قياس التغيرات في فيفو في خارج الخلية العصبية أثناء الطبع مكافأة السلوكيات في أنثى الهامستر السوري

Summary

هذه الورقة بالتفصيل استخدام تسجيلات أمبيروميتريك إمكانات ثابتة باستخدام ألياف الكربون أقطاب والتكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور لقياس إطلاق الدوبامين وغلوتامات مع عالية الدقة الزمنية خلال السلوك الطبيعي مجزية في الهامستر الأنثى.

Abstract

القدرة على قياس الإفراج العصبي على مقياس زمني سريع يسمح أنماط كبيرة مرتبطة بسلوكيات معينة أو التلاعب؛ أداة قوية في توضيح آليات والدوائر الأساسية. بينما استخدمت تقنية ميكرودياليسيس لعقود لقياس ما يقرب من أي أكثر من الفائدة في الدماغ، يقتصر هذا الأسلوب في الأزمنة. وبدلاً من ذلك، مسح سريعة فولتاميتري دوري كل وقتيا دقيقة وحساسة للغاية؛ ومع ذلك، نظراً لأن هذا الأسلوب صعباً من الناحية التقنية يعتمد على اليكترواكتيفيتي لأكثر الفائدة، هو القضاء على احتمال للكشف عن المواد نونيليكترواكتيفي (مثلاً، غلوتامات العصبي). هذه الورقة تفاصيل استخدام نظام تسليم المفتاح الذي يجمع بين الإمكانات الثابتة أمبيروميتري وبيوسينسينج الانزيمية لقياس العصبية اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي مع الدقة الزمنية. الاقتران من هذه التقنيات القوية هما يسمح بقياس منشط وطوريه كبيرة بسهولة نسبية، ويسمح بتسجيل من العصبية متعددة في وقت واحد. والهدف من هذه المخطوطة لإثبات عملية قياس الدوبامين وغلوتامات كبيرة في فيفو استخدام سلوك الطبيعي مجزية (أي، السلوك الجنسي) في اليرانب الإناث، مع الهدف النهائي المتمثل في عرض الجدوى التقنية لهذا التحليل لدراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

Introduction

القدرة على قياس الإفراج العصبي في الحيوانات يتصرف مستيقظا يسمح للباحثين الربط بين سلوكيات معينة مع الأنماط المكانية والزمانية لكبيرة أداة قوية للتحقيق في الآليات والدوائر الأساسية لكلا الطبيعية والسلوك استثابي في الوقت الحقيقي. تاريخيا، استخدمت ميكرودياليسيس لقياس المواد المتفاعلة كهربائياً ونونريكتيفي في الوسط خارج الخلية من الدماغ¹. ويستخدم هذا الأسلوب تدفق مستمر من محلول مائي لتكوين الأيونية مماثل للسوائل خارج الخلية، من خلال تحقيق ميكرودياليسيس تتألف من رمح صغير مع تلميح مصنوع من غشاء الألياف المجوفة سيميبيرميابل². بعد إدراج التحقيق، العصبية أو التحاليل الأخرى التي تهم يمكن عبور الغشاء سيميبيرميابل بنشر السلبي قبل يجري جمعها كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])، وعلى فترات متقطعة للتحليل اللاحق تقنية الكيمياء التحليلية المستخدمة عادة لفصل، تحديد وقياس المكونات في خليط غير متجانس³.

على الرغم من أن ميكرودياليسيس هو أسلوب حساسة التي يمكن استخدامها لقياس أي تقريبا أكثر من الاهتمام، القرار الزماني منخفضة، مع معدلات أخذ العينات أقصى حدود دقيقة لعشرات الدقائق^1،2. يمكن توضيح اختراع مسح سريعة فولتاميتري دوري (فسكف)، أسلوب الذي يعتمد على إمكانيات الأكسدة الأنواع اليكترواكتيفي، قرب لحظية تركيزات أكثر الفائدة في السائل خارج الخلية. باختصار (انظر روبنسون et al. ⁴ لإجراء استعراض شامل)، يتم تطبيق قطب رفع وخفض الجهد بطريقة موجه ثلاثية في مقياس وقت بسرعة⁴. عندما يكون الجهد في النطاق الصحيح، مجمع الفائدة مرارا وتكرارا تتأكسد وخفضت. أكسدة والحد من هذه النتائج في حركة الإلكترونات التي تخلق تيار المتردد صغيرة. مسح معدلات تجري بمقياس الفرعية الثانية مع أكسدة والحد من المركبات التي تحدث في ميكرو ثانية. بطرح الخلفية الحالية تم إنشاؤها بواسطة المسبار من الحالية الناجمة عن ذلك، واحد يمكن أن تولد جهد مقابل الأرض الحالية فريدة من نوعها لكل مجمع. حيث يعرف مقياس الوقت للذبذبات الجهد، يمكن استخدام هذه البيانات لحساب قطعة الحالية كدالة للزمن. وهكذا، قد تحددت تركيزات النسبية المجمع طالما نقل عدد الإلكترونات في كل الأكسدة والحد من رد فعل المعروف⁴.

