Summary
نقدم هنا لتكيف من الوضوح السلبي وأسلوب إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للتصور المفرج المبيض وجرابي الشعيرات الدموية في المبايض سليمة الماوس.
Abstract
المبيض هو الجهاز الرئيسي للجهاز التناسلي الإناث، وهو أمر أساسي لإنتاج الأمشاج الإناث ومراقبة النظام الغدد الصماء، ولكن العلاقات الهيكلية المعقدة وأبنية المفرج ثلاثي الأبعاد (3D) المبيض ليست وصفاً جيدا. من أجل تصور اتصالات ثلاثية الأبعاد والهندسة المعمارية من الأوعية الدموية في المبيض سليمة، الخطوة الهامة الأولى جعل المبيض واضح بصريا. تفاديا لانكماش الأنسجة، استخدمنا المائية الوضوح السلبي القائم على التثبيت (مسح الدهن-وتبادل جامدة تهجين الاكريلاميد "المائية الأنسجة" التصوير/إيمونوستينينج/في الموقع-التهجين-متوافق مع) البروتوكول طريقة لمسح مبيض سليمة . ثم استخدمت Immunostaining ومتقدمة مولتيفوتون المجهري [كنفوكل]، والصورة ثلاثية الأبعاد-عمليات إعادة البناء للتصور من سفن المبيض وجرابي الشعيرات الدموية. باستخدام هذا النهج، واظهرنا ارتباط إيجابي كبير (ف < 0.01) بين طول الشعيرات الدموية جرابي وحجم الجدار الحبيبي.
Introduction
المسام هي الوحدة الأساسية الهيكلية والوظيفية المبيض، وتطويره عالية تتصل المفرج داخل المبيض. توفير التغذية والهرمونات للمسام الأوعية الدموية وهكذا تلعب أدواراً هامة في نمو ونضج المسام1.
مزيج من التكنولوجيات، بما في ذلك علامات الأوعية الدموية انتقائية ونماذج الماوس المعدلة وراثيا وتطوير الأدوية، ازدادت معرفتنا حول المبيض شبكات الأوعية الدموية والأوعية، ووظيفة الأوعية الدموية في فوليكولوجينيسيس. ومن المعروف المبيض جهازا نشطاً نظراً لأنه يعيد تشكيل مختلف شبكات الأوعية الدموية والأنسجة أثناء فوليكولوجينيسيس والاباضه. هذا يعيد البناء النشطة في حجم وهيكل السفن المطلوب للوظيفة البيولوجية لتطوير وتوظيف المسام.
الأساليب التقليدية في غذائها وهيستومورفوميتريك باستخدام المقاطع المبيض وإيمونولابيلينج من الأوعية الدموية تقتصر على صور ثنائية الأبعاد (2D)2. مع تطوير تكنولوجيات إعادة الإعمار (3D) ثلاثي الأبعاد، يمكن أن تتداخل الصور 2D لشرائح الأنسجة جعل هيكل ثلاثي الأبعاد، ولكن هذا الأسلوب لا يزال لديها بعض القيود – تقطيع الأنسجة يمكن أن تدمر المجهرية، بعض أجزاء الأنسجة غالباً ما تكون مفقودة، وعمالة كبيرة وتشارك في إجراء عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها من الشرائح. كل الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد مع الفحص المجهري [كنفوكل] يمكن التغلب على كثير من هذه القيود، ولكن هذه الأساليب محدودة في تقييم الأوعية في المبيض الجنينية3. يمكن استخدام أنسجة كله تطهير الطرق مثل الوضوح4 زيادة حجم تصور لحل هذه المشاكل في المبيضين بعد الولادة والكبار، ومثل هذه الأساليب تقديم موافقة الضوئية المبيض دون أي تشوهات هيكلية. تصوير بنية ثلاثية الأبعاد من المبيض سليمة توفر قاعدة بيانات صورة دقيقة للبرنامج تحليل الصور، مثل مجموعة إيماريس من البرامج المستخدمة في هذا العمل.
