Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Оценка механизмов сосудистой контроля использования видео микроскопии изолированных сопротивления артериях крыс

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

Эта рукопись описывает в vitro видео микроскопии протоколов для оценки функции сосудистого в артериях головного мозга сопротивления крыса. Манускрипт также описывает методы для оценки плотности microvessel с дневно обозначенные лектины и тканевой перфузии, используя Лазерная доплеровская флоуметрия.

Abstract

Этот протокол описывает использование в vitro телевидения микроскопии для оценки функции сосудистого в изолированных мозгового сопротивления артерий (и других судов), а методы оценки перфузии тканей, с использованием Лазерная доплеровская флоуметрия (МСО ) и плотности microvessel, используя дневно помечены лектина Griffonia simplicifolia (ГС1). Нынешние методы для изучения изолированные сопротивления артерий на Трансмуральное давление с которыми в естественных условиях и в отсутствие влияния Паренхиматозный клетки обеспечивают важную связь между в vivo исследований и информации, полученной от молекулярной упрощенческих подходов, которые предоставляют ограниченное понимание интегративной ответы на уровне всей животных. LDF и методы выборочно определить артериол и капилляров с дневно меченых GS1 Лектин обеспечивают практические решения, позволяющие следователям расширить знания, полученные от исследования артерий изолированных сопротивления. Этот документ описывает применение этих методов для получения фундаментальных знаний сосудистой физиологии и патологии в крыса как общей экспериментальной модели и в различных специализированных генетически «дизайнер» крыса штаммов, которые могут обеспечить важно понимание влияние специфических генов на важных сосудистой фенотипов. Используя эти ценные экспериментальных подходов в крыса штаммов, разработанных стратегий селекции и новых технологий для производства моделей Нокаут гена в крыса, будет расширяться строгость научных помещений, разработанных в нокаут мыши модели и расширение знаний к более соответствующих животных модели, с хорошо понимали физиологических фон и пригодность для физиологических исследований из-за его большего размера.

Introduction

Ранние исследования функции сосудистого в артерии артерии использованы каналом и во многих случаях аорту. Формирование сил в крупных артерий обычно изучал прикрепляется кольцо сегмента артерии преобразователь силы в ванну ткани; в случае аорты методом спиральной резки полосы судна таким образом, чтобы гладкие мышечные волокна были ориентированы в продольном направлении между точкой крепления и датчик силы, для предоставления наиболее точной оценки сил, порожденных сокращение гладкие мышцы вдоль его продольной оси. Стандартным методом для резки винтовой полоски аорты было место стеклянной палочкой в просвет сосуда, сделать разрез в стенке сосуда на желаемый угол и Держись до конца подвергаются края стенки сосуда, как разрез был продлен производить весь Спиральные полосы судна. В тот момент эндотелиальные стороны судна обычно смыты для удаления мусора перед присоединением полосы судно для датчика силы и погружаемой подготовки в насыщенной кислородом и температуры ткани ванна. В конце концов что подход привел к одному из самых известных и важных открытий в истории физиологии Furchgott и Завадским1, а именно роль эндотелия производные расслабляющий фактор (EDRF), впоследствии определены как оксид азота, в регулирующие функции сосудистого. Решающим событием, ведущих к это открытие было положение, в котором следователи сохранить нетронутыми эндотелия, избегая контакта со стороны эндотелия артерии с внешней поверхности и заметил, что аортальной газа не сделал exhibit ожидаемых сокращение ацетилхолина (ACh), но вместо этого расслабленным в ответ ACh. На основе этого наблюдения, следователи Подготовка «сэндвич», в которой они придают сегмент аорты с нетронутыми эндотелия (но не в состоянии генерировать сократительной силы) разработать стандартные спиральные полосы аорты и преобразован, ACh индуцированной сокращение в релаксации.

Два основных достижений в этой области, которые широко используются сегодня являются разработка препаратов для измерения активной сократительной силы в малое сопротивление артерии2,3 (например в кишечной брыжейка3 ) и канюлированной сопротивления артерии препараты4,5,6. В одном из первых сообщений, Mulvany и Халперном3 описал применение препарата myograph проволока для изучения активной сократительной силы в изолированных сопротивления артерии от кишечных брыжейка спонтанно гипертензивных крыс (ШРМ) и нормотензивной WKY элементов управления. После разработки системы myograph проволока канюлированной сопротивления артерии препаратов были разработаны для исследования сосудов, ближе к в vivo условия4,,5-6.  Хотя оба подхода обеспечивают ценные результаты, подготовка канюлированной артерия имеет добавил преимущества более эффективного сохранения встроенные активные тон в артериях; и позволяя следователей для изучения активных миогенных реакции на изменения в Трансмуральное давление и сосуд реакции на изменения в скорости потока и эндотелиальных касательное напряжение (см. Обзор Халперн и Келли6).

Основная цель настоящего документа заключается в описывают, как использовать проверенный временем метод видео микроскопии с помощью изолированных, канюлированной сопротивления артерий для того чтобы получить точную информацию о механизмах, которые регулируют активные тон в этих важнейших судов, независимо от влияний нейронные, гуморальные или Паренхиматозный клеток. Этот основной информации, используя стандартный мышиной модели и примеры из нашего исследования новых генетически инженерии крыса штаммов, будет предоставить читателю представление о виды идеи относительно сосудистой функции, которые могут быть получены с телевидение микроскопия подходы, и которые могут быть использованы в исследованиях с участием любого управления и экспериментальной группы следователя выбора, включая мощные новые экспериментальные крыса модели производимые селективного инбридинга и недавно разработанный генетический Инженерные технологии.

Благодаря точности телевидения микроскопии подходов измерение диаметра изменений в канюлированной артерии препараты могут обеспечить весьма ценную информацию о эндотелий зависимых и эндотелий независимые механизмы сосудов релаксации, а также важные (и иногда неожиданных) изменения в механизмах контроля сосудов, происходящие с гипертонией, высоким содержанием соли и другие экспериментальные мероприятия. Кроме того, измерение давления диаметр отношений в изолированных и канюлированной сопротивления артерий, которые максимально расслаблены, лечение с Ca2 +-бесплатные решения или фармакологических сосудорасширяющего препарат, позволяет следователю оценить структурные изменения в артериях благодаря сосудистого ремоделирования и для вычисления отношения пассивной напряженно деформированного7 , который может обеспечить важные понимание изменений в пассивной механических свойств артерий, которые могут повлиять на функцию артериальной независимые (или в дополнение к) изменения в механизмы активного контроля. Важно также отметить, что информация, полученная от исследования артерий изолированных сопротивление может быть дополнена информация, полученная, используя LDF, практический метод для оценки перфузии тканей в целом животного уровня8,9 ,10, и на информации, полученной от оценки плотности microvessel, используя дневно помечены GS1 Лектин, который специально связывает гликопротеина постановление в базальной мембраны мелких артериол и капилляров11 , 12. Последний метод обеспечивает очень точную оценку плотности microvessel, что не подлежит классический трудности в оценке microvessel плотность путем подсчета судов в естественных условиях, например пропавших без вести, не увлажненную сосуды, где поток крови остановлена из-за закрытия активных артериол. При совместном использовании, эти подходы могут предоставить важную информацию для соотнесения функциональные изменения в артериях изолированных сопротивление изменениям в перфузии тканей на уровне микроциркуляторного; и некоторые примеры использования этих ценных подходов в сочетании с методами канюлированной артерия будет также оказываться в настоящей рукописи.