تجعل هذه الخصائص الكيميائية وعالية الدقة الزمنية فسكف تقنية قوية للكشف عن تغيير تركيزات المواد الكيميائية في الجسم الحي. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب على الرغم من هذه المزايا المتعددة، الخبرة التقنية الواسعة ومعدات غالية الثمن والإعداد. علاوة على ذلك، لا يمكن قياس العصبية نونيليكترواكتيفي (مثلاً، الغلوتامات) باستخدام هذا الأسلوب. لحسن الحظ، والتقدم التكنولوجي في المجال الكيمياء الكهربائية⁵، فضلا عن تسويق هذه الاختراعات، أدخلت نهج بسيط نسبيا لقياس العصبية غير اليكترواكتيفي في الحيوانات يتصرف مستيقظا دون المساس بالزمانية الدقة في تقنية تعرف باسم التكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور. ويستخدم هذا الأسلوب الانزيمية تحويل العصبي نونيليكترواكتيفي الاهتمام إلى ركائز اثنين، واحد منها هو بيروكسيد الهيدروجين اليكترواكتيفي تم الكشف عنه أكسدة أمبيروميتريك الحالي تولدها بإمكانيات تطبيق⁵ . (انظر الشكل 1) قياس المسابير biosensor المتاحة تجارياً بطريقة انتقائية تحليلها للفائدة بشكل تنافسي تخفيض مساهمة إينتيرفيرينتس الذاتية. في حالة غلوتامات، المساهمة حمض الأسكوربيك إينتيرفيرينت المشتركة (أإ) تنافسية ينخفض إلى التيار المقاسة بتعريب شارك أوكسيديز AA على سطح الانزيمية النشطة من أجهزة الاستشعار، وتحويل AA لغير اليكترواكتيفي ديهيدرواسكورباتي والماء. وباﻹضافة إلى ذلك، يستبعد بوليمر نافيون مشحونة سلبا على طبقة موجودة تحت الطبقة إنزيم مركبات أنيونى الذاتية.

يمكن قياس هذا الإعداد التجريبية biosensor نفس العصبية اليكترواكتيفي كما هو الحال في فسكف، ولكن بدلاً من ذلك أنها توظف إمكانات إصلاحها تسجيل⁶. خلافا للجهد تتأرجح المطبقة في فسكف، في تسجيل الثابتة ذات الإمكانات الجهد يتم الاحتفاظ في الأكسدة المحتملة لأكثر الفائدة. على الرغم من أنها أقل كيميائيا انتقائية من فسكف العصبية متعددة قد يؤدي إلى الأكسدة نفس المحتملة، في مناطق الدماغ التي تحرف أغلبية ساحقة نحو ناقل عصبي واحد، طبيعة تسليم المفتاح لهذا النهج ترجح عدم وجود مادة كيميائية خصوصية.

القدرة على قياس الإفراج العصبي اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي في قرب الوقت الحقيقي وربطه بأحداث سلوكية معينة توفر فرصة لدراسة التلاقي العصبي الإفراج. هذه المخطوطة تفاصيل استخدام هذا النظام استجواب كبيرة الدوبامين وغلوتامات ردا على مكافأة الطبيعية في الهامستر يتصرف مستيقظا. الهدف من هذه الورقة أن التفاصيل العملية لقياس هذا الإصدار العصبي أثناء السلوك الجنسي في اليرانب الإناث، بهدف إثبات جدواه في دراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

قداد نموذجا مثاليا للاستخدام في تسجيلات الكهروكيميائية
تاريخيا، استخدمت نماذج الجرذان والفئران في دراسة السلوك الجنسي. هذه أنواع القوارض الدخول في تسلسل copulatory ديناميكية، التي تنطوي على السلوكيات التماس الإناث العديدة التي تشمل التنقل والاندفاع، والإذن التلوي لجذب الذكور مطاردة وجبل الإناث⁷في نهاية المطاف. المتصاعدة من الذكور (مع أو بدون الإيلاج المهبلي) تستغرق بضع ثوان فقط، خلالها يمارس الأنثى لها السلوك الجنسي الموقف (يطلق عليها قعس) أيضا إلا لبضع ثوان قبل استئناف سلوكيات التماس النشط. وهذا النمط من السلوك، ويتألف من مستويات عالية من النشاط تتخللها فترات قصيرة من الجمود، إشكالية بالنسبة لقياس كبيرة في سلوك الحيوانات. أولاً، يمكن أن تكون هناك حركة القطع الأثرية في التسجيلات أمبيروميتريك التي لا علاقة لها بالنشاط العصبي. ثانيا، الحركة يرتبط بالإفراج عن العصبية خاصة في بعض مناطق الدماغ. على سبيل المثال، اقترن إطلاق الدوبامين إلى النشاط الحركي في المخطط الظهرية والبطني^8،9، استنتاجا بأن تشكل الأساس لقياسات ميكرودياليسيس الدوبامين بعد بسيتشوستيمولانت ¹⁰من الإدارة. لأن سلوك التماس أنثى نموذجية في موسt القوارض تنطوي على مستويات عالية من النشاط الحركي، وهي ممثلة بالجزء الأكبر من اختبار السلوك الجنسي بعد 10 دقائق، وهذا يجعل من الصعب تنسب التغيرات في كبيرة على مكونات السلوك الجنسي الصريح بشكل جماعي آخر فقط دقيقة.

لتحليل الشخصية الكيميائية العصبية للسلوك الجنسي للإناث، سعى هذا المعمل من أنواع التي يوجد الحد الأدنى من النشاط الحركي المصاحبة للسلوك الجنسي. تسلسل كوبولاتوري في الهامستر السوري (Mesocricetus الذهبي) مثالي للتسجيلات الكيميائية العصبية نظراً لعدم وجود سلوكيات التماس عادة ما ينظر في الجرذان والفئران¹¹. نتيجة لذلك، سيدخل اليرانب الإناث والحفاظ على الموقف قعس لما يزيد عن 9 دقائق من أصل 10 دقائق اختبار الدورة¹². مع عدم وجود حركات الحركي دخيلة الإناث، في فيفو يمكن الحصول على التسجيلات الكهروكيميائية التي يمكن أن ترتبط بمكونات تفاعلات الجنسية مع الذكور.

نوبات copulatory في الهامستر
بعد إدخال حيوان التحفيز الذكور في قاعة الاختبار، سيعكف الذكور في البداية في التحقيق (منظمة العفو الدولية) من الناحية الشرجية التناسلية للإناث قبل تركيب لها (الشكل 2أ). وللذكور جبل، يجب أن تحمل الأنثى تقبلا موقف جنسي المعروف باسم قعس، التي قالت أنها الأقواس ظهرها وينحرف لها ذيل حيث أن الذكور المتصاعدة يمكن الوصول القضيب إلى مهبلها. سيتم تحميل الأنثى، قبض لها هيندقوارتيرس مع كل الكفوف (الشكل 2ب)، الذكور وتبدأ الجه في محاولة للحصول على القضيب الولوج (الشكل 2-ج). الذكور سوف جبل الأنثى (دون الإدراج)، فضلا عن إينتروميت لعدد من المرات قبل أن تحقق في نهاية المطاف القذف. ويطلق على هذا التسلسل يتصاعد وإينتروميشنس مما يؤدي إلى القذف نوبة "كوبولاتوري". وسيكون الذكور عدة نوبات copulatory ضمن جلسة عمل واحدة.

