un écran de télévision (Figures 1 b, 1C). Cela permet à l’observateur mesurer les diamètres de navire manuellement en plaçant des lignes de référence mobile sur la paroi interne de l’artère et, si vous le souhaitez, sur la paroi externe de l’artère ainsi, afin de mesurer l’épaisseur de paroi de navire.
    NOTE : Quelques micromètres vidéo offrent un suivi automatique des dimensions du navire.
    NOTE : Calibrer le micromètre vidéo avec un micromètre de microscope et l’entrée et sortie des capteurs de pression avec un manomètre de mercure (mm Hg 0 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg et 200 mmHg) entre les expériences afin d’assurer des mesures précises de pression de diamètre et intraluminale de navire.
    Remarque : La pression transmurale de contrôle standard pour des expériences MCA de rat est de 80 mmHg. Étalonnage des niveaux de pression supérieur et inférieur assure précision pour les études de myogènes réactions aux changements transmurale des courbes pression-diamètre passive et de la pression dans les artères dilatées au maximum.
  11. Régler la hauteur de l’entrée et sortie des réservoirs à maintenir la pression transmurale désirée à un niveau constant. Soulever le réservoir d’entrée par une petite quantité (< 5 mmHg) et l’abaissement du réservoir de l’écoulement du même montant maintient la pression transmurale moyenne et crée le débit de perfusion dans le lumen de bateau6.
    Remarque : Soulever le réservoir de l’afflux et réduisant le réservoir de l’écoulement de quantités égales maintient la même transmurale moyenne pression dans l’artère de distension, mais génère un gradient de pression hydrostatique qui provoque des flux et la contrainte de cisaillement dans le vaisseau, ce qui permet la enquêteur pour évaluer les réponses endothélium-dépendante à l’évolution de la contrainte de cisaillement intraluminale dans différents groupes expérimentaux48.
  12. Pour évaluer les réponses myogéniques et navire réponses aux stimuli vasodilatateur, assurez-vous que l’artère présente un degré acceptable de tonalité active (environ 40 %) avant l’expérience. Jeter les artères manque de tonus actif au repos à l’exception des navires, par exemple, petites artères mésentériques qui ne présentent pas normalement ton repos actif.
    Remarque : Pour les navires qui ne présentent pas normalement ton spontané, pré se contractent les artères d’un montant équivalent utilisant un agoniste vasoconstricteurs tels que la noradrénaline ou de la phényléphrine. Une bonne approche pour choisir la dose de l’agoniste utilisé préalablement constriction de l’artère est d’utiliser une dose de50 EC de l’agent vasoconstricteur, par exemple, la norépinéphrine41,,42. Cependant, agents vasoconstricteurs pharmacologiques ne devraient pas être appliquées aux artères qui présentent un tonus actif spontané sous conditions de repos.
  13. Test de réactivité endothélium-dépendante de l’artère de résistance canulées en mesurant le diamètre du vaisseau lors de l’ajout de concentrations croissantes de ACh (10-10 M-10-5 M) à la chambre de navire. Tester la sensibilité de l’oxyde nitrique indépendante de l’endothélium du muscle lisse vasculaire en mesurant le diamètre du vaisseau lors de l’ajout de concentrations croissantes (10-10 M-10-5 M) du nitroprussiate de sodium donneur d’oxyde nitrique à la chambre de navire.
    NOTE : Sensibilité aux agents vasoconstricteurs et d’autres agonistes de vasodilatateurs peut être testée de manière similaire en ajoutant des concentrations croissantes de l’agoniste à la chambre de navire.
    Remarque : En plus d’agents vasoactifs, divers médicaments inhibiteurs et autres agents pharmacologiques peuvent être ajoutés à la préparation tissulaire et/ou le perfusat luminal. Changements PO2 (ainsi que BCP2 et pH) peuvent être sélectivement administrés à la face endothéliale ou le côté extra-luminale de l’artère par équilibration distincte du perfusat luminal avec une pierre à air relié à un mélange de gaz calibré différent du mélange utilisé pour équilibrer le SSP dans le tissu bain33,34,49. Myogènes réponses aux changements dans la pression transmurale peuvent être étudiés en fermant la pipette de sortie et de lever (ou baisser) la hauteur du réservoir PSS relié à l’afflux pipette49,50,51 à Augmentez ou diminuez la pression intraluminale.
  14. Pour évaluer le rôle de l’endothélium dans la médiation navire réponses à des stimuli spécifiques, retirez l’endothélium vasculaire et comparer les réponses de navire à ces stimuli en présence ou en absence de l’endothélium. Pour supprimer l’endothélium, soigneusement délier l’artère de la pipette d’écoulement et perfuse lentement la lumière de l’artère avec un bol d’air (0,5 à 1,0 mL). Après la perfusion de l’air, restauration de perfusion PSS pour dégager les débris cellulaires avant de ré-attacher le navire à la pipette de sortie43.
    Remarque : En suivant la procédure de dénudation endothéliale, il est important de vérifier que l’endothélium est supprimé en testant des réponses vasculaires à un agoniste (habituellement ACh) connu pour sa production de vasodilatation dépendante de l’endothélium dans ce type de navire. Toutefois, dans certaines conditions pathologiques, dépendante de l’endothélium vasoconstricteurs sont libérés, dans ce cas, il est important de vérifier que la réponse constrictrice est éliminée après ablation endothéliale.
  15. À la fin de l’expérience, déterminer le diamètre maximal de l’artère en ajoutant Ca2 +-gratuits PSS le perfusat et liquide. Calculer ton repos actif (%) comme (Dmax-D (repos) /Dmax) x 100, où Dmax est le diamètre maximum en présence de Ca2 +-une solution et Dreste est le diamètre de contrôle au repos.
    NOTE : Mesures du diamètre des artères au maximum détendus dans différents groupes expérimentaux sont précieux en comparant le tonus de repos actif, rénovation structurelle (p. ex., changements de diamètre épaisseur et lumen de mur) et les propriétés mécaniques passives (relations contrainte-déformation calculée à partir des diamètres passives à différents niveaux de pression transmurale).

