Summary
Hier beschreiben wir eine gängige Methode um chronische Schädigung der Leber bei Mäusen zu induzieren, durch die Fütterung einer Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Ernährung. Wir zeigen Systemüberwachung, Leber Perfusion, Isolation und Erhaltung. Schädigung der Leber, Pathohistology, Fibrose, entzündliche, und Leber Stammvater-Zell-Reaktionen kann ein zeitlichen Verlauf von sechs Wochen mitteilen.
Abstract
Chronische Erkrankungen der Leber, z. B. Virushepatitis, alkoholische Leberkrankheit oder nicht-alkoholische Fettleber, zeichnen sich durch kontinuierliche Entzündung, fortschreitende Zerstörung und Regeneration der Leber Parenchym, Leber Stammvater Zelle Proliferation und Fibrose. Das Endstadium einer jeden chronische Lebererkrankung ist Leberzirrhose, ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms. Um Prozesse, die Regulierung der Krankheit Einleitung, Aufbau und Verlauf zu untersuchen, werden verschiedenen Tiermodellen in Laboratorien verwendet. Hier beschreiben wir einen sechswöchige zeitlicher Verlauf des Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Mausmodells, umfasst sechs - Wochen alten männlichen C57BL/6J Mäuse mit Cholin-defizienten Chow und 0,15 % DL-Ethionine-ergänzt Trinkwasser zu füttern. Überwachung der Tiergesundheit und eine typische Körperkurve Gewicht Verlust werden erläutert. Das Protokoll zeigt die grobe Prüfung einer CDE-behandelte Leber und Blut-Sammlung durch Herzpunktion für nachfolgende Serum Analysen. Als nächstes sind die Leber Perfusion Technik und Sammlung von verschiedenen Leber-Lappen für Standardauswertungen gezeigt, einschließlich Leber Histologie Einschätzungen von Hämatoxylin und Eosin oder Sirius Rote Färbungen, immunofluorescent Erkennung von hepatischen Zellpopulationen sowie Transkriptom profiling der Leber Mikroumgebung. Dieses Maus-Modell eignet sich für entzündliche studieren, Fibrogenic und Leber Stammvater Zelle Dynamik induziert durch chronische Lebererkrankungen und kann verwendet werden, um potenzielle Therapeutika zu testen, die diese Prozesse modulieren kann.
Introduction
Die Leber ist die größte glanduläre Stoffwechselorgan des Körpers und hat viele komplexe Funktionen. Schlüsselrollen für die Leber gehören Verdauung, Stoffwechsel, Entgiftung, Speicherung von Nährstoffen, Herstellung von Blutplasma Proteinkomponenten und durch ansässige Makrophagen oder Kupffer Zellen vermittelte Immunität. Die Leber hat eine große Fähigkeit zu regenerieren, auch wenn bis zu 70-90 % seiner gesamten Masse verloren geht. Im Falle einer akuten Schädigung der Leber vermehren sich die verbleibenden gesunden Hepatozyten wie gesehen nach einer teilweisen Hepatektomie oder Paracetamol-Vergiftung, um den Schaden in einer hochgradig koordinierten Prozess1reparieren. Wenn die Hepatozyten durch langfristige virale Infektion, alkoholische und nicht-alkoholische Fettleber, chronisch verletzt sind die entzündlichen Mikroumgebung löst jedoch die Aktivierung des Ganglion Leberzellen Fibrose fahren und die Verbreitung von Leber Vorläuferzellen (LPCs) mit dem Potential, in Cholangiocytes oder Hepatozyten2,3,4,5zu unterscheiden. Die genaue Herkunft Differenzierung Schicksal der LPCs, ihren Beitrag zur Leberregeneration und Hepatocarcinogenesis Themen intensiv diskutiert wurden und wahrscheinlich hängen von der Schwere der Verletzung und Kontext2. Die Reihenfolge der frühen Regeneration verbundenen Ereignisse wird auch kontrovers diskutiert, mit einigen Ermittler, die besagt, dass hepatische stellate Zelle Aktivierung und Umbau-Matrix ist wesentlich für die Erzeugung eines LPC-Begünstigung Nische6, während andere, Bericht, dass LPC Expansion und die so genannte Ductular Reaktion auf Trigger Fibrogenese7erforderlich sind. Es gibt zahlreiche Tiermodelle, spezifische Aspekte der Schädigung und Regeneration, in einem Versuch, die zugrunde liegenden Faktoren zu verstehen, die Fortschreiten der Erkrankung zu regulieren und letztendlich neue Behandlungsstrategien bei Patienten8entwickeln zu studieren.
