Summary
在这里, 我们描述了一个常见的方法来诱导慢性肝损伤小鼠通过喂养的胆碱缺乏和氨基补充 (多) 饮食。我们展示健康监测, 肝脏灌注, 隔离和保存。六周的时间过程可以告知肝损伤、病理、纤维化、炎症和肝祖细胞反应。
Abstract
慢性肝病, 如病毒性肝炎、酒精性肝病或非酒精脂肪肝, 其特征是持续性炎症、肝实质的渐进破坏和再生, 肝祖细胞增殖和纤维化。每个慢性肝病的终末期是肝硬化, 是肝癌发展的主要危险因素。为了研究控制疾病的起始、建立和进展的过程, 实验室中使用了几种动物模型。在这里, 我们描述了六周的时间过程中的胆碱缺乏和氨基补充 (多) 小鼠模型, 其中包括喂养六周的老雄性 C57BL/6J 小鼠与胆碱缺乏的 chow 和 0.15% DL 氨基补充饮用水。对动物健康的监测和典型的体重损失曲线进行了解释。该协议显示了经心脏穿刺治疗的肝脏和血液采集的总检查结果, 随后进行血清分析。其次, 肝脏灌注技术和收集不同的肝叶的标准评价显示, 包括肝组织学评估的苏木精和曙红或天狼星红色染色, 荧光检测肝细胞数量以及对肝脏微环境的转录分析。这种小鼠模型适于研究慢性肝病诱发的炎症、化和肝祖细胞动力学, 并可用于测试可能调节这些过程的潜在治疗剂。
Introduction
肝脏是身体的最大的腺新陈代谢的器官并且有许多复杂作用。肝脏的关键作用包括消化、新陈代谢、解毒、储存必要的营养素、生产血浆蛋白组分、以及通过驻留巨噬细胞或枯否体细胞介导的免疫。肝脏有很大的能力再生, 即使高达70-90% 的总质量损失。在急性肝损伤的情况下, 如看到部分肝切除或扑热息痛中毒, 其余健康肝细胞增殖, 以修复在高度协调的过程中的损害1。然而, 当肝细胞因长期病毒感染、酒精或非酒精性脂肪肝而长期受伤时, 炎症微环境引发肝纤维化的活化, 并肝祖细胞增殖 (LPCs), 有可能分化为胆管或肝细胞2,3,4,5。确切的起源, 分化命运的 LPCs, 他们对肝脏再生的贡献, 和肝癌一直是激烈辩论的话题, 很可能取决于伤害的严重性和上下文2。早期再生相关事件的顺序也有争议的讨论, 一些研究人员指出, 肝星状细胞活化和基质重塑对于产生 LPC 偏爱的小生境6是必不可少的, 而其他报告, 要触发纤维7, 需要 LPC 扩展和 so-called 胆管反应。有许多动物模型研究损伤和再生的具体方面, 试图了解所有的潜在因素, 调节疾病进展, 并最终制定新的治疗策略的病人8。
本发明的胆碱缺乏和氨基补充的饮食模型最初是为大鼠使用的, 后来改性用于小鼠的慢性肝损伤诱导,9,10。膳食缺乏的胆碱导致受损的组装和分泌非常低密度脂蛋白。结合 hepatocarcinogen dl-氨基, 这种方案导致过量的肝脏脂肪负荷, 连续炎症, periportal 纤维化, LPC 反应和长期肝癌的发展11,12.然而, 重要的是, 不同的小鼠菌株表现出鲜明的炎症, 化和 LPC 反应动力学13。本协议描述了慢性肝损伤诱导的 C57BL/6J 小鼠, 最常用的近交系小鼠品系。
在慢性肝病的研究中, 典型的分析包括苏木精和红素的组织学评估以及天狼星红色染色, 以可视化胶原沉积、免疫组织化学或荧光检测肝细胞的数量,组通过复杂生长因子和细胞因子网络协调诱导细胞变化的肝脏微环境分析14,15,16,17,18。
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Protocol
1. 动物实验
在本调查中描述的所有动物研究都是由科大学动物伦理委员会 (批准编号: AEC_2014_28) 在开始之前批准的根据《澳大利亚动物保育和使用守则》进行实验和执行.
- 动物
- 使用六周的老雄性 C57BL/6J 小鼠进行实验.
- 实验设计
- 到达动物设施后, 允许小鼠在任何实验开始前适应四天.
- 在小麦谷壳床上用品上的小鼠, 它已经耗尽了可见的谷物和茎秆, 并在单独通风的笼子里保持12小时的昼夜循环。改变床上用品在天三和七, 然后每周之后.
