Summary
Her presenterer vi en tilpasning av passiv KLARHET og 3D rekonstruksjon metoden for visualisering av eggstokkene blodkar og follikulær kapillærene i intakt musen eggstokkene.
Abstract
Eggstokken er den største orgelet av kvinnelige reproduktive system og er avgjørende for produksjonen av kvinnelige gameter og kontrollere det endokrine systemet, men komplekse strukturelle relasjoner og tredimensjonale (3D) blodkar arkitekturer av den eggstokken er ikke godt beskrevet. For å visualisere 3D tilkoblinger og arkitektur av blodkar i intakt eggstokken, er den første viktige skrittet å gjøre eggstokken optisk klart. For å unngå vev krymping, vi brukte hydrogel fiksering-baserte passiv KLARHET (Fjern Lipid-byttet akrylamid-hybridiserte Rigid tenkelig / Immunostaining/In situ-hybridisering-kompatible vev Hydrogel) protokollen metoden å fjerne en intakt eggstokk . Immunostai-avansert multiphoton AC confocal mikroskopi og 3D image-rekonstruksjoner ble deretter brukt for visualisering av eggstokkene fartøy og follikulær kapillærer. Bruker denne tilnærmingen, vi viste en signifikant positiv sammenheng (P < 0,01) mellom follikulær kapillærene og volumet av follikulær veggen.
Introduction
Hårsekken er eggstokken grunnleggende strukturelle og funksjonelle enheten, og utviklingen er svært knyttet til blodkar i eggstokken. Blodkar ernæring og hormoner til hårsekkene og dermed spille en viktig rolle i vekst og modning av hårsekkene1.
En kombinasjon av teknologier, inkludert selektiv blodkar markører, transgene musen modeller og farmasøytisk utvikling, har økt vår kunnskap om eggstokkene vaskulære nettverk, angiogenese og funksjonen av blodkarene i folliculogenesis. Eggstokken er kjent som en aktiv organ fordi det remodels ulike vev og vaskulære nettverk under folliculogenesis og eggløsning. Slik aktive remodeling i størrelse og struktur av fartøy kreves for funksjonen biologisk utvikling og rekruttere follikler.
Tradisjonelle histologiske og histomorphometric metoder ovarian delene og immunolabeling av blod fartøy er begrenset til todimensjonal (2D) bilder2. Med utviklingen av tredimensjonale (3D) rekonstruksjon teknologier, 2D-bilder av vev skiver kan overlappe hverandre for å lage en 3D-struktur, men denne metoden har fortsatt noen begrensninger-skjæring av vev kan ødelegge microstructures, deler av den vev er ofte mangler, og betydelig arbeid er involvert i å gjøre 3D rekonstruksjoner fra profilen oppnådd fra skiver. Hele-vev 3D-bildebehandling med AC confocal mikroskopi kan overvinne mange av disse begrensningene, men disse metodene er begrenset til evalueringen av angiogenese i embryonale eggstokk3. Ved hjelp av hele vev fjerne metoder som KLARHET4 kan øke visualisert volumet for å løse disse problemene i postnatal og voksen eggstokkene, og slike metoder gir optisk klarering av eggstokken uten noen strukturelle deformasjoner. Avbildning av 3D arkitektur intakt eggstokken gir en nøyaktig bildedatabase for analyseprogramvare, for eksempel Imaris programvarepakken brukt i dette arbeidet.
Ombygging av eggstokk gjennom hele voksenlivet er en del av en dynamisk fysiologiske systemet, og dette gjør eggstokken en utmerket modell for etterforskning regulering av angiogenese. Videre kan vurdere rollen ovarian blodkar i patologisk forhold til kvinnelige reproduktive system som polycystisk ovariesyndrom eller ovarian kreft studeres gjennom hele ovarian vev avbildning. Utviklingen av metoden for passiv KLARHET og bruk av avansert analyseprogramvare har gitt detaljert romlig informasjon om forholdet mellom blodkar og eggstokkene strukturer som follikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr fag fulgt retningslinjene i dyr etiske komiteen ved Shanghai Medical College, Fudan University (godkjenningsnummer 20160225-013).
1. forberedelse av gjennomsiktig musen eggstokkene
-
Forberedelse av løsninger
- Forberede fosfat-bufret (PBS) saltløsning (1 M, pH 7.6) med 0,1% Triton X-100 (PBST). For å gjøre 1 L 10 x PBS lagerløsning, bland 87 g NaCl, 3.1 g NaH2PO4 · 2H2O og 28.7 g av Na2HPO4 ·12H2O. legge dH2O 1 L og røre ~ 2 h. Juster til pH 7.4 med 1 N NaOH og lagre ved romtemperatur. Fortynne 10 x lager løsningen ved 1/10 bruker dH2O og gjør 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Forberede hydrogel løsningen (pH 7.5) ved miksinger 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA) løsning, 4% (wt/vol) akrylamid, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide og 0,25% (wt/vol) VA-044 initiatoren i dobbel-destillert vann på is.
- Forberede clearing løsningen (pH 8.5) ved å blande 200 mM natriumborat bufferen som inneholder 4% (wt/vol) natrium dodecyl sulfate (SDS) i dobbel-destillert vann.
-
Transcardial perfusjon og eggstokk forberedelse
- Holde alle løsninger på is under alle prosedyrer.
- Bedøve voksne kvinnelige wild type C57BL/6 mus med en intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (0,35 mg/kg) løsning. En gang den viser ingen tå-klype respons, er musen riktig anesthetized.
- Bruke selvklebende tape å fikse musen med lemmer strukket ut på en flat skum bord.
- Utsett hjertet av et snitt på xiphoid-prosessen gjennom brystet, hud og bein med saks.
- Gjør et snitt i dyrets høyre atrium, og deretter perfuse venstre ventrikkel med 20 mL iskald 1 x PBS på 10 mL/min.
- Perfuse dyr med minst 20 mL hydrogel på 10 mL/min.
- Incise huden over magen langs medioventral med saks, som viser hele enterocoelia, og fjerne tarmen. Samle eggstokkene samt livmor å opprettholde integriteten til eggstokkene morfologi.
- Fjerne fett vev rundt eggstokken under et mikroskop.
-
Avgassing
- Plass eggstokkene i 10 mL hydrogel løsning på 4 ° C for fiksering for 3 dager.
- Overføre eggstokken til en 5-mL tube og fyll røret med hydrogel løsning. Strekke parafilm over toppen av røret og deretter pakke parafilm rundt halsen av røret.
Advarsel: Pass på at det ikke er noen bobler mellom parafilm og hydrogel løsningen. - Sett røret i en shaker i kuvøse på 37 ° C for maksimalt 3 h å tillate hydrogel til danner.
- Fjern eggstokken fra gel med en spatel og forsiktig fjerne overflødig gel fra rundt eggstokken av papir. Vask eggstokken fire ganger med 1 x PBS.
-
Passiv clearing
- Senk eggstokken i 10 mL av clearing løsningen. Forsiktig risting 80 RPM på 37 ° C for å starte clearing prosessen.
- I den første uken, endre løsningen hver tredje dag. Etter en uke, oppdaterer du fjerne løsningen når en uke til eggstokken blir klart. Vanligvis tar prosessen ca 2-3 uker.
Merk: Eggstokken kan være direkte immunostained eller kan lagres i Natriumazid (0,02%) i PBS på 4 ° C i flere uker før immunostaining.
2. Immunostaining
- Vask eggstokken to ganger i PBST på dag 1 på 37 ° C i en shaker.
- Inkuber eggstokken på en shaker i primære antistoffer/PBST løsning (tabell 1) på dag 2-3 på 37 ° C. I arbeidet presentert her primære antistoffer var blodplater-endothelial celle vedheft molekyl 1 (CD31) og tyrosin hydroksylase utvannet på 1:10 og 1:50 i PBST, henholdsvis.
Advarsel: Hvis to eller flere typer primære antistoff, kontroller at det er forskjellige dyr kilder. - Vask av primære antistoffer med PBST buffer på 37 ° C på dag 4 på en shaker.
- Inkuber eggstokken med ønsket sekundære antistoffer i PBST på dag 5-6 på 37 ° C i en shaker. I arbeidet presentert her, var sekundære antistoffer Alexa mel 488 tyrosin hydroksylase og Alexa mel 594 for CD31 utvannet på 1:50 i PBST.
- Vask av sekundær antistoffer med PBST buffer på 37 ° C på dag 7 på en shaker.
- Overføre vevet til brytningsindeks samsvarende løsning for brytningsindeks homogenisering på dag 8. Sette vev på papir med rutenett å sjekke sin visuell klarhet ved å sjekke om rutenettet kan sees. Når vev er avklart fullt, kan det bli avbildet.
- Gjøre en kitt sylinder som kunne bare omgir vevet, formet i en hesteskoform og trykk den ytre kanten tett på et glass lysbilde for å gjøre et lukket rom. Høyden på kitt bør være litt høyere enn eggstokken.
- Plasser avklart eggstokken nøye i midten av putty og legge brytningsindeks matchende løsning. Sett et glass-bottom rett over putty tett og bruke kitte fikse parabolen.
3. AC confocal mikroskopi
- For bildebehandling med AC confocal mikroskop, i "Ni-E"-panelet velger du objektivet (i dette tilfellet vann nedsenking 25 X linsen, 1.1-NA, 2 mm-WD) med de riktige arbeidsavstand (i dette tilfellet 2.0 mm).
-
Velg antall kanaler i "Erverv"-panelet. Her Bruk tre kanaler.
- Bruk først kategorien "øye port" og XY kontrolleren styrespaken flytte vevet til midten av feltet ved å se gjennom mikroskopet okularene.
- Etter dreier av lukkeren lyset, klikker du kategorien "live" for å justere "laser makt", "HV (gevinst)", og "forskyvning" for hver kanal separat. Høyere laser makt og HV kan føre til høyere signaler, og høyere forskyvning kan redusere bakgrunnsstøy.
- Velg riktig "Scan størrelse" og "Teller". Bruk en skanning størrelse på 1024 x 1024 µm2 og antallet 4 til 8.
-
Etter bildekvaliteten for å definere dybden av vev i panelet "Z intensitet korrigering", og etter å finne linsen på det øverste laget av eggstokkene (i midten av vev) og justere oppkjøpet for det øverste laget, klikk på "pluss" for å definere det øverste laget.
- Flytte linsen ned og angi riktige HV og laser makt at bunnen av vev og Legg laveste laget informasjonen i tabellen Z intensitet korreksjon. Klikk på "Til ND" synkronisere innstillingen med "ND erverv" panel.
-
I "ND erverv" panel, første sett antall skanning trinn. Deretter sjekke fanene "Z" og "Store bildet".
- Gå til vinduet "Scan stort bilde" for å definere størrelsen på feltet grunnvollen av vev ved hjelp av vev visualisering gjennom okularene. Gå tilbake til "ND erverv"-panelet for å angi størrelsen på skanneområdet ("felt") og velge overlappingen mellom 10% og 15%.
- Klikk "Kjør Z korreksjon", ikke "løpe nå", automatisk angi riktig HV, laser makt og forskyvning for hvert lag, og vente på bildet for å behandle.
4. 3D rekonstruksjon av individuelle hårsekker og deres Vasculatures
- Bruk først ImageJ5 åpne filen NIS. Klikk knappen "Bilde" og velg "Farge" og "Split kanaler". Deretter klikker du "Fil" og separat lagre kanalene som tiff fil-serien ved hjelp av alternativet "Bildesekvenser" i "Lagre som".
- Bruk Imaris til å åpne en av tiff fil serien. Klikk knappen "Rediger" og velg "Legg til kanaler" legge til resten av kanalene. Navnet og fargen av kanalen kan endres i kategoriene "Display justering". Tykkelsen på vevet må rettes i "Egenskaper"-panelet i rullegardinlisten under "Rediger".
- Den 3D beskjære av endelige bilder og fjerning av overflødige deler, velger du knappen "Rediger" og velger "Beskjær 3D". Størrelsen på feltet kan justeres ved å dra kantlinjen.
-
For å rekonstruere fartøyet signaler med filamenter algoritmen i Overgå panelet, klikk "Filamenter" for å opprette en ny Filament og klikk Neste.
- For å definere det største og den tynneste diameteren, gå til "Del" panel og finne sporing fartøyet. Avstanden vises automatisk i "Mål"-panelet ved å velge to punkter på den maksimale bredden av fartøyet.
- Gå tilbake til "Overgå" panel og input målt bredden og klikk Neste.
- Juster start- og frø punkt terskelen. Velg "Velg" til "Kamera". Hvis noen av automatisk produsert kulene må fjernes, trykke SKIFT og klikke punktet. Ved å velge "Naviger" og bevege musen, kan strukturen roteres for å sikre at alle de riktige punktene beholdt, og klikk deretter Neste.
- Velg høyeste terskelen for de lokale contrast og klikk Neste. Ikke Velg "Oppdage Spines", og fortsette å fullføre gjenoppbyggingen av blod fartøy sylinderen. Fargen kan redigeres ved å klikke kategorien "Farge". De statistiske dataene kan hentes i "Flygninger"-panelet i rekonstruert Filament. Overflødig deler kan fjernes i "Rediger"-panelet.
Merk: Andre algoritmer kan brukes for å måle mengden totalt follikler eller follikulær vegger. I arbeidet presentert her, var oocytes preget av autofluorescence av både sekundære antistoffer. På grunn av store mengder data, ble en arbeidsstasjon server brukt for dataanalyse.
5. statistisk analyse
Merk: Analyse bildedata presenteres som betyr ± standardfeil.
- Utføre sammenligninger mellom follikler med t-test med uavhengige utvalg, og bruke Pearsons korrelasjon testen til å sammenligne korrelasjonskoeffisienter follikulær veggen og kapillær lengde. Angi en verdi av P < 0,05 som grensen for statistisk betydning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset metoden for passiv KLARHET i en rask og enkel metode for passiv eggstokk fjerne samtidig bevare den follikulære og vaskulær arkitekturen og få høyest fluorescerende signalet fra merket markører av fartøy og follikler. 3D arkitektur er follikulær blodkar ble bestemt av immunostaining for CD31, en markør for endotelceller6. CD31 flekker i eggstokkene voksen mus ble sporet ved hjelp av Filament algoritmen og viste innbyrdes forbindelser mellom follikulær kapillærene og primære og sekundære follicles (figur 1).
Spot transformasjon og overflate algoritmer ble brukt til å gjenkjenne de tyrosin hydroksylase-immunostained oocytes og granulosa og thecal lag og beregner det totale volumet av hårsekkene7,8. På grunn av komprimering av hårsekkene, ble noen deler av beskjæres follicles identifisert semi manuelt. Etter sted transformasjonen av enkelte follikulær volum og oocytes og Surface Rekonstruksjon av follikulær veggen lag og Filament gjenoppbygging av fartøyene, Fjern relasjoner mellom individuelle follikulær vasculatures og den andre målt indekser, spesielt granulosa og thecal lag volumer, ble observert (figur 2).
Figur 1 : Høyoppløselig avbildning av en intakt voksen mus eggstokk etter avregning med tilpasset passiv KLARHET protokollen. (A-B) Inndelinger og XYZ store skanning oppkjøpet. Tre-dimensjonale (3D) beskjæres videregående (C) og primære (D) follikler (øverste rad) og 3D rekonstruert kapillærene, oocytes og granulosa/thecal celler i samme hårsekken (nederste rad) vises som er identifisert av Filament, overflate, og Spot transformasjon algoritmer. Skalere barer = 200 µm (AB), 50 µm (C), 30 µm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Komparativ indekser av relasjonene mellom primær og sekundær ovarian follicles og deres vasculatures. Oocyte volumet (A) ble pakket ut etter 3D rekonstruksjoner av follikulær volum og oocytes i individuelle hårsekker som bestemmes av Spot transformasjon algoritmen og follikulær veggen volumet (B) ble bestemt av overflaten algoritmen og kapillærene ble sporet av Filament algoritmen. Follicular volumet (C), oocyte volum/kapillær lengde forholdet (D), follikulær veggen volum/kapillær lengde forholdet (E), follikulær volum/kapillær lengde forholdet (F), kapillære lengden (H), og korrelasjon kapillær lengde og follikulær veggen volum (G) ble beregnet med passende verktøy i programvarepakken. Feilfelt representerer standard feil av midler. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: 3-dimensjonal modell av kapillærene i sekundære follicles av musen eggstokken. Dette avslører en hulrommet over oocyte side av follikler (hvite firkanter Vis kantlinjer på plass). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenterer vi 3D bildeprodukter for å vurdere relasjonene mellom kapillærene og personlige voksende follikler. I vår tidligere arbeid bruker den samme protokollen 9, studerte vi rollene til store blodkar, interaksjoner mellom follicles og plasseringen av hårsekkene i intakt musen eggstokkene. Passiv KLARHET tilnærming tillot oss å studere mikro - og makro-vasculatures, folliculogenesis og sammenhengen mellom corpora lutea og follikler samt å rekonstruere ovarian arkitekturen på ulike utviklingsstadier.
For å få 3D bildedata intakt vev, er clearing prosessen den første viktige skrittet. Finnes det to hovedstrategier-dehydrering metoder og hydrofile reagens-baserte metoder, for eksempel passiv KLARHET10. Fordi dehydrering metoder ofte føre til en nedgang i fluorescerende signaler og ofte produsere giftig organisk løsning avfall, fokuserer vi har vår oppmerksomhet på å forenkle noen trinn av metoden for passiv KLARHET for bruk med ulike vev.
Den første viktige fremgangsmåten i clearing prosessen er transcardial perfusjon. Under perfusjon spiller pulsen en viktig rolle i hele kroppen sirkulasjonen av PBS og hydrogel løsning, som kan skylle ut blodet for å redusere bakgrunnen fluorescens. Dermed perfusjon operasjonen skal utføres nøyaktig og raskt for å unngå dyret før hydrogel for tidlige død er fullstendig distribuert gjennom dyret. Alle agenter må holdes på is under hele eksperimentet, som nevnt av Liang et al. 11, eller de vil begynne å danner før perfusjonen er fullført. Neste viktige trinn fjerner hydrogel, og det er nødvendig å fjerne så mye overflødig gel som mulig fordi det vil beholde antistoffer. Når vevet fjernes, bør det fjernet fra fjerne løsningen og lagret i PBS på 4 ° C fordi for mye tid i clearing løsningen vil føre til for mye protein tapt. I AC confocal mikroskopi bildebehandling, bør alltid Z-innstillingene angis før X-Y området. Hvis X-Y området settes ned først, kan ikke Z-innstillingene synkroniseres på hele XY-feltet.
Passiv KLARHET ble først introdusert av Yang et al. 12 i deres protokollen, de utføre ikke perfusjon trinn og i stedet degassed med nitrogen. I tillegg sine lysning løsning inkluderte ikke bisacrylamide i hydrogel løsningen, de brukte 8% SDS i clearing løsningen og de brukt FELGER for brytningsindeks matchende media. Denne metoden ble senere forbedret ved økende SDS konsentrasjon13perfusjon trinnet og det nitrogen-fri avgassing prosedyren14og kombinere metoden med andre clearing metoder som PARS-mPACT15. Her har vi ytterligere utviklet protokollen kombinerer transcardial perfusjon og nitrogen-fri avgassing, redusere SDS i clearing løsningen til 4%, og bruker FocusClear som brytningsindeks matchende media, som gir høyere kvalitet mikroskopi bilder.
Etter passiv KLARHET, kan AC confocal multiphoton mikroskopi og bildet analyse utføres for å få intakt 3D arkitektur er eggstokkreft follikulær blodkar. Denne protokollen forvandler en ikke-lys-permeable intakt eggstokk i en optisk gjennomsiktig hydrogel-hybridiserte nanoporous form som passer for gjennomtrengning av macromolecules for eksempel antistoffer16. I motsetning til klassisk 2D flerdelte histologiske analyser kan passiv KLARHET og flekker med spesifikke indikatorer 3D tilordningen relasjonene mellom kapillærene og personlige voksende follicles.
I voksen vev skjer aktive vaskulær remodeling og angiogenese hovedsakelig under patologisk prosesser som sårheling, brudd reparasjon, svulst og metastasering formasjoner, retinopathies, fibroses og revmatoid artritt17. Imidlertid representerer sykliske endringer under folliculogenesis en unik kapasitet for blodkar remodeling. Etter dannelsen av antrum i sekundære follicles, follikulær væske fyller og omgir oocyte, som gir en passende microenvironment for oocyte modning og follikulær utvikling18. Tidligere 2D imaging studier viste at eggstokkene follikler er omgitt av et nettverk av blodkar i theca interna19. Granulosa laget er nonvascular, og hvert hårsekken er omgitt av sin egen kapillærer. I samsvar med den viktige rollen CD31 i vasculogenesis6, fant vi en økning i kapillær lengde under folliculogenesis i overgangen fra grunnskole til videregående follikler (tall 2 g og 2 H). I stedet for en tilfeldig fordeling av kapillærene rundt personlige primær eller sekundær follikler, 3D rekonstruksjon av kapillærene vist at kapillær grener distribuert i hårsekkene var i større follikler, og i de fleste tilfeller disse kapillær grener dannet en hulrommet (Figur 3).
En stor bekymring er at tilpasset metoden tar relativt lang tid å fjerne eggstokken, men den lange tiden er nødvendig for best fjerne effekten. For å spare tid, anbefaler vi å samle alle nødvendige prøvene samtidig og fjerne dem sammen fordi ryddet vev kan lagres i PBS og 0.02% Natriumazid på 4 ° C i flere måneder. En annen begrensning er arbeidsavstand av AC confocal mikroskopet. Høyere forstørrelse målet linser har kortere arbeide avstander, som kan være et hinder for bildebehandling av tykk prøver.
Flere protokoller har blitt introdusert for avbilding av gjennomsiktig og intakt vev, inkludert BABB20, skala21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, KLARHET16, passiv KLARHET (med4 eller uten hydrogel25), PAKTEN12, KUBIKK26,27, FASTClear28, og faktisk29, men bare tre av dem har blitt brukt for hele ovarian vev clearing og evaluering9, 30,31. SeeDB30 og ScaleA231 har blitt introdusert for bildebehandling av hele ovarian vev, men disse protokollene tillater bare en enkelt immunostai-trinn. Passiv KLARHET, men gir flere protein-merking reaksjoner, som vist i studien og i våre tidligere studier9.
Avslutningsvis gir våre tilpasset protokoll for å bestemme 3D strukturelle forholdet mellom follikulær lag og blodkar bruker hele avklart ovarian vev en ny tilnærming for å studere angiogenese i ulike ovarian sykdommer som polycystisk eggstokk-syndrom og ovarian kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra den kinesiske spesielt fond for postdoc (nr. 2014T70392 til YF), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (nr. 81673766 til YF), nye læreren grunning fondet, Zuoxue grunnvoll Fudan University og utvikling Prosjekt av Shanghai Peak disipliner-Integrative Medicine (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
