Summary
Promoter-Expressionsanalysen sind entscheidend für besseres Verständnis der Genregulation und der raumzeitlichen Ausdruck der Zielgene. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um zu identifizieren, zu isolieren und zu klonen einen Pflanzen-Promotor. Darüber hinaus beschreiben wir die Charakterisierung des Knötchen-spezifischen Promotors in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln.
Abstract
Die vorgelagerten Sequenzen des Gens Codierung Sequenzen werden als Promotorsequenzen bezeichnet. Studieren die Expressionsmuster der Promotoren sind sehr bedeutsam für das Verständnis der Genregulation und raumzeitlichen Expressionsmuster von Zielgenen. Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. In dieser Studie untersuchten wir die raumzeitlichen Expressionsmuster der rhizobial Symbiose-spezifische Knötchen Gründung (NIN) Förderer der Phaseolus Vulgaris in den transgenen behaarte Wurzeln. Mit pflanzlichen Genom Datenbanken und Analyse-Tools, die wir identifiziert, isoliert und geklont p. Vulgaris NIN Promotor transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter β-Glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit Agrobacterium Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt ≥2 cm behaarte Wurzeln bei 10 bis 12 Tage nach der Transformation. Als nächstes untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in Rhizobium geimpft behaarte Wurzeln in regelmäßigen Abständen nach Inokulation. Unsere Ergebnisse dargestellt von GUS-Aktivität zeigen, dass der NIN-Veranstalter während des Prozesses der Nodulation aktiv war. Zusammen, veranschaulicht dieses Protokolls zu identifizieren, zu isolieren, Klonen und zu charakterisieren einen Pflanzen-Promotor in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.
Introduction
Promotoren sind wichtige molekularen biologischen Werkzeuge, die eine entscheidende Rolle bei die Regulierung der Genexpression von Interesse zu verstehen. Promotoren sind DNA-Sequenzen befindet sich oberhalb der Übersetzung Einleitung Codon des Gens-Sequenzen und tragen die zentrale regulatorische Informationen Gene; Daher sind ihre korrekte Beschriftung und Charakterisierung entscheidend zum Verständnis der Genfunktion. Abhängig von der Expressionsmuster sind Pflanze Promotoren als konstitutive, Gewebe-spezifische oder Bühne-entwicklungsspezifische und induzierbaren1eingestuft. Fortschritte in der transkriptomischen Technologien, Verbesserungen der Computermodellierung und die Verfügbarkeit der steigenden Zahl von Genomsequenzen für verschiedene Pflanzenarten haben die groß angelegte Vorhersage von Promoter Sequenzen2erleichtert.
Auf der anderen Seite ist es auch entscheidend für die Projektträger Bewertungsinstrumente und genetische Transformation Techniken, die schnell, effizient und reproduzierbar zu etablieren. Im Gegensatz zu den anderen Modellpflanzen wird die funktionelle Charakterisierung der gemeinsamen Bohnen Leguminosen (p. Vulgaris) Gene vor allem wegen der widerspenstigen Natur Phaseolus SP. für stabile gentechnische Transformation behindert. Transiente Transformationssysteme dienen als Alternative für schnelle gen funktionelle Charakterisierung Studien3. Hülsenfrucht Symbiose Forschung ist die Interaktion zwischen der Hülsenfrucht Wirtspflanze und rhizobial Bakterium eine der am meisten gefügig Modellsysteme für die Funktionsanalyse von Knötchen-spezifischen Genen und Projektträger Studien. Bisher wurden mehrere Hülsenfrucht Promotoren im Zusammenhang mit diesen Symbiosen gekennzeichnet, dh., Medicago Truncatula PT44, SWEET115, Lotus Japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, p. Vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etc.. GUS Elemente beeinflussen direkt die Genregulation. Der Transkriptionsfaktor ENBP1A bindet an eine regulatorische Region GUS (−692 bp) des frühen Nodulin VfENOD12, und dies ermöglicht den Ausdruck von ein Reportergen in Knötchen Primordia Vicia Faba16. Ersatz von regulatorischen Regionen GUS (−161 zu −48 bp) des Projektträgers Knötchen-spezifische Leghemoglobin GLB3 mit der heterologen abgeschnitten Promotoren δ-p35S und δ-pNOS, führte zu einem Verlust der Knötchen Spezifität und reduziert Promotoraktivität17 .
Frühere Berichte zeigen, dass der Transkriptionsfaktor NIN ist erforderlich für die Einleitung von rhizobial Infektion in den Zellen der Wurzelhaare und ist auch wichtig für Knötchen Organogenese in L. Japonicus18. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Identifikation, Isolierung, Klonierung und Charakterisierung von Knötchen-spezifischen Promoter in den gemeinsamen Bohne behaarte Wurzeln. Um dies zu erreichen, wir wählten rhizobial Symbiose-spezifische NIN Förderer von p. Vulgaris und transkriptionelle Verschmelzung der Chimären Reporter GUS-enhanced::GFP geklont. Dieses Protokoll beschreibt weiter, ein schnelles und vielseitiges System genetische Veränderung bei p. Vulgaris mit A. Rhizogenes induzierte behaarte Wurzeln. Dieses System erzeugt behaarte Wurzeln in weniger als 2 Wochen nach der Transformation. Zu guter Letzt untersuchten wir den raumzeitlichen Ausdruck von NIN Promoter in kolonisiert Rhizobien Wurzelknöllchen von GUS Färbung.
Das hier beschriebene Verfahren kann nicht nur für das Studium der Nodulation und Mykorrhizierung11 Hülsenfrucht Pflanzen, sondern auch für das Studium der Projektträger Expressionsmuster in Wurzeln19nützlich. Darüber hinaus ist dieses Protokoll in nicht spezialisierten Labors einfach zu bedienen.
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Protocol
1. Identifizierung, Isolierung und Klonen von P. Vulgaris NIN Promoter
- Promotorsequenz für das gen des Interesses zu identifizieren. Es gibt mehrere Genom Datenbanken und Analyse-Tools für Pflanzen wie Phytozome, Ensembl Pflanzen, NCBI, etc. A Hülsenfrucht Promotor p. Vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) wurde in dieser Studie20verwendet.
- Design Oligos entweder für Gateway oder traditionelle Restriktionsenzym je nach Vektorsystem Klonen verwendet (Abbildung 1A).
Hinweis: Standard (25-35 bp), entsalzte Primer funktionieren. Umgekehrte Oligo-Sequenzen, die zwischen dem Veranstalter und dem Gen flankieren sind empfehlenswert. - Verstärken Sie die PvNIN-Promotor-Region (oder Promotor-Region des Gens von Interesse) aus frisch isolierte p. Vulgaris genomischer DNA mit dem Promotor-spezifische Oligo-Set. Verwenden Sie eine High Fidelity Polymerase mit folgenden PCR-Bedingungen: 95 ° C für 5 min; 30 Zyklen (95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 1 min); und 72 ° C für 5 Minuten.
- Verstärkte Fragment auf 1 % Agarose-Gel bei 60 V auf einem 7 x 10 cm Gel Tablett führen, und die entsprechenden Amplikons eluieren (700 bp, Abbildung 1 b) und Klon in den pENTR/D-TOPO-Vektor nach den Anweisungen des Herstellers.
- Transformieren von 2 µL der Reaktion in kompetenten Escherichia coli Zellen mit den Anweisungen des Herstellers und Platte 150 µL der Transformation Mischung auf Lysogeny Bruder (LB) mit 50 mg/L Kanamycin (Kan50) ergänzt. Wachsen Sie die vergoldeten Zellen bei 37 ° C über Nacht.
- Wählen Sie zwischen 3-6 Kolonien und Kultur, die sie über Nacht in LB-Medium mit Kan50. Isolieren Sie Plasmid DNA mit Hilfe der Methode der Wahl zu und zu analysieren Sie das Plasmid mittels PCR unter Verwendung der Vektor spezifische M13 Oligos. Für PCR, Einsatz 100 ng von Plasmid, 12:03 von Oligos, 10 X PCR-Puffer, 0,5 U Taq-DNA-Polymerase und 10 mM dNTPs.
- Verwenden Sie die folgenden PCR Verstärkung Bedingungen; 95 ° C für 3 min; 30 Zyklen (95 ° C für 30 s, 58 ° C für 30 s, 72 ° C für 75 s); und 72 ° C für 7 min. visualisieren die PCR-Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel. Sicherstellen Sie, dass die richtigen Einlagen haben ein Band bei 1.024 bp und Vektoren ohne Einsätze wird eine 324 bp Band (Abbildung 1).
- Führen Sie die LR-Reaktion zwischen einem Eintrag Vektor (pENTR/D-TOPO-PvNIN) und Ziel Vektor pBGWFS7.021 mit einem kommerziellen Enzym-Mix entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
- Transformieren von 2 µL der LR Reaktion in kompetente E. Coli Zellen mit standard-Techniken, wie in den Anweisungen des Herstellers und Platte 150 µL Transformation Mischung auf LB ergänzt mit 100 mg/L Spectinomycin (Spe100) beschrieben. Wachsen Sie die vergoldeten Zellen bei 37 ° C über Nacht.
- Wählen Sie etwa 5 Kolonien und Kultur sie über Nacht in LB-Medium mit Spe100. Isolieren Sie das Plasmid DNA mit Hilfe einer Methode der Wahl zu und analysieren Sie das Plasmid mittels PCR unter Verwendung der Promotor-spezifische Oligos.
- Verwenden Sie die PCR-Zustände im Schritt 1.3. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf einem 1 % Agarosegel, Verstärkung zu bestätigen. Amplifikate sind 700 bp.
- Reihenfolge der positiven Plasmid pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GLP (Abbildung 1) mit dem Promotor-spezifische Oligos, die Echtheit des Einsatzes.
- Verwandeln Sie die Plasmiden in A. Rhizogenes Stamm K599 (jedoch können jede andere Stämme von A. Rhizogenes verwendet werden). 50 µL der Electrocompetent Zellen und Electroporate in einem 1 mm-Küvette 2 µL Plasmid Prep hinzufügen, mit den folgenden Einstellungen: 1,8 kV, 25 µF und 200 Ω.
- Wiederherstellen von Zellen in ~ 500 µL SOC-Medium und schütteln bei 28 ° C für 2 h Platte auf LB-Spe100 und wachsen bei 28 ° C für 2 Tage.
- Durchführen Sie Kolonie Screening, wie unter Schritt 1,7 und verwenden Sie die PCR-Zustände wie in Schritt 1.3. Glycerin-Bestände von positive Klone und speichern Sie diese bei-80 ° C.
- Verwenden Sie A. Rhizogenes Kultur beherbergen leer pBGWFS7.0 Vektor als die negativ-Kontrolle.
2. A. Rhizogenes verwandelt behaarte Wurzeln die Gartenbohne
- Sterilisieren Sie Bohnensamen (p. Vulgaris CV Negro Jamapa) (ca. 20) in 50 mL Ethanol 96 % für 1 min und entsorgen Sie das Ethanol; dann fügen Sie 50 mL 20 % Bleichmittel (Natriumhypochlorit) für 10 min, mit konstanten Mischen in einer Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie das Bleichmittel und waschen Sie 3 Mal in überschüssige steriles Wasser.
Hinweis: Andere p. Vulgaris -Sorten können für behaarte Wurzel Induktion verwendet werden. - Die sterilisierten Samen auf sterile Filterpapiere angefeuchtet mit Broughton Keimen & Dilworth (B & D) Lösung22 (Tabelle 1) für 2 Tage im Dunkeln bei 28 ° C.
- Bereiten Sie am Tag vor der Transformation Folgendes:
- Streifen aus 150 µL A. Rhizogenes Kultur beherbergen die binären Vektor (vorbereitet in Schritten 1.13 und 1.14) auf solide LB Spe100 und wachsen bei 28 ° C über Nacht.
- Füllen Sie eine 15 mL-Tube mit B & D-Lösung und ersetzen die Schraubkappe mit doppelt geschichteten Aluminium-Folie. Montieren Sie diese in eine 22 cm-Glasrohr mit 10 mL B & D-Lösung (Abbildung 2) und Autoklaven es.
- Am Tag der Transformation, montieren die folgenden sterilen Materialien in einem Laminar-Flow-Abzug: gekeimten Samen aus Schritt 2.2, Kultur-Platte aus Schritt 2.3.1, Rohre aus Schritt 2.3.2, sterile doppelt destilliertes Wasser (10 mL), Pipetten und Pipettenspitzen, sterile Pinzetten, und 3 mL Spritzen.
- Verwenden Sie eine gebogene Spitze 200 µL A. Rhizogenes Zellen von der Platte zu einem Microcentrifuge Schlauch zu kratzen und in 1 mL der doppelten steriles Wasser Aufschwemmen. In ähnlicher Weise bereiten Sie Vektor Kontrollzellen getrennt.
- Mischen Sie die Zellen sanft aufzuwirbeln. Tun Sie nicht Wirbel.
- Machen Sie ein Loch mit 3 mm auf der Alufolie der Rohre aus Schritt mit einer sterilen Pipettenspitze 2.3.2.
- Kassiere Schritt 2.5 mit der Spritze in die Zellen (Veranstalter oder Vektor-Steuerung) und leicht stechen die Hypocotyle der gekeimten Samen mit der Nadelspitze (Abbildung 2).
Hinweis: Sicherstellen, dass die Nadel dringt (4 - 6 Mal) der Aderhaut und spritzen kleine (~ 5 µL) sinkt der Zellen auf die Wunde an verschiedenen Positionen um die Keimachse. - Legen Sie die Wurzeln der injizierten Sämlinge in das 3 mm Loch von der 15 mL Tube mit B & D-Lösung. Wieder das gesamte Setup in den 22 mL Glasröhrchen und versiegeln Sie, um Feuchtigkeit zu halten.
- Inkubieren Sie die Rohre in einem Wachstum beibehalten bei 28 ° C mit 16 h Licht: 8 h dunkel Photoperiode.
Hinweise: 3-4 Tage nach der Inkubation, wachsen die Pflanzen bis zum Rand der Glasröhren 22 mL.
Hinweis: Es ist wichtig, die B & D Lösung ständig in Kunststoff und Glas-Röhrchen.
(3) Förderer Analyse: NIN Promoter Ausdruck in Rhizobial Knötchen der Gartenbohne
- Impfen Sie für die Induktion von Wurzelknöllchen Rhizobium Tropici oder Rhizobium etli¬ (das sind kompatibel zu der Gartenbohne) in 100 mL PY Medium (0,5 g Pepton, 0,3 g Hefeextrakt) mit 700 mM CaCl2 und 20 mg mL−1 ergänzt Nalidixic Säure. Bei 30 ° C für 24 h unter Schütteln bei 300 u/min inkubieren.
Hinweis: Bei transgenen Rhizobiumkonnte keine spezifische Antibiotika verwendet werden. - Pellet-Zellen in einer Zentrifuge für 3 min bei 2.800 x g bei Raumtemperatur und in 10 mL 10 mM MgSO4aufzuwirbeln. OD der Zellen um 0,6 OD600 durch Verdünnung mit 10 mM MgSO4einstellen.
- 1-2 mL der Kultur (aus Schritt 3.2 vorbereitet) pro Pflanze (Promoter und Vektor-Steuerung) induzieren Wachstum Knötchen an den behaarten Wurzeln zu impfen. Bewässern der Pflanzen mit B & D-Lösung mit begrenzten Stickstoff (2 mM KNO3) Nodulation zu fördern.
- Je nach der experimentellen Bedarf sammeln Sie die behaarten Wurzeln zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Sammele Proben zur Untersuchung Infektion Fäden zwischen 3-5 Tage post Inokulation (dpi).
Hinweis: Ur Knötchen und junge Knötchen können bei 6-9 dpi und 10-12 Tage dpi bzw. untersucht werden. Schließlich, ausgereifte und funktionelle Knötchen können untersucht werden, bei 14-21 dpi und gealtert Knötchen am > 28 dpi. - Verarbeiten Sie die Wurzelknöllchen für die Aktivität des Reporter-Gene (GUS oder GLP). Analysieren Sie GUS-Aktivität nach dem Protokoll von Jefferson23beschrieben. Beobachten Sie GFP unter dem Fluoreszenzmikroskop. GFP-Fluoreszenz zu begeistern, mit einem blauen Argon-Ionen-Laser (488 nm), und sammle die emittierte Fluoreszenz von 510 auf 540 nm.
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Representative Results
Das Ziel dieser Studie war es, das räumlich-zeitliche Expressionsmuster der Knötchen-spezifische p. Vulgaris NIN zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurde ein 700 bp Region stromaufwärts von der Übersetzung Einleitung Codon des Gens NIN ausgewählt und eine Reihe von Oligos entworfen wurde, wie in Figur 1Adargestellt. Mit Hilfe einer High Fidelity Polymerase, NIN Promoter Fragment wurde verstärkt, isoliert (Abbildung 1 b) und geklont in der Ziel-binären Vektor-pBGWFS7.0 (Abbildung 1) durch einen Gateway-Ansatz eine transkriptionelle Fusion zu erzeugen die Chimären Reporter GUS-enhanced GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GLP). Das pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP-Vektor-Konstrukt erzeugt in der Regel Hunderte von unabhängigen Klone. Kolonie Screening mittels PCR mit Gen-spezifischen Oligos erkennt leicht die richtigen Klone (Abb. 2D). Die PCR positivere Plasmid war Sanger mit dem Promotor-spezifische Oligos sequenziert, um die Echtheit des Einsatzes zu überprüfen.
Aufrechterhaltung hohen Luftfeuchtigkeit während des Experiments ist notwendig für die Induktion der Kallus und behaarten Wurzeln. Auf dem Gelände der Verwundung Calli sind in der Regel beobachtete bei 5 bis 7 Tagen (Abb. 2J) und ≥ 2 cm behaarte Wurzeln bei 10 bis 12 Tage nach der Transformation eingehalten werden. Die Mehrheit der A. Rhizogenes verwandelt Pflanzen erfolgreich zu produzieren behaarte Wurzeln von 2 Wochen (Abbildung 2 K). Allerdings können die Anzahl und Länge der behaarten Wurzeln Variable sein. Wählen Sie daher die schärfste wachsenden Wurzeln für Analyse und weitere Experimente. Verbrauchsteuern Sie die primäre Wurzel durch den Stamm 2 cm unterhalb der behaarten Wurzeln abschneiden und verpflanzen sie in Töpfen mit sterilen Vermiculit (Abbildung 2 L) oder in einer Hydrokultur-System.
Um den raumzeitlichen Ausdruck des Veranstalters Knötchen-spezifische NIN zu untersuchen, wurden behaarte Wurzeln mit R. Tropicibeimpft und GUS-Aktivität wurde in regelmäßigen Abständen nach Impfung je nach experimentellen Bedarf beobachtet. Inokulation mit R. Tropici induziert einen starken Ausdruck der GUS in den transgenen Wurzeln, darauf hinweist, dass Rhizobien induziert den NIN-Ausdruck in die Gartenbohne (Abb. 3A). Darüber hinaus Probenahme bei 6-9 dpi zeigten GUS Ausdruck in Rhizobium infiziert Wurzelhaare Zellen (Abb. 3 b). Phaseolus Knötchen Primordium und junge und Reife Knötchen zeigten auch NIN Ausdruck (Abbildung 3). In allen Phasen der Nodulation war kein solcher GUS Ausdruck in den Vektor-Kontrolle-Wurzeln (Abbildung 3D, 3E, 3F) gesehen.
Abbildung 1 : Gliederung der P. Vulgaris NIN Genstruktur und Klonen. (A) A schematische Darstellung der NIN Genstruktur zeigt 5' UTR (grün), 4 Exons 3 Introns und 3' UTR (rot) auf Chromosom Nummer 9 von p. Vulgaris. Stromaufwärts zu NIN Übersetzung Einleitung Codon ATG, zeigt eine Promotor-Region auf welche Oligos wurden entwickelt. FO, vorwärts Oligo; RO, umgekehrte Oligo; ATG, Start-Codon; TAA, Stopp-Codon. (B) PvNIN Promotor-Region war von frisch verstärkt isoliert p. Vulgaris genomischen DNA mit dem Promotor-spezifische Oligo-Set. M, 1 Kb Leiter; 1, PCR-Reaktion mit gDNA zeigt Amplikons Größe von 700 bp; 2, PCR-Reaktion ohne gDNA (-Ve-Kontrolle). (C) Screening von pENTR/D-TOPO-PvNIN Plasmide mittels PCR unter Verwendung der Vektor spezifische M13 Oligos. Richtige Einfügungen haben eine Band bei 1.024 bp (Bahn 3-6) und Vektoren ohne Einsätze eine 324 bp-Band (Spur 1 - 2). (D) Promoter Ausdruck binäre Vektorkarte verwendet in der vorliegenden Studie, pBGWFS7.0 Vektor zeigt PvNIN Promotor in Fusion mit GUS und GLP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: A. Rhizogenes verwandelt behaarte Wurzeln die Gartenbohne. (A) das Sterilisationsgut Samen von p. Vulgaris CV Negro Jamapa Keimen auf steriles Filterpapier. (B) Samen, Mantel entfernt. (C) Tube setup für behaarte Wurzel Induktion. (D) Schaben, A. Rhizogenes Kultur (pNIN & Steuerung). (E) A. Rhizogenes Kultur Nukleinsäuretablette in sterilem destilliertem Wasser. (F, G) Injektion von bakteriellen Zellen in Hypocotyles. (H) Rohr setup mit Phaseolus Sämlinge mit bakteriellen Zellen injiziert. (Ich, J) Calli gebildet auf verwundete Seite 5-7 dpi. (K) behaarte Wurzeln 15 dpi (L) besteuert Pfahlwurzeln 2 cm unter der Website der behaarte Wurzel Induktion. (M) zusammengesetzte Pflanzen in sterilen Vermiculit mit R. Tropicibeimpft verpflanzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Promoter Analyse der P. Vulgaris NIN in transgenen p. Vulgaris Wurzeln. Räumlichen und zeitlichen Muster der NIN Ausdruck offenbart durch ein promoterNIN::GUS-GFP-Konstrukt in transgenen behaarte Wurzeln mit GUS als Substrat inkubiert. Optisches Mikroskopbilder von PvNIN: GUS: (A) Wurzeln mit R. Tropici, (B) GUS Ausdruck in gekräuselt Wurzelhaare und (C) junge Knötchen geimpft. Bilder der Kontrolle (leerer Vektor) zeigen keine solche GUS Ausdruck in (D) Wurzeln mit R. Tropicigeimpft, gewellt (E), Wurzelhaare und junge Knötchen (F). RH, Wurzelhaare. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Während der Funktionsanalyse von Genen Rolle die Untersuchung von gen-Expressionsmuster eine entscheidende für das Verständnis der räumlichen und zeitlichen Regelung der Gene in Vivo. Eine bekannte Methode, gen Expressionsmuster zu studieren ist, die gen-Promotor-Region von Interesse, zu klonen, Reporter-Gene wie fluoreszierende Marker-Gene (GFP, RFP, etc.) oder β-Glucuronidase upstream. Hier haben wir eine Promotor-Region des Wurzel Knötchen Symbiose (RNS) spezifischen Gens, NIN, die räumlich-zeitliche Expressionsmuster in p. Vulgaris während RNS zu studieren ausgewählt. Die ausgewählten Promotorsequenz hat stromaufwärts zu GFP::GUS Reporter mit der Gateway-Methode in einem Promotor Expressionsvektor geklont wurde.
Wir haben beschrieben, dass die Expression von der Symbiose spezifischen Promotor in behaarte Wurzelsystem der p. Vulgaris. Das behaarte Wurzelsystem hat weithin für funktionelle Charakterisierung von Genen, einschließlich RNAi vermittelte gen niederzuschlagen, ektopische konstitutive Expression von Genen, Projektträger Ausdruck und Protein-Lokalisierung in widerspenstige Kulturen. Die wichtigsten Vorteile des Systems sind, dass es einfache, reproduzierbare und zuverlässige, und zur gleichen Zeit nicht arbeitsintensiv. Das behaarte Wurzelsystem erfolgreich in anderen Ernte Leguminosen wie G. max24, M. Truncatula25, L. Japonicus26,27, Tomate28, etc., mit übernommen die notwendigen Änderungen vor. Darüber hinaus das Tool angenommen werden kann, bei anderen Leguminosen und nicht-Leguminosen Spezies wenn optimiert für die geeignete A. Rhizogenes Stamm, Methode der Impfung und Wachstumsbedingungen.
Es gibt viele wichtige Parameter. Bei der Auswahl der Promotor-Region, sollte darauf geachtet werden, um die Oligos zu entwerfen, die die notwendigen Promotor Elemente, beginnend mit der vorgelagerten Region Übersetzung Start Sitein das Protein Gene codieren verstärken würde; Analyse der Projektträger sollte mit der verfügbaren Software um Informationen über den Transkriptionsfaktoren binden an die regulatorischen Region durchgeführt werden. Während der Induktion behaarte Wurzeln kümmern: injizieren Sämlinge an die entsprechende Phase; sicherzustellen Sie beim Einspritzen, dass die Nadel nicht durch die Hypocotyle geht; und hoher Luftfeuchtigkeit zu erhalten. Weiter, während des Studiums der Projektträger Expressionsprofile in behaarte Wurzeln, die behaarte Wurzeln, produziert von A. Rhizogenes sind nicht immer verwandelt, und daher ist es wichtig, die transformierte Natur der Wurzeln mit GFP oder GUS Reportern vor dem bestätigen Promotor Ausdruck Studien durchführen. Geeignete Stämme von Rhizobium gewählt werden und die Konzentrationen von Rhizobium sollte angepasst werden, wie im Protokoll angezeigt. Probenahme in den entsprechenden Phasen ist Post Impfung entscheidend für räumlich-zeitliche Ausdruck des Veranstalters in den verschiedenen Phasen der Pflegekräfte zu dokumentieren.
A. Rhizogenes verwandelt behaarte Wurzel Produktion ist eine der schnellsten und effiziente alternative Methoden zusammengesetzte Pflanzen in p. Vulgariszu generieren. Diese zusammengesetzten Pflanzen nicht transgenen Samen produzieren, aber können transgene Wurzeln innerhalb von ein paar Tagen produzieren. In diesem Protokoll, im Gegensatz zu den anderen Methoden29Luftfeuchtigkeit die geschlossenen Röhren konstant hohe schneller bei 10 Tagen dpi behaarte Wurzeln zu fördern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise von der Dirección General de Asuntos del unterstützt persönliche Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (keine zu gewähren. IN219916, M.L und IA205117 M-k. (A) und der Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT Stipendium Nr. 240614 m.l.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
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