Summary
Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.
Abstract
Yumurtalık kadın üreme sisteminin ana organ ve kadın gamet üretim için ve endokrin sistem, karmaşık yapısal ilişkiler ve üç boyutlu (3D) damarlara mimarileri, ama kontrol etmek için önemlidir Yumurtalık de açıklanan değildir. 3D bağlantıları ve bozulmamış yumurtalık kan damarlarının mimarisini görselleştirmek için ilk önemli adım yumurtalık optik açık hale getirmektir. Doku büzülme önlemek amacıyla, biz hidrojel kullanılan pasif NETLİK fiksasyon tabanlı (Akrilamid melezleşmiştir Rigid temizleyin Lipid değiş tokuş görüntüleme / Immunostaining/In situ hibridizasyon-uyumlu doku hidrojel) protokol yöntemi sağlam bir yumurtalık temizlemek için . Immunostaining, Gelişmiş multiphoton confocal mikroskobu ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu yumurtalık damarlarının ve foliküler kılcal görselleştirme için kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, önemli bir pozitif korelasyon gösterdi (P < 0,01) foliküler kılcal damarlar ve foliküler duvar hacmi uzunluğu arasında.
Introduction
Folikül temel yapısal ve Fonksiyonel yumurtalık birimidir ve onun gelişme son derece yumurtalık içinde damarlara ilgilidir. Kan damarları beslenme ve hormonlar köklerinin sağlamak ve böylece büyüme ve olgunlaşma köklerinin1önemli rol oynarlar.
Seçici kan damarı işaretleri, transgenik fare modelleri ve ilaç geliştirme teknolojileri kombinasyonu yumurtalık damar ağları, anjiogenez ve kan damarlarının fonksiyonu hakkında bilgimizi artmıştır folliculogenesis. Bu remodels çeşitli doku ve damar ağları folliculogenesis ve yumurtlama sırasında yumurtalık etkin bir organ bilinir. Boyutu ve yapısı damarlarının etkin böyle remodeling geliştirme ve köklerinin işe biyolojik fonksiyonu için gereklidir.
Yumurtalık bölümler ve immunolabeling kan damarlarının kullanarak geleneksel histolojik ve histomorphometric yöntemleri için iki boyutlu (2B) görüntüleri2sınırlıdır. Üç boyutlu (3D) imar teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte, dokusu dilimlerin 2D görüntüleri 3D bir yapı yapmak için örtüşen, ancak bu yöntem, hala bazı sınırlamalar vardır — doku kesit microstructures, bazı kısımları yok doku genellikle eksik ve önemli emek dilimleri elde edilen görüntülerden 3B rekonstrüksiyonlar yapımında ilgilenmektedir. Bütün doku 3D görüntüleme confocal mikroskobu ile bu sınırlamaların çoğunu üstesinden gelebilir, ama bu yöntemlerin angiogenez embriyonik Over3değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Bütün doku NETLİK4 gibi yöntemleri takas kullanarak doğum sonrası ve yetişkin yumurtalık bu sorunları çözmek için görüntülenmeyecektir birimin artırabilir ve optik izni olmadan herhangi bir yapısal deformasyonlar yumurtalık tür yöntemler sağlar. Sağlam yumurtalık 3D mimari görüntüleme için görüntü analiz yazılımı, bu çalışmada kullanılan Imaris yazılım paketi gibi bir doğru görüntü veritabanı sağlar.
Yumurtalık yetişkinlik boyunca remodeling dinamik bir fizyolojik sistemin ve bu yönetmelik angiogenez soruşturmalar için mükemmel bir model yumurtalık yapar. Ayrıca, polikistik over sendromu veya yumurtalık kanserleri gibi kadın üreme sisteminin patolojik koşullarında yumurtalık kan damarları rolünün değerlendirilmesi tüm yumurtalık dokusu görüntüleme aracılığıyla okudu. Pasif NETLİK yöntem geliştirilmesi ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı kullanımı olması koşuluyla detaylı mekansal bilgi kan damarları ve köklerinin gibi yumurtalık yapıları arasındaki ilişkileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan Etik Komitesi Shanghai Medical College, Bund'a Üniversitesi (onay numarası 20160225-013) yönergeleri takip etti.