- 为鼠标提供 ad 随意 获得胆碱缺乏饮食和饮用水补充0.15% 的 dl-氨基。在4和 #176 中保持氨基补充水, 每隔一天更换一次饮用水, 以确保新鲜度并鼓励饮用。每隔一周, 每周一次彻底改变, 就会出现胆碱缺乏的食物.
- 在休息和处理过程中观察小鼠。监测动物健康的标准标志, 包括整体外貌、姿势、社会互动、仪容、皮毛状况和体重.
- 在实验的前两周每天对小鼠进行称重, 以确保任何有超过20% 体重减少的动物被安乐死, 以限制不必要的痛苦。这是典型的情况下, 在不到5% 的动物。两周后, 称重的频率可以减少到每周三次 ( 例如 , 星期一, 星期三, 星期五).
- 肝脏灌注和隔离
- 麻醉小鼠在指定的时间点 (在这项研究一, 两个, 和六周的多药) 与氯胺酮 (100 毫克/千克) 和嗪 (10 毫克/千克) 腹腔注射。测试踏板的撤退反射, 以确保足够的麻醉.
- 用70% 乙醇润湿毛皮, 在腹壁上垂直中线切开, 使用梅奥剪刀。肋骨笼可以被移除, 以便更容易进入心脏.
- 使用 25 G x 1/2 和 #34, 通过慢心穿刺收集血液; 常规壁针, 以避免心脏塌陷。允许血液在室温下在离心管内凝结, 在 2000 x g 离心10分钟后获得血清样品。后来, 通过标准的步骤测量血清丙氨酸转氨酶水平 12 .
- 将胃和小肠移到一侧, 并暴露门静脉。使用梅奥剪刀切割心脏, 允许液体退出和灌注肝脏与无菌磷酸盐缓冲盐水 (pH = 7.4) 通过插管门静脉使用 27 G x 1/2 和 #34; 规则壁针。一个均匀脱皮肝脏表明成功灌注所有肝裂片.
- 小心地将肝脏分离, 然后用镊子和梅奥剪刀把它放在培养皿中。除去多余的、肝的组织和胆囊.
- 在总的肝脏重量被记录了之后, 切开一个小裂片成几平方毫米的几小块, 转移他们到无菌管, 并且在液氮结冰为以后 RNA和蛋白质提取, 按照标准的协议。在器官收集后尽快将这些组织块冷冻起来, 以避免任何组织退化.
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Representative Results
在六周的时间过程中, 多因素诱发慢性肝损伤, 参数评估的天数 7 (归纳阶段), 14 和 21 (建立阶段) 和 42 (维护阶段)。与对照组小鼠相比, 经治疗的小鼠在初始适应阶段损失了20% 的初始体重, 并倾向于在建立和维护阶段重拾重量(图 1)。体重与血清丙氨酸转氨酶水平呈反比关系, 这是肝细胞损伤的指标(图 2)。四微米, 福尔马林固定, 石蜡包埋肝组织切片染色苏木素和曙红, 以评估肝脏结构。健康的肝脏显示一个正常的结构与有序的肝细胞辐射从中央静脉, 形成肝实质。相比之下, 经治疗的肝脏显示出极大的破坏肝结构和许多嗜细胞的实质浸润的诱导和建立阶段和正常化的维护阶段(图 3)。为了评估纤维, 4 微米的薄, 福尔马林固定, 石蜡嵌入肝切片染色的多聚偶氮染料天狼星红, 这是肝脏胶原沉积的可视性。在慢性肝损伤的诱导阶段, 胶原蛋白在 periportal 区的软组织中积累。但是, 在建立和维护阶段(图 4)中规范化的级别。基质嵌体和冷冻肝组织被切成7微米的薄切片低温。荧光染色的细胞标记, 然后进行分析的时间和空间安排的特定肝细胞在一个时期的过程。在健康的肝脏中, 胆道和肝祖细胞标记 panCK 只染色胆管结构, 而炎症细胞标记 CD45 检测肝细胞或枯否细胞。在慢性损伤的肝脏, 然而, 增加 panCK 染色反射胆汁和肝祖细胞增殖, 达到峰值和到达一个稳定状态在大约14天以后治疗。CD45-positive 炎性细胞的数量, 代表肝居民和浸润细胞, 也达到峰值, 在诱导阶段的多能诱发损伤, 并慢慢正常化到控制水平的建立和维护阶段(图 5)。慢性损伤肝脏炎症细胞数量的增加伴随着肝脏微环境的迅速变化。快速诱导或显著增加转录水平的细胞因子和生长因子观察。这些包括肿瘤坏死因子 (TNF), 肿瘤坏死因子样细胞凋亡 (调整), 毒素β (LTβ), 肝细胞生长因子 (HGF), 转化生长因子β (TGFβ), 和 interleukin-6 (IL-6), 例如。他们的成绩单水平都在归纳阶段达到峰值, 并在建立和维护阶段正常化-类似于以前显示的疾病参数(图 6)。
图 1.健康和经治疗的小鼠的体重记录.慢性损伤的小鼠失去了20% 的初始体重在诱导阶段的多能喂养和随后恢复。显示了一个代表性的图示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.健康和多药治疗小鼠血清丙氨酸转氨酶水平的变化.在六周的时间过程中, 健康小鼠血清丙氨酸转氨酶 (ALT) 水平保持不变, 但在诱导期达到峰值, 在经治疗的动物的建立和维持阶段正常化。显示了一个代表性的图示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3.肝切片的苏木和曙红染色.福尔马林固定的和石蜡包埋的肝组织切片, 用 H 和 #38 染色; E 显示控制小鼠肝细胞的有序排列。与此相反, 肝脏结构在诱导阶段被治疗的小鼠被极大地打乱了, 与六星期的时间路线的结尾正常化。刻度栏代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.天狼星红染色促进胶原蛋白可视化的健康和治疗小鼠.与对照组只显示小 perivenous 胶原蛋白的小鼠相比, 慢性损伤的动物在诱导期的 periportal 软组织区表现出胶原蛋白积累, 对维持阶段的保持缓慢正常化。六周的时间历程。刻度栏代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 5.荧光检测炎症和胆道/肝祖细胞.在健康的肝脏中, 只有胆道和肝祖细胞标记 panCK (red) 和 CD45 抗体可视化的肝细胞或枯否细胞 (绿色) 染色。在 CD45 喂养的诱导阶段, 大量的+细胞数量急剧增加, 其中包括肝居民和浸润性炎症细胞。这炎症反应正常化到 t 的末端他六周的时间课程。胆汁和肝祖细胞, 染色与标记 panCK 增加了数到第二周, 并达到了一个稳定的状态之后。DAPI 用于核定量。刻度栏代表100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.细胞因子和生长因子的组分析.RNA 被隔绝了从被处理的被治疗的肝脏组织的被冻结的片断做组分析肝脏微环境。图示肿瘤坏死因子 (tnf)、tnf 样弱诱导细胞凋亡 (调整)、毒素β (LTβ)、肝细胞生长因子 (HGF)、转化生长因子β (TGFβ) 和 interleukin-6 (IL-6)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
慢性肝病通常是一种无声的疾病, 大多数患者无症状, 它是一个主要的贡献, 发病率和死亡率在世界范围内。慢性酒精中毒和丙肝病毒感染是主要原因。慢性肝损伤的特点是肝脏炎症、纤维化和严重的肝硬化、肝癌和最终肝功能衰竭。目前尚无治疗方法, 虽然已取得重大进展, 了解肝脏疾病的机制, 但仍然迫切需要新的治疗途径。
时间饮食是一个简单的, 容易管理的模型, 诱导和研究脂肪的变化或肝脂肪, 炎症, 纤维化, LPC 增殖, 并在长期实验中, 肝癌的发展6 ,11,12,13,16,17。最初用于大鼠19,20, 后来被改编为促进野生和转基因小鼠的 LPC 研究9。
在我们的实验室里, 我们发现使用小麦谷壳代替其他的床上用品是至关重要的。尽管它是可见的谷物和秸秆耗尽, 一些额外的营养素仍然留在小麦谷壳床上用品和抵消一些苛刻的影响, 慢性肝损伤诱导。此外, 这种床上用品提供了环境的丰富, 并鼓励正常的食物搜索行为在小鼠。绝大多数的不良事件都是在第一周的治疗中观察到的, 此后很少见到。使用具有至少16克起始重量的小鼠, 可以减少不良事件的发生几率。然而, 如果起始重量大于18-20 克, 诱导的肝祖细胞的数量可能会降低。该模型可用于研究肝脂肪, 炎症, 肝祖细胞反应, 纤维化, 肝细胞癌的发展没有肝硬化的存在, 如在一些非酒精性脂肪肝病 (脂肪肝) 和乙型肝炎病毒感染患者21,22。相比之下, 慢性肝损伤的乙酰 (TAA) 模型是一种更具侵略性的制度。它诱导轻度的脂肪变化, 炎症, 肝祖细胞, 和纤维化已经进展到早期肝硬化周围的6周时间点12。因此, 如果非酒精性脂肪相关的过程是研究重点, 而 TAA 的时间过程可能是有利的, 当不同阶段的纤维化严重程度是有益的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究理事会 (APP1042370、APP1061332、APP1087125) 澳洲的资助。作者希望感谢科科卫生创新研究所的工作人员提供技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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