Protocol

وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة مينيسوتا" جميع الإجراءات الموصوفة هنا، ووفقا "دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ¹³ .

1-الحيوانات وجراحة كانوليشن

1. السورية الحصول على الهامستر من مورد حيوانات شائعة في حوالي 55 يوما عمر.
   ملاحظة: على الرغم من أن سن الحيوانات تختلف بسبب القيود المفروضة على مختلف نماذج تجريبية، للسلوك الجنسي فإنه من المهم الحصول على الحيوانات ناضجة جنسياً التي هي كلها تقريبا في نفس العمر.
2. بيت الحيوانات في التي تسيطر عليها درجة الحرارة (22 درجة مئوية) والبيئة الإضاءة (14 ح خفيفة تليها 10 ح الظلام بإطفاء الأنوار في ح 13:00)، مع الغذاء والمياه المتاحة libitum الإعلانية إلا خلال فترات الاختبار التجريبي-
   ملاحظة: نظراً لإنتاج الهامستر موسميا، هذا 14:10 دورة الضوء/الظلام يحاكي ظروفها الطبيعية تربية.
3. بعد التأقلم مدتها أسبوع واحد للمختبر، أداء أوفاريكتوميس الثنائية العقيم وداخل الجمجمة كانولاتيونس ستيريوتاكسيك تحت التخدير العام (مثلاً، بينتوباربيتال)، وإدارة مناسبة مؤسسياً وافق عليها علاج مسكن والمضادات الحيوية بعد العمليات الجراحية كما تم وصفه سابقا ^{14 ، 15}-
   ملاحظة: لدراسة السلوك الجنسي، أوفاريكتوميس تعتبر ضرورية لإزالة الذاتية المصدر الرئيسي للهرمونات الجنسية حيث أن الحيوانات يمكن أن يتسبب موحد للتقبل الجنسي مع هرمون خارجية وفقا للجدول الزمني التجريبي.
   1. لغرس مسبار تتميز وجلوتاماتيرجيك على حد سواء، زرع ستيريوتاكسيكالي دليل القنيات (0.7 مم؛ الرقم 3) في مجال الاهتمام (مثلاً، استهدف هذا المعمل accumbens نواة الحق (NAc)) كما هو موضح بالتفصيل التدرجي في أماكن أخرى ¹⁵-
      ملاحظة: على الرغم من أن البيانات المقدمة من تسجيلات استشعار واحد واحد المسبار غلوتامات أو الدوبامين للحيوان الواحد، يسمح هذا النظام لتسجيل واحد ليصل إلى 4 أجهزة الاستشعار في حيوان مفردة؛ وهكذا، يمكن زرعها القنيات 1-4 اعتماداً على التصميم التجريبي المرجوة والنتائج.
      1. تحديد إحداثيات منطقة اهتمام أطلس ستيريوتاكسيك باستخدام عملية الزرع (مثلاً، الدماغ الهامستر الذهبي واسطة مورين & الخشب)، آخذة في الاعتبار أن أجهزة الاستشعار يمتد 1 مم أدناه القنية في أنسجة المخ.
   2. بعد أن يتم تخفيض قنية ستيريوتاكسيكالي إلى الموقع المطلوب الظهرية البطني، إلصاق في الجمجمة باستخدام غطاء مصنوع من اﻷكريليك الأسنان، المضمون مع مسامير العظام الفولاذ المقاوم للصدأ ورأس بلاستيك جبل ( رقم 3 ; انظر ¹⁵ لمزيد من التفاصيل).
   3. لاختبار ألياف الكربون، إدراج قطب مرجعية (350 قطر ميكرومتر، والطول الإجمالي 7.5 ملم) في نصف الكرة الغربي كونترالاتيرال-
      ملاحظة: موقع معين أو المسافة من القنية ليس المطلوبة؛ يمكن وضع أقطاب مرجعية في أي مكان في نصف الكرة الغربي contralateral ملائم.