3. évaluation des réponses du débit sanguin cérébral avec LDF

  1. Anesthésier l’animal avec 5 % isoflurane et fixer le rat dans un appareil stéréotaxique9,10.
  2. Maintenir l’animal sous anesthésie constante tout en contrôlant la fréquence respiratoire, fin marée CO2et profondeur de l’anesthésie avec une pincée d’orteil36.
  3. Soigneusement mince le crâne à la transparence à l’aide d’une fraise dentaire à vitesse réduite et l’huile minérale pour offrir de couplage optique10. Faire preuve de prudence pour éviter de générer une chaleur excessive et d’éviter la pénétration de l’OS.
    NOTE : Amincissement du crâne permet à la lumière du laser pour atteindre les tissus sous-jacents et être réfléchie vers la sonde afin de mesurer l’effet Doppler, dont l’amplitude est déterminée par le nombre de particules mobiles (i.e., globules rouges) et leur vitesse.
  4. Fixez la tige LDF est un micromanipulateur et placez-la directement au-dessus de la zone amincie du crâne. Pendant l’expérience, il est très important empêcher tout déplacement de la sonde de la LDF ou la préparation elle-même, comme la LDF est conçue pour mesurer le flux dans une zone restreinte du tissu et est extrêmement sensible aux artefacts de mouvement.
    Remarque : Tout mouvement de la sonde loin de sa position initiale fournira une estimation du débit sanguin dans une région différente du tissu, excluant les comparaisons. Alors que la LDF ne fournit pas de valeurs absolues et n’est pas approprié pour la comparaison entre les sujets, c’est un excellent moyen de façon non invasive évaluer les changements dans la perfusion tissulaire en réponse aux interventions expérimentales chez des sujets individuels ; et les changements relatifs au signal de la LDF des valeurs témoins peuvent être en moyenne et par rapport aux changements dans le signal de la LDF de contrôle dans les autres groupes expérimentaux.
    NOTE : LDF est une approche pratique pour avoir un aperçu des facteurs régulant le débit sanguin au niveau du lit vasculaire ensemble dans différents groupes expérimentaux8,9,10. Évaluation de la perfusion tissulaire avec LDF fournit une approche pratique pour assimiler les connaissances acquises grâce à des études isolées navire dans une perspective de lit tout entier. Si l'on excepte les différences régionales dans les mécanismes de contrôle vasculaire entre les artères de résistance et de la microcirculation, mesures obtenues avec LDF donnent une bonne indication de contrôle de flux sanguin tissulaire qui est généralement conforme aux résultats obtenus avec préparations d’artères canulé.