Die Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) diätetische Modell wurde ursprünglich entwickelt für den Einsatz in Ratten und später für die chronische Schädigung der Leber Induktion in Mäusen9,10modifiziert. Diätetischen Mangel an Cholin führt zu eingeschränkter Montage und Sekretion von sehr Low-Density-Lipoproteine. In Kombination mit der Hepatocarcinogen DL-Ethionine, diese Therapie führt zu übermäßiger hepatische Fett Laden, kontinuierliche Entzündung, Fibrose Periportal, LPC Reaktion und langfristig an hepatozellulären Karzinom Entwicklung11,12 . Wichtig ist, allerdings zeigen verschiedene Mausstämme markante Mustern von entzündlichen, Fibrogenic und LPC Antwort Dynamik13. Dieses Protokoll beschreibt chronische Schädigung der Leber Induktion in den Mäusen C57BL/6J, die am häufigsten verwendeten Inzucht Maus Belastung.
Chronische Lebererkrankung Forschung umfassen typische Analysen histologische Bewertung von Hämatoxylin und Eosin sowie Sirius rote Färbung, um Kollagen Ablagerungen, immunhistochemische oder immunofluorescent Erkennung von hepatischen Zellpopulationen zu visualisieren, und transkriptomischen Analysen von der Leber Mikroumgebung, die induzierte Zellveränderungen durch komplexe Wachstumsfaktoren und Cytokine orchestriert Netzwerke14,15,16,17 , 18.
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Protocol
1. Tier-Experimente
alle tierexperimentellen Studien beschrieben in dieser Untersuchung wurden von der Curtin University Tier Ethikkommission genehmigt (Zulassungsnummer: AEC_2014_28) vor Beginn des der Experimente und im Einklang mit den australischen Code für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt.
- Tiere
- sechs - Wochen alten männlichen C57BL/6J Mäuse für die Experimente verwenden.
- Experimentelles Design
- nach Ankunft in der Tier-Einrichtung, können Mäuse für vier Tage vor Beginn der Experimente akklimatisieren.
- Hausmäuse auf wheaten Spreu Bettwäsche, die hat sichtbare Körner und erschöpft worden und halten Mäuse auf 12-Stunden-Tag/Nacht-Zyklen in individuell belüftete Käfige. Wechsel Bettwäsche an Tagen drei und sieben, dann wöchentlich danach.
- Für Mäuse mit Ad Libitum Zugriff auf die Cholin-Mangel Ernährung und Trinkwasser mit 0,15 % des DL-Ethionine ergänzt. Halten Sie Wasser bei 4° C die DL-Ethionine-ergänzt und ersetzen Sie Trinkwasser jeden zweiten Tag frische zu gewährleisten und fördern trinken zu. Die Cholin-defizienten Chow jeden zweiten Tag mit einer kompletten Veränderung der Chow einmal wöchentlich aufladen.
- Beobachten Mäuse in Ruhe und bei der Handhabung. Monitor standard Anzeichen für Tiergesundheit, einschließlich Gesamterscheinung, Körperhaltung, soziale Interaktion, Pflege, Zustand zu beschichten und Körpergewicht.
- Wiegen Mäuse täglich während der ersten zwei Wochen des Experiments um sicherzustellen, dass keine Tiere aus mehr als 20 % Gewichtsverlust Körper werden eingeschläfert, um unnötige Leiden zu begrenzen. Dies gilt in der Regel in weniger als 5 % der Tiere. Nach zwei Wochen, die Häufigkeit der Wägung reduziert werden bis dreimal wöchentlich (z.B. Montag, Mittwoch, Freitag).
