Summary
Her beskriver vi en felles metode for å indusere kroniske skader i mus av fôring av kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) diett. Viser vi helseovervåking, lever perfusjon, isolasjon og bevaring. En gang løpet av seks uker kan informere om skader, pathohistology, fibrosis, provoserende, og lever stamfar celle svar.
Abstract
Kronisk leversykdom som hepatitt, alkoholholdige leversykdom eller alkoholfrie fatty leversykdom, er preget av stadige betennelse, progressiv ødeleggelse og regenerering av hepatic parenchyma, lever stamfar cellen spredning og fibrose. Sluttstadiet til hver kronisk leversykdom er skrumplever, en stor risikofaktor for utvikling av leverkreft. For å studere prosesser regulere sykdom innvielsen, etablering og progresjon, brukes flere dyr modeller i laboratorier. Her beskriver vi en seks ukers tid kurs av kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) musemodell, som medfører mate seks - uke gamle mannlige C57BL/6J mus med kolin-mangelfull chow og 0,15% DL-ethionine-supplert drikkevann. Overvåking av dyrehelse og en typisk kroppen vekt tap kurve er forklart. Protokoll viser brutto undersøkelse av en CDE-behandlet leveren og blod samling av cardiac punktering for påfølgende serum analyser. Neste, lever perfusjon teknikk og samling av ulike hepatic lobes for standard evalueringer er vist, inkludert leveren histology vurderinger av hematoxylin og eosin eller Sirius røde stainings, immunofluorescent oppdagelsen av hepatic celle populasjoner og transcriptome profilering av leveren microenvironment. Denne musemodell er egnet for studerer inflammatorisk, fibrogenic, og lever stamfar dynamics indusert gjennom kronisk leversykdom og kan brukes til å teste potensielle terapeutiske agenter som modulere prosessene.
Introduction
Leveren er den største kjertel metabolske organet av kroppen og har mange komplekse funksjoner. Nøkkelroller for leveren inkluderer fordøyelsen, metabolisme, avgiftning, lagring av viktige næringsstoffer, produksjon av blodplasma protein komponenter og immunitet formidlet gjennom bosatt makrofager eller Kupffer celler. Leveren har en stor evne å regenerere selv om 70-90% av sin totale masse går tapt. Ved akutte skader, som sett etter en delvis hepatectomy eller acetaminophen forgiftning, sprer de gjenværende sunn hepatocytter for å reparere skaden i en svært koordinert prosessen1. Men når hepatocytter er kronisk skadet på grunn av langsiktig virusinfeksjon, alkoholholdige eller alkoholfrie fatty leversykdom, den inflammatoriske microenvironment utløser aktivering av fibrose-kjøring nedsatt stellate celler og spredning av leveren progenitor celler (LPCs) til å skille ut cholangiocytes eller hepatocytter2,3,4,5. Nøyaktige opprinnelsen, differensiering skjebnen til LPCs, deres bidrag til leveren gjenfødelse, og hepatocarcinogenesis har vært tema for intens debatt og mest sannsynlig avhenge skade alvorlighetsgraden og kontekst2. Hendelsesrekkefølgen tidlig fornyelse-assosiert diskuteres også kontroversielt, med noen etterforskere sier at hepatisk stellate celle aktivering og matrix remodeling er avgjørende for generering av en LPC-favoriserer nisje6, mens andre rapporten at LPC ekspansjon og såkalte Ductular reaksjonen er nødvendig for å utløse fibrogenesis7. Det er mange dyr modeller å studere bestemte aspekter av skader og gjenfødelse, i et forsøk på å forstå alle de underliggende faktorene som regulerer sykdomsprogresjon og til slutt utvikle nye behandling strategier for pasienter8.
Kolin-mangelfull og ethionine-supplert (CDE) kosttilskudd modellen ble opprinnelig utviklet for bruk i rotter og senere endret til kroniske skader induksjon i mus9,10. Kosttilskudd mangel på kolin resulterer i svekket montering og sekresjon av svært lav tetthet lipoproteiner. Kombinert med hepatocarcinogen DL-ethionine, dette område fører til overdreven hepatic fett lasting, kontinuerlig betennelse, periportal fibrose, LPC svar og langsiktige hepatocellulært karsinom utvikling11,12 . Men viktigst, annen mus stammer viser karakteristiske mønstre av provoserende, fibrogenic og LPC svar dynamics13. Denne protokollen beskriver kroniske skader induksjon i C57BL/6J mus, de mest brukte innavlede musen belastning.