4. evaluation de Muscle squelettique microvaisseaux densité avec GS1 lectine

  1. Enlever le muscle cremaster un rat mâle en coupe ouverte le scrotum avec des ciseaux chirurgicaux fines standards, puis en utilisant une pince Dumont #5 à saisir le muscle.
    Remarque : Des muscles minces (par exemple, le muscle crémaster, ainsi que les muscles extenseur commun des orteils et le muscle jambier antérieurs que l'on retrouvent chez les rats mâles et femelles) sont idéales pour utilisation comme ensemble monte pour les études de la lectine, bien qu’histologique sections peuvent être utilisées pour les tissus plus épais.
  2. Enlever le muscle cremaster du testicule à l’aide d’une seule coupe. Placez-la dans PSS glacée et épinglez-le dehors dans une boîte de Pétri avec une doublure d’élastomère de silicone sur le bas à l’intérieur de la surface. Doucement taquiner à l’extérieur du tissu conjonctif à l’aide de pinces Dumont #5.
  3. Rincer les échantillons de muscle avec 2 mL de tampon PSS et puis immergez-les dans lectine GS1 rhodamine-étiqueté (20 µg/mL PSS) pendant 50 min dans une plaque de culture de cellules de 12 puits avec 2 mL/bien qui est enveloppé dans du papier d’aluminium pour éliminer la lumière.
  4. Retirer les tissus de la solution de la lectine, rincer trois fois à PSS avec 5 min des incubations de « laver » sur une base berçante et montez-les sur lames de microscope. Veillez à incuber les tissus dans l’obscurité et de stocker les lames dans l’obscurité pour prévenir la perte de fluorescence.
    Remarque : Si les diapositives ne peut pas être utilisés immédiatement, il peuvent être conservés dans le réfrigérateur sans perte de fluorescence. Pour une conservation prolongée, les lames peuvent être conservés dans un congélateur afin d’éviter la détérioration11.
  5. Évaluer les microvaisseaux densité en comptant le nombre d’intersections des microvaisseaux étiquetées avec les lignes de la grille de synthèse superposées sur l' image52, ou avec une superposition d’une grille claire superposées sur le moniteur utilisé pour visionner les diapositives.
    NOTE : GS1 lectine approches ont été utilisées pour démontrer :53de raréfaction microvasculaire causée par le sel, l’effet protecteur d’empêcher sel induit suppression II l’angiotensine dans le rétablissement des microvaisseaux densité chez les animaux nourris avec du sel17 ,53,54; le rôle de NRF2 médiant l’effet protecteur du faible dose l’angiotensine II perfusion afin d’éviter les microvaisseaux raréfaction des rats nourris avec du sel17; et aussi pour évaluer le rôle de l’angiotensine II dans le maintien d’angiogénique réponses à la stimulation musculaire chronique en sel nourris rats54,,55. Un des avantages de la technique de lectine GS1 sont qu’il peut être utilisé pour évaluer la densité des microvaisseaux dans ces mêmes animaux utilisés pour l’étude des artères de résistance canulées ou LDF.

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Representative Results

In vitro la microscopie des artères de résistance canulées permet pour l’étude des facteurs influençant la tonalité active dans les artères de faible résistance (et plus grandes artérioles) à des pressions normales en vivo transmurale et en l’absence de cellules parenchymateuses influences. En plus d’évaluer la réactivité des navires à divers stimuli vasodilatateur et vasoconstricteur et myogènes réponses à l’élévation de la pression transmurale de PSS normal, le Ca2 +-PSS gratuit peuvent être ajoutés au milieu de perfusion et liquide à la fin de l’expérience pour déterminer l’épaisseur maximale des embarcations de diamètre et le mur. Les mesures de ces derniers sont extrêmement utiles pour évaluer le remodelage vasculaire, c'est-à-dire, évolution du ratio de mur/lumen qui peuvent se produire en réponse aux changements dans la pression artérielle ou l’administration d’agents pharmacologiques. Mesures du diamètre des vaisseaux dilatés au maximum de Ca2 +-PSS gratuits sont utiles pour calculer le tonus intrinsèque comme (Dmax-D (repos) /Dmax) x 100, où Dmax et Dreste au maximum (Ca2 +- gratuits PSS) et repos diamètre (PSS), respectivement, à la pression de l’équilibration du contrôle (généralement 80 mmHg pour MCA). Dans notre expérience, active ton dans le MCA en moyenne environ 40 % à une pression transmurale de 80 mmHg. Mesurer le diamètre des artères dilatées au maximum est également un moyen pratique d’évaluer les propriétés mécaniques passives des vaisseaux en mesurant le diamètre des artères à différents niveaux de transmurale pression de distension et l’utilisation des résultats de calculer les relations contrainte-déformation et autres propriétés mécaniques des vaisseaux7,56.