2. بيوسينسور، واختبار ألياف الكربون

1. عقب أسبوع للشفاء من عملية جراحية، إدارة نظام فتيلة الهرمون للحث على التقبل الجنسي.
   1. حقن 10 ميكروغرام لنزوات استراديول في 0.1 مل زيت بذر القطن تحت الجلد (الليبي)، حوالي 48 ساعة و 24 ساعة قبل السلوك الجنسي للاختبار، للحث على التقبل الجنسي تجاه الذكور ¹¹-
   2. حقن 500 ميكروغرام من البروجسترون في 0.1 مل زيت بذر القطن، الليبي، ح 4 قبل الأخذ بالذكور للحث على التقبل الجنسي ¹¹-
2. اختبار جميع الحيوانات في بداية مرحلة مظلمة دورة اليومية، السلوكيات الاجتماعية من القوارض خاضعة للتعديل تحت الضوء الأبيض والضوء الأحمر اختبار ظروف ^{16 ، 17 ، 18}-
3. لاختبار غلوتامات بيوسينسور الانزيمية، معايرة أجهزة الاستشعار في المختبر ( الشكل 4) قبل الاستخدام كما هو موضح مسبقاً ^{15 ، 19}-
   1. إجراء المعايرة حلول جديدة اليوم للاختبار في 20 مل زجاج أنابيب الطرد المركزي. لحل أكثر، يذوب 7.4 مغ حمض الجلوتاميك ل في 10 مل من غلاة نقي ح ₂ س بعكس الأنبوب بلطف. جعل الحل إينتيرفيرينت بتذويب ملغ 176.1 AA في 10 مل ح نقية فائقة ₂ سين
   2. إعداد للمعايرة عن طريق وضع محرض مغناطيسية على قاعدة موقف خاتم مختبر الأساسية. ضع كوب تغلف 20 مل على رأس محرض المغناطيسية، والمشبك في مكانها باستخدام المشبك الشق 2 متوسطة. بار
      1. إضافة إثارة مغناطيسية و 20 مل من الفوسفات 100 مم مخزنة المالحة (PBS) في الكأس تغلف. الاتصال الكأس تغلف بحمام مائي المتداولة لتسخين الحل المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية.
         ملاحظة: يجب أن تقوم معايرات biosensor الانزيمية في درجة حرارة الجسم أن النشاط الأنزيمي يتأثر بدرجة الحرارة-
   3. وضع صاحب معايرة جهاز استشعار على رأس الكأس تغلف، وتعيين المضخم معايرة 4-قناة في الأعلى، تأمين في مكان باستخدام المشبك زاوية قائمة. الاتصال المضخم لجهاز تكييف واقتناء بيانات إلى بيانات سجل معايرة.
   4. اختبار حساسية كل بيوسينسور الانزيمية غلوتامات (أو التحاليل الأخرى من أهمية بالنسبة للأخرى المتاحة تجارياً biosensor المسابر مثل الجلوكوز) قبل تسجيل تجريبي بوضع التحقيق في حامل المعايرة فوق تغلف الكأس، غمر تجويف الاستشعار وجزء من سلك الإشارة كلوريد الفضة (AgCl) في المخزن المؤقت للحل.
      1. قبل توصيل كل أجهزة الاستشعار (حتى 4) يجري اختبار بمنفذ على المضخم معايرة 4-قناة، الشروع في تسجيل جديد على واجهة الكمبيوتر استخدام البرمجيات اقتناء للتنزيل مجاناً. السماح لأجهزة الاستشعار للوصول إلى خط أساس مستقر.
   5. البدء في إضافة الحقن أكثر عند أجهزة الاستشعار قد وصلت إلى خط أساس مستقر. استخدام الثقب في حامل المعايرة لإدخال تلميح ماصة للحل المخزن المؤقت. استخدام أداة التعليق التوضيحي رئيسية سريعة في برنامج التسجيل لإضافة تعليق توضيحي عندما يتم حقنه.
      1. جعل 10 ميكرومتر الإضافات من غلوتامات بيبيتينج 40 ميكروليتر من الحل أكثر في الحل المخزن المؤقت. الانتظار لجهاز استشعار لتحقيق الاستقرار بين الإضافات. إضافة 3 حقن الحل أكثر قبل إضافة حقنه واحدة من الحل AA إينتيرفيرينت (ميكروليتر 50 حقن حجم 250 ميكرو التغيير في تركيز).
         ملاحظة: يسمح المعايرة لتحويل التغييرات في إشارة أمبيروميتريك (ينظر أثناء التسجيل التجريبي الانزيمية في الخطوة 2، 12) إلى أحداث تغييرات في تركيز غلوتامات، إذا رغبت في ذلك. راجع مرجع ¹⁵ لتعليمات تدريجية. يتم معايرة المجسات تتميز المستخدمة من قبل هذا المعمل أثناء عملية التصنيع مقدم التجارية. يجب معايرة غلوتامات المسابير في وقت الاستخدام كما يمكنك تقليل حساسيتها على مر الزمن كما تتحلل العناصر الانزيمية ¹⁹. لأن التحلل لا أقطاب ألياف الكربون، المعايرة تقوم بها الشركة قبل الشحن غير كافية على طول ك tهنا زيادة في احتمال الأضرار بألياف الكربون رقيقة (350 ميكرومترات القطر) من خلال معالجة إضافية-
4. خط غرفة الاختبار مع الأسرة مأخوذة من الحيوان ' قفص المنزل s-
   ملاحظة: وهذا يزيد من الإناث ' s الألفة مع اختبار الدائرة، فضلا عن تعرض الذكور لحفز جنسياً العظة التزاوج حاسة الشم التي تم توزيعها من قبل الإناث في الاستجابة للعلاج استراديول-
5. طفيفة تخدير الحيوانات قبل الإدراج المسبار isoflurane أو مخدر متفجرة أخرى في دائرة التعريفي.
6. إزالة أوبدوراتور الانسداد من قنية دليل، وإدراج القطب ألياف الكربون أو مسبار الانزيمية عن طريق رمح الدليل.
7. بعد الإدراج التحقيق، وضع الحيوان في قاعة الاختبار.
   ملاحظة: يستخدم هذا المعمل 10-غال زجاج حوض السمك (24.5 × 48.9 × 29.4 سم)، ولكن يجوز أيضا الدوائر جولة من ناحية المساواة-
8. بدء تسجيل إشارة أمبيروميتريك الفيديو والوقت غير الساحلية في أحد البرامج متاحة تجارياً، ووصف بالتفصيل في مكان آخر ¹⁵-
9. توصيل جهاز استشعار لنظام التسجيل: بوتينتيوستات عن طريق كبل محمية كهربائياً وقطب كهربائي. تثبيت اتصال جهاز استشعار بالشد على مرفق رقم pin على جبل الرأس. تعزيز الاتصال باستخدام مختبر الفيلم إذا لزم الأمر-
   ملاحظة: هناك حاجة إلى موصل مخصص لإرفاق كل من ألياف الكربون القطب والقطب الإشارة إلى بوتينتيوستات، بينما يمكن توصيل أجهزة الاستشعار غلوتامات الانزيمية مباشرة بوتينتيوستات-
السماح
10. بجهاز استشعار لحجته في الدماغ قبل الاختبار التجريبي-
    ملاحظة: مرات الموازنة تختلف تبعاً لاستشعار التسجيل (مثلاً، أجهزة الاستشعار الانزيمية تتطلب الموازنة ح 2-4، بينما أقطاب ألياف الكربون فقط تتطلب حوالي 30 دقيقة). إذا كان يتم زرعها كلا النوعين من أجهزة الاستشعار، حجته لأطول وقت استشعار الانزيمية.
11. بعد الموازنة الاستشعار، إدخال الذكور تحفيز في قاعة الاختبار.
12. وبعد جبل الأولى مع الإدراج القضيب (يسمى الولوج) من الذكور التحفيز، يستمر تسجيل 10-30 دقيقة إضافية، تبعاً لأهداف تجريبية.
13. عقب اختبار سلوكية، قم بفصل الإناث ' استشعار s-
قداد
14. إزالة كلا من قاعة الاختبار. إزالة الفراش، وتنظيف الدائرة باستخدام الإيثانول 70%-
    ملاحظة: بسبب الموازنة قصيرة المطلوبة لتسجيلات ألياف الكربون، يمكن أن تتكرر الخطوات 2.3-2.14 لاختبار الحيوانات متعددة في نفس اليوم. وفي المقابل، نظراً لأن أجهزة الاستشعار الانزيمية تتطلب حوالي 4 ح للموازنة، اختبار الحيوان واحد فقط يوميا للحد من التباين بين الموضوع ممكن بسبب الاختلافات في الحيوانات ' الإيقاعية وقت الاختبار.