I kronisk leversykdom forskning inkluderer typisk analyser histologiske vurderinger av hematoxylin og eosin samt Sirius røde flekker å visualisere kollagen depositions, immunohistochemical eller immunofluorescent påvisning av hepatic celle populasjoner, og transcriptomic analyser av den lever microenvironment som orkestrerer indusert mobilnettet endringene gjennom komplekse vekstfaktor og cytokin nettverk14,15,16,17 , 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyr eksperimentering
alle dyrestudier beskrevet i denne undersøkelsen ble godkjent av Curtin University dyr etikk (godkjenningsnummer: AEC_2014_28) før oppstart av den eksperimenter og samsvar med australske koden og bruk av dyr.
- Dyr
- bruke seks - uke gamle mannlige C57BL/6J mus for eksperimenter.
- Eksperimentell design
- etter ankomst på dyr anlegget, tillate mus til acclimatize i fire dager før starten av eksperimenter.
- Huset mus på wheaten chaff sengetøy, som har blitt tømt for synlige korn og stilker og holde mus på 12-timers dag/natt sykluser i individuelt ventilert burene. Endre sengetøy på dager tre og syv, så ukentlig etterpå.
- Gi mus annonse libitum tilgang til kolin-mangelfullt kosthold og drikkevann med 0,15% av DL-ethionine. Holde DL-ethionine-supplert vann på 4° C og erstatte drikkevann hver annen dag for å sikre friskhet drikke. Fylle opp kolin-mangelfull chow hver annen dag med en fullstendig endring av chow ukentlig.
- Observere mus i ro og under behandling. Skjermen standard tegn til dyrehelse, inkludert helhetsinntrykket, holdning, sosialt samspill, grooming, pels tilstand, og kroppen vekt.
- Veie mus daglig under de første to ukene for å sikre noen dyr viser mer enn 20% kroppen vekttap er euthanized for å begrense utilbørlig lidelse. Dette er vanligvis tilfelle i mindre enn 5% av dyr. Etter to uker, hyppigheten av veier kan reduseres til tre ganger ukentlig (f.eks mandag, onsdag, fredag).
- Lever perfusjon og isolasjon
- bedøve mus på angitt tidspunkt (i denne studien én, to og seks uker på CDE diett) med ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) av intraperitoneal injeksjon. Teste den pedal uttak refleks for å sikre tilstrekkelig anestesi.
- Våt pelsen med 70% etanol og gjøre en loddrette midtlinjen snitt i bukveggen til membranen med Mayo saks. Ribbe buret kan fjernes for enklere tilgang til hjertet.
- Samle blod av langsom cardiac punktering med en 25 G x 1/2 " vanlig veggen p å unngå skjuling av hjertet. Tillat blodet å koagulere i et microcentrifuge rør ved romtemperatur å få serumprøver etter sentrifugering 2000 x g i 10 min. Senere, måle serum alanin transaminase nivåer av standard prosedyrer 12.
- Flytte mage og tynntarm til siden og avsløre portalen blodåre. Kutte hjertet med Mayo saks for å tillate væsker å avslutte og perfuse leveren med sterilt fosfat bufret saltvann (pH = 7.4) av cannulating portalen blodåre bruker en 27 G x 1/2 " vanlig veggen nål. Et jevnt forvellet leveren indikerer vellykket perfusjon av alle lever lobes.
- Nøye løsne leveren og plasserer den i en Petriskål ved hjelp av tang og Mayo saks. Fjerne overflødig, ikke-leveren vev og gallbladder.
- Lever bevaring
- etter leveren totalvekten er registrert, skåret en liten flik i flere små biter av noen få kvadratmillimeter, overføre dem til sterilt rør, og snapin-fryser i flytende nitrogen senere RNA og utvinning, som standardprotokoller. Snapin-fryse brikkene vev så snart som mulig etter orgel samling å unngå vev degradering.
- Samle en flik i 10% nøytral bufrede formalin for senere behandling og parafin embedding, som per standardprotokoller.
