Summary
Análisis de expresión del promotor son cruciales para mejorar la comprensión de la regulación de los genes y la expresión espacio-temporal de genes diana. Adjunto presentamos un protocolo para identificar, aislar y clonar un promotor de la planta. Además, se describe la caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común.
Abstract
Las aguas arriba secuencias de codificación de secuencias del gene se llaman como secuencias de promotor. Estudiar los patrones de expresión de los promotores son muy importantes en la comprensión de la regulación génica y patrones espacio-temporales de expresión de genes diana. Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. En este estudio, investigamos el patrón spatiotemporal de la expresión del promotor de creación (NIN) nódulo específico de simbiosis rizobios de Phaseolus vulgaris en las raíces pilosas transgénicos. Utilizando bases de datos de genoma vegetal y herramientas de análisis se identificaron, aislado y clonado el promotor NIN de p. vulgaris en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP de β-glucuronidasa (GUS). Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética en p. vulgaris usando Agrobacterium rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas de ≥ 2 cm en 10 a 12 días después de la transformación. A continuación, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en las raíces pilosas Rhizobium inoculados a intervalos periódicos de post-inoculación. Nuestros resultados descritas la actividad de GUS muestran que el promotor de NIN fue activado durante el proceso de nodulación. Juntos, el presente Protocolo muestra cómo identificar, aislar, clonar y caracterizar un promotor de la planta en las raíces pilosas de frijol común. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.
Introduction
Promotores son herramientas biológicas moleculares importantes que desempeñan un papel crucial en la comprensión de la regulación de la expresión de genes de interés. Promotores son secuencias de ADN ubicadas aguas arriba de la traducción codón de la iniciación del gene de secuencias y llevan la información reguladora central de genes; por lo tanto, su correcta anotación y caracterización son vitales para entender la función del gene. Dependiendo de los patrones de expresión, promotores de la planta se clasifican como constitutivos, específicos de tejido, o específicos de etapa de desarrollo y inducible1. Avances en tecnologías transcriptómicos, mejoras en el modelado de la computadora y la disponibilidad de un número creciente de secuencias del genoma de diferentes especies de plantas han facilitado la predicción a gran escala de promotor secuencias2.
Por otro lado, también es fundamental para establecer instrumentos de evaluación del promotor y técnicas de transformación genética que son rápidos, eficientes y reproducibles. A diferencia de las otras plantas del modelo, la caracterización funcional de genes de leguminosa (p. vulgaris) frijol común es impedida principalmente debido a la naturaleza recalcitrante de Phaseolus SP. para la transformación genética estable. Transformación transitoria sistemas sirven como una alternativa para la caracterización funcional de genes rápida estudios3. En la investigación de la simbiosis de leguminosas, la interacción entre la planta huésped de leguminosas y rizobios bacteria es uno de los sistemas modelo más manejables para el análisis funcional de genes específicos de nódulo y promotor estudios. Caracterizado hasta el momento, han sido varios promotores de leguminosas relacionadas con estas simbiosis, viz, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, glicina max PT5 8, Exo70J9, p. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etcetera. CIS elementos influyen directamente en Regulación génica. El factor de transcripción ENBP1A se une a una región reguladora de Cis (−692 bp) de nodC temprana ENOD12 Vf, y esto facilita la expresión de un gen reportero en primordios de nódulo de Vicia faba16. Reemplazo de regiones reguladoras Cis (−161 para −48 bp) del promotor específico de nódulo melocotonero GLB3 con la heteróloga truncado promotores δ-p35S y δ-pNOS, resultó en una pérdida de especificidad del nódulo y disminución de la actividad de promotor17 .
Informes anteriores indican que el factor de transcripción NIN es necesario para el inicio de la infección por rizobios en las células de pelo de la raíz y también es esencial para la organogénesis del nódulo en L. japonicus18. En el presente estudio, se describe un protocolo para la identificación, aislamiento, clonación y caracterización del promotor específico de nódulos en las raíces pilosas de frijol común. Para lograr esto, seleccionamos promotora rizobios del NIN de simbiosis específica de p. vulgaris y reproducido en una fusión transcripcional a la quimérica reportero GUS-enhanced::GFP. Además, este protocolo describe un rápido y versátil sistema de transformación genética de p. vulgaris con a. rhizogenes inducida por raíces pilosas. Este sistema genera raíces pilosas en menos de 2 semanas después de la transformación. Finalmente, se evaluó la expresión espacio-temporal de promotor de NIN en nódulos radiculares de rizobios colonizados por tinción GUS.
