Summary
Her præsenterer vi en tilpasning af den passive klarhed og 3D rekonstruktion metoden for visualisering af æggestokkene kar og follikulært kapillærer i intakt mus æggestokke.
Abstract
Æggestokken er det vigtigste organ i den kvindelige reproduktive system og er afgørende for produktion af kvindelige mælke og til at kontrollere det endokrine system, men komplicerede strukturelle forhold og tredimensionale (3D) Vaskulaturen arkitekturer for den æggestokken er ikke godt beskrevet. For at visualisere 3D forbindelser og arkitektur af blodkar i intakt æggestokken, er det første vigtige skridt at gøre æggestokken optisk klar. For at undgå væv svind, brugte vi hydrogel fiksering-baserede passiv klarhed (Ryd Lipid-udvekslet acrylamid-hybridiseret stiv Imaging / immunfarvning/In situ-hybridisering-kompatibelt væv Hydrogel) protokol metode til at klare en intakt æggestok . Immunfarvning, avancerede multiphoton Konfokal mikroskopi og 3D billede-rekonstruktioner blev derefter brugt til visualisering af æggestokkene fartøjerne og follikulært kapillærer. Brug denne fremgangsmåde, vi viste en signifikant positiv sammenhæng (P < 0,01) mellem længden af follikulært kapillærer og volumen af follikulært væggen.
Introduction
Hårsækken er den grundlæggende strukturelle og funktionelle enhed i æggestokkene, og dens udvikling er stærkt relateret til Vaskulaturen i æggestokken. Blodkar levere ernæring og hormoner til folliklerne og således spille en vigtig rolle i vækst og modning af folliklerne1.
En kombination af teknologier, herunder selektiv blodkar markører, transgene musemodeller og farmaceutisk udvikling, har øget vores viden om æggestokkene vaskulære netværk, angiogenese og funktionen af blodkar i folliculogenesis. Æggestokken er kendt som en aktiv orgel, fordi det bygger om forskellige væv og vaskulære netværk under folliculogenesis og ægløsning. Sådanne aktive remodeling i størrelse og struktur af fartøjer, der er nødvendig for den biologiske funktion af udvikle og rekruttere follikler.
Traditionelle histologiske og histomorphometric metoder ved hjælp af æggestokkene sektioner og immunolabeling af blodkar er begrænset til todimensionale (2D) billeder2. Med udviklingen af tre-dimensionelle (3D) genopbygning teknologier, 2D-billeder af væv skiver kan skal overlappe hinanden for at gøre en 3D struktur, men denne metode stadig har nogle begrænsninger-skæring af væv kan ødelægge mikrostrukturer, nogle dele af den væv er ofte mangler, og betydelig arbejdskraft er involveret i at gøre 3D rekonstruktioner fra billeder fås fra skiver. Hele-væv 3D imaging med Konfokal mikroskopi kan løse mange af disse begrænsninger, men disse metoder er begrænset til evaluering af angiogenese i embryonale æggestokken3. Ved hjælp af hele væv clearing metoder såsom klarhed4 kan øge den visualiseret volumen for at løse disse problemer i postnatal og voksen æggestokke, og sådanne metoder giver optisk clearance af æggestokken uden nogen strukturelle deformationer. Billeddannelse af intakt æggestokken 3D arkitektur giver en nøjagtig billeddatabase efter billede analyse software, som den Imaris softwarepakke anvendt i dette arbejde.
Ombygning af æggestokken gennem voksenalderen er en del af en dynamisk fysiologiske system, og det gør æggestokken en fremragende model for efterforskning af reguleringen af angiogenese. Desuden kan evaluering af æggestokkene blodkar rolle i patologiske betingelser for den kvindelige reproduktive system såsom polycystisk ovariesyndrom og æggestokkene kræftformer studeres gennem hele æggestokkene væv billeddannelse. Udviklingen af metoden passiv klarhed og anvendelse af avancerede billede analyse software har givet detaljerede geografiske oplysninger om relationer mellem blodkarrene og æggestokkene strukturer, såsom hårsække.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der involverer dyr fag fulgt retningslinjerne i den animalsk etiske komité på Shanghai Medical College, Fudan University (godkendelsesnummer 20160225-013).
1. forberedelse af gennemsigtige mus æggestok
-
Forberedelse af løsninger
- Forberede fosfatbufferet saltopløsning (PBS) opløsning (1 M, pH 7,6) med 0,1% Triton X-100 (PBST). For at gøre 1 liter 10 x PBS stamopløsning, mix 87 g NaCl, 3.1 g NaH2PO4 · 2H2O og 28,7 g Na2HPO4 ·12H2O. tilføje dH2O til 1 L og rør ~ 2 h. Juster pH 7,4 med 1 N NaOH og opbevares ved stuetemperatur. Fortynde denne 10 x stamopløsning af 1/10 ved hjælp af dH2O og derefter gøre 0,1% Triton X-100 i PBS.
- Forberede hydrogel løsning (pH 7,5) af mixings 4% (wt/vol) PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning, 4% (wt/vol) acrylamid, 0,05% (wt/vol) bisacrylamide og 0,25% (wt/vol) VA-044 initiativtager i dobbeltdestilleret vand på is.
- Forberede clearing løsning (pH 8,5) ved at blande 200 mM natriumborat buffer indeholdende 4% (wt/vol) sodium dodecyl sulfat (SDS) i dobbeltdestilleret vand.
-
Transcardial perfusion og æggestok forberedelse
- Holde alle løsninger på isen under alle procedurer.
- Bedøver voksne kvindelige vildtype C57BL/6 mus med en intraperitoneal injektion med pentobarbital (0,35 mg/kg) løsning. Når det viser ingen tå-knivspids svar, bedøvede musen korrekt.
- Brug klistret tape til at fastsætte mus med lemmer strakt ud på en flad foam bord.
- Udsætte hjertet af et snit på formet som et sværd processen gennem brystet, hud og knogler med en saks.
- Gøre et snit ind i dyrets højre atrium, og derefter perfuse venstre hjertekammer med 20 mL iskold 1 x PBS på 10 mL/min.
- Perfuse dyr med mindst 20 mL af hydrogel løsning på 10 mL/min.
- Incise huden over maven langs linjen medioventral med saks, som udsætter den hele enterocoelia, og fjern tarmen. Indsamle æggestokkene samt livmoderen for at bevare integriteten af æggestokkene morfologi.
- Fjern fedtvæv omkring æggestokkene under et mikroskop.
-
Afgasning
- Anbring æggestokkene i 10 mL hydrogel ved 4 ° C for fiksering i 3 dage.
- Overføre æggestokkene ind i et 5-mL-rør og fylde røret med hydrogel løsning. Strække parafilm over toppen af røret og så pak parafilm omkring halsen på røret.
Forsigtig: Sikre, at der ingen bobler mellem parafilm og hydrogel løsning. - Røret anbringes på en shaker i varmeskab ved 37 ° C i højst 3 h at tillade hydrogel at polymerisere.
- Fjerne æggestokken fra gel ved hjælp af en spatel, og fjern forsigtigt de overskydende gel fra omkring æggestokkene af silkepapir. Vask æggestokken fire gange med 1 x PBS.
-
Passiv clearing
- Dykke æggestokken i 10 mL af opløsningen, clearing. Ryst forsigtigt på 80 rpm ved 37 ° C til start clearing proces.
- I den første uge, ændre løsningen hver 3 dage. Efter en uge, opdatere clearing løsning når ugen indtil æggestokken bliver klar. Denne proces tager normalt omkring 2-3 uger.
Bemærk: Æggestokkene kan være direkte immunostained eller kan være gemt i natriumazid (0,02%) i PBS ved 4 ° C for flere uger før immunfarvning.
2. immunfarvning
- Vask æggestokken to gange i PBST på dag 1 ved 37 ° C på en shaker.
- Inkuber i æggestokkene på en shaker i primære antistoffer/PBST løsning (tabel 1) på dag 2-3 ved 37 ° C. I arbejde præsenteret her, de primære antistoffer var trombocyt-endotel celle vedhæftning molekyle 1 (CD31) og tyrosin hydroxylase fortyndet 1:10 og 1:50 i PBST, henholdsvis.
Forsigtig: Hvis to eller flere former for primær antistof er anvendt, sørge for der er forskellige animalske kilder. - Vaske de primære antistoffer med PBST buffer ved 37 ° C på dag 4 på en shaker.
- Inkuber æggestokken med de ønskede sekundære antistoffer i PBST på dag 5-6 ved 37 ° C på en shaker. I det arbejde, der er fremlagt her, var de sekundære antistoffer Alexa mel 488 til tyrosin hydroxylase og Alexa mel 594 for CD31 fortyndet til 1:50 i PBST.
- Vaske de sekundære antistoffer med PBST buffer ved 37 ° C på dag 7 på en shaker.
- Overføre vævet ind i brydningsindeks matchende løsning for brydningsindekset homogenisering på dag 8. Sætte væv på et papir med gitterlinjer at tjekke sin visuel klarhed ved at kontrollere, om gitterlinjer kan ses. Når vævet er afklaret, kan det være afbildet.
- Gøre en putty cylinder, der kunne bare omgiver væv, og derefter forme det ind i en hestesko form og tryk på den ydre højderyg tæt på et glas dias for at gøre en forseglet rum. Højden af kit bør være en smule højere end æggestokken.
- Placer klarede æggestokken omhyggeligt ind i midten af kit og tilføje brydningsindeks matchende løsning. Sætte en glas-bund fad over putty stramt og bruge putty for at løse parabol.
3. konfokalmikroskopi
- For billeddannelse med en Konfokal mikroskop, i panelet "Ni-E" Vælg linse (i dette tilfælde vand fordybelse 25 X mål linse, 1.1-NA, 2 mm-WD) med den korrekte arbejde afstand (i dette tilfælde 2,0 mm).
-
Vælg antallet af kanaler i panelet "Tilegnelse". Her brug tre kanaler.
- Brug først fanen "øje port" og XY controller joystick flytte vævet til midten af feltet ved at kontrollere gennem mikroskop okularer.
- Efter ombøjning ned af lukkeren lys, skal du klikke på fanen "live" for at justere "laser-magt", "HV (gevinst)", og "offset' for hver kanal adskilt. Højere laser power og HV kan føre til højere signaler, og højere forskydning kan reducere baggrundsstøj.
- Vælg korrekt "scanningsstørrelse" og "Tæller". Bruge en scanningsstørrelse 1024 x 1024 µm2 og en optælling af 4 til 8.
-
Efter indstilling billedkvalitet for at definere dybde af væv i panelet "Z intensitet korrektion", og efter at placere linsen på det øverste lag af æggestok (i midten af væv) og justere anskaffelsessum for det øverste lag, skal du klikke på "plus" knap til at definere det øverste lag.
- Flytte linsen og indstille passende HV og laser power til bunden af vævet og tilføje de laveste lagoplysninger i tabellen Z-intensitet korrektion. Klik på "ND til" for at synkronisere indstillingen med panelet "ND erhvervelse".
-
I "ND erhvervelse" panel, første sæt antallet af scanning trin. Derefter, kryds fanerne "Z" og "Store billede".
- Gå til vinduet "Scan store image" til at definere størrelsen på feltet efter grænsen af væv ved hjælp af væv visualisering gennem okularerne. Gå tilbage til "ND erhvervelse" panel til input størrelsen på scanningsområdet ("felter") og vælge overlapning mellem 10% og 15%.
- Klik på "Kør Z korrektion", ikke "Kør nu", at automatisk indstille korrekt HV, laser power og forskydning for hvert lag, og vente på billedet for at behandle.
4. 3D rekonstruktion af individuelle follikler og deres Vasculatures
- Brug først ImageJ5 for at åbne den oprindelige fil, NIS. Klik på knappen "Billede" og vælge "Color" og "Split kanaler". Derefter, klik på "File" og særskilt gemme kanalerne som tiff fil serien ved hjælp af indstillingen "Billedsekvenser" i "Gem som".
- Brug Imaris til at åbne en af tiff-fil-serien. Klik på "Rediger"-knappen og vælg "Tilføj kanaler" at tilføje resten af kanalerne. Navnet og farven på kanalen kan ændres under fanerne "Justeringen af skærmens". Tykkelsen af vævet måske skal korrigeres i panelet "Egenskaber for billede" i drop-down listen under "Edit".
- Den 3D beskæring af de endelige billeder og fjernelse af overskydende dele, klik på "Rediger"-knappen og vælge "Afgrøde 3D". Størrelsen af feltet kan justeres ved at