Настоящий документ посвящен использованию методов видео микроскопии для оценки сосудистые изменения в артериях беспородных крысах Sprague-Dawley. Однако важно отметить, что эти методы оказались весьма ценными в разъяснение фенотипические изменения в узкоспециализированных генетически крыса штаммов, созданные селекции или гена редактирования с использованием методов. В этой рукописи мы предоставляем примеры методов как видео микроскопии предоставили важную информацию о функции сосудистого ряда ценных крыса моделей, в том числе даль соли чувствительных (СС) крыса ан беспородных крыс штамм, который является наиболее широко используется Экспериментальная модель для изучения механизмов соли чувствительных hypertenson18,19,20,21,,2223; и consomic крысы, созданные с помощью селекции СС крыс с Солт нечувствительны штамм крыса Норвегии Браун (BN). В consomic крыса панелей Каждая хромосома из крыса Норвегии Браун был introgressed индивидуально в генетический фон Даль СС24,25,26 . Использование панелей крыса consomic предоставил ценные подсказки относительно конкретных хромосом, которые способствуют соли чувствительности кровяного давления и другие фенотипы, включая сосудистой реактивности24,25,26 ,27,28.

Селекция стратегии использования СС крыс и consomic крысы, перевозящих отдельные хромосомы BN позволили также поколения суженного congenic штаммы с небольших сегментов отдельных introgressed хромосомы Браун Норвегии в даль СС генетических 22,фон29. Эти можно предоставить чрезвычайно ценным ввода на конкретные гены или узких областей хромосом, которые могут повлиять на важнейших физиологических переменные, такие как кровяное давление, повреждение почек и сосудистой реактивности22,29. Еще одно мощное дополнение к крыса генетических элементов является развитие крысы Джин нокаут моделей использования передовых гена, редактирование методы, включая ZFNs, transcriptional nucleases активатор как эффекторных (ТАЛЕНС) и совсем недавно ТРИФОСФАТЫ-Cas913 ,14,,1516,17. Наступление эти мощные методы, позволяющие генов в нокаут в крыса является чрезвычайно важным событием, поскольку исследования Нокаут гена к настоящему времени использовали (и продолжают использовать) мышей почти исключительно. Другой экспериментальный компонент в настоящем документе демонстрирует значение методов канюлированной артерии и видео микроскопии для оценки контроля физиологических механизмов в нокаут крыс не хватает мастер антиоксидант и ячейки защитной транскрипции фактор, ядерный фактор (эритроидные производные 2) - как - 2 (NRF2)30,31, которые были разработаны с помощью технологии TALEN Sprague-Dawley генетический фон17. В этих экспериментах в пробирке видео микроскопии методы были использованы для обеспечения функциональной верификации потеря гена NRF2 и тестирования потенциально ценный лечебный подход, основанный на прямой upregulation антиоксидант, NRF2-опосредованной оборону. СР-2 имеет существенное терапевтическое значение в борьбе с сосудистой окислительный стресс в организме человека, учитывая разочаровывающие результаты клинических испытаний с участием прямого управления антиоксидантов, таких как витамины C и E32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Медицинский колледж Висконсин институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) одобрил все протоколы, описанные в этом документе и все процедуры проводятся во исполнение национальных институтов здравоохранения (НИЗ) Управление социального обеспечения по животных лаборатория (OLAW) правила.