إعادة عرض المبيض طوال مرحلة البلوغ جزء من نظام ديناميكي الفسيولوجية، وهذا يجعل المبيض نموذجا ممتازا لإجراء تحقيقات في تنظيم الأوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة تقييم دور المبيض الأوعية الدموية في ظروف مرضية من الجهاز التناسلي الإناث مثل متلازمة تكيس المبيض أو سرطان المبيض عن طريق تصوير أنسجة المبيض كله. تطوير أسلوب الوضوح السلبي واستعمال برمجيات تحليل الصور المتقدمة قدمت المعلومات المكانية المفصلة عن العلاقات بين هياكل المبيض مثل المسام والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة الأخلاقيات الحيوان" في شانغهاي كلية الطب، جامعة فودان (الموافقة على رقم 20160225-013).
1-إعداد الماوس شفافة المبيض
-
إعداد الحلول
- تحضير المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) الحل (1 م، درجة الحموضة 7.6) مع 0.1% Triton X-100 (ببست). جعل 1 ل 10 x إلى برنامج تلفزيوني حل الأسهم، مزيج ز 87 من كلوريد الصوديوم، 3.1 ز نة2بو4 · 2 ح2س، و 28.7 ز غ2هبو4 ·12H2سين إضافة dH2س 1 لتر وآثاره ~ 2 حاء ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1 وتخزين في درجة حرارة الغرفة. تمييع هذا الحل الأسهم 10 x من 1/10 باستخدام dH2س ومن ثم جعل 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
- إعداد الحل المائية (درجة الحموضة 7.5) والاخت 4% (wt/المجلد) بارافورمالدهيد (PFA) الحل والاكريلاميد 4% (wt/المجلد) بيساكريلاميدي 0.05% (wt/المجلد) 0.25% (wt/المجلد) خامسا-044 البادئ في الماء المقطر مزدوجة على الجليد.
- إعداد الحل المقاصة (pH 8.5) عن طريق خلط 200 ملم بورات الصوديوم مخزن يحتوي على 4% (wt/المجلد) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في الماء المقطر مزدوجة.
-
إعداد نضح والمبيض ترانسكارديال
- تبقى جميع الحلول على الجليد خلال جميع الإجراءات.
- تخدير الكبار من الإناث البرية نوع C57BL/6 الماوس مع حقن داخل الحل بينتوباربيتال (0.35 ملغ/كغ). بمجرد أنه يظهر أي رد تو-قرصه، هو تخديره الماوس بشكل صحيح.
- استخدام الشريط مثبت لإصلاح الماوس مع أطرافه ملقاة على لوحة مسطحة رغوة.
- كشف القلب عن طريق شق على الرهابه العملية من خلال الصدر والجلد، والعظام مع المقص.
- جعل شق في الاذين الأيمن للحيوان، ومن ثم نتخلل البطين الأيسر مع 20 مل من برنامج تلفزيوني المثلج x 1 في 10 مل/دقيقة.
- نتخلل الحيوان مع مالا يقل عن 20 مل من محلول المائية في 10 مل/دقيقة.
- جداً الجلد على البطن على طول الخط ميديوفينترال مع مقص، الذي يعرض انتيروكوليا كله، وإزالة الأمعاء. جمع المبايض وكذلك الرحم للحفاظ على سلامة مورفولوجيا المبيض.
- إزالة الأنسجة الدهنية حول المبيض تحت مجهر.
-
جليحه
- مكان المبايض في 10 مل هيدروجيل الحل عند 4 درجة مئوية للتثبيت لمدة 3 أيام.
- نقل المبيض في أنبوب 5 مل وملء الأنبوب مع الحل المائية. تمتد بارافيلم عبر الجزء العلوي من الأنبوب والتفاف ثم بارافيلم حول رقبة الأنبوب.
تنبيه: تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات بين بارافيلم والحل المائية. - ضع الأنبوب على شاكر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 ح السماح المائية بلمرة.
- قم بإزالة المبيض من الجل باستخدام ملعقة وعناية الجل الزائد من حول المبيض من المناديل الورقية. يغسل المبيض أربع مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
-
إزالة المبنى للمجهول
- غمر المبيض في 10 مل الحل المقاصة. تهز بلطف 80 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لبدء عملية تطهير.
- وفي الأسبوع الأول، تغيير الحل كل 3 أيام. بعد أسبوع واحد، قم بتحديث الحل إزالة مرة واحدة أسبوع حتى المبيض يصبح واضحا. وعادة ما تستغرق هذه العملية حوالي 2-3 أسابيع.
ملاحظة: يمكن أن تكون مباشرة من إيمونوستينيد المبيض أو يمكن تخزينها في أزيد الصوديوم (0.02 في المائة) في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل إيمونوستينينج.
2-إيمونوستينينج
- يغسل المبيض مرتين في ببست في يوم 1 في 37 درجة مئوية في شاكر.
- احتضان المبيض في شاكر في الحل الأساسي الأجسام المضادة/ببست (الجدول 1) في يوم 2-3 عند 37 درجة مئوية. في الأعمال المعروضة هنا، الأجسام المضادة الأولية كانت الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء 1 (CD31) و hydroxylase التيروزين المخفف الساعة 01:10 و 01:50 في ببست، على التوالي.
تنبيه: إذا كان يتم استخدام أنواع اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية، تأكد من هناك مصادر حيوانية مختلفة. - يغسل الأجسام المضادة الأولية مع المخزن المؤقت ببست في 37 درجة مئوية في يوم 4 في شاكر.
- احتضان المبيض مع الأضداد الثانوي المطلوب في ببست في يوم 5-6 في 37 درجة مئوية في شاكر. في الأعمال المعروضة هنا، كانت الأجسام المضادة الثانوية 488 الطحين أليكسا hydroxylase التيروزين واليكسا 594 الدقيق ل CD31 المخفف في 01:50 في ببست.
- يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع المخزن المؤقت ببست في 37 درجة مئوية في يوم 7 في شاكر.
- نقل الأنسجة إلى الانكسار حل مطابق لتجانس الانكسار في يوم 8. وضع الأنسجة على ورقة مع خطوط الشبكة للتحقق من الوضوح البصري عن طريق التحقق من ما إذا كان يمكن رؤية خطوط الشبكة. بمجرد الأنسجة قد أوضح تماما، فإنه يمكن تصويرها.
- جعل اسطوانة معجون الذي يمكن أن يحيط فقط الأنسجة، ثم الشكل إلى شكل حدوة حصان واضغط ريدج الخارجي محكم إلى شريحة زجاج بغية جعل مساحة مغلقة. ينبغي أن يكون ارتفاع المعجون أطول قليلاً من المبيض.
- مكان المبيض أوضح بعناية في وسط المعجون وإضافة الانكسار مطابقة الحل. وضع صحن أسفل زجاج أكثر المعجون محكم واستخدام المعجون لإصلاح الطبق.
3-[كنفوكل] مجهرية
- للتصوير مجهر [كنفوكل]، في لوحة "ني-هاء" اختيار العدسة (في هذا غمر المياه قضية 25 X عدسة الهدف، 1.1-نا، 2 مم-WD) مع المسافة العمل المناسبة (في هذه الحالة مم 2.0).
-
في لوحة "حيازة"، حدد العدد من القنوات. وهنا استخدام ثلاث قنوات.
- أولاً، استخدم علامة التبويب "ميناء العين" وعصا تحكم س وص لنقل الأنسجة إلى وسط الميدان عن طريق التحقق من خلال العدسات المجهر.
- بعد إيقاف تشغيل ضوء مصراع الكاميرا، انقر فوق علامة التبويب "حية" لضبط الليزر "السلطة"، "الجيش الكرواتي (كسب)"، و "إزاحة' لكل قناة بشكل منفصل. العالي للطاقة الليزر وذات الجهد العالي يمكن أن يؤدي إلى إشارات أعلى، وإزاحة أعلى يمكن الحد من الضوضاء الخلفية.
- تحديد السليم "حجم المسح" و "العد". استخدام حجم 1024 × 1024 ميكرومتر2 المسح الضوئي وعد من 4 إلى 8.
-
بعد إعداد جودة الصورة لتحديد عمق النسيج في لوحة "زد كثافة التصحيح"، وبعد تحديد مكان العدسة على طبقة أعلى من المبيض (في وسط النسيج) وضبط حيازة للطبقة العليا، انقر فوق "plus" زر تحديد الطبقة العليا.
- تحريك العدسة لأسفل وتعيين HV المناسبة وطاقة الليزر للجزء السفلي من الأنسجة وإضافة المعلومات طبقة أدنى إلى الجدول التصحيح الكثافة Z. انقر فوق "إلى ND" لمزامنة الإعداد مع الفريق "اقتناء ND".
-
لوحة في "شراء ND"، أول مجموعة خطوات عدد المسح الضوئي. ثم، ضع علامة على علامات التبويب "Z" و "الصورة الكبيرة".
- الانتقال إلى الإطار "مسح الصورة الكبيرة" لتحديد حجم الحقل وفقا لحدود الأنسجة مع مساعدة التصور الأنسجة من خلال العدسات. العودة إلى لوحة "اقتناء ND" لإدخال حجم منطقة المسح ("حقول") واختر التداخل بين 10% و 15%.
- انقر فوق "تصحيح تشغيل Z"، لا "التشغيل الآن"، تلقائياً تعيين السليم الجيش الكرواتي، وطاقة الليزر، وإزاحة لكل طبقة، وانتظر الصورة لعملية.
4-3D التعمير المسام الفردية وعلى فاسكولاتوريس
- أولاً، استخدم إيماجيج5 لفتح الملف الأصلي شيكل. انقر فوق الزر "الصورة" واختر "اللون" و "القنوات سبليت". ثم، انقر فوق "ملف" وحفظ القنوات بشكل منفصل كسلسلة ملف tiff باستخدام الخيار "تسلسل الصور" في "حفظ باسم".
- استخدام إيماريس لفتح واحدة من سلسلة ملف tiff. انقر فوق الزر "تحرير"، ثم اختر "إضافة قنوات" لإضافة بقية القنوات. يمكن تغيير اسم ولون القناة في علامات التبويب "عرض التسوية". سمك الأنسجة قد تحتاج إلى تصحيح في لوحة "خصائص الصورة" في القائمة المنسدلة تحت "تحرير".
- للاقتصاص 3D الصور النهائية وإزالة الأجزاء الزائدة، انقر فوق الزر "تحرير"، ثم اختر "3D المحاصيل". يمكن ضبط حجم الحقل بواسطة سحب الحدود.
-
لإعادة بناء الإشارات السفينة مع خوارزمية خيوط في تفوق الفريق، انقر فوق الزر "خيوط" لإنشاء خيوط جديدة ثم انقر فوق التالي.
- بغية تحديد أكبر وأنحف القطر، انتقل إلى لوحة "شريحة" والعثور على السفينة التتبع. المسافة تلقائياً سيظهر على اللوحة "قياس" عن طريق تحديد نقطتين في عرض الحد الأقصى من السفينة.
- العودة إلى لوحة "تفوق" وإدخال قياس العرض وانقر فوق التالي.
- ضبط عتبة نقطة انطلاق والبذور. في لوحة "الكاميرا"، اختر "تحديد". إذا كان بعض المجالات المنتجة بشكل تلقائي بحاجة إلى إزالتها، اضغط shift وانقر على النقطة. باختيار "الانتقال" وتحريك الماوس، يمكن تدويرها الهيكل التأكد من أن جميع النقاط الصحيحة التي تم الاحتفاظ بها ومن ثم انقر فوق التالي.
- اختر عتبة أعلى للتباين المحلي ثم انقر فوق التالي. لا حدد "كشف الأشواك"، والاستمرار في وضع اللمسات الأخيرة على إعادة بناء الاسطوانة الأوعية الدموية. يمكن تحرير اللون بواسطة النقر فوق علامة التبويب "اللون". ويمكن استخراج البيانات الإحصائية في لوحة "إحصاء" من خيوط أعيد بناؤها. ويمكن إزالة الأجزاء الزائدة في لوحة "تحرير".
ملاحظة: يمكن استخدام خوارزميات أخرى لقياس حجم المسام مجموع أو الجدران الحبيبي. في الأعمال المعروضة هنا، اتسمت بويضات أوتوفلوريسسينسي الأجسام المضادة الثانوية على حد سواء. بسبب كمية كبيرة من البيانات، استخدم ملقم محطة عمل لتحليل البيانات.
5-إحصائية تحليل
ملاحظة: يتم عرض بيانات تحليل الصورة كوسيلة ± الأخطاء المعيارية.
- إجراء مقارنات بين المسام باستخدام الاختبار t عينة مستقلة، واستخدم اختبار الارتباط بيرسون لمقارنة معاملات الارتباط للجدار جرابي وطول شعري. تعيين قيمة P < 0.05 كالحد لدلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
علينا تكييف أسلوب الوضوح السلبي إلى طريقة سريعة وبسيطة المبيض الخامل المقاصة مع الحفاظ على الهيكل الحبيبي والأوعية الدموية والحصول على إشارة الفلورية أعلى من علامات المسمى السفن والمسام. هندسة 3D المفرج جرابي تحددها إيمونوستينينج ل CD31، علامة لخلايا بطانية6. تم تتبعه تلطيخ CD31 في المبيض الفئران الكبار باستخدام خوارزمية الشعيرة وأظهرت العلاقات المتبادلة بين الشعيرات الدموية جرابي والمسام الابتدائي والثانوي (الشكل 1).
واستخدمت نقطة التحول والسطحية خوارزميات للكشف عن بويضات إيمونوستينيد hydroxylase التيروزين و granulosa وطبقات thecal وحساب الحجم الإجمالي للمسام7،8. بسبب الضغط المسام، وتم تحديد بعض أجزاء من المسام اقتصاص شبه يدوياً. بعد تحويل بقعة من الحجم الحبيبي الفردية وبويضات والتعمير سطح طبقات الجدار جرابي والتعمير خيوط من السفن، امسح العلاقات بين فاسكولاتوريس جرابي الفردية وغيرها وقد لوحظت مؤشرات قياس، لا سيما granulosa ووحدات تخزين طبقة thecal، (الشكل 2).
الشكل 1 : تصوير عالية الدقة من المبيض الماوس الكبار سليمة بعد المقاصة مع البروتوكول الوضوح السلبي تكييف- (أ-ب) أقسام XYZ كبيرة--مسح واكتساب. اقتصاص الأبعاد الثلاثة (3D) الثانوي (ج) والمسام (د) الابتدائي (الصف العلوي) وأعيد بناء 3D الشعيرات الدموية وبويضات و granulosa/thecal تظهر الخلايا من نفس المسام (الصف السفلي) كما حددتها الشعيرة، السطحية، و بقعة خوارزميات التحويل. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر (أ-ب)، 50 ميكرومتر (ج)، 30 ميكرون (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : مؤشرات مقارنة للعلاقات بين جريبات المبيض الأولية والثانوية، وعلى فاسكولاتوريس- تم استخراج حجم البويضات (A) بعد إعادة البناء ثلاثي الأبعاد الحجم الحبيبي وبويضات في المسام الفردية كما حددتها خوارزمية تحول بقعة، ويتحدد حجم الجدار الحبيبي (ب) على سطح الخوارزمية والشعيرات الدموية تعود قبل خوارزمية الشعيرة. الحجم الحبيبي (ج)، نسبة طول وحدة التخزين/شعري البويضيه (د)، نسبة طول الجدار جرابي حجم/الشعرية (ﻫ)، ونسبة طول الحجم الحبيبي/الشعرية (و)، وطول شعري (ح)، وحسبت ترابط شعري طول وحجم الجدار الحبيبي (ز) استخدام الأدوات المناسبة في حزمة البرامج. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعيارية للوسائل. n = 6؛ * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الشعيرات الدموية في المسام الثانوية المبيض الماوس. وهذا يكشف عن مساحة جوفاء أعلاه إلى جانب البويضيه المسام (المربعات البيضاء تظهر حدود الفضاء). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الدراسة الحالية، ونحن نقدم 3D التصوير لتقييم العلاقات بين الشعيرات الدموية والمسام تنامي الفردية. في أعمالنا السابقة باستخدام البروتوكول نفسه 9، قمنا بدراسة أدوار المفرج الكبيرة، والتفاعلات بين المسام، وموقع المسام في المبايض سليمة الماوس. النهج الوضوح السلبي الذي سمح لنا بدراسة فاسكولاتوريس الجزئي والكلى، وفوليكولوجينيسيس، والعلاقات المتبادلة بين صفراء المجاميع والمسام، وكذلك فيما يتعلق بإعادة بناء هيكل المبيض مراحل إنمائية مختلفة.
للحصول على بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد من أنسجة سليمة، بعملية تطهير هو الخطوة الهامة الأولى. هناك استراتيجيتين رئيسيتين – أساليب الجفاف والأساليب المستندة إلى كاشف ماء، مثل السلبي الوضوح10. لأنه غالباً ما يؤدي إلى انخفاض في إشارات الفلورسنت أساليب الجفاف وغالباً ما تنتج النفايات السامة العضوية حل، ركزنا اهتمامنا على تبسيط بعض الخطوات للأسلوب الوضوح السلبي للاستخدام مع أنواع مختلفة من الأنسجة.
هو الإجراء الأولى الحاسمة في عملية تطهير نضح ترانسكارديال. أثناء التروية، ضخ القلب يلعب دوراً هاما في تعميم الجسم كله حل برنامج تلفزيوني والمائية، يمكن طرد الدم بغية تقليل fluorescence الخلفية. وبالتالي، ينبغي إجراء عملية جراحية التروية بدقة بسرعة لتجنب الوفاة المبكرة للحيوان قبل المائية هو تماما الموزعة في أنحاء الحيوان. يجب أن تظل جميع الوكلاء على الجليد خلال التجربة بأكملها، كما ذكر ليانغ et al. 11، أو أنها ستبدأ بلمرة قبل اكتمال التروية. الخطوة الهامة التالية هي إزالة المائية، ومن الضروري إزالة كجل كثير الزائدة قدر الإمكان نظراً لأنه سيحتفظ بالأجسام المضادة. مرة واحدة يتم مسح الأنسجة، ينبغي إزالتها من الحل المقاصة والمخزنة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لأنه سوف يسبب الكثير من الوقت في حل إزالة الكثير من البروتين أن تضيع. في تصوير مجهرية [كنفوكل]، ينبغي دائماً تعيين Z-الإعدادات قبل مجموعة س ص. إذا تم تعيين مجموعة س ص انخفاض الأولى، لا يمكن تزامنها Z-الإعدادات للحقل بأكمله س-ص.
وقدم أولاً الوضوح السلبي يانغ et al. 12 على البروتوكول، أنهم لم يقم بالخطوة نضح ويطرد بدلاً من ذلك مع النيتروجين. وبالإضافة إلى ذلك، لا يشمل حل مركز بيساكريلاميدي في الحل المائية، استخدموا 8% الحزب الديمقراطي الصربي في الحل المقاصة، وأنها تستخدم دواليب للانكسار مطابقة الوسائط. تم تحسين هذا الأسلوب في وقت لاحق بزيادة تركيز الحزب الديمقراطي الصربي13، مشيراً إلى أن الخطوة نضح و الإجراء كبسولة خالية من النيتروجين14، والجمع بين الأسلوب مع أساليب المقاصة الأخرى مثل بارس-mPACT15. هنا، كما طورنا البروتوكول بالجمع بين نضح ترانسكارديال وخالية من النيتروجين ولﻵﻻت وتناقص مخزونات النشر الاستراتيجي في الحل المقاصة بنسبة 4 في المائة، واستخدام فوكوسكليار الانكسار مطابقة وسائط الإعلام، التي توفر أفضل جودة صور مجهرية.
بعد الوضوح السلبي، يمكن إجراء التحليل المجهري والصورة مولتيفوتون [كنفوكل] للحصول على بنية سليمة 3D المفرج جرابي المبيض. هذا البروتوكول يتحول مبيض سليمة عدم نفاذية ضوء نموذج شفاف بصريا نانوبوروس المهجنة المائية المناسبة للاختراق بالجزيئات الكبيرة مثل الأجسام المضادة16. خلافا لتحليلات النسيجي مقطعية الكلاسيكية 2D، يسمح الوضوح السلبي وتلطيخ بعلامات محددة رسم خرائط 3D للعلاقات بين الشعيرات الدموية والمسام تنامي الفردية.
في أنسجة البالغين، يعيد البناء النشطة والأوعية الدموية والأوعية يحدث أساسا أثناء العمليات المرضية مثل التئام وإصلاح الكسر وتشكيلات الورم وورم خبيث، ريتينوباثيس، فيبروسيس والتهاب المفاصل17. ومع ذلك، تمثل التغيرات الدورية خلال فوليكولوجينيسيس قدرة فريدة من نوعها لإعادة عرض المفرج. بعد تشكيل التجويف في المسام الثانوية، يملأ سائل جرابي وتحيط بالبويضات، الذي ينص المكروية مناسبة نضوج البويضات والتنمية جرابي18. السابقة 2D التصوير الدراسات أظهرت أن جراب المبيض تكون محاطة بشبكة من الشعيرات الدموية في الهج رة القراب19. طبقة جرانولوسا نونفاسكولار، وكل جريب محاط بالشعيرات الدموية الخاصة به. وتمشيا مع الدور الأساسي الذي تؤديه CD31 في فاسكولوجينيسيس6، وجدنا زيادة في طول شعري أثناء فوليكولوجينيسيس في الانتقال من المرحلة الابتدائية إلى الثانوية المسام (الأرقام 2 وح 2). بدلاً من توزيع الشعيرات الدموية حول المسام الابتدائي أو الثانوي الفردية بصورة عشوائية، إعادة البناء ثلاثي الأبعاد الشعيرات الدموية أثبتت أن الشعرية فروع موزعة في المسام قد يمكن اكتشافها في المسام الكبيرة، وفي معظم الحالات هذه وشكلت فروع الشعرية مساحة جوفاء (الشكل 3).
أحد الشواغل الرئيسية هو الأسلوب تكييف وقتاً طويلاً نسبيا لمسح المبيض، ولكن مطلوب وقتاً طويلاً للحصول على أفضل إزالة تأثير. لتوفير بعض الوقت، نوصي بجمع جميع العينات المطلوبة في وقت واحد وإزالتها معا لأنه يمكن تخزين الأنسجة تم مسحها في برنامج تلفزيوني و 0.02 في المائة من أزيد الصوديوم في 4 درجات مئوية لعدة أشهر. قيد آخر هو المسافة العمل المجهر [كنفوكل]. عدسات التكبير أعلى الهدف يكون أقصر المسافات العامل، التي يمكن أن تكون عائقا لتصوير العينات سميكة.
وقد أدخلت عدة بروتوكولات لتصوير أنسجة شفافة وسليمة، بما في ذلك باب20، الجدول21، 3DISCO22، كليارت23، سيدب24، ووضوح16، الوضوح السلبي (مع4 أو دون25من hydrogel)، ميثاق12، مكعب26،27،28من فاستكلير، وحقيقة29، لكن ثلاثة فقط منهم قد استخدمت لانسجة المبيض كله مسح وتقييم9، 30،31. سيدب30 و31 من ScaleA2 وقد أدخلت لتصوير أنسجة المبيض كلياً، ولكن هذه البروتوكولات تسمح سوى خطوة واحدة إيمونوستينينج. الوضوح السلبي، ومع ذلك، يسمح لردود متعددة العلامات البروتين، كما هو مبين في هذه الدراسة وفي أعمالنا السابقة دراسة9.
وفي الختام، لدينا بروتوكول تكييفها لتحديد العلاقة الهيكلية 3D بين طبقات جرابي والأوعية الدموية باستخدام أنسجة المبيض كله أوضح يقدم نهجاً جديداً لدراسة الأوعية في أمراض المبيض مختلفة مثل متلازمة تكيس المبيض وسرطان المبيض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من "الصندوق الخاص الصيني" عن Postdocs (رقم 2014T70392 إلى يلافن)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81673766 إلى يلافن) والصندوق فتيلة المعلم الجديد، زوزو مؤسسة جامعة فودان، وتطوير المشروع الذروة شانغهاي التكاملية تخصصات الطب (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