- Plasserer en flik i mold fylt med optimal kutte temperatur cryomatrix innebygging harpiks og snapin-fryse i flytende nitrogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjennom seks ukers tid CDE-indusert kroniske skader, ble parametere vurdert på dager 7 (induksjon fase), 14 og 21 (etableringen fase) og 42 (vedlikeholdsfase). Sammenlignet med kontroll mus, CDE-behandlet mus mistet opptil 20% av kroppsvekten sin første i en innledende tilpasning fase og tendens til å gjenvinne vekt i etableringen og vedlikeholdet faser (figur 1). Kroppsvekten var omvendt korrelert med serum alanin transaminase nivåer, angir hepatocellulært skade (figur 2). Fire mikrometer-tynn formalin-fast og parafin-embedded leveren vev deler var farget med hematoxylin og eosin å vurdere hepatic arkitektur. Sunn lever vises en normal arkitektur med ryddig snorer av hepatocytter stråler ut fra den sentrale stemningen, danner leveren parenchyma. Derimot viste CDE-behandlet lever vesentlig forstyrret leveren arkitektur og parenchymal infiltrasjon av mange basophilic celler i induksjon og etablering og normalisering i Vedlikeholdsfasen (Figur 3). For å vurdere fibrogenesis, var 4-mikrometer tynn, formalin-fast og parafin-embedded leveren deler farget med poly-azo fargestoff Sirius rød, som visualiserer hepatic kollagen deponering. I den induksjon fasen av CDE-indusert kroniske skader, kollagen akkumulert i parenchyma i periportal områder. Imidlertid normalisert nivåer i etableringen og Vedlikeholdsfasen (Figur 4). Matrix-embedded og snapin-frosset leveren vev ble skåret i 7-mikrometer tynne snitt på en kryostaten. Immunofluorescent flekker for cellen markører ble deretter utført for å analysere timelige og romlig ordningen av bestemte hepatic celle populasjoner en gang løpet. I sunn lever farget biliær og lever stamfar celle markør panCK bare galle duct strukturer, mens inflammatorisk celle markøren CD45 oppdaget leveren bosatt makrofager eller Kupffer celler. Kronisk skadet lever reflekterte økt panCK flekker men biliær og lever stamfar celle spredning, som nådde og nådd en stabil tilstand etter ca 14 dager CDE behandling. Antall CD45-positive inflammatoriske celler, som representerer både leveren-resident og infiltrere celler, også nådde i induksjon fase av CDE-indusert skade og sakte normalisert kontroll nivåer i etableringen og vedlikeholdet faser ( Figur 5). Utvidelsen av inflammatoriske celle populasjoner i kronisk skadet lever ble ledsaget av raske endringer i hepatisk microenvironment. En rask induksjon eller betydelig økning i transkripsjon nivåer av cytokiner og vekstfaktorer ble observert. Disse inkluderer tumor nekrose faktor (TNF), tumor nekrose faktor-lignende svak induser av apoptose (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyte vekst faktor (HGF), omforming vekst faktor-beta (TGFβ) og interleukin-6 (IL-6), for eksempel. Tilgangsnivå transcript alle nådde i induksjon fasen og normalisert i etableringen og vedlikeholdet fasen - ligner på tidligere vist sykdom parametere (figur 6).