1. Подготовка решений и судно камеры

  1. До проведения серии экспериментов, приготовить 2 Л 20 x концентрированной соли Стоковый раствор, состоящий из 278 г/Л NaCl; 14 г/Л хлористого калия; 11.52 г/Л MgSO4. 7H2O; и 9,4 г/Л CaCl2. 2H2O. Также приготовить 2 Л 20 x концентрированной буферных запасов, состоящих из 80.8 г/Л NaHCO3 и 0,4 г/Л ЭДТА, и 2 Л 20 x сосредоточены Ca2 +-бесплатный Стоковый раствор, состоящий из 281.6 г/Л NaCl; 14 г/Л хлористого калия и 11,52 г/Л MgSO4. 7H2O.
    Примечание: 20 X акций решения может храниться в холодильнике до использования.
  2. В день эксперимента, подготовить 2 Л физиологического раствора соли (PSS) от 20 x концентрированных растворов запасов следующим: добавить 100 мл 20 x соль акционерное 1800 мл обессоленной воды в колбу Эрленмейера 2 Л или стакан на моторизованных перемешивания тарелку. Добавить 100 мл 20 x буферных запасов при непрерывно equilibrating решение с газовой смеси, содержащей 21% O2, 5% CO2, N2, и помешивая магнитной перемешивания бар. Медленно добавьте 0,28 g NaH2PO4 во время мониторинга рН; Отрегулируйте при необходимости для рН 7,4, добавляя капли 6 N HCl или 6,5 N NaOH раствора из пипетки Пастера. После того, как подготовлен PSS и pH корректируется, добавьте 1,98 г глюкозы в PSS.
    Примечание: Важно, медленно добавить NaH2PO4 Последнее время мониторинг pH PSS, потому что добавление NaH2PO4 к щелочной раствор (pH > 7,4) может сформировать преципитат кальция фосфат, как указано внешний вид облачно раствора или белый осадок в нижней части контейнера.
    Примечание: Окончательного состава PSS-119 мм/Л NaCl; 4.7 мм/Л хлористого калия; 1.17 мм/Л мг2так4; CaCl 1.6 мм/Л2; NaH 1,18 мм/Л2PO4; 24 мм/Л NaHCO3; 0,03 мм/Л ЭДТА; и 5,5 мм/Л глюкозы. Хотя состава PSS могут отличаться между лабораториями, этот рецепт отлично подходит для поддержания сосудистый тонус, Эндотелиальная функция и ответы на вазоактивных агентов в изолированных сопротивления артерий.
  3. Чтобы определить максимальный диаметр и оценить активный тон в артерии, производя максимальная дилатация судна, подготовить 500 мл Ca2 +-бесплатно PSS, добавив 25 мл 20 X Ca2 +-бесплатно соли складе до 450 мл деионизированной воды , а затем 25 мл 20 x буферных запасов в колбу Эрленмейера или стакан подобный шаг 1.2 выше. Добавьте в решение 0,07 г NaH2PO4 во время мониторинга и корректировки рН раствора. Ca2 +-бесплатно PSS добавляется в зале в конце эксперимента, чтобы избежать истощения внутриклеточных Ca2 + магазины, которые могут повлиять на судно ответы в нормальных PSS PSS водохранилище и судна. Потому что Ca2 +-бесплатное решение добавляется в конце эксперимента для получения максимального расслабления артерий, нет необходимости добавлять глюкозы в PSS.
    Примечание: Когда полный, окончательный состав Ca2 +-бесплатный PSS-120.6 мм/Л NaCl; 4.7 мм/Л хлористого калия; 1.17 мм/Л мг2так4; NaH 1,18 мм/Л2PO4; 24 мм/Л NaHCO3; CaCl 0 мм/Л2; и 0,03 мм/Л ЭДТА.
    Примечание: Для многих исследований, требующих максимальной дилатация артерии, блокатор вход кальция например верапамил (1 мкм) и/или донора оксида азота как натрия нитропруссида (10 мкм) можно добавить в решение, помимо удаления Ca2 + от PSS.
  4. Сохранить PO2, ЦУП2и рН PSS, непрерывно equilibrating PSS, впадающих в зале судна в ванну стандартного орган, используется для изучения изолированных аортального кольца, гладких мышц кишечника или другие ткани (рис. 1). Использование синтетических фторопластовые трубы тетрафторэтилена соединиться ванна органа бензобака, потому что этот тип трубки газовой, непроницаема, в отличие от многих других видов труб, например, латекс.
  5. Место небольшой воздушный камень подключен к уравновешивания газовой смеси в камере судна для поддержания газового состава PSS.
    Примечание: Сосуд реакции на изменения в PO-2 может быть проверена путем equilibrating PSS в камере судна и просветный perfusate с газовой смеси, содержащие различные проценты O2, например, 21% O2, 10% O2, 5% O2 и 0% O2, с 5% CO2 и баланс N233,34,35. Для более крупных артерий толстые стены, где диффузии кислорода в центр стенке сосуда может быть ограничение, могут использоваться более высокий процент кислорода, например, 95% O2 .
  6. Температура в камере сосуд тщательно контролировать, как отдельных камер может варьироваться в их характеристики теплопередачи.
    Примечание: Многие коммерчески подготовленные судно камеры используется для исследования артерий канюлированной сопротивления использовать Перистальтический насос, чтобы доставить кислородом PSS от водохранилища, достижение равновесного уровня газа и обеспечивают очень точный контроль температуры и оксигенация PSS.
  7. Место PSS в большой бутылке Мариотта (2 Л), с пробкой и центральной стеклянной трубки, чтобы служить в качестве резервуара, непрерывно доставлять PSS в орган ванну, которая нагревает и газ уравновешивает PSS, впадающих в зале судна (рис. 1A).
  8. Место открытия центральной стеклянной трубки в бутылке Мариотта на том же уровне, как в верхней части PSS в ванне органа, для поддержания постоянного гидростатического давления головка для доставки PSS в ванну орган. Использование полиэтиленовые трубки подключены к J-образный стеклянные или пластиковые трубы для доставки PSS от бутылки Мариотта в ванну орган.
  9. Для Люминал перфузии (рис. 1а) используйте полиэтиленовые трубы для подключения приток пипеткой PSS водохранилище, состоящий из 60 cc Пластиковый шприц возведен в позицию, которая поддерживает желаемый приток давления (обычно 80 mmHg для исследования мозга крысы артерий), измеряемая с давлением датчика к системе через кран.
  10. Подключите отток пипеткой полиэтиленовые трубки позволяют PSS течь через судна в ответ на давление градиент, а линии отток в водоем похож на приток водохранилище. Используйте подключение аналогичные краном и давления датчика для измерения давления отток.
    Примечание: В разделе 2, ниже описаны процедуры для установки Трансмуральное давление и контроля потока через судна.
  11. В конце эксперимента тщательно промойте камеры, линии доставки и водохранилище систем с дистиллированной водой. Промежутки, заменить линии труб и доставки, чистый или заменять запорные краны в системе и периодически подвергать любое стекло PSS водохранилищ кислоты стирки для предотвращения роста бактерий и других микроорганизмов, которые вызывают загрязнение и влияет на судно реактивности.