3. والتضحية ونضح

1. عقب انتهاء فترة الاختبار، تخدير عميق الإناث اختبار هذا الموضوع مع وكيل يوثانيزينج (مثلاً، هذا المعمل يستخدم حقنه داخل حل الفينيتوئين وبينتوباربيتال 0.2 مل) .
2. ترانسكارديالي نتخلل الحيوان مع 25 مم PBS، درجة الحموضة 7.6، لإزالة كل الدم المتداولة، يليه تثبيت 20 دقيقة باستخدام 4% بارافورمالدهيد-برنامج تلفزيوني-
3. إزالة الدماغ و postfix في ~ 30 مل الحل بارافورمالدهيد 4 ٪ في أنبوب مخروطي 50 مل بين عشية وضحاها.
   1. مخزن الدماغ في 10 ٪ حل السكروز-برنامج تلفزيوني حتى جاهزة لقسم المسلسل.
      ملاحظة: العقول يمكن تخزين إلى 2 أسابيع، مع التغييرات حل السكروز أسبوعية لتجنب النمو المحتمل للملوثات-
4. المسلسل قسم الدماغ في 40 ميكرومتر شرائح من خلال منطقة مزروع أما مع مبضع تجميد أو كريوستات كما تم وصفه سابقا ¹⁹-
5. جبل شرائح متسلسل على الشرائح المتاحة تجارياً المغلفة بمادة لاصقة (أو انظر ²⁰ جعل). السماح لتجف، على الأقل بين عشية وضحاها.
6. وصمة عار الشرائح مع صبغ كريسيل البنفسجي، واضحة، وكما سبق ذكره ساترة ²⁰-
7. الصور الشرائح باستخدام مجهر الحقل مشرق لتأكيد وضع تشريحي للاستشعار-

4. الترميز السلوكية

1. عرض وإضافة تعليقات توضيحية الفيديو باستخدام البرمجيات الحرة للتنزيل تجارياً (انظر الجدول للمواد) البطيء للسلوكيات رمز التحديد الوقت غير الساحلية إلى إشارة أمبيروميتريك.
   ملاحظة: لاستخدام التعليمة البرمجية MATLAB في التحليل (انظر أدناه )، وإضافة تعليقات توضيحية في بداية و نهاية كل من الإناث ' s وذكر ' السلوكيات s.
   1. تعليق ستارتلوردوسيس في الإطار عند الإناث يبدأ دورسوفليكسيون ظهرها وعيوب لها ذيل صعودا. إضافة تعليق توضيحي اندلوردوسيس عند الأنثى ينهي هذا الموقف، الذي غالباً ما يحدث عند الأنثى أحل إلى موقع آخر في قاعة الاختبار.
   2. تعليم ستارتاي عند الأنثى في الموقف قعس والذكر يتحرك له آنف نحو الأنثى ' s المنطقة الناحية الشرجية التناسلية، حيث قد يحدث استنشاق، لعق، أو نوزلينج لها المنطقة العجانيه. إضافة تعليق توضيحي أندي عند الذكور يزيل له آنف من مقربة من الإناث ' المنطقة الناحية الشرجية التناسلية s-
   3. تعليم ستارتماونت عند الذكور النهج ويضع له فوريباوس على الأنثى في تصاعد موقف، بغض النظر عن التوجه لمحاولة جبل (مثلاً، الجانب، الردف).
   4. تعليم ستارتينتروميشن عند الجه الناجح المكاسب المحملة وصول القضيب الذكور إلى الإناث ' المهبل s-
      ملاحظة: الولوج سلوكيا يمكن تمييزها من الجه المحملة التي تحدث قبل الولوج، كما الذكور واضح يسحب أطرافه العليا نحو جسده والتوجهات له الحوض إلى الأمام، وتجعيد الشعر ذيله إلى أعلى، مما يشير إلى اختراق (انظر < فئة قوية = "إكسفيج" > الشكل 4 ج).
      1. وعند الاقتضاء، تعليق توضيحي القذف.
         ملاحظة: في نهاية نوبة التزاوج وبالاقتران مع الولوج نجاح، سوف ينزل الذكور. على الرغم من أن المرء غير قادر على تصور الانبعاثات الفعلية، الهامستر الذكور قد سمة وطئ الحركة مع أقدامهم هند أثناء الولوج ²¹، ومن ثم إضافة تعليق توضيحي القذف في الحدوث حركة القدم.
   5. تعليم اندينتروميشن و اندماونت في أن واحد في الإطار عند الذكور أزال له آثار أقدام هما الجبهة، وبالتالي، أي اتصال مع الإناث. بسبب عجز متكرر لتصور رمز انسحابه، واحد هذه السلوكيات اثنين للسماح للاتساق والموثوقية عبر التزاوج نوبات.
      ملاحظة: نوبة التزاوج يتبع قذف نجاح أو عند الإناث فواصل الموقف قعس بعد واحد على الأقل جبل.

5. مثال على "تحليل البيانات"

ملاحظة: استخدام ألياف الكربون الإمكانات الثابتة والتسجيلات الانزيمية الدوبامينغلوتامات nd، على التوالي، يسمح للقدرة على قياس منشط وأنماط طورية الإفراج الكهروكيميائية. هذا المعمل يستخدم نظام حيازة الحرة والتجارية وتسجيل برامج لتسجيل وتحويل الإشارات من تمثيلي إلى رقمي (التحيز 0.600 الخامس، معدل أخذ العينات = 1 هرتز).

1. وصف بروتوكول تحليل البيانات المثال
   1. على الرغم من أن يمكن استخدام برامج أخرى، قياس منشط وطوريه التغييرات (عابر) في الإشارات الكهروكيميائية مسجل باستخدام MATLAB.
      1. للبيانات المقدمة، وحساب منشط الإشارات باستخدام عامل تصفية متوسط متحرك 50 نقطة. تم حساب تمثيل الإشارة عابرة فقط تم تسويتها عن طريق طرح إشارة منشط من البيانات الخام. عند تحديد قمم طورية، هناك عدة خيارات حسابي (مثلاً، وسم قمم كالتغيرات في إشارة أكثر من 1 SD فوق المتوسط)-
      2. تحديد مواقع هذه القمم، أي، ماكسيما المحلية، من إشارة تم تسويتها باستخدام الدالة MATLAB بيكفيندير مع السعة ذروة الحد الأدنى تعيين إلى جذر متوسط مربع الإشارة. موقع قمم الكشف من إشارة طبيعية استخدمت لاستخراج السعة من كل الذروة. القدرة على الكشف عن قمم يسمح للتعرف على أي سلوكيات الوقت غير الساحلية قد تزامنت مع، أو القيادة في ذروة نسبي في الكيميائية العصبية تحت التحقيق.
   2. الجزء البيانات المجهزة وفقا للشروح سلوكية (راجع الخطوة 3)؛ وطالب ' s t-تم استخدام اختبار لتقييم الاختلافات في مستوى الناقل العصبي منشط وحدوث العابرين والسعة ل العابرين خلال قعس بوت قبل التزاوج مقابل قعس أثناء التزاوج نوبات. لقياس التغييرات في أنماط منشط الإفراج الكهروكيميائية، قورنت نقاط البيانات التي تحدث أثناء موقف قعس مباشرة قبل نوبة التزاوج (أي، قبل التزاوج نوبة قعس) إلى نقاط البيانات أثناء نوبة التزاوج دورة استخدام تي-test.
2. إعداد البيانات الأولية لبروتوكول تحليل البيانات وصف
   ملاحظة: كما ورد، على الرغم من أن التحليلات أو برامج أخرى قد تكون أيضا خيارات قابلة للتطبيق، من أجل استخدام التعليمة البرمجية MATLAB الموصوفة أعلاه، يجب أن تكون مستعدة في البيانات الخام بالطريقة التالية:
   1. تصدير ملفات الشرح والجهد. للقيام بذلك، تحت ' ملف ' التبويب، حدد ' التصدير ' تعمل وحدد ' الشروح ' التبويب حفظ التعليقات التوضيحية. تحت ' ملف ' التبويب، حدد ' التصدير ' تعمل واختر " TSV ' علامة التبويب حفظ قياسات الجهد كملف ملحق TSV.
   2. فتح كل ملف مع برنامج جداول بيانات، وحفظ باسم ' xls/xlsx ' لجعل الملفات المتوافقة مع MATLAB.
      ملاحظة: للحصول ' الشرح ' الملف، وهناك إضافية الشروح التي يجب يدوياً إضافة الصادرات فيما بعد في برنامج جدول بيانات يملي على بدء و نهاية كلا مرحلة ما قبل التزاوج نوبة قعس (المشروح بريمبلوردورسيس ) ونوبة التزاوج حيث أنه يمكن مقارنة هذه النقاط الزمنية مباشرة كما هو مذكور في الخطوة 5.1.2.
   تعليم
   3. بدء قعس بوت قبل التزاوج (ستارتبريمبلوردوسيس) في نفس الوقت كما يبدأ سلوك قعس (ستارتلوردوسيس) هذا أيضا يتضمن سلوكاً جبل، وأيضا في بداية جديدة التزاوج نوبة إذا الأنثى لا يزال الموقف قعس.
   4. تعليم نهاية قعس بوت قبل التزاوج (اندبريمبلوردوسيس) عندما يبدأ أول جبل.
   5. تعليم بدء نوبة التزاوج (ستارتمب) من اندبريمبلوردوسيس، وفي الوقت نفسه، وهذا يدل على بدء نوبة التزاوج.
   6. تعليم نهاية نوبة التزاوج (اندمب) في أما نهاية جبل يحتوي القذف (راجع الخطوة 4.1.4.1)، أو بعد الأنثى ' s إنهاء الموقف قعس (اندلوردوسيس)-

Representative Results

استخدام الكهروكيميائية والسلوكية الترميز المنهجية المبينة أعلاه، بدأ هذا المعمل لتوصيف منشط وتقلبات طورية في الدوبامين وغلوتامات خلال في فيفو تسجيلات للسلوك الجنسي. بسبب طريقة دقيقة وقتيا لهذه المنهجية، ونحن أكثر دقة تميز كبيرة خلال السلوك الجنسي؛ وكذلك تنسب تغييرات محددة في الإفراج عن أنماط للمقابلة منشط التغييرات أثناء نوبات التزاوج، وتقلبات عابرة المقابلة أثناء استلام للأنثى من السلوكيات كوبولاتوري الفردية (مثل، الولوج والقذف) من الذكور المتصاعدة.

على وجه التحديد، استخدمنا هذه المنهجية إلى التركيز على قياس أنماط إطلاق الدوبامين والغلوتامات في ائتلاف البرنامج الجديد الحيوانات منفصلة. وهي منطقة حرجة المتورطين في مكافأة تجهيز²² ائتلاف البرنامج الجديد ووصفت بأنها منطقة لا يتجزأ في الجوانب مكافأة للسلوك الجنسي²³.

ولاحظنا أن الإناث تظهر خلال السلوك الجنسي، زيادة منشط في مستويات تتميز في صميم NAc أثناء التزاوج نوبات (الشكل 5). بينما تكون هذه التغييرات منشط سيظهر لجميع نوبات التزاوج، المنهجية الموصوفة أعلاه يمكن قياس التغيرات منشط بين كل نوبة التزاوج، وبالتالي زيادة الزمنية تحديد التغييرات الشاملة لمستويات منشط للإفراج عن ناقل عصبي طوال الدورة بكاملها. علاوة على ذلك، يمكن تحديد تغيرات طورية هذه المنهجية وصف وخريطة وقتيا التصرفات المحتمل المقترنة بهذه التقلبات العصبي طورية. على وجه التحديد، أن هذه النتائج الأولية تشير إلى أن تتميز العابرين في ائتلاف البرنامج الجديد تنشأ أثناء التزاوج نوبات، أثناء الإدراج المهبلية (الولوج) من الذكور (الشكل 6). وعلاوة على ذلك، هذا الارتباط مع الولوج محددة، مع الاستجابات تتميز ضئيلة للسلوكيات copulatory الأخرى، مثل منظمة العفو الدولية.

وقد لوحظ وجود نمط مماثل في الحيوانات الأخرى فيما يتعلق بإطلاق سراح غلوتامات، مع العابرين السريعة التي تتوافق مع إينتروميشنس الفردية في صميم NAc الظهرية خلال نوبة copulatory (الشكل 7). هذا النمط هو المنطقة المحددة، مع لا إشارة ملحوظة تحدث في شل بريدًا أو الآنسي كودات للحيوانات الأخرى.

الشكل 1 : التكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور.
قياسي تلفيق المسابير biosensor الانزيمية المتاحة تجارياً التي تكشف عن العصبية عن طريق المعالجة بوساطة إنزيم (الصورة اليسرى). في حالة أجهزة استشعار جلوتاماتيرجيك، أوكسيديز غلوتامات يعمل في طبقة الانزيمية (الصورة اليمنى) لتحويل العصبي نونيليكترواكتيفي إلى اليكترواكتيفي فوق أكسيد الهيدروجين (H₂O₂) يتم الكشف عنها بواسطة الأكسدة في قطب البلاتين-ايريديوم (Pt-الأشعة تحت الحمراء). حمض الأسكوربيك (أإ)، إينتيرفيرينت مشتركة التي هي تتأكسد في نفس الإمكانات، مستبعدة عن طريق إضافة أوكسيديز AA في طبقة الانزيمية يحول إينتيرفيرينت للمياه نونيليكترواكتيفي. يتم استبعاد إينتيرفيرينتس اليكترواكتيفي السلبية الأخرى الموجودة في الدماغ عبر غشاء انتقائي سلبي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : عناصر الهمستر التزاوج نوبة.
في قداد، نوبة التزاوج يتكون من سلسلة سلوكيات كوبولاتوري، خلالها الأنثى يظل في الموقف قعس غير متحرك أثناء التحقيق (أ)أنوجينيتالي الذكور ويتصاعد (ب)ويحقق الولوج (ج). . علما الولوج سلوكيا يمكن تمييزها عن تصاعد الذكور تسحب أطرافه العليا نحو جسده، التوجهات له الحوض إلى الأمام، وتجعيد الشعر ذيله إلى أعلى، مما يشير إلى اختراق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : بناء سقف الجمجمة.
دليل القنيات ومسامير العظام، والاكريليك الأسنان تستخدم في بناء سقف الجمجمة للسماح بالإدراج من ألياف الكربون أو مسبار الانزيمية (انظر¹⁵ للحصول على تفاصيل متدرج). يصور هذا الرقم زرع قنية مفردة عبر NAc الحق لاستشعار الانزيمية (لا مرجع مزروع الكهربائي) وجبل الرأس البلاستيك لاستشعار الاستقرار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : معايرة غلوتامات بيوسينسور.
حساسية كل بيوسينسور إلى غلوتامات يتم اختبارها في المختبر قبل التسجيل التجريبي من 10 ميكرون الإضافات الغلوتامات (الأخضر) عند 37 درجة مئوية (نظراً للنشاط الأنزيمي يتأثر بدرجة الحرارة). ويتأكد كل جهاز استشعار لعدم الاستجابة لحمض الأسكوربيك (AA؛ الأحمر) أو الدوبامين (DA؛ الأزرق). هذه المعايرة يسمح بتحويل تغييرات في إشارة أمبيروميتريك رأيت أثناء التسجيل التجريبي للتغيرات في تركيز غلوتامات.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : منشط يزيد في الدوبامين خلال نوبة التزاوج.
ألف المثال مجدد من نوبة قعس إشارة مقابل التزاوج نوبة قعس إشارة. بريماتينج قياس إطلاق الدوبامين منشط، قورنت الردود أمبيروميتريك على مستويات الدوبامين خلال قعس قبل نوبة التزاوج (ميغابايت) تلك خلال ميغابايت. وتشير إلى مربعات رمادية قعس قبل ميغابايت. Blتشير خانات رق إلى قعس خلال ميغابايت. باء الكمي الممثل من الحيوان واحد مقارنة الجهد يعني بين بريمب قعس وقعس ميغابايت. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM)، وتشير العلامة النجمية إلى فرق كبير (قيمة p < 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 6 : تتبع الدوبامين الممثل.
الإصدار طورية الدوبامين تأمين الوقت إلى إينتروميشنس من الذكور في صميم NAc الظهرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 7 : تتبع غلوتامات الممثل.
غلوتامات العابرين تناظر إينتروميشنس الفردية من الذكور في صميم NAc الظهرية خلال تجربة جنسية موسعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

على الرغم من معقدة نسبيا، يمكن أن تنشأ بعض المشاكل عند استخدام هذا الأسلوب. أولاً، يجب أن يكون موضع ستيريوتاكسيك التحقيقات دقيقة: خلافا ميكرودياليسيس أن عينات قطرها أوسع من الوسط خارج الخلية المحيطة بالمسبار، هذا الأسلوب يسمح فقط بقياس العصبي التي تأتي في اتصال مباشر مع التحقيق. ثانيا، في حالة تسجيل ألياف الكربون، بسبب عرض صغير من الألياف، ويمكن أن يحدث الكسر، ويجب إدراجها في التحقيق مع الرعاية المتعمد. وفي حالة جلوتاماتيرجيك أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، يمكن أن يحدث تدهور الانزيمية إذا لم يتم استخدام التحقيق داخل الإطار الزمني مضمونة لمدة 3 أسابيع. لحسن الحظ، كل هذه القضايا يتم عنونة، ويمكن القضاء عليها مع الرعاية المناسبة والاهتمام بالتفاصيل.

تحذير إشكالية يحتمل أن ينشأ في خصوصية التسجيلات الثابتة المحتملة من ألياف الكربون. نظراً لإمكانية تطبيق الدوبامين يتزامن مع مونوامينيس الأخرى، مثل إفراز، إذا تم إجراء التسجيلات في المناطق أن الإفراج عن كل أجهزة الإرسال العصبية، من هذا النقص في خصوصية الكيميائية قد تحد من تفسير النتائج. في ائتلاف البرنامج الجديد وهذا لا يشكل مشكلة رئيسية، مع الدوبامين يجري الإرسال الكاتيكولامينات الابتدائي²⁴. نظراً لأن حوالي 98% الخلايا في ائتلاف البرنامج الجديد هي متوسطة شوكي من الخلايا العصبية التي تستجيب تتميز كبيرة²⁴، الإشارة متحيزة تجاه الكشف عن الدوبامين ويسهل استخدام هذا النهج أكثر تسليم المفتاح.

فائدة أخرى من هذا بيوسينسور الانزيمية وألياف الكربون إمكانية إصلاح نظام تسجيل أنه يمكن إجراء التسجيلات التحقيق المزدوج، حيث أن كلا من اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي العصبية مثل الدوبامين وغلوتامات يمكن أن يقاس في نفس الحيوان في نفس الوقت. على الرغم من أن تأتي البيانات المقدمة هنا من التسجيلات في الحيوانات منفصلة، هذه التقنيات يمكن أن تستخدم في الوقت نفسه أن أحد يمكن تقييم تقارب كبيرة في مناطق متعددة في الدماغ أو في نفس المنطقة على المستوى الثنائي. مجموعة من التسجيلات داخل الحيوان نفسه، أو مقارنة التسجيلات عبر الحيوانات كما هو موضح هنا، كل أدوات قوية في توضيح الآليات وراء اتصالات شبكة الاتصال والإشارات.

وباختصار، هذه الورقة يوضح تقنيات قوية بيوسينسينج الانزيمية وتسجيل الإمكانات الثابتة لقياس متعددة العصبية اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي في الاستفادة من إعداد تجريبية واحدة. على الرغم من أن البيانات المقدمة هنا يأتي من التسجيلات الفردية العصبي عبر الحيوانات متعددة، يوفر هذا النظام القدرة على تسجيل من يصل إلى 4 أجهزة الاستشعار في الحيوان واحد وفي نفس الوقت¹⁵. نتائج العينة المعروضة مجتمعة توفير نظرة ثاقبة كبيرة السريع في الهامستر الإناث الناتجة عن أنماط محددة من التحفيز كوبولاتوري من الذكور. علاوة على ذلك، تثبت هذه التجارب الردود الوقت غير الساحلية من العابرين تتميز وجلوتاماتيرجيك في جوهر الأنثى بريدًا للولوج من الذكور، مما يوحي بأن هذا الإفراج قد تكون مسؤولة عن ترميز خصائص مميزة مجزية السلوك الجنسي. أن هدفنا الاستمرار في استخدام نمط التزاوج في أنثى الهامستر السوري لوضع صورة أكثر شمولاً من العلاقة بين الدوبامين في الجسم الحي وإطلاق سراح غلوتامات والدوائر الأساسية للمكونات الفردية للمنبهات كوبولاتوري من الذكور. ونحن نعتقد أن القدرة على توصيف أنماط هذه العصبية ليس فقط مفيداً من علوم أساسية منظور²³، بل أيضا في توضيح النهج العلاجية المحتملة للأشكال المرضية لمكافأة السلوك هذه ك إدمان المخدرات²⁵.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal	Oak Pharmaceuticals Inc.	76478-501-50	Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5 mg/100 g body weight, injected intraperotineally.
Loxicom analgesic	Norbrook Laboratories	6451603670	NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam.
Enroflox antibiotic	Norbrook Laboratories	5552915411	Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D	Merck Animal Health	00061047305	Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws	Pinnacle Technologies, Inc.	8111-16	1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull.
Dental acrylic (Bosworth Duz-All)	Bosworth	166261C	Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup	Pinnacle Technologies, Inc.	8400-K2	Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K1	The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables.
Video EQ700 EverFocus camera  package	Pinnacle Technologies, Inc.	9000-K10	EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available.
Sirenia Acquisition software	Pinnacle Technologies, Inc.	Free--available to download from pinnaclet.com	Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit	Pinnacle Technologies, Inc.	7000-K2-T-BAS	In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051).
Stir plate	Corning	6795-410D	Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation	PolyScience	8006A11B	PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature.
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae	Pinnacle Technology, Inc.	7002-CFS	Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode	Pinnacle Technology, Inc.	7065	Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors	Pinnacle Technology, Inc.	7001	Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae	Pinnacle Technologies, Inc.	7030	Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats	Pinnacle Technologies, Inc.	7011	Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.