1. şeffaf Mouse ovarium hazırlanması
-
Çözümler hazırlanması
- Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm (1 M, pH 7,6) % 0.1 ile hazırlamak Triton X-100 (PBST). 10 x PBS hisse senedi çözüm 1 L yapmak, 87 gram NaCl, NaH2PO4 · 3.1 g mix 2H2O ve 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. dH2O 1 L ve heyecan ~ 2 h. ayarlama pH 7.4 için 1 N NaOH ile ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Bu 10 x hisse senedi çözüm 1/10 tarafından seyreltik dH2O kullanarak ve % 0.1 yapın PBS Triton X-100.
- Mixings % (wt/vol) 4 paraformaldehyde (PFA) çözüm, %4 (wt/vol) Akrilamid, % 0.05 (wt/vol) bisacrylamide ve % 0.25 (wt/vol) VA-044 başlatıcı buz üzerinde çift distile suda hidrojel çözüm (pH 7.5) hazırlayın.
- Takas çözüm (pH 8,5) 200 mM sodyum Borat arabellek içeren %4 (wt/vol) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) çift distile su karıştırılarak hazır olun.
-
Transcardial perfüzyon ve yumurtalık hazırlık
- Buz üstünde tüm çözümleri tüm işlemler sırasında tutmak.
- Yetişkin kadın vahşi türü C57BL/6 fare mayi enjeksiyonu Fentobarbital (0.35 mg/kg) çözüm ile anestezi. Toe-çimdik yanıt gösterir sonra fare düzgün anestezi.
- Kullanım fare ile bacaklarda düzeltmek için bant bir düz köpük tahta üzerine uzanmış.
- Kalp makas ile bir kesik göğüs, cilt ve kemik xiphoid süreci tarafından ortaya çıkarmak.
- Hayvanın Sağ atrium içine bir kesi yapmak ve buz gibi 1 x PBS 10 mL/dk 20 mL ile sol ventrikül sıvı.
- En az 20 mL hidrojel çözeltisi 10 mL/dk hayvanla sıvı.
- Cilt medioventral hattı boyunca karın üzerinde bütün enterocoelia ortaya koyar, makas ile deşmek ve bağırsak kaldırın. Yumurtalık yumurtalık Morfoloji bütünlüğünü korumak için rahim toplamak.
- Mikroskop altında yumurtalık etrafında yağlı doku kaldırın.
-
Gaz Giderme
- 3 gündür fiksasyon için 4 ° C'de 10 mL hidrojel çözüm yumurtalıklar yerleştirin.
- Yumurtalık 5 mL tüp içine aktarmak ve tüp hidrojel çözüm ile doldurun. Parafilm tüp üst üzerinde streç ve sonra parafilm tüp boyun etrafında sarın.
Dikkat: hava kabarcığı yok parafilm ve hidrojel çözüm arasında olduğundan emin olun. - Bir shaker en fazla polimerize hidrojel izin vermek için 3 h 37 ° C'de kuluçka tüpü yerleştirin.
- Yumurtalık bir spatula kullanarak jel kaldır ve yumurtalık etrafında gelen jel aşırı doku kağıt tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. Yumurtalık dört kez 1 x PBS ile yıkayın.
-
Pasif takas
- 10 ml Temizleme çözüm yumurtalık daldırın. 37 ° C'de temizleme işlemini başlatmak için 80 rpm'de hafifçe sallayın.
- İlk haftasında 3 günde çözüm değiştirin. Bir hafta öncesine kadar yumurtalık açık olur sonra bir hafta sonra takas çözüm yenileyin. Genellikle bu süreç yaklaşık 2-3 hafta sürer.
Not: Yumurtalık immunostained olabilir doğrudan veya immunostaining önce birkaç hafta 4 ° C'de PBS içinde saklanabilir sodyum azid (%0.02).
2. Immunostaining
- Yumurtalık bir shaker olarak 37 ° C'de 1 günde iki kez PBST yıkayın.
- Bir shaker gün 2-3 37 ° C'de (Tablo 1) birincil antikorlar/PBST çözümünde tarihinde yumurtalık kuluçkaya İş burada, birincil antikorlar trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (CD31) sunuldu ve tirozin hidroksilaz sırasıyla 1:10 ve 1:50 PBST içinde seyreltilmiş.
Dikkat: birincil antikor iki veya daha fazla tür kullandıysanız, farklı hayvan kaynakları olduğundan emin olun. - PBST arabellek 37 ° C'de ile birincil antikorlar kapalı gün 4 bir shaker tarihinde yıkayın.
- Gün 5-6 bir shaker olarak 37 ° C'de PBST içinde istediğiniz ikincil antikorlar ile yumurtalık kuluçkaya. Burada sunulan çalışma, ikincil antikorlar tirozin hidroksilaz ve Alexa un 594 1:50 PBST de seyreltilmiş CD31 için Alexa un 488 içindi.