2. канюлированной артерии подготовка

  1. Анестезировать Sprague-Dawley крыс с изофлюрановая 5% и поддержания анестезии, используя 1,5-2,5% медицинского кислорода36. Кроме того управлять внутримышечной инъекции, содержащей кетамин (75.0 мг/кг), acepromazine (2,5 мг/кг) и ксилазина (10,0 мг/кг); внутрибрюшинного введения Пентобарбитал (50-60 мг/кг); или любой другой утвержденный метод анестезии, в зависимости от протоколов и/или следователь предпочтения.
  2. Обезглавить крысу под глубокой анестезии и удалить мозга для исследования артерий головного мозга сопротивления.
  3. После удаления мозга, тщательно изолировать средней мозговой артерии (MCA) (или других артерий интерес, например, базилярной артерии или задней мозговой артерии)37,38. Чтобы изолировать MCAs, место мозга лежа в чашке Петри стекла, наполненный ледяной PSS (рис. 2).
  4. Используйте беззаботными ножницы, пинцет штрафа отзыв Дюмон #5 для акцизных MCA от мозга.  Очистить любые остаточные мозговой ткани от MCA, с помощью щипцов и передачи артерии температуры контролируемой судно камеру, содержащую PSS как описано выше. 33 , 34  .
  5. Для передачи артерии к палате судна, аккуратно прижмите подакцизным судно ACA или задней соединительной артерии сегмента и осторожно поместите его в камеру.
    Примечание: в дополнение к MCA, канюлированной судно система подходит для широкого спектра препаратов малого судна, включая скелетных мышц сопротивления артерий33,,3940, сопротивление верхней брыжеечной артерии 38 , 41 , 42и большой (первого порядка) артериол мышцы cremaster43, а также человека коронарных артериол и человека артериол, полученные из подкожной жировой ткани во время биопсии ягодичной44,45, 47 46,.
  6. Прикрепите артерии к приток микропипеткой, потянув ее к основанию пипетку до тех пор, пока кончик успехи в Люмене MCA. Закрепите артерии на приток пипетки, связывая петли из одной пряди волокон, ранее дразнили из 10-0 швов вокруг артерии (рис. 1B). Закрепите в противоположном конце MCA для оттока пипетки, затянув второй шов петля вокруг судна (рис. 1B).
    Примечание: Место петель шва на micropipettes до монтажа судна и разместите их рядом конечная точка крепления, позволяя им быть легко скользнула над артерией и быстро обеспеченных когда судно находится в положении, которое минимизирует риск артерия скольжения от пипетки.
    Примечание: Micropipettes готовят от капиллярной трубки боросиликатное стекло (внешний диаметр 2 мм; 1 мм внутренний диаметр 10 см длиной) с помощью вертикальной микропипеткой съемник. До присоединения артерии, матч кончик диаметры micropipettes максимально предотвратить несоответствия приток и отток сопротивления в системе перфузии.
  7. После артерии надежно связан с micropipettes, используйте микрометр, подключенных к держателю пипеткой приток растянуть артерии к длине в situ .
  8. Галстук с все боковые ветви с одной нити, дразнили от 10-0 швы для того, чтобы поддерживать постоянное давление в артериях.
  9. Проверьте отсутствие утечек, убедившись, что внутрипросветная (Трансмуральное) давление остается неизменным после временного закрытия притока пипеткой. Галстук с любой ветви или проверьте на предмет отверстий в емкости Если давление падает. Восстановление перфузии после проверки, что Трансмуральное давление остается постоянным.
    Примечание: Катетеризации изолированных сопротивления артерий требует сноровки и практики. Основные меры предосторожности, которые следует соблюдать, чтобы избежать нарушения пипетки и убедиться, что артерии не соскальзывали пипетки. Важно быть нежным с изолированной артерии на протяжении всей процедуры, как травма судна может привести к повреждению эндотелия и/или мешать нормальной функции гладких мышц сосудов.
  10. Измерьте внутренний диаметр артерии, с помощью микроскопии видео установки (рис. 1A), состоящий из видео камеры прилагается к микроскопом рассечения и подключен к видео микрометра и телевизионных монитора (цифры 1B, 1 C). Это позволяет наблюдателя для измерения диаметра сосуда вручную путем размещения подвижных опорных линий на внутренней стенке артерий и, при желании, на наружной стене артерии, а также для измерения толщины стенок сосуда.
    Примечание: Некоторые видео микрометров предлагают автоматическое отслеживание размеров судна.
    Примечание: Откалибровать видео микрометр микрометр Этап микроскопа и приток и отток преобразователи давления с манометром ртути (0 мм рт.ст., 50 мм рт.ст., 100 мм рт.ст., 150 мм рт.ст и 200 мм рт.ст.) между эксперименты для обеспечения точных измерений Диаметр и внутрипросветная давления судна.
    Примечание: Стандартный элемент управления Трансмуральное давление для крыса экспериментов MCA. 80 мм рт.ст. Калибровка для уровней выше и ниже давления обеспечивает точность исследований миогенных реакции на изменения в Трансмуральное давление и пассивного давления диаметр кривых в максимально расширенных артерий.
  11. Отрегулируйте высоту приток и отток водохранилищ для поддержания желаемого Трансмуральное давление на постоянном уровне. Повышение притока водохранилище на небольшую сумму (< 5 mmHg) и снижение оттока водохранилище на ту же сумму поддерживает среднее Трансмуральное давление и создает поток перфузии в просвет сосуда6.
    Примечание: Повышение притока водохранилище и снижение оттока водохранилище в равных количествах сохраняет же среднее Трансмуральное расправляющего давления в артериях, но создает градиент гидростатического давления, что вызывает поток и касательное напряжение в сосуде, позволяя следователь оценить эндотелий-зависит от реакции на изменения в внутрипросветная касательное напряжение в48различных экспериментальных групп.
  12. Чтобы оценить миогенных ответов и судно с сосудорасширяющим раздражители, убедитесь, что артерии exhibits подходящий уровень активных тон (около 40%) до эксперимента. Отказаться от любых артерий, отсутствует активный тон в состоянии покоя, за исключением судов, например, небольшой верхней брыжеечной артерии, которые обычно не проявляют активного отдыха тон.
    Примечание: Для судов, которые exhibit обычно спонтанное тон, предварительно сжимают артерии на эквивалентную сумму используя агонист вазоконстриктора норадреналин или фенилэфрин. Хороший подход к выбору доза агонист, используется для предварительно сужает артерии является использовать доза50 EC вазоконстриктора агента, например, норадреналина41,42. Однако вазоконстриктора фармакологических агентов не должны применяться к артерии, которые демонстрируют спонтанное активный тон под условия для отдыха.
  13. Протестировать эндотелий-зависит от реактивности артерии канюлированной сопротивление путем измерения диаметра сосуда при добавлении повышения концентрации ACh (10-10 M-10-5 M) к палате судна. Испытания эндотелий независимые оксида чувствительность сосудистой гладких мышц путем измерения диаметра сосуда при добавлении увеличения концентрации (10-10 M-10-5 M) оксида азота нитропруссида натрия доноров для Палата судна.
    Примечание: Чувствительность к вазоконстриктора агентами и другими агонистами сосудорасширяющим может испытываться аналогичным образом, добавив увеличение концентрации агониста к палате судна.
    Примечание: Помимо вазоактивных веществ, различные препараты, ингибиторы и других фармакологических агентов могут быть добавлены для ванны ткани и/или Люминал perfusate. Изменения в PO-2 (а также ЦУП2 и рН) может быть выборочно препарат эндотелиальной стороне или загородный просветный стороне артерии на отдельный уравновешивания Люминал perfusate с воздуха камень, подключенных к калиброванные газовой смеси отличается от смеси, используемые для сбалансировать PSS в ткани Ванна33,34,49. Миогенных реакции на изменения в Трансмуральное давление может быть изучен закрытия отток пипетки и повышение (или снижение) высота резервуара PSS подключен к приток пипеткой49,50,51 - увеличение или уменьшение давления внутрипросветная.
  14. Чтобы протестировать роль эндотелия в посредничестве судно ответы на конкретные стимулы, удалите эндотелия и сравнить судно ответы на эти раздражители в наличие или отсутствие эндотелия. Чтобы удалить эндотелия, тщательно развязать артерии из пипетки отток и медленно perfuse в просвет артерии с воздуха болюс (0,5-1,0 мл). После воздуха перфузии восстановите PSS перфузии чтобы очистить сотовой мусора до повторного связывания судна отток пипеткой43.
    Примечание: Эндотелиальная денудации процедурой, важно проверить, что эндотелия удаляется путем тестирования сосудистой ответы на агонистов (обычно ACh) известно, производят эндотелий зависимой вазодилатация в этом типе судна. Однако в некоторых патологических условиях, выпускаются эндотелий зависимой сосудосуживающие средства, в этом случае, важно, чтобы убедиться, что ответ удав устраняется после удаления эндотелия.
  15. В конце эксперимента, определить максимальный диаметр артерии, добавив Ca2 +-бесплатно PSS, perfusate и superfusate. Расчет активного отдыха тон (%) как ((DМакс-Dотдыха) /DМакс) x 100, где Dmax -максимальный диаметр присутствии Ca2 +-бесплатные решения и Dотдых это отдыха диаметр управления.
    Примечание: Диаметр измерения максимально расслабленным артерий в различных экспериментальных групп являются ценными в сравнении активного отдыха тон, структурной реконструкции (то есть, изменения в стены толщиной и Люмене диаметр) и пассивных механических свойств (напряжение деформация отношения рассчитывается от пассивного диаметров на различных уровнях Трансмуральное давление).