La figure 3 est une représentation schématique des trois souches congéniques rétrécie dérivé le rat SS.13BN utilisant des approches complémentaires d’élevage sélectif. Ces souches de rats, les segments chromosomiques soit incluent l’allèle de rénine Brown Norway (Ren1-BN) ou sont coupés juste au-dessus (Ren1-SSA) ou juste ci-dessous (Ren1-SSB) locus du gène de la rénine (donc de conserver l’allèle de rénine SS). Dans cette étude29, le segment chromosomique contenant l’allèle de rénine Brown Norvège contenait seulement 25 gènes.

La figure 4 illustre la réponse à l’endothélium-dépendante vasodilatateur ACh (1 µM) en MCAs isolés de rats mâles de Dahl SS et les trois réduisait les souches congéniques illustrés à la Figure 3. Utilisation combinée de ces trois souches congéniques qui comprennent (Ren1-BN) ou sont coupés juste au-dessus (Ren1-SSA) ou au-dessous de gène (Ren1-SSB) la rénine limiter la région d’intérêt (c'est-à-dire, la zone entourant le locus du gène de la rénine), environ 25 gènes. Dans ces expériences, les animaux étaient normotendus et alimenté un sel faible (0,4 % NaCl) régime alimentaire. À cet étude29 endothélium-dépendante dilatation à l’ACh est absente chez la souche parentale SS et dans les deux souches congéniques conservant l’allèle de rénine SS, mais a été restauré dans la souche congéniques porteurs de l’allèle de rénine BN dans le bagage génétique de la SS. Les résultats de cette étude appuie les conclusions d’études antérieures utilisant SS.13BN tendance rats57,58 et fourni des preuves solides que la dysfonction endothéliale est présent chez les SS, même quand ils sont normotendus et nourris avec un régime faible en sel. Prises ensemble, que les résultats de ces études29,57,58 supportent l’hypothèse que la dysfonction endothéliale chez les rats de la SS est en raison du règlement ayant une déficience du gène rénine, résultant en une exposition chronique à faible niveaux de l’angiotensine II dans le sang.

Une autre étude59, résumées à la Figure 5, par rapport à la réponse à l’endothélium-dépendante vasodilatateur ACh en isolé MCAs (MCA) de rats mâles de Dahl SS et SS.5BN consomique rats porteurs du chromosome 5 (contenant Brown Norvège gènes pour diverses isoformes du cytochrome P450-4 a ω-hydroxylase). Dans cette étude, les animaux ont été nourris soit un sel faible (0,4 % NaCl) ou sel élevé (4 % NaCl) régime alimentaire. Contrairement à la MCA de rats SS, dilatation dépendante de l’endothélium à l’ACh a été maintenue dans MCA des SS.5BN consomique rats soumis à une régime pauvre en sel. En outre, (et contrairement aux résultats obtenus de SS.13BN tendance rats57,58, Sprague-Dawley rats33,39,40,60et hamsters dorés 61), un régime riche en sel n’a pas pu éliminer dilatation induite par l’ACh chez les rats SS.5BN , indiquant que ω CYP450-4 a-hydroxylase et acide 20-hydroxyeicosatétraénoïque (20-HETE) contribuent fortement à un stress oxydant vasculaire et endothéliales dysfonctionnement chez les rats de la SS et au cours de la topographie de la consommation de sel alimentaire chez les autres souches. Du point de vue expérimental, l’échec de la régime hypersodé pour éliminer une dilatation endothélium-dépendante à l’ACh fournit un exemple de comment études des artères de résistance canulées peuvent produire des résultats inattendus qui s’écartent de la sagesse conventionnelle et pourrait conduire à une nouvelle compréhension des mécanismes de contrôle complexes affectant la fonction de ces navires cruciales.