El procedimiento descrito aquí puede ser útil no sólo para el estudio de la nodulación y micorrización11 de plantas leguminosas, sino también para el estudio de patrones de expresión del promotor en raíces19. Además, este protocolo es fácil de usar en laboratorios no especializados.
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Protocol
1. identificación, aislamiento y clonación de P. Vulgaris NIN promotor
- Identificar la secuencia del promotor del gen de interés. Hay varias bases de datos del genoma y las herramientas de análisis disponibles para las plantas tales como Phytozome, plantas de Ensembl, NCBI, etc. A leguminosas promotor p. vulgaris NIN (PvNIN; Phvul.009G115800) fue utilizado en este estudio20.
- Diseño de oligos para la puerta de enlace o tradicional enzima de restricción dependiendo del sistema de vectores de clonación utilizados (figura 1A).
Nota: Estándar (25-35 bp), desalado iniciadores trabajan bien. Secuencias de oligo Reverse que bordean entre el promotor y el gen son recomendables. - Amplificar la región promotora de PvNIN (o región del promotor del gen de interés) de recién aislados de p. vulgaris DNA genomic usando el promotor específico oligo. Uso de una polimerasa de alta fidelidad con las siguientes condiciones PCR: 95 ° C por 5 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 1 min); y 72 ° C durante 5 minutos.
- El fragmento amplificado en gel de agarosa al 1% a los 60 V en una bandeja de gel de 7 x 10 cm y eluir el amplicón correspondiente (700 bp, figura 1B) y el clon en el vector D/pENTR-TOPO según las instrucciones del fabricante.
- Transformar 2 μl de la reacción en competente Escherichia coli las células utilizando las instrucciones del fabricante y placa 150 μL de la mezcla de transformación el hermano de la Lisogenia (LB) suplementado con kanamicina 50 mg/L (Kan50). Crecen las células plateadas a 37 ° C durante la noche.
- Toma 3-6 colonias y cultura que durante la noche en medio LB con Kan50. Plásmido ADN mediante el método de elección de aislar y analizar el plásmido por PCR con los oligos M13 específico de vector. Para PCR, uso 100 ng de plásmido, 12:03 de oligos, 10 X buffer PCR 0,5 U de Taq ADN polimerasa y 10 mM dNTPs.
- Utilice las siguientes condiciones de amplificación de PCR; 95 ° C por 3 min; 30 ciclos (95 ° C por 30 s, 58 ° C por 30 s, 72 ° C durante 75 s); y 72 ° C por 7 minutos visualizar los productos PCR en gel de agarosa al 1%. Asegúrese de que las inserciones correctas tienen una banda en 1.024 bp y vectores sin voluntad insertos una banda 324 de bp (figura 1).
- Realizar la reacción de la LR entre un vector de entrada (pENTR/D-TOPO-PvNIN) y destino de vectores pBGWFS7.021 utilizando una mezcla de enzima comercial según las instrucciones del fabricante.
- Transformar 2 μl de reacción de LR en competentes de e. coli las células utilizando técnicas estándar como se describe en las instrucciones y placa 150 μL de mezcla de transformación LB suplementado con 100 mg/L de espectinomicina (Spe100). Crecen las células plateadas a 37 ° C durante la noche.
- Recoger aproximadamente 5 colonias y de la cultura les durante la noche en medio LB con Spe100. El plásmido de ADN usando un método de elección de aislar y analizar el plásmido por PCR con los oligos específicos del promotor.
- Utilizar las condiciones de la PCR en el paso 1.3. Visualizar los productos PCR en gel de agarosa al 1% para confirmar la amplificación. Amplicons son 700 bp.
- La secuencia del plásmido positivas pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP (figura 1) con los oligos específicos del promotor para verificar la autenticidad de la pieza de inserción.
- Transformar la plásmidos en a. rhizogenes cepa K599 (sin embargo, se pueden utilizar cualquier otra de las cepas de a. rhizogenes ). Añadir 2 μl de la preparación de plásmido a 50 μl de células de espectro y electroporate en una cubeta de 1 mm con la configuración siguiente: 1,8 kV, 25 μF y 200 Ω.
- Recupera las células en ~ 500 μl de medio SOC y agitar a 28 ° C por 2 h. placa LB-Spe100 y crecer a 28 ° C durante 2 días.
- Proyección de la Colonia como se menciona en el paso 1.7 y las condiciones de la PCR como en el paso 1.3. Hacer acciones de glicerol de clones positivos y almacenarlas a-80 ° C.
- Uso de a. rhizogenes cultura albergando vector pBGWFS7.0 vacío como control negativo.
2. A. Rhizogenes transforman melenudas raíces de frijol común
- Esterilizar las semillas de frijol (p. vulgaris variedad Negro Jamapa) (aproximadamente 20) en 50 mL de etanol al 96% durante 1 min y descartar el etanol; Añada 50 mL de lejía (hipoclorito sódico) de 20% por 10 min, con una mezcla constante en campana de flujo laminar. Quitar el cloro y lavar en exceso agua estéril 3 veces.
Nota: Otros cultivares de p. vulgaris pueden utilizarse para la inducción de raíz melenuda. - Germinar las semillas estériles en los papeles de filtro estériles humedecidos con Broughton & Dilworth (B & D) solución22 (tabla 1) por 2 días en la oscuridad a 28 ° C.
- El día antes de transformación preparar lo siguiente:
- Raya a 150 μL del cultivo de a. rhizogenes albergando el vector binario (preparado en los pasos 1.13 y 1.14) en Spe100 LB sólido y crece a 28 ° C durante la noche.
- Llene un tubo de 15 mL con B & solución D y volver a colocar la caperuza a rosca con doble capa de aluminio. Este montaje en un tubo de vidrio de 22 cm que contiene 10 mL de B & D solución (figura 2) y autoclave.
- En el día de transformación, ensamble los siguientes materiales estériles en campana de flujo laminar: germinaron las semillas en el paso 2.2, placa de cultivo de paso 2.3.1, tubos de paso 2.3.2, agua bidestilada estéril (10 mL), pipetas y puntas de pipeta, pinzas estériles, y jeringas de 3 mL.
- Utilice una punta de 200 μL doblada para raspar las células de a. rhizogenes de la placa en un tubo de microcentrífuga y resuspender en 1 mL de agua estéril doble. Del mismo modo, preparar a las células del control vectorial por separado.
- Mezclar las células suavemente para resuspender. No no agitar con vortex.
- Hacer un agujero de 3 mm en el papel de aluminio de los tubos de paso 2.3.2 utilizando una pipeta estéril.
- Recoger las células (ya sea promotor o vector control) de paso 2.5 con la jeringa y pinchar ligeramente los hypocotyls de semillas germinadas con la punta de la aguja (figura 2).
Nota: Asegúrese de que la aguja penetra en el tejido vascular (4 - 6 veces) e inyectar pequeñas (~ 5 μl) gotas de las células de la herida en diferentes posiciones alrededor del hipocótilo. - Inserte con cuidado las raíces de las plántulas inyectadas en el agujero de 3 mm de tubo de 15 mL que contiene el B & solución D. Volver la configuración entera en 22 mL tubos de cristal y junta para mantener la humedad.
- Incubar los tubos en una cámara de crecimiento mantenida a 28 ° C con 16 h de luz: 8 h fotoperíodo oscuro.
Notas: 3-4 días después de la incubación, las plantas crecen en el borde de los tubos de vidrio de 22 mL.
Nota: Es importante mantener la B & solución D constantemente en tubos de plástico y vidrio.
3. promotor análisis: NIN promotor expresión en rizobios nódulos de frijol común
- Para la inducción de nódulos radiculares, inocular Rhizobium tropici o Rhizobium etli (que son compatibles con el frijol común) en 100 mL de medio PY (peptona 0.5 g, extracto de levadura 0,3 g) suplementado con 700 mM de CaCl2 y 20 mg mL−1 ácido nalidíxico. Incubar a 30 ° C por 24 h con agitación a 300 rpm.
Nota: Cualquier antibióticos específicos podrían utilizarse en el caso de transgénicos Rhizobium. - Sedimenten las células en una centrifugadora durante 3 min a 2.800 x g a temperatura ambiente y resuspender en 10 mL de 10 mM de MgSO4. Ajustar la do de las células a 0.6 a OD600 por dilución con 10 mM MgSO4.
- Inocular 1-2 mL de cultivo (preparado en el paso 3.2) por planta (promotor y vector control) para inducir el crecimiento de nódulos en las raíces pilosas. Regar las plantas con B & solución D con nitrógeno limitada (2 mM KNO3) promover la nodulación.
- Dependiendo de la necesidad experimental, recoger las raíces pilosas en diferentes puntos temporales. Recogemos muestras para el estudio de hilos de infección entre 3-5 días post inoculación (dpi).
Nota: Nódulo Primordial y pequeños nódulos pueden ser estudiados en 6-9 PPP y dpi 10-12 días, respectivamente. Por último, madurados y funcionales de los nódulos pueden ser estudiados en 14-21 dpi y nódulos senescentes en > 28 dpi. - Proceso de los raíz, nódulos para la actividad de los genes del reportero (GUS o GFP). Analizar la actividad de GUS según el protocolo descrito por Jefferson23. Observar GFP bajo el microscopio de fluorescencia. Excitar la fluorescencia de GFP con un láser de ion argón azul (488 nm) y recoger la fluorescencia emitida de 510 a 540 nm.
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Representative Results
El objetivo de este estudio fue evaluar el patrón de expresión espacio-temporal de nódulo específico NIN de p. vulgaris . Para ello, se seleccionó una 700 bp región corriente arriba del codón de iniciación de traducción del gen NIN y un conjunto de oligos fue diseñado como se muestra en la figura 1A. Utilizando una polimerasa de alta fidelidad, el fragmento de promotor de NIN fue amplificado, aislado (figura 1B) y clonados en el vector binario destino pBGWFS7.0 (figura 1) a través de un enfoque de la puerta de entrada para generar una fusión transcripcional a los quimérica reportero GUS-enhanced GFP (pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP). La construcción del vector de pBGWFS7.0/PvNIN::GUS-GFP genera normalmente cientos de clones independientes. Proyección de la Colonia por PCR con oligos específicos del gene identifica fácilmente los clones correcta (Figura 2D). El plásmido positivo de PCR fue secuenciado Sanger con los oligos específicos del promotor para verificar la autenticidad del parte movible.
Mantener la humedad alta durante todo el experimento es necesario para la inducción de callo y raíces pilosas. En el sitio de la herida, calli generalmente se observan en 5 a 7 días (figura 2J) y ≥ 2 cm peludas raíces se observan en el 10 a 12 días después de la transformación. La mayoría de a. rhizogenes transformado plantas con éxito para producir raíces pilosas por 2 semanas (figura 2 K). Sin embargo, el número y longitud de raíces pilosas pueden ser variable. Por lo tanto, seleccionar las raíces más vigorosamente crecientes para análisis y otros experimentos. Suprimir la raíz primaria cortando el tallo 2 cm por debajo de las raíces pilosas y transplantarlas a macetas con vermiculita estéril (figura 2 L) o en un sistema de hidroponía.
Para estudiar la expresión espaciotemporal del promotor NIN nódulo inespecífico, raíces pilosas fueron inoculadas con r. tropici, y se observó actividad de GUS en post-inoculación periódicamente dependiendo de la necesidad experimental. La inoculación con r. tropici indujo una fuerte expresión de GUS en las raíces transgénicas, lo que indica que el Rhizobium induce la expresión de NIN en el frijol común (Figura 3A). Además, muestreo en 6-9 dpi demostrada la expresión de GUS en Rhizobium que infectan células de pelo de la raíz (figura 3B). Primordio del nódulo de Phaseolus , joven y maduro nódulos y también demostrado expresión de NIN (figura 3). En todas las etapas de nodulación, no fue vista esa expresión de GUS en las raíces del control del vector (figura 3D, 3E, 3F).
Figura 1 : Esquema de la P. vulgaris NIN estructura génica y la clonación de. (A) A representación esquemática de la estructura del gen de NIN mostrando 5' UTR (verde), 4 exones, 3 intrones y 3' UTR (rojo) en número del cromosoma 9 de p. vulgaris. Aguas arriba al codón de iniciación traducción NIN ATG, muestra una región del promotor de oligos que fueron diseñados. FO, oligo forward; RO, oligo reverse; ATG, codón de inicio; TAA, codón de parada. PvNIN (B) región del promotor fue amplificada de recién aisló DNA genómico de p. vulgaris usando el promotor específico oligo. M, escalera de 1 Kb; 1, reacción de PCR con gDNA mostrando tamaño de amplicón de 700 bp; 2, reacción de PCR sin gDNA (-ve control). (C) proyección de la plásmidos pENTR/D-TOPO-PvNIN por PCR con los oligos M13 específico de vector. Correcta inserción tiene una banda en 1.024 bp (carril 3-6) y vectores sin partes movibles tendrá una banda bp 324 (carril 1 - 2). (D) promotor mapa de vector binario de expresión utilizado en el presente estudio, la proyección del vector de pBGWFS7.0 PvNIN promotor en fusión con GUS y GFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: A. rhizogenes transformado raíces pilosas de la haba común. (A) el esterilizar semillas de p. vulgaris variedad Negro Jamapa germinación sobre papel de filtro estéril. (B) semillas, capa quitada. (C) tubo de instalación para la inducción de raíz melenuda. (D) raspado de un cultivo de a. rhizogenes (pNIN & control). (E) a. rhizogenes cultura resuspendió en estéril agua destilada. (F, G) Inyección de células bacterianas en hypocotyles. (H) tubo de instalación con plantas de Phaseolus inyectados con las células bacterianas. (I, J) Callo formado en el sitio herido 5-7 dpi. (K) raíces peludas 15 dpi (L) extirpando las raíces tap 2 cm por debajo del sitio de la inducción de raíz melenuda. (M) compuesto plantas transplantadas en vermiculita estéril inoculan con r. tropici. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Análisis del promotor de P. vulgaris NIN en transgénicos p. vulgaris raíces. Patrón espacial y temporal de NIN expresión revelada una construcción promoterNIN::GUS-GFP en las raíces pilosas transgénicas se incubaron con GUS como sustrato. Imágenes de microscopio óptico de PvNIN: GUS: (A) las raíces inocularon con r. tropici, expresión de GUS (B) en rizados pelos de la raíz y nódulos pequeños (C). Imágenes de control (vector vacío) que no hay tal expresión de GUS en raíces (D) inoculadas con r. tropici, (E) rizados pelos de la raíz y nódulos pequeños (F). RH, pelo de la raíz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante el análisis funcional de genes, el estudio de patrones de expresión genética desempeña un papel crucial en la comprensión de la regulación espacial y temporal de los genes en vivo. Es un método bien conocido para estudiar patrones de expresión del gen a clonar la región del promotor del gen de interés, río arriba a genes del reportero como genes marcador fluorescente (GFP, RFP, etc.) o β-glucuronidasa. En este documento, hemos seleccionado una región del promotor de la raíz nódulo simbiosis (RNS) gen específico, NIN, para estudiar los patrones espacio-temporales de expresión en p. vulgaris en RNS. La secuencia del promotor seleccionado ha sido clonada aguas arriba a los reporteros GFP::GUS utilizando el método de entrada en un vector de expresión del promotor.
Hemos descrito la expresión del promotor específico de simbiosis en el sistema raíz melenudo de p. vulgaris. El sistema piloso de raíz ha sido ampliamente utilizado para la caracterización funcional de genes, incluyendo RNAi mediado gene derribar, ectópico expresión constitutiva de genes, promotor expresión y localización de la proteína en cultivos recalcitrantes. Las principales ventajas del sistema son que es fácil, reproducible y fiable y al mismo tiempo no de mano de obra intensiva. El sistema de raíz melenudo se ha adoptado con éxito en otras legumbres cultivo tales como G. máximo24 M. truncatula25, L. japonicus26,27, tomate28, etc., con las modificaciones necesarias. Además, la herramienta puede ser adoptada en otras especies leguminosas y no leguminosas cuando optimizado para el conveniente a. rhizogenes cepa, método de inoculación y condiciones de crecimiento.
Hay muchos parámetros críticos. Al seleccionar la región del promotor, se debe tener cuidado para el diseño de los oligos que amplificaran los elementos necesario promotor, desde la región ascendente de la traducción Inicio sitein la proteína codificación de genes; Análisis del promotor deben llevarse a cabo utilizando el software disponible para recoger información sobre los factores de transcripción a la región reguladora. Tenga cuidado mientras que la inducción de raíces pilosas: inyectar las plántulas en la etapa correspondiente; durante la inyección, asegúrese de que la aguja no pasa a través del hypocotyle; y mantener condiciones de humedad alta. Además, mientras estudiaba los perfiles de la expresión del promotor en las raíces pilosas, las raíces pilosas producidas por a. rhizogenes no siempre se transforman, y por lo tanto, es importante confirmar la naturaleza transformada de las raíces usando GFP o GUS reporteros antes realizar estudios de expresión del promotor. Adecuado deben elegirse de cepas de Rhizobium y las concentraciones de Rhizobium deben ajustarse como se indica en el protocolo. Muestreo en las etapas apropiadas post inoculación es crucial para documentar la expresión espacio-temporal del promotor en diferentes etapas de RNS.
A. rhizogenes transformados raíz melenuda producción es uno de los métodos alternativos más rápidos y eficientes para generar plantas compuestas de p. vulgaris. Estas plantas compuestas no pueden producir semillas transgénicas, pero pueden producir raíces transgénicas en pocos días. En el presente Protocolo, a diferencia de los otros métodos29, los tubos cerrados mantienen humedad constante para promover raíces pilosas más rápidas en 10 días dpi.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente financiado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (no de la concesión. IN219916 M.L y IA205117 a M-K. A) y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (beca CONACYT no. 240614 a M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator - 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
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