3. Оценка ответов потока церебрального кровотока с МСО

  1. Анестезировать животное с 5% изофлюрановая и закрепите крыса в стереотаксического аппарата9,10.
  2. Сохраняя мониторинг частоты дыхания, конца Приливные CO2и глубины анестезии с ног щепотку36животного под постоянным анестезии.
  3. Тщательно тонкий черепа, чтобы прозрачность с помощью низкая скорость стоматологических дрель и минеральное масло для предоставления оптическая муфта10. Проявлять осторожность во избежание создания избыточного тепла и во избежание проникновения кости.
    Примечание: Разбавление черепа позволяет лазерного света для достижения основной ткани и должны быть отражены обратно в зонд для измерения доплеровского сдвига, величина которого определяется количество движущихся частиц (то есть, красных кровяных клеток) и их скорость.
  4. Безопасный LDF зонд в микроманипулятор и поместите его непосредственно над районом разбавлять черепа. В ходе эксперимента это очень важно для предотвращения перемещения LDF зонд или подготовки себя, как Сол предназначен для измерения потока в одном ограниченной области ткани и чрезвычайно чувствителен к артефакты движения.
    Примечание: Любое движение зонда от своей первоначальной позиции даст оценку потока крови в другой области ткани, исключающие сравнений. Хотя МСО не предоставляют значения абсолютной потока и не подходит для сравнения между субъектами, это отличный способ для неинвазивно оценивать изменения в перфузии тканей в ответ на экспериментальных мероприятий в отдельных предметов; и относительные изменения в МСО сигнала от значений элементов управления может быть в среднем и по сравнению с изменениями в МСО сигнал от управления в других экспериментальных групп.
    Примечание: МСО представляет собой удобный подход лучше понять факторы, регулирующие поток крови на уровне всей сосудистого русла в различных экспериментальных групп8,9,10. Оценка перфузии тканей с МСО представляет собой практический подход усваивать знания, полученные от изолированных судно исследований в целом кровати перспективу. За исключением региональные различия в механизмах контроля сосудов между сопротивления артерий и микроциркуляцию измерения, полученные с МСО обеспечивают хорошим показателем ткани крови потока управления, который в целом соответствует результаты, полученные с подготовка канюлированной артерии.

4. Оценка плотности Microvessel скелетных мышц с GS1 Lectin

  1. Удалите cremaster мышцы от мужских особей крысы, резки мошонки с Стандартный штраф Ножницы хирургические и затем с помощью щипцов Дюмон #5 понять мышцы.
    Примечание: Тонкие мышцы (например, cremaster мышца, а также разгибателя пальцев Лонг и tibialis передней мышцы, которые находятся в самцов и самок крыс) идеально подходят для использования в целом крепления для исследования Лектин, хотя гистологические секции могут использоваться для толще ткани.
  2. Удалите cremaster мышцы от яичка, используя один разрез. Поместите его в ледяной PSS и закрепить его в чашку Петри с прокладкой из эластомера силикона на дне внутри поверхности. Аккуратно дразнить прочь соединительной ткани, с помощью щипцов Дюмон #5.
  3. Промойте мышц образцы с 2 мл буферизации PSS и затем погрузить их в родамин меченых GS1 Лектин (20 мкг/мл PSS) для 50 мин в 12-ну клетки культуры плита с 2 мл/хорошо, завернутый в фольгу для исключения свет.
  4. Удаление ткани из решения Лектин, промойте их три раза в PSS 5 мин «стирать» инкубаций на рокер и смонтировать их на скольжениях микроскопа. Убедитесь в том, инкубировать тканей в темноте и хранить слайды в темноте, чтобы предотвратить потерю флуоресценции.
    Примечание: Если слайды не может использоваться непосредственно, они могут храниться в холодильнике без потери флуоресценции. Для длительного хранения слайды могут храниться в холодильнике для предотвращения ухудшения11.
  5. Оцените microvessel плотность, подсчитывая количество пересечений помечены микрососудов, с линиями сетки, генерируемые компьютером, накладывается на изображение52, или с наложением ясно сетки, наложенной на экране монитора, используемого для просмотра слайдов.
    Примечание: GS1 Лектин подходы были использованы для демонстрации: соль индуцированной микрососудистой разрежения53, защитный эффект предотвращения соли индуцированной ангиотензина II подавления в восстановлении microvessel плотность в соль кормили животных17 ,,5354; роль NRF2 посреднической защитный эффект низкой дозы ангиотензина II настой для предотвращения microvessel разрежения в соль кормили крыс17; а также для оценки роли ангиотензина II в поддержании ангиогенных ответы на хронический мышечной стимуляции в соли кормили крыс54,55. Одним из преимуществ метода Лектин GS1 является, что она может использоваться для оценки плотности microvessel в том же животных, используемых для исследования канюлированной сопротивления артерий или LDF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В vitro микроскопии канюлированной сопротивления артерий позволяет для изучения факторов, влияющих на активный тон артерий малого сопротивления (и больше артериол) в нормальной в vivo Трансмуральное давление и в отсутствие Паренхиматозный ячейки влияние. Помимо оценки реактивности сосудов на различные раздражители, сосудорасширяющим и сосудосуживающие и миогенных ответы на высоте Трансмуральное давление в нормальных PSS, Ca2 +-бесплатный PSS могут быть добавлены к perfusate и superfusate в конце эксперимент, чтобы определить максимальное судно диаметра и толщины стенки. Последние измерения являются весьма ценным в оценке сосудистого ремоделирования, т.е., изменения в соотношении стены/люмен, которая может возникнуть в ответ на изменения в артериального давления или отправления фармакологических агентов. Измерения диаметра максимально расширенные сосуды в Ca2 +-бесплатные PSS являются полезными для вычисления внутренних тон как ((DМакс-Dотдыха) /DМакс) x 100, где DМакс и Dотдыха максимум (Ca2 +- Бесплатные PSS) и отдыха диаметр (PSS), соответственно, управления уравновешивания давления (обычно 80 mmHg для MCA). По нашему опыту активный тон в MCA в среднем около 40% на Трансмуральное давление 80 мм рт.ст.. Измерение диаметра максимально расширенных артерий является также практический способ оценки пассивной механических свойств сосудов путем измерения диаметра артерий на различных уровнях Трансмуральное расправляющего давления и с использованием результатов расчет напряженно деформированного отношения и другие механические свойства суда7,56.