La figure 6 montre la réponse du MCA isolé à l’ACh (1 µM) dans le type sauvage et Nrf2(- / -) knockout rats a reçu un régime faible en sel (0,4 % NaCl) haute sel de régime (4 % NaCl), ou un régime hypersodé contenant un connu NRF2 activateur30,62 . En l’absence de stress oxydatif induit par le sel, ACh induite par la dilatation était semblable au MCA de type sauvage et les rats de knockout Nrf2(- / -) . Compatible avec les résultats des études antérieures des rats Sprague-Dawley, le régime hypersodé éliminé dilatation induite par l’ACh chez le type sauvage et chez les rats knockout Nrf2(- / -) . Ajout de l’inducteur NRF2 pour le régime hypersodé restauré dilatation endothélium-dépendante à l’ACh chez les rats de type sauvage, mais pas chez les rats Nrf2(- / -) , démontrant une élimination réussie du gène Nrf2 dans les rats knockout, et en soutenant l’utilisation de NRF2 haut-responsables de la réglementation comme une approche thérapeutique pour atténuer le stress oxydant vasculaire.

Figure 7 résume les résultats des mesures de LDF en comparant les réponses de la microcirculation pie-mère à tension artérielle produites par des retraits de volume de sang successives chez les rats Sprague-Dawley maintenus sur une des réductions progressives un sel normal (0,4 % NaCl) régime alimentaire ou un sel élevé (4 % NaCl) pendant quatre semaines. Contrairement aux rats nourris avec un régime faible en sel, des rats nourris à l’exposition de régime hypersodé capacité à maintenir un flux constant de sang au cours de la réduction de la pression de perfusion, ce qui indique que les mécanismes responsables de l’autorégulation du débit sanguin cérébral sont compromise par l’exposition à long terme à un régime hypersodé. Les résultats de ces expériences sont compatibles avec la présence de mécanismes d’altération de la relaxation vasculaire dans les artères cérébrales isolées des rats nourris avec du sel60 et offrent un bon exemple de comment les mensurations de la LDF peuvent être employées pour soutenir et étendre le résultats des études utilisant des artères de résistance isolée au niveau du lit vasculaire ensemble.

En plus d’évaluer la fonction de résistance à l’artère à l’aide des artères isolées et la perfusion tissulaire à l’aide de laser-Doppler débitmétrie, la densité des microvaisseaux et angiogéniques réponses aux divers stimuli tels que de la stimulation musculaire chronique54, 55 peut être évalué dans les mêmes animaux utilisant fluorescent marqué GS1 lectine, qui se lie sélectivement aux portions de glycoprotéine dans les membranes basales des artérioles et des capillaires. La figure 8 montre la lectine typique de coloration dans le muscle cremaster de Sprague-Dawley rats nourris avec un régime pauvre en sel ou régime hypersodé pendant 2 semaines (note la plus faible densité des microvaisseaux chez les rats nourris sels élevés). Densité des microvaisseaux est évaluée en comptant les intersections des microvaisseaux de lectines marquées avec une grille de référence générées par ordinateur52et fournit une excellente méthode pour évaluer angiogénique réponses54,55 ou à détecter et quantifier la perte des microvaisseaux dans des conditions telles que l’hypertension et l’apport de sel alimentaire élevée12,17,53.

Figure 1
Figure 1 : In vitro installation vidéo microscopie utilisée pour étudier les artères de résistance isolés, canulées (A). Artère canulées résistance liée à micropipettes de verre (B) et l’affichage vidéo micromètre montrant la mesure du diamètre du lumen dans artère canulées résistance (C). Barre d’échelle en panneau B représente le diamètre interne de l’artère canulée (µm), et 125 µm en panneau C est l’affichage vidéo de la distance entre les lignes de référence mobile placé manuellement sur les parois internes de l’artère par l’observateur mène l’expérience . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Diagramme schématique de la procédure pour isoler l’artère cérébrale moyenne du cerveau et la préparer pour canulation avec les micropipettes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Diagramme schématique des souches de rats congéniques rétrécie ayant de petits segments de Norvège Brown du chromosome 13 introgressé dans le bagage génétique sensible sel de Dahl. Segments chromosomiques ou figurant l’allèle de rénine Brown Norway (Ren1-BN) sont coupés juste au-dessus (Ren1-SSA) ou juste en dessous (Ren1-SSB) locus du gène de la rénine et ainsi conserver l’allèle de rénine SS. Ce chiffre a été modifié et tiré à Durand et al. 29 avec la permission de l’American Physiological Society. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Réponse d’isolé, canulé rats MCAs des SS et des souches de rats congéniques (illustrées à la Figure 2) à l’acétylcholine 1 µM. Données sont exprimées en ±ét changement (Δ µm) diamètre moyen de repos diamètre de contrôle avant l’acétylcholine et sont reloties provenant d’une étude originale par Durand et al. 29 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Réponse canulés, isolées des rats MCAs des SS et les rats de toutes SS.5BN à 1 µM l’acétylcholine chez les animaux nourris hyposodé (0,4 % NaCl) ou sel élevé (4 % NaCl) régime alimentaire. Données sont exprimées en ±ét changement (Δ µm) diamètre moyen de repos diamètre de contrôle avant l’acétylcholine et sont reloties provenant d’une étude originale par Lukaszewicz et al. 64 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Réponse à l’acétylcholine de 1 µM à MCAs canulés, isolées des rats knockout Nrf2(- / -) et des contrôles de type sauvage nourri hyposodé (0,4 % NaCl), haut régime de sel (4 % NaCl), ou régime hypersodé contenant un connu NRF2 activateur30, 62. données sont exprimées en ±ét changement (Δ µm) diamètre moyen de repos diamètre de contrôle avant l’acétylcholine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Évalué par LDF dans la microcirculation pial le débit sanguin cérébral. Sprague-Dawley rats soumis à un régime hypersodé pendant quatre semaines présentaient une déficience importante dans leur capacité à maintenir constante d’écoulement de sang, comme la pression artérielle a été réduite en réponse aux retraits de volume de sang successives. Données sont tracées sous forme de pourcentage moyen de contrôle ±ét * p < 0,05 vs hyposodé à même la pression artérielle moyenne. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Micrographie de rat cremaster muscles marqués avec marqué rhodamine GS1 lectine afin d’identifier des artérioles et des capillaires pour l’évaluation de la densité des microvaisseaux. Les muscles crémasters proviennent de Sprague-Dawley rats nourries hyposodé (LS ; 0,4 % NaCl) ou haute (HS:4 % NaCl) du régime alimentaire de sel pendant 2 semaines et montrent une raréfaction microvasculaire chez les animaux nourris HS par rapport aux témoins de LS. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Tel que mentionné dans l’introduction, ce document décrit l’utilisation de la microscopie de télévision et artère résistance isolée s’approche pour évaluer la fonction vasculaire non seulement dans les modèles standard de rat (tel qu’employé dans la vidéo), mais aussi en hautement spécialisée génétiquement souches de rats machiné, qui montrent le roman et les aperçus puissants qui peuvent être obtenus en utilisant ces approches. L’utilisation de ces techniques puissantes pour évaluer ton actif et des propriétés mécaniques passives des artères de faible résistance peuvent fournir des informations importantes concernant un large éventail de mécanismes de contrôle vasculaire y compris la réglementation de l’endothélium-dépendante du tonus actif dans les artères de résistance, fonction de muscle lisse vasculaire dans des conditions normales et physiopathologiques et des propriétés passives des artères liée à remodelage vasculaire et les changements dans la mécanique de la paroi vasculaire. La dysfonction endothéliale s’est avérée être un puissant indicateur pronostique de multiples événements cardiovasculaires chez les humains, y compris les décès associés au système cardiovasculaire63et préparations d’artères de résistance canulées sont particulièrement utiles dans détection de la dysfonction endothéliale et une meilleure compréhension des mécanismes de la dysfonction endothéliale.