- PBST arabellek 37 ° C'de ile ikincil antikorlar kapalı bir shaker üzerinde 7 günü yıkayın.
- Doku Kırılma indisi homojenizasyon günde 8 için Kırılma indisi eşleşen çözüm içine aktarın. Kılavuz çizgilerini kılavuz çizgileri görülebilir olup olmadığını kontrol ederek onun görsel netlik kontrol etmek için bir kağıt doku koymak. Bir kez doku tam olarak açıklık vardır, yansıma.
- Sadece çevreler olabilir bir macun silindir doku yapmak ve bir at nalı Şekil şekil ve dış ridge bir cam slayt üzerine sıkıca kapalı bir yer açmak için tuşuna basın. Macun yüksekliğini yumurtalık biraz daha uzun olmalı.
- Açıklanan yumurtalık dikkatle macun ortasına yerleştirin ve Kırılma indisi çözüm eşleme ekleyin. Cam-alt çanak sıkıca macun koymak ve macun yemek düzeltmek için kullanın.
3. confocal mikroskobu
- Confocal mikroskop ile görüntüleme için uygun çalışma mesafesi (içinde bu durumda 2.0 mm) ile (Bu durumda su daldırma 25 X objektif lens, 1.1-NA, 2 mm-WD) lens "Ni-E" panelinde seçin.
-
"Satın alma" panelinde kanal sayısını seçin. Burada, üç kanal kullanın.
- İlk olarak, "göz port" sekmesini ve XY denetleyicisi joystick ile mikroskop göz mercekleri kontrol ederek alanın ortasına doğru doku taşımak için kullanın.
- Çekim ışığı kapatıp açtıktan sonra "lazer gücü", "HV (kazanç)", ayarlamak için "canlı" sekmesini tıklatın ve "ofset ' her biri için ayrı ayrı kanal. Yüksek lazer gücü ve HV daha yüksek sinyalleri açabilir ve daha yüksek ofset arka plan gürültü azaltabilir.
- Uygun "tarama boyutu" ve "Count" seçin. Tarama boyutu 1024 x 1024 µm2 ve 4-8 sayısını kullanın.
-
Doku derinliği panelinde tanımlamak için görüntü kalitesi "Z yoğunluğu düzeltme" ayarladıktan sonra ve sonra Yumurtalık (doku Center'da) en üst tabakası üzerinde objektif bulma ve üst katmanı edinmesinin ayarlama "artı" tıklayın üst katmanı tanımlamak için düğmesine basın.
- Lens aşağı taşı ve uygun HV ve lazer güç dokunun alt için ayarlayın ve en düşük katman bilgisi Z-yoğunluk düzeltme tabloya ekleyin. Bu ayar "ND edinme" paneli ile eşitlemek için "için ND" tıklayın.
-
İçinde "ND edinme" paneli, ilk seti tarama sayısını adımlar. O zaman, belgili tanımlık tabs "Z" ve "Büyük resmi" kene.
- Doku sınır doku görselleştirme yoluyla göz mercekleri yardımıyla göre alanın boyutu tanımlamak için "İnceden inceye gözden geçirmek büyük görüntü" penceresine gidin. Tarama alanının ("alanlar") boyutunu girip % 10 ve % 15 arasında örtüşme seçmek için "ND edinme" paneli geri dön.
- "Run Z düzeltme", "otomatik olarak uygun HV, lazer güç ve ofset her bir katman için ayarlamak ve görüntüyü işlemek beklemek değil çalışma şimdi",'ı tıklatın.
4. 3D imar bireysel köklerinin ve onların Vasculatures
- İlk olarak, ImageJ5 özgün NIS dosyasının açmak için kullanın. "Görüntü" düğmesini tıklatın ve "Renk" ve "Bölünmüş Kanallar" seçin. Ardından, "dosya" ve "Kayıt" "Görüntü sıralarını" seçeneğini kullanarak TIFF dosya serisi ayrı ayrı kanallar kaydedin.
- TIFF dosyası dizilerinde birini açmak için Imaris kullanın. "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ekle Kanallar" Seç gerisi kanalları eklemek için. Kanalın rengini ve adı "Ekran ayarlama" sekmeleri değiştirebilirsiniz. Doku kalınlığı "Düzenle" altında aşağı açılan listesinde "Görüntü özellikleri" panelinde düzeltilmesi gerekebilir.
- 3D son görüntüleri ve aşırı bölümleri kaldırılması kırpma için "Düzenle" düğmesini tıklayın ve "Ürün 3D" seçin. Alanın büyüklüğü kenarlığı sürükleyerek ayarlanabilir.
-
Gemi sinyalleri Surpass Masası'ndaki filamentler algoritması ile yeniden oluşturmak için yeni bir Filament oluşturmak ve İleri'yi tıklatın "Filamentler" düğmesini tıklatın.
- En büyük ve en ince çapı tanımlamak için "Dilim" Masası'na gidin ve izleme Taşıyıcıyı bulmak. Mesafe, "Ölçü" panelde iki noktada en büyük genişliğe geminin seçerek otomatik olarak gösterilecek.
- Tekrar "Surpass" Masası'na gidin ve ölçülen genişliği girin ve İleri'yi tıklatın.
- Başlangıç ve tohum noktası eşik ayarlayın. "Kamera" panelinde, "Seç". Bazı otomatik olarak üretilen küreler kaldırılması gerekiyorsa, Shift tuşunu basılı tutun ve üzerinde noktasını tıklatın. "Bul" seçme ve fareyi hareket ettirerek, yapısı doğru noktaları muhafaza edilmiştir ve İleri'yi tıklatın emin olmak için döndürülebilir.
- Yerel kontrast için en yüksek eşik seçin ve İleri'yi tıklatın. Değil "Tespit Spines" seçin ve kan damarı silindir yeniden inşası sonuçlandırmaya devam. Rengi "Renk" sekmesine tıklayarak düzenlenebilir. İstatistik verilerini yeniden oluşturulan Filament "İstatistik" panelinde elde edilebilir. Aşırı parça-ebilmek var olmak çıkarmak "Düzenleme" paneline.
Not: Toplam köklerinin veya Folliküler duvarlar ses düzeyini ölçmek için diğer algoritmalar kullanılabilir. Burada sunulan çalışma, yumurtalar her iki ikincil antikorlar autofluorescence tarafından işaretlenen. Büyük miktarda veri nedeniyle bir iş istasyonu sunucu veri analizi için kullanıldı.
5. istatistiksel analiz
Not: Görüntü analiz veri ± standart hataları aracı olarak sunulmaktadır.
- Bağımsız örnek t-testi kullanarak köklerinin arasında karşılaştırmalar yapmak ve Pearson korelasyon testi korelasyon katsayıları foliküler duvar ve kılcal damar uzunluğu karşılaştırmak için kullanın. P değeri < istatistiksel anlamlılık sınırı olarak 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz pasif yumurtalık foliküler ve vasküler mimari koruma ve damarları ve köklerinin etiketli işaretleri en yüksek floresan sinyal alma sırasında takas için hızlı ve basit bir yöntem pasif NETLİK yöntemi uyarlanmış. Foliküler damarlara 3D mimari CD31, endotel hücreleri6avans için immunostaining tarafından tespit edilmiştir. Yetişkin fareler yumurtalıklarda CD31 boyama Filament algoritmasıyla ve foliküler kılcal damarlar ve birincil ve ikincil foliküller (şekil 1) arasındaki karşılıklı ilişkileri gösterdi takip ettiler.
Yüzey algoritmaları ve nokta dönüştürme tirozin hidroksilaz-immunostained yumurta ve granulosa ve thecal Katmanlar algılamak ve köklerinin7,8toplam hacmini hesaplamak için kullanılmıştır. Köklerinin sıkıştırma nedeniyle, bazı bölümleri kırpılmış köklerinin yarı el ile tespit edilmiştir. Nokta dönüştürme bireysel foliküler birim ve yumurta ve foliküler duvar katmanların yüzey yeniden yapılanma ve gemilerin inşası Filament sonra bireysel foliküler vasculatures ve diğer arasındaki ilişkileri temizleyin ölçülen endeksi, özellikle granulosa ve thecal katman birimleri, (Şekil 2) tespit edildi.
Resim 1 : Bir bozulmamış yetişkin mouse ovarium yüksek çözünürlüklü görüntü adapte pasif NETLİK protokolü ile takas sonra. (A-B) Bölümler ve XYZ büyük-edinme inceden inceye gözden geçirmek. Üç boyutlu (3D) kesilmiş orta (C) ve birincil (D) köklerinin (üst satır) ve 3D yeniden kılcal damarlar, yumurta ve granulosa/thecal (alt satır) aynı folikül hücrelerinin Filament tarafından tanımlandığı gibi gösterilir yüzey, ve Nokta dönüştürme algoritmaları. Ölçek çubukları 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Birincil ve ikincil yumurtalık köklerinin ve onların vasculatures arasındaki ilişkileri karşılaştırmalı endeksleri. Oosit birim(a)foliküler birim ve yumurta nokta dönüştürme algoritması tarafından belirlenen bireysel folikülleri içinde 3D rekonstrüksiyonlar sonra ayıklandı ve (B) foliküler duvar birim yüzey tarafından belirlendi algoritma ve kılcal Filament algoritması tarafından takip edildi. Foliküler birim (C), oosit birim/kılcal uzunluğu oranı (D), foliküler duvar birim/kılcal uzunluğu oranı (E), foliküler birim/kılcal damar uzunluğu oranı (F), kapiller süre (saat) ve kılcal damar uzunluğu ve foliküler duvar hacim (G) korelasyon hesaplanan uygun araçları yazılım paketi kullanarak. Hata çubukları temsil eden standart hataları anlamına gelir. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Mouse ovarium ikincil köklerinin kılcal üç boyutlu rekonstrüksiyon. Bu ortaya (beyaz kareler göster alanı sınırları) köklerinin oosit yan üstüne içi boş bir boşluk. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışmada, kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki ilişkileri değerlendirmek için görüntüleme 3D tanıtacağız. Önceki çalışmalarda, aynı protokolü 9kullanarak rolleri büyük damarlara, köklerinin ve köklerinin olduğu gibi fare yumurtalık içinde konumunu arasındaki etkileşimler okudu. Pasif NETLİK yaklaşımı mikro ve makro vasculatures, folliculogenesis ve karşılıklı ilişkileri arasında corpora lutea ve köklerinin de yumurtalık mimarisi farklı gelişim dönemleri yeniden olarak çalışmaya izin verdi.
3D görüntü verileri olduğu gibi dokuların elde etmek için takas işleminin ilk önemli adımdır. İki ana strateji vardır — dehidratasyon ve hidrofilik reaktif tabanlı yöntemleri, pasif NETLİK10gibi. Su kaybı yöntemleri genellikle floresan sinyallerini azalmasına yol ve genellikle zehirli organik çözüm atık üretmek çünkü dikkatimizi pasif NETLİK yöntemi kullanmak için bazı adımlar çeşitli doku tipleri ile basitleştirilmesi üzerinde odaklanmıştır.
İlk kritik takas işleminin transcardial perfüzyon işlemdir. Perfüzyon sırasında kalp pompalama arka plan Floresans azaltmak için kan floş PBS ve hidrojel çözümün tüm vücut dolaşımda önemli bir rol oynar. Böylece, perfüzyon ameliyat doğru bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken ve hızlı bir şekilde hayvan hidrojel önce erken ölümü önlemek için tamamen hayvan dağıtılır. Tüm ajanlar buza tüm deneme sırasında Liang et al. tarafından belirtildiği gibi tutulmalıdır 11veya perfüzyon tamamlanmadan önce polimerize başlayacak. Önemli bir adım hidrojel kaldırıyor ve mümkün olduğunca çok fazla jel olarak antikorlar korur çünkü kaldırmak gereklidir. Doku temizlenir sonra takas çözümden kaldırıldı ve takas çözüm çok fazla zaman çok fazla protein kaybolmasına neden olacağından PBS 4 ° C'de depolanan gerekir. Confocal mikroskobu görüntülemede Z-ayarlar her zaman önce X-Y aralığı ayarlamanız gerekir. İlk önce X-Y aralığı ayarlarsanız, Z-ayarlar X-Y alanın tamamı eşitlenemiyor.
Pasif NETLİK ilk Yang vd tarafından kullanılmıştır 12 onların protokolündeki onlar perfüzyon adım gerçekleştirmedi ve bunun yerine azot ile degassed. Buna ek olarak, onların takas çözüm bisacrylamide hidrojel çözüme eklemek değil, onlar % 8 SDS takas çözümde kullanılan ve Kırılma indisi için medya eşleşen jantlar kullandılar. Bu yöntem daha sonra SDS konsantrasyon13artan, perfüzyon adım ve nitrojen içermeyen gaz giderme yordamı14ekleme ve PARS mPACT15gibi diğer Temizleme yöntemleri yöntemiyle birleştirerek tarafından geliştirildi. Burada, daha fazla iletişim kuralı transcardial perfüzyon birleştiren ve nitrojen içermeyen gaz giderme, % 4 takas çözümde SDS azalan ve FocusClear kırılma daha kaliteli sağlayan medya, eşleşen dizin olarak kullanarak geliştirdiğimiz mikroskopi görüntüler.
Pasif NETLİK sonra yumurtalık foliküler damarlara sağlam 3D mimari elde etmek için confocal multiphoton mikroskobu ve görüntü analizi gerçekleştirilebilir. Bu iletişim kuralı tarafından antikorlar16oluştururlar penetrasyon için uygun bir optik şeffaf hidrojel melezleşmiştir nanoporous formu ışığı geçirgen olduğu gibi yumurtalık dönüstürür. Klasik 2D Seksiyonel histolojik analizler pasif NETLİK ve belirli işaretleri ile boyama kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki bağlantıların 3D eşleme sağlar.
Yetişkin dokularda etkin vasküler remodeling ve anjiogenezi ağırlıklı oluşur yara iyileşmesi, kırık tamir, tümör ve metastaz oluşumları, retinopathies, fibroses ve romatoid artrit17gibi patolojik süreçler sırasında. Ancak, folliculogenesis sırasında döngüsel değişiklikler damarlara remodeling için benzersiz kapasite temsil eder. İkincil foliküller test oluşumu sonra foliküler sıvısı doldurur ve oosit olgunlaşma ve foliküler gelişim18için uygun bir microenvironment sağlayan oosit ferahlık veriyor. Önceki 2D çalışmaları Imaging yumurtalık köklerinin bir ağ kılcal granulosa olaraktan19ile çevrili gösterdi. Granulosa katman nonvascular ve her folikül kendi kılcal damarlar tarafından çevrilidir. CD31 önemli rol vasculogenesis6ile tutarlı, artış kılcal damar uzunluğu folliculogenesis birincil ikincil foliküller (rakamlar 2 g ve 2 H) geçiş sırasında bulduk. Yerine rasgele bir dağıtım kapiller çevresinde bireysel birincil veya ikincil foliküller kapiller 3D imar kılcal damar dalları folikülleri içinde dağıtılmış büyük köklerinin algılanabilir olduğunu gösterdi ve bunlar çoğu durumda kılcal damar dalları içi boş alan (şekil 3) kurdu.
Bir büyük endişe adapte yöntemi yumurtalık temizlemek için oldukça uzun bir zaman alır, ama uzun süre için en iyi etkisi temizlenmesi gereklidir. Biraz zaman kazanmak için tüm gerekli örnekleri aynı anda toplama ve temizlenen doku PBS ve %0.02 sodyum azid 4 ° C'de birkaç ay için saklanabilecek olan çünkü onları birlikte temizlemek öneririz. Çalışma mesafesi confocal mikroskop başka bir kısıtlamadır. Yüksek büyütme objektif lensler görüntüleme kalın örnekleri için bir engel olabilir daha kısa çalışma mesafeler var.
Birkaç protokol şeffaf ve sağlam dokular, BABB20, ölçek21, 3DISCO22, berrak23, SeeDB24, NETLİK16, pasif açıklık da dahil olmak üzere görüntüleme için ortaya konan (4 ya da hidrojel25), tüm yumurtalık dokusu temizlenmesi ve değerlendirme9PAKTI12, kübik26,27, FASTClear28ve aslında29, ama sadece üç tane kullanılmaya başlandı, 30,31. SeeDB30 ve ScaleA231 tüm yumurtalık dokuları görüntüleme için getirilmiştir, ancak bu iletişim kuralları yalnızca bir tek immunostaining adım. Pasif NETLİK, ancak, bu da çalışmanın ve bizim önceki çalışma9gösterildiği gibi birden fazla protein etiketleme reaksiyonlar için sağlar.
Sonuç olarak, foliküler katmanları ve kan damarları tamamen açıklık yumurtalık dokusu kullanarak 3D yapısal ilişkisi belirlenmesi için adapte bizim protokol angiogenez farklı yumurtalık hastalıkları gibi çalışmak için yeni bir yaklaşım sağlar polikistik over sendromu ve yumurtalık kanserleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Postdocs için hibe Çin Özel Fonu tarafından desteklenmiştir (YF için No 2014T70392), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (YF için No 81673766), yeni öğretmen Priming Fonu, Bund'a Üniversitesi Zuoxue temeli ve geliştirme Shanghai en yüksek disiplinleri İntegratif tıp (20150407) projesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N.
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