Рисунок 3 это схематическое представление трех штаммов суженного congenic, производного от SS.13BN крыса, используя дополнительные селекции подходы. В этих штаммов крыса хромосомные сегментов либо включают Браун Норвегии ренина аллеля (Ren1-BN) или отрезать чуть выше (Ren1-SSA) или чуть ниже (Ren1-SSB) локус гена ренина (таким образом сохраняя аллеля ренина СС). В том, что исследование29, хромосомные сегмент, содержащий аллеля ренина Браун Норвегии содержится только 25 генов.

Рисунок 4 иллюстрирует ответ на эндотелий зависимой сосудорасширяющим ACh (1 мкм) в изолированных MCAs от самцов крыс даль СС и три сузили congenic штаммов, показанный на рисунке 3. Совместное использование этих трех congenic штаммов, которые включают (Ren1-BN) или cut off чуть выше (Ren1-SSA) или ниже (Ren1-SSB) ренина гена области интереса (то есть, в непосредственной близости Локус гена ренина) ограничивается примерно 25 генов. В этих экспериментах, животные были нормотензивной и кормили с низкой концентрацией соли (0,4% NaCl) диета. В этом исследовании29 эндотелий зависимой дилатация для ACh отсутствует родительский сорт СС и в обоих congenic штаммов, сохраняя аллеля ренина СС, но был восстановлен в congenic штамма, перевозящих BN ренина аллеля в СС генетический фон. Результаты этого исследования поддерживает результаты более ранних исследований с использованием SS.13BN consomic крысы57,58 и представил убедительные доказательства что эндотелиальной дисфункции в СС крыс, присутствует, даже когда они нормотензивной и кормили низким содержанием соли. Получения вместе, результаты этих исследований по29,,5758 поддержки гипотезу что эндотелиальной дисфункции в СС крыс связано нарушение регуляции ренина гена, в результате хронического воздействия низких уровень ангиотензина II в крови.

Другое исследование59, обобщены в Рисунок 5, по сравнению ответ на эндотелий зависимой сосудорасширяющим ACh в изолированных MCAs (MCA) от самцов крыс даль СС и SS.5BN consomic крысы, перевозящих хромосомы 5 (содержащий гены Браун Норвегии для различных изоформ цитохрома P450-4A ω-гидроксилазы). В этом исследовании, животные получали либо низкой концентрацией соли (0,4% NaCl) или высокой соль (4% NaCl) диета. В отличие от MCA от SS крыс эндотелий зависимой дилатация к ACh сохранялся в MCA от SS.5BN consomic крыс кормили низким содержанием соли. Кроме того (и в отличие от результатов от SS.13BN consomic крысы57,58, Sprague-Dawley крыс33,,3940,60и Золотой хомяков 61), высоким содержанием соли удалось устранить ACh индуцированной дилатация SS.5BN крыс, указывающее, что CYP450-4A ω-гидроксилазы, и 20-hydroxyeicosatetraenoic кислоты (20-HETE) являются важными факторами, сосудистая окислителя стресс и эндотелиальных дисфункция в СС крыс и фасады в рацион соли в других штаммов. С точки зрения экспериментальной, высоким содержанием соли неспособность устранить эндотелий зависимой дилатация для ACh представляет собой пример как исследования канюлированной сопротивления артерий может производить неожиданные выводы, которые отходят от обычных мудрость и может привести к новому пониманию механизмов комплексного управления, влияющих на функции этих важнейших судов.

На рисунке 6 показан ответ изолированных MCA ACh (1 мкм) в дикого типа и Nrf2(- / -) нокаут крыс кормили низким содержанием соли (0,4% NaCl), высокая соли диетические (4% NaCl), или высокий соли диета, содержащая известные NRF2 активатор30,62 . В отсутствие соли индуцированного окислительного стресса ACh индуцированной дилатация был похож на MCA от дикого типа и Nrf2(- / -) нокаут крыс. В соответствии с результатами предыдущих исследований на крысах Sprague-Dawley, высоким содержанием соли ликвидированы ACh индуцированной дилатация дикого типа и в Nrf2(- / -) нокаут крыс. Добавление индуктором NRF2 с высоким содержанием соли восстановлен эндотелий зависимой дилатация ACh дикого типа крыс, но не в Nrf2(- / -) крыс, демонстрируя успешной ликвидации гена Nrf2 в нокаут крыс, и поддержку использования NRF2 вверх регуляторы как терапевтический подход к улучшению сосудистой оксидативного стресса.

Рисунок 7 резюмируются результаты измерений LDF, сравнивая ответы сетчаточных микроциркуляции прогрессивного сокращения в артериального давления производится путем последовательных крови объем изъятия в крысах Sprague-Dawley, поддерживается на либо обычной соли (0,4% NaCl) диеты или высокой соль (4% NaCl) диета для четырех недель. В отличие от крыс кормили низким содержанием соли крыс кормили высоким содержанием соли экспонат нарушениями способности поддерживать постоянное кровотока во время сокращения перфузионного давления, указывая, что механизмы, ответственные за саморегуляции потока церебрального кровотока скомпрометированы длительным воздействием с высоким содержанием соли. Результаты этих экспериментов согласуются с наличием механизмов нарушения сосудистой релаксации в изолированных церебральных артериях крыс кормили соли60 и обеспечивают хороший пример того, как МСО измерений могут быть использованы для поддержки и расширения результаты исследований, используя отдельные артерии сопротивления до уровня всего сосудистого русла.