Pour illustrer l’efficacité de in vitro microscopie vidéo techniques employant des artères de résistance isolés, nous fourni des exemples de l’utilisation de ces techniques dans des rats Dahl sensibles au sel (SS) et dans les toutes nouvelles souches de rats qui montrent une réduction sensibilité du sel de la pression artérielle par rapport à la souche parentale SS24. Ces études ont analysé les mécanismes de contrôle vasculaire associés à des gènes sur les chromosomes de deux qui sont particulièrement intéressantes en contribuant au sel sensibilité de la pression artérielle et des altérations vasculaires chez le rat de SS. Ces chromosomes sont chromosome 13, porteur de la rénine gène18,22,29,57,58et le chromosome 5, porteurs de gènes pour les isoformes du CYP450-4 a ω-hydroxylase64 ,65— l’enzyme qui synthétise 20-HETE, qui a des effets majeurs sur la fonction rénale et sur la réactivité vasculaire66,67,,68. Un autre ajout récent et puissant à la boîte à outils génétique du rat est le développement de rat gène knockout modèles utilisant des techniques d’édition avancées gène dont : ZFNs ; transcriptionnelles activator-like-effecteur nucléases (TAPS) et plus récemment CRISPR-Cas913,14,15,16,17. In vitro microscopie vidéo utilisant ces techniques pour étudier MCAs isolés d’un modèle de rat knockout Nrf2(- / -) qui ne dispose pas de l’antioxydant essentiel et le facteur protecteur transcription NRF2, a fourni un important et auparavant inconnue comprendre les mécanismes de la dysfonction endothéliale induite par le sel en l’absence d’un élevé de sang pression17. Résultats spécifiques d’expériences utilisant ces modèles de rat spécialisées sont décrites dans un certain nombre de précédents rapports17,29,57,58,59, 60 , 64 , 65 .

S’il est clair que les études des artères de résistance isolés, canulées sont extrêmement précieuses pour comprendre les mécanismes qui régissent le fonctionnement de ces navires crucial dans une variété de conditions, il est très important d’exercer un certain nombre de précautions afin d’assurer que les résultats précis et fiables sont obtenus. Alors que les artères cérébrales et les artères de résistance de nombreux autres lits vasculaires pièce tonus intrinsèque, certaines artères (notamment les artères de résistance mésentériques) doivent être préalablement contracté avec vasoconstricteurs tels que la norépinéphrine afin d’évaluer les réponses à des stimuli vasodilatateur et plus précisément simuler les conditions in vivo , où les navires sont sous l’influence de stimuli nerveux et humoraux vasoconstricteur, tels que la noradrénaline libérée des terminaisons nerveuses adrénergiques. Par conséquent, il est important de se familiariser avec les propriétés de base des artères d’étudier, de la littérature ou de soigneusement réalisé des expériences préliminaires. Parce que l’endothélium joue un rôle majeur dans la régulation des grosses artères, les petites artères et artérioles dans la microcirculation, il est essentiel de faire preuve de prudence pour éviter d’endommager l’endothélium pendant l’isolement et la canulation de l’artère. Le critère classique pour l’intégrité de l’endothélium est la démonstration que ACh provoque la dilatation du vaisseau. Une mise en garde est que, dans des conditions de stress oxydatif, l’endothélium du navire peut être intact, mais la vasodilatation à l’ACh est absente car des niveaux excessifs de radicaux superoxyde piéger l’oxyde nitrique, empêchant la réponse vasodilatatrice. Dans ces cas, intégrité endothéliale peut être vérifiée en répétant l’application ACh en présence d’un piège de superoxyde tels que tempol, qui devrait redonner une vasodilatation en réponse à l’ACh et autres stimuli vasodilatateur endothélium-dépendante. En outre, dans un certain nombre d’états pathologiques, l’endothélium peut libérer des substances qui provoquent la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires et la constriction de l’artère ; et, dans certains cas, une dilatation endothélium-dépendante (ou constriction) est véhiculée par autres substances telles que les métabolites de la cyclo-oxygénase, H2O2, métabolites de l’époxygénase, etc.. Le critère classique pour un vasodilatateur endothélium-dépendante ou d’une substance vasoconstrictrice doit démontrer que la dilatation ou rétrécissement de l’artère est éliminé par l’enlèvement endothéliale. Enfin, l’identité des diverses substances vasodilatatrices et vasoconstricteur de l’endothélium-dépendante soit vérifiable en général par l’administration d’inhibiteurs spécifiques ou des charognards, comme L-NAME pour inhiber l’oxyde nitrique synthase, indométhacine pour inhiber la formation de métabolites de la cyclo-oxygénase, catalase pour piéger les antagonistes de la voie du CYP450-4 a/20-HETE, inhibiteurs de thromboxane synthase, inhibiteurs de l’époxygénase ou H2O2.

Il est aussi important (et instructif) afin de quantifier le montant de l’actif de tonalité à la fin de l’expérience en perfusant superfusion l’artère avec un Ca2 +-gratuits PSS ou administrer une dose maximale d’un vasodilatateur puissant comme la papavérine. Un niveau typique d’active tonus au repos dans le MCA, calculé comme (Dmax-D (repos) /Dmax) x 100, est environ 40 %, où Dmax et Dreste sont au maximum (Ca2 +-gratuits PSS) et diamètre (PSS), de repos respectivement, à la pression de l’équilibration de contrôle (généralement 80 mmHg pour MCA). Bateaux avec beaucoup moins active ton ou artères montrant des constrictions segmentaires ou dilatations est exclus de l’analyse, que ces signes sont révélateurs d’un traumatisme aux navires. Mesure du diamètre des artères dilatées au maximum Ca2 +des-solution libre autorise également l’enquêteur évaluer les propriétés mécaniques passives des vaisseaux de diamètre artériel mesure et calcul des relations contrainte-déformation au cours de topographie séquentielle de la pression transmurale dans les vaisseaux dilatés au maximum7,56. Ces relations contrainte-déformation passive sont facilement obtenues et fournissent une indication précieuse de tout changement dans les caractéristiques mécaniques des navires.

La propreté des pipettes, raccords et tubes fournissant les réservoirs est absolument essentielle pour les expériences réussies. À cet égard, il est important de rincer toutes les solutions de la tubulure après l’expérience, et à rincer et nettoyer le tissu bain, le tuyau de la livraison, tous les réservoirs utilisés pour stocker, réchauffent et gaz-Equilibrer le PSS avant d’atteindre le navire chambre. Robinets et vannes dans le système de livraison aussi et surtout changés périodiquement, comme se doit tout tube transportant PSS. Un signe classique de tubulure contaminé est une brume grise générée par les moisissures et les bactéries ; et ces changements sont accompagnés par la perte de réactivité normale des vaisseaux sanguins en raison de substances produites par la contamination bactérienne. Toutefois, la contamination par des bactéries et autres micro-organismes peut être encore présente en l’absence de toute preuve visible.

Nous croyons que le présent document fournit un exemple utile pour l’utilisation de techniques séculaires qui sont exceptionnellement bien adapté pour l’étude des artères très faible résistance de différents lits vasculaires. Lorsqu’il est combiné avec des méthodes standards pour l’évaluation de la perfusion tissulaire, telles que la LDF et la méthode de lectine GS1 pour évaluer la densité des microvaisseaux, in vitro vidéo microscopie des artères de résistance canulées donne un aperçu très précieux le facteurs qui contrôlent la perfusion tissulaire et comment celles-ci peuvent être modifiées dans les états pathologiques. En plus de fournir un moyen puissant pour l’étude des mécanismes fondamentaux du muscle lisse vasculaire et la fonction endothéliale dans les modèles standard de rat, l’utilisation de la microscopie vidéo afin d’étudier les artères de résistance individuelle peut être appliquée à d’autres modèles animaux et à artères de la résistance humaine. L’application de la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de nouveaux modèles de rats génétiquement ouvre de nouvelles portes pour comprendre les changements phénotypiques qui se produisent en réponse à une fonction altérée d’une multitude (et la liste toujours croissante) de gènes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs expriment leurs sincères remerciements à Katie Fink et Lynn Dondlinger pour leur aide précieuse dans la préparation de ce manuscrit.

Subventions : NIH #R21-OD018309 ; #R56-HL065289 ; et #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

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References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

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Médecine numéro 130 artères de résistance endothélium microcirculation sel hypertension circulation cérébrale
Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats
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