- Leber Perfusion und Isolation
- Mäuse zu angegebenen Zeitpunkten (in dieser Studie ein, zwei und sechs Wochen auf der CDE-Diät) mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion zu betäuben. Testen Sie das Pedal Rückzug Reflex dafür ausreichende Anästhesie.
- Befeuchten Sie das Fell mit 70 % Ethanol und machen einen vertikalen Mittellinie Schnitt in der Bauchdecke bis die Membrane mit Mayo Schere. Für einen leichteren Zugang zum Herzen des Brustkorbs entfernt werden.
- Sammeln Blut durch langsame Herzpunktion mit einem 25 X 1/2 " regelmäßige Wand Nadel zu vermeiden, reduzieren des Herzens. Lassen Sie das Blut in einem Microcentrifuge Schlauch bei Raumtemperatur zu Serumproben nach Zentrifugation bei 2.000 x g für 10 min. gerinnen. Später messen Alanin Transaminasen Serumspiegel von Standardverfahren 12.
- Im Magen und Dünndarm zur Seite bewegen und setzen die Pfortader. Schneiden Sie das Herz mit Mayo Schere damit Flüssigkeiten zu verlassen und durchspülen die Leber mit sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH = 7,4) durch die Pfortader mit einem 27 X 1/2 Metallspirale " regelmäßige Wand Nadel. Eine gleichmäßig gebrühte Leber zeigt erfolgreiche Perfusion der Leber alle Lappen.
- Lösen die Leber vorsichtig und legen Sie sie in eine Petrischale mit Zange und Mayo Schere. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe-Leber und Gallenblase.
- Leber Erhaltung
- nachdem das Gesamtgewicht der Leber aufgenommen wurde, schneiden Sie einen kleinen Lappen in mehrere kleine Stücke von ein paar Quadratmillimeter, übertragen Sie sie auf sterilen Röhrchen und Snap-Einfrieren in flüssigem Stickstoff für spätere RNA und Proteingewinnung gemäß standard-Protokolle. Snap-Freeze diese Gewebe Stücke so bald wie möglich nach Organ-Sammlung, eine Verschlechterung des Gewebes zu vermeiden.
- Sammeln, einem Lappen in 10 % neutral gepuffertem Formalin für die spätere Verarbeitung und Paraffin einbetten, wie pro Standardprotokolle.
- Legen Sie einen Lappen in eine Form gefüllt mit optimale Temperatur Cryomatrix Harz einbetten und Snap-Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
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Representative Results
Im Laufe des CDE-induzierten chronischen Leberschädigung sechs Wochen Zeit wurden die Parameter an den Tagen 7 (Induktionsphase), 14 und 21 (Aufbauphase) und 42 (Erhaltungsphase) bewertet. Im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, CDE-behandelten Mäusen in einer anfänglichen Anpassungsphase bis zu 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren und sind in der Regel wieder Gewicht in der Einrichtung und Wartung (Abbildung 1). Das Körpergewicht wurde umgekehrt korreliert mit Alanin Transaminasen Serumspiegel Indikator für hepatozellulären Schädigung (Abbildung 2). Vier Mikrometer dünn, Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten Leber waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin die hepatische Architektur zu beurteilen. Gesunde Leber angezeigt eine normale Architektur mit geordneten Schnüre von Hepatozyten, die strahlenförmig von der Zentralvene, bilden das Leberparenchym. Im Gegensatz dazu zeigte CDE-behandelte Leber stark gestörten Leber Architektur und das Parenchym Eindringen vieler Basophile Zellen in der Induktion und Aufbau-Phase und Normalisierung in der Erhaltungsphase (Abbildung 3). Fibrogenese bewerten, waren 4 Mikrometer dünn, Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Leber Abschnitte mit dem Poly-azo Farbstoff Sirius rot befleckt, die hepatische Kollagen Ablagerung visualisiert. In der Induktionsphase CDE-induzierten chronischen Leberschäden Kollagen in das Parenchym in Periportal Regionen angesammelt. Jedoch normalisiert Ebenen bei der Einrichtung und Wartungsphase (Abbildung 4). Matrix eingebettet und Snap eingefroren Lebergewebe wurde in 7 Mikrometer dünne Abschnitte auf einem Kryostat geschnitten. Immunofluorescent Färbung für Zelle Marker wurde dann durchgeführt werden, um die zeitliche und räumliche Anordnung der spezifischen hepatische Zellpopulationen während einer Zeit zu analysieren. In gesunde Leber Gallenwege und Leber Stammvater Zelle Marker PanCK nur gebeizt Gallengang Strukturen, während der entzündlichen Zellmarkierung CD45 Leber resident Makrophagen oder Kupffer Zellen erkannt. Chronisch Geschädigten Leber wider jedoch erhöhte PanCK Färbung Gallenwege und Leber Stammvater Zellproliferation, die erreichte und erreicht einen Steady-State nach ca. 14 Tagen der CDE-Behandlung. Die Zahl der Entzündungszellen CD45-positiven, Leber-Resident und eindringende Zellen, auch ihren Höhepunkt in der Induktionsphase CDE-induzierten Schädigung und langsam normalisiert, Gruppenstufen in der Einrichtung und Wartung ( vertreten Abbildung 5). Diese Erweiterung des entzündlichen Zell-Populationen in chronisch Geschädigten Leber wurde durch raschen Wandel in der hepatischen Mikroumgebung begleitet. Eine schnelle Induktion oder signifikante Erhöhung der Zytokine und Wachstumsfaktoren Transkription wurde beobachtet. Dazu gehören Tumor Nekrose Faktor (TNF), Tumor-Nekrose-Faktor-wie schwacher Induktor von Apoptose (ZWICKEN), Lymphotoxin-Beta (LTβ), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ) und Interleukin-6 (IL-6), zum Beispiel. Ihre Niederschrift Ebenen alle ihren Höhepunkt in der Induktionsphase und normalisiert während der Errichtung und Wartung - ähnlich wie bisher gezeigte Krankheit Parameter (Abbildung 6).
Abbildung 1 . Körper Gewicht Aufnahmen von gesunden und CDE-behandelten Mäusen. Chronisch verletzte Mäuse in der Induktionsphase der CDE Fütterung bis zu 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verloren und danach wiederhergestellt. Eine repräsentative Abbildung dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Serum-Alanin-Transaminasen-Spiegel bei gesunden und CDE-behandelten Mäusen. Alanin Transaminasen (ALT) Serumspiegel blieb unverändert bei gesunden Mäusen eine sechswöchige Zeit Laufe aber Normalisierung in der Einrichtung und Wartung Phase im CDE-behandelten Tieren in der Induktionsphase gipfelte. Eine repräsentative Abbildung dargestellt ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Hämatoxylin und Eosin Färbungen der Leber Abschnitte. Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Lebergewebe Abschnitte, die befleckt wurden mit H & E geordneten Arrangements von Hepatozyten Schnüre in Kontroll-Mäusen gezeigt. Im Gegensatz dazu war die Leber Architektur erheblich in der Einarbeitungsphase mit Normalisierung gegen Ende der sechs-Wochen-Zeit-Kurs in CDE-behandelten Mäusen zum Erliegen. Die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Sirius rote Färbung erleichtert Kollagen Visualisierung bei gesunden und CDE-behandelten Mäusen. Im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, die nur geringfügige PERIVENÖSE Kollagen Ablagerungen angezeigt, chronisch verletzte Tiere zeigten Kollagen Akkumulation in Periportal Parenchym Regionen in der Einarbeitungsphase mit langsamen Normalisierung in der Erhaltungsphase der Richtung der CDE zeitlichen Verlauf von sechs Wochen. Die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Immunofluorescent Erkennung von entzündlichen und Gallenwege/Leber Vorläuferzellen. In gesunden Leber nur biliären Strukturen gebeizt mit der Gallenwege und Leber Stammvater Zelle Marker PanCK (rot) und der CD45 Antikörper visualisiert Leber-Bewohner Makrophagen oder Kupffer Zellen (grün). In der Induktionsphase CDE Fütterung, die Anzahl der CD45+ Zellen erhöht drastisch die Leber-Resident sowie eindringende Entzündungszellen enthalten. Diese Entzündungsreaktion normalisiert gegen Ende des ter sechs-Wochen-Zeit-Verlauf. Gallenwege und Leber Stammvater Zellen die Flecken mit der Markierung PanCK in Zahlen bis zu zwei Wochen zugenommen und danach einen stabilen Zustand erreicht. DAPI wurde für nukleare Quantifizierung verwendet. Die Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Transkriptomischen Analysen von Zytokinen und Wachstumsfaktoren. RNA wurde von Snap-gefrorene Stücke von CDE-behandelte Leber Gewebe transkriptomischen Analysen von der Leber Mikroumgebung isoliert. Repräsentative Diagramme von Tumor Nekrose Faktor (TNF), TNF-wie schwacher Induktor von Apoptose (ZWICKEN), Lymphotoxin-Beta (LTβ), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ) und Interleukin-6 (IL-6) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Chronischer Lebererkrankung ist oft eine stille Krankheit bei den meisten Patienten asymptomatisch sein und es ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Chronischer Alkoholismus und Hepatitis C-Virus-Infektion sind die häufigsten Todesursachen. Chronische Schädigung der Leber zeichnet sich durch hepatischen Entzündung, Fibrose und in schweren Fällen Zirrhose, Karzinom und letztlich Leberversagen. Es gibt derzeit keine Heilung, und zwar große Fortschritte erzielt wurden, die Mechanismen von Lebererkrankungen, neue therapeutische Wege sind nach wie vor dringend notwendig.
Die CDE-Diät ist eine einfache, zeitsparende und einfach administrierbaren Modell für Induktion und Studie von fetthaltigen Änderungen oder hepatische Steatose, Entzündung, Fibrose, LPC Verbreitung und in langfristige Experimente, Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms6 ,11,12,13,16,17. Zuerst verwendet in Ratten19,20, wurde es später angepasst, um LPC-Studien in den Wildtyp und genetisch veränderten Mäusen9zu erleichtern.
In unserem Labor fanden wir es kritisch, wheaten Spreu statt andere Einstreu-Alternativen zu verwenden. Obwohl es sichtbare Körner und erschöpft ist, ein paar zusätzliche Nährstoffe bleiben in der wheaten Spreu Bettwäsche und einige der harten Auswirkungen der CDE-induzierten chronischen Leberschädigung Induktion ein Gegengewicht. Darüber hinaus dieser Bettwäsche bietet Umweltanreicherung und fördert die normale Nahrung Suchverhalten bei Mäusen. Die überwiegende Mehrheit der unerwünschten Ereignisse waren in der ersten Woche der CDE Behandlung beobachtet und danach selten gesehen. Die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten Ereignissen kann mithilfe von Mäusen, die ein Startgewicht von mindestens 16 g reduziert werden. Wenn die Einwaage mehr als 18-20 g ist, kann die Anzahl der induzierten Leber Vorläuferzellen jedoch niedriger sein. Das CDE-Modell kann verwendet werden, um hepatische Steatose, Entzündungen, Leber Stammvater-Zell-Reaktionen, Fibrose und hepatozellulären Karzinom-Entwicklung ohne das Vorhandensein einer Leberzirrhose, zu studieren, wie in einigen nicht-alkoholische Fettleber (NAFLD) gesehen und Hepatitis B-Virus-infizierten Patienten21,22. Im Vergleich dazu stellt das Thioacetamide (TAA) Modell einer chronischen Leberschädigung eine aggressivere Regelung. Es induziert leichte fettigen Veränderungen, Entzündungen, Leber Vorläuferzellen und Fibrose, die bereits zu Anfang einer Leberzirrhose um die 6 Wochen Zeitpunkt12fortschreitet. Deshalb ist die CDE Fütterung vorgeschlagen wenn NAFLD verbundenen Prozesse der Studienschwerpunkt während ein TAA zeitlichen Verlauf möglicherweise vorteilhaft, wenn verschiedene Stadien der Fibrose Schweregrad von Interesse sind.
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Disclosures
Es gibt nichts von den Autoren offen gelegt werden.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC) von Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Die Autoren möchten die Curtin Health Innovation Research Institute Mitarbeiter für technische Hilfe bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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