Помимо оценки сопротивления артерии функции с помощью изолированных артерий и перфузии тканей, с использованием лазерная допплеровская флоуметрия, microvessel плотность и ангиогенных ответы на различные раздражители, такие как хронический мышечной стимуляции54, 55 могут оцениваться в том же животных, используя дневно меченых GS1 Лектин, которая избирательно связывается с гликопротеина постановление в базальной мембраны артериол и капилляров. На рисунке 8 показана типичная Лектин, пятнать в cremaster мышцу крысах Sprague-Dawley, кормят соленой диеты с низким или высоким содержанием соли за 2 недели (Примечание нижней плотности микрососудов в высокой соли кормили крыс). Microvessel плотность оценивается путем подсчета пересечений Лектин меченых микрососудов с компьютера генерируемые ссылки сетки52и обеспечивает превосходный метод для оценки ангиогенных ответы54,55 или выявлению и количественной оценке потерь микрососудов в условиях например, гипертонической болезни и повышенных диетическое потребление соли12,17,53.

Figure 1
Рисунок 1: В vitro видео микроскопии установки используются для изучения изолированные, канюлированной сопротивления артерий (A). Канюлированной сопротивления артерии связаны с micropipettes стекла (B) и отображения видео микрометра, показаны измерения диаметр просвета артерии канюлированной сопротивления (C). Линейки в группе B представляет внутренний диаметр канюлированной артерии (мкм), и 125 мкм в группе C видео-дисплей расстояния между линиями подвижный ссылки размещены вручную на внутренних стенах артерии наблюдателем от проведения эксперимента . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Схема процедуры для изоляции средней мозговой артерии от головного мозга и его подготовке для катетеризации с micropipettes. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Принципиальная схема штаммов суженного congenic крыса, имея небольшие сегменты Браун Норвегии хромосомы 13 introgressed в даль соли чувствительных генетический фон. Хромосомных сегментов либо содержащиеся Браун Норвегии ренина аллеля (Ren1-BN) или cut off чуть выше (Ren1-SSA) или чуть ниже (Ren1-SSB) локус гена ренина и таким образом сохранить аллеля ренина СС. Этот рисунок был изменен и перепечатано из Дюран и др. 29 с разрешения Американского физиологического общества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Ответ изолированных, канюлированной крыс MCAs СС и штаммы крыса congenic (показано на рис. 2) до 1 мкм ацетилхолина. Данные выражаются как средний диаметр изменения (Δ мкм) ±SEM от отдыха управления диаметром до ацетилхолина и являются replotted из оригинального исследования Дюран и др. 29 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Ответ изолированных, канюлированной MCAs СС крыс и крысы consomic SS.5млрд на 1 мкм ацетилхолина в животных кормили с низкой концентрацией соли (0,4% NaCl) или высокой соль (4% NaCl) диета. Данные выражаются как средний диаметр изменения (Δ мкм) ±SEM от отдыха управления диаметром до ацетилхолина и являются replotted из оригинального исследования Лукашевич и др. 64 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Ответ 1 мкм ацетилхолина в изолированных, канюлированной MCAs дикого типа элементов управления и Nrf2(- / -) нокаут крыс кормили низким содержанием соли (0,4% NaCl), высокая соли диетические (4% NaCl), или высокий соли диета, содержащая известные NRF2 активатор30, 62. данных выражаются как средний диаметр изменения (Δ мкм) ±SEM от отдыха управления диаметром до ацетилхолина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: Мозгового кровотока, оценены LDF сетчаточных микроциркуляции. Крысах Sprague-Dawley, поддерживается на высоким содержанием соли для четырех недель выставлялись значительное ухудшение в их способности поддерживать постоянный поток крови, артериальное давление было сокращено в ответ на последовательные кровь объем изъятия. Данные выводятся как средний процент контроля ±SEM * p < 0,05 против низким содержанием соли в же означает артериального давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8: Микрофотография крыса cremaster мышц, помечены родамин меченых GS1 Лектин для выявления артериол и капилляров для оценки плотности microvessel. Cremaster мышцы были получены от крысах Sprague-Dawley, кормили с низкой концентрацией соли (LS; 0,4% NaCl) или высокий соль (HS:4% NaCl) диета на 2 недели и продемонстрировать микрососудистой разрежения в HS-кормили животных, по сравнению с LS элементов управления. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как отмечалось во введении, этот документ описывает использование телевидения микроскопии и изолированные сопротивления артерии подходы для оценки сосудистой функции не только в моделях стандартных крыс (как занятые в видео), но также в узкоспециализированных генетически инженерии крыса штаммов, которые показывают Роман и мощные идеи, которые могут быть получены используя эти подходы. Использовать эти мощные методы для оценки активных тон и пассивной механических свойств артерий малого сопротивления могут обеспечить важную информацию относительно широкого спектра сосудистых контрольных механизмов, включая регулирование эндотелий зависимых активный тон в артериях сопротивления функция сосудистой гладкой мускулатуры в условиях нормальных и патофизиологические и пассивной свойства артерий связанных с сосудистого ремоделирования и изменения в механике сосудистой стенки. Эндотелиальная дисфункция было показано, быть мощным прогностическим показателем нескольких неблагоприятных сердечно-сосудистых заболеваний в организме человека, включая сердечно связанных смерти63, и канюлированной сопротивления артерии препараты особенно ценны в Обнаружение эндотелиальной дисфункции и увеличения нашего понимания механизмов эндотелиальной дисфункции.

Чтобы проиллюстрировать эффективность в vitro видео микроскопии методов использования изолированных сопротивления артерий, мы предоставили примеры использования этих методов в даль соли чувствительных (СС) крыс и Роман consomic крыса штаммов, которые демонстрируют снижение соли чувствительности кровяного давления по сравнению с СС родительский сорт24. Эти исследования исследованы сосудистой контрольные механизмы, связанные с генами на двух хромосом, которые представляют особый интерес в содействии соли чувствительности кровяного давления и сосудистые изменения в SS крыса. Эти хромосомы являются хромосомы 13, перевозящих ренина гена18,22,,2957,58и хромосомы 5, гены для изоформ CYP450-4A ω-гидроксилазы64 ,65— фермента, который синтезирует 20-HETE, которая имеет серьезное воздействие на функцию почек и сосудистой реактивности66,,6768. Еще последние и мощным дополнением к крыса генетических элементов является развитие крысы Джин нокаут моделей использования методов редактирования расширенные гена включая: ZFNs; transcriptional nucleases активатор как эффекторных (ТАЛЕНС) и совсем недавно ТРИФОСФАТЫ-Cas913,14,,1516,17. В vitro видео микроскопии использования этих методов для изучения изолированных MCAs из Nrf2(- / -) нокаут крыса модели, которая не хватает важнейших антиоксидантных и ячейки защитной транскрипционный фактор NRF2, предоставила важную и ранее неизвестных заглянуть в механизмы соли индуцированной эндотелиальной дисфункции в отсутствие повышенных крови давление17. Конкретные результаты экспериментов, используя эти специализированные крыса модели описаны в ряде предыдущих докладов17,29,,5758,59, 60 , 64 , 65 .