Figur 1 . Kropp vekt opptak av sunn og CDE-behandlet mus. Kronisk skadet mus mistet opptil 20% av kroppsvekten sin første i induksjon fase av CDE fôring og gjenopprettet etterpå. En representant diagrammet vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Serum alanin transaminase nivåer i sunn og CDE-behandlet mus. Serum alanin transaminase (ALT) nivåer uforandret i sunne mus en seks ukers tid løpet, men nådde i induksjon fase, med normalisering i etableringen og vedlikeholdet fase i CDE-behandlede dyr. En representant diagrammet vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Haematoxylin og eosin stainings av leveren. Formalin-fast og parafin-embedded leveren vev deler som var farget med H & E vist ryddig ordninger hepatocyte ledninger i kontroll mus. Derimot forstyrret leveren arkitekturen kraftig i CDE-behandlet mus i induksjon fase, med normalisering mot slutten av seks ukers time course. Baren skala representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Sirius røde flekker-tilrettelagt kollagen visualisering i sunn og CDE-behandlet mus. Sammenlignet med kontroll mus som vises bare mindre perivenous kollagen depositions, kronisk skadde dyr viste kollagen akkumulering i periportal parenchyma regioner i induksjon fasen, med langsom normalisering mot Vedlikeholdsfasen av den CDE gang løpet av seks uker. Baren skala representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Immunofluorescent påvisning av inflammatoriske og biliær/leveren progenitor celler. I sunn lever, bare biliær strukturer beiset med biliær og lever stamfar celle markør panCK (rød) og CD45 antistoffer visualisert lever-resident makrofager eller Kupffer celler (grønn). I induksjon fase av CDE fôring, antall CD45+ celler økte drastisk som inkluderte lever-resident samt infiltrere inflammatoriske celler. Dette inflammatorisk respons normalisert mot slutten av than seks ukers tid kurs. Biliær og lever stamfar celler som flekker med markør panCK Akerselva til uke to og nådde stabilt etterpå. DAPI ble brukt for kjernefysisk kvantifisering. Baren skala representerer 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Transcriptomic analyser av cytokiner og vekstfaktorer. RNA ble isolert fra snapin-frosne biter av CDE-behandlet leveren vev å utføre transcriptomic analyser av leveren microenvironment. Representant diagrammer av tumor nekrose faktor (TNF), TNF-lignende svak induser av apoptose (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyte vekst faktor (HGF), omforming vekst faktor-beta (TGFβ) og interleukin-6 (IL-6) er vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er en av de viktigste bidragsyterne sykelighet og dødelighet verdensomspennende kronisk leversykdom er ofte en stille sykdom med de fleste pasienter være asymptomatiske. Kronisk alcoholism og hepatitt C virusinfeksjon er de viktigste årsakene. Kroniske skader er preget av hepatic betennelse, fibrose og i alvorlige tilfeller skrumplever, karsinom og til slutt leversvikt. Det er ingen kur tilgjengelig og selv om store fremskritt har blitt gjort å forstå mekanismer for leversykdom, nye terapeutiske veier fortsatt raskt behov.
CDE dietten er en enkel tid effektivt og enkelt administrere modell for induksjon og studere fet endringer eller hepatisk Steatose, betennelse, fibrosis, LPC spredning og langsiktig eksperimenter, utviklingen av leverkreft6 ,,11,,12,,13,,16,,17. Opprinnelig brukt i rotter19,20, ble det senere gjort til rette LPC studier i wildtype og genmodifiserte mus9.
I vårt laboratorium, har vi funnet det kritiske bruke wheaten chaff i stedet for andre sengetøy alternativer. Selv om det er oppbrukt synlige korn og stilker, noen flere næringsstoffer beholdes i wheaten chaff sengetøy og motvekt noen av de tøffe effektene av CDE-indusert kroniske skader induksjon. I tillegg denne sengetøy gir miljømessig berikelse og oppfordrer vanlig mat søkeatferd i mus. Majoriteten av uønskede hendelser ble observert i den første uken av CDE behandling og sjelden sett etterpå. Sannsynligheten for uønskede hendelser kan reduseres ved hjelp av mus med en startvekt på minst 16 g. Men hvis igangsettingen vekt mer enn 18-20 g, kan antall indusert lever stamfar celler være lavere. CDE modellen kan brukes til å studere hepatisk Steatose, betennelse, lever stamfar celle svar, fibrose og hepatocellulært karsinom utvikling uten tilstedeværelse av levercirrhose, som sett i noen alkoholfrie fatty leversykdom (NAFLD) og hepatitt B virus-infiserte pasienter21,22. Til sammenligning representerer thioacetamide (TAA) modell av kroniske skader en mer aggressiv regime. Det medfører mildt fet endringer, betennelse, lever stamfar celler og fibrose som allerede utvikler seg til tidlig skrumplever rundt 6 ukers tidspunkt12. Derfor foreslås CDE fôring hvis NAFLD-assosiert prosesser studie fokus, mens TAA tid kurs kan være en fordel når forskjellige stadier av fibrose alvorlighetsgraden er av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting ved forfatterne.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Forfatterne vil gjerne takke Curtin helse Innovation Research Institute ansatte for teknisk assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