Хотя ясно, что исследования артерий изолированных, канюлированной сопротивления являются чрезвычайно ценными в понимании механизмов, регулирующих функцию этих критически важных судов под разнообразные условия, очень важно проявлять количество мер предосторожности, с тем чтобы обеспечить, что точные и надежные результаты. Хотя церебральных артерий и сопротивления артерий многих других сосудистых кровати выставлять встроенные тон, некоторые артерий (особенно брыжеечных сопротивления) должны быть предварительно контракт с сосудосуживающие средства, такие как норадреналина для того чтобы оценить ответы на сосудорасширяющее раздражители и более точно моделировать условия в естественных условиях , где сосуды находятся под влиянием вазоконстриктора нервные и гуморальные стимулы, например освобожден от адренергических нервных окончаний норадреналина. Таким образом важно быть знакомы с основными свойствами артерий необходимо изучить, из литературы или из тщательно провели предварительные эксперименты. Потому что эндотелия играет важную роль в регулировании крупных артерий, мелких артерий и артериол в микроциркуляцию, важно проявлять осторожность во избежание повреждения эндотелия при изоляции и катетеризации артерии. Классический тест для целостности эндотелия, демонстрация, ACh вызывает дилатация сосудов. Одно предостережение, что, в условиях оксидативного стресса, эндотелий судна может быть нетронутыми, но вазодилатация ACh отсутствует потому что чрезмерного уровня супероксид Мусоробот оксида азота, предотвращая сосудорасширяющим ответ. В тех случаях эндотелиальных целостности можно проверить, повторив ACh приложение присутствии супероксид мусорщика например tempol, который следует восстановить вазодилатация в ответ ACh и другие раздражители эндотелий зависимой сосудорасширяющее. Кроме того в ряде патологических состояний, эндотелий может выпустить вещества, которые вызывают сужение сосудов гладких мышечных клеток и сужение артерии; и в некоторых случаях, эндотелий зависимой дилатация (или сужения), это опосредовано через другие вещества, такие как метаболиты циклооксигеназы, H2O2, epoxygenase метаболитов, и т.д. Классический тест для зависящих от эндотелия сосудорасширяющим или сосудосуживающие вещества — продемонстрировать, что расширение или сужение артерии устраняется эндотелиальной удаления. Наконец администрацией специфичные ингибиторы или падальщики, такие как L-NAME для ингибирования синтаза оксида азота, индометацина для подавления обычно может быть установлена личность различных эндотелий зависимой сосудорасширяющим и сосудосуживающих веществ формирование циклооксигеназы метаболитов, каталазы, чтобы очистить H2O2, ингибиторы синтазы тромбоксана, ингибиторы epoxygenase или антагонисты CYP450-4A/20-HETE пути.

Это также важно (и полезным) чтобы подсчитать количество активных тон в конце эксперимента, perfusing и superfusing артерии с Ca2 +-бесплатно PSS, или управляющей максимальная доза мощное сосудорасширяющее агента как папаверин. Типичный уровень активных отдыхает тон в MCA, рассчитанные как ((DМакс-Dотдыха) /DМакс) x 100, является примерно 40%, где DМакс и Dотдыха являются максимальная (Ca2 +-бесплатно PSS) и отдыха диаметр (PSS), соответственно на управления уравновешивания давления (обычно 80 mmHg для MCA). Судов с значительно менее активным тон или артерий, показаны сегментарный сужения или расширения исключены из анализа, поскольку эти признаки свидетельствуют о травме сосудов. Измерение диаметра максимально расширенных артерий в Ca2 +-бесплатное решение также позволяет следователю оценить пассивной механических свойств сосудов путем измерения диаметра артериальной и расчета напряженно деформированного отношения во время последовательного фасады в Трансмуральное давление в максимально расширенные сосуды7,56. Эти отношения пассивной напряженно деформированного легко получить и предоставлять ценные указания любых изменений в механических характеристик судов.

Чистота пипетки, соединители и труб, поставка резервуаров является абсолютно критическим для успешных экспериментов. В этой связи важно очистить все решения из трубы после завершения эксперимента, и промыть и очистить ткани Ванна, поставки труб, а также все резервуары используются для хранения, теплый и газ сбалансировать PSS до достижения судна камеры. Запорные краны и клапаны в системе доставки должен также быть уборка и периодически, как любой трубопровод, перевозящих PSS. Классический знак загрязненных труб является серая дымка, порожденных плесени и бактерий; и эти изменения сопровождаются потерей нормальной реактивности кровеносных сосудов, благодаря веществ, получают путем бактериального загрязнения. Однако загрязнение бактерий и других микроорганизмов может все еще присутствовать в отсутствие каких-либо видимых доказательств.

Мы считаем, что настоящий документ обеспечивает полезный пример для использования time-honored методов, которые являются исключительно хорошо подходит для изучения важнейшей малое сопротивление артерий различных сосудистых кровати. В сочетании со стандартной подходы для оценки перфузии тканей, например LDF и GS1 Лектин метод для оценки плотности microvessel, в пробирке видео микроскопии канюлированной сопротивления артерий обеспечивает чрезвычайно ценную информацию в факторы, определяющие перфузии тканей и как они могут быть изменены в положениях заболеванием. Помимо мощным средством для изучения фундаментальных механизмов сосудистой гладкой мускулатуры и функции эндотелия в модели стандартных крыс, использование видео микроскопии для изучения отдельных сопротивления артерии может применяться для других животных моделей и артерии человека сопротивления. Применение видео микроскопии изолированных сопротивления артерий Роман генетически крыса моделей открывает новые двери для понимания фенотипические изменения, которые происходят в ответ на изменения функции множества (и постоянно растущий список) генов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы имеют без финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы выражают свою искреннюю благодарность Кэти Fink и Линн Dondlinger за их неоценимую помощь в подготовке этой рукописи.

Грантовая поддержка: Низ #R21-OD018309; #R56-HL065289; и #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

Медицина выпуск 130 сопротивление артерий эндотелий микроциркуляцию соль гипертонии мозгового кровообращения
Оценка механизмов сосудистой контроля использования видео микроскопии изолированных сопротивления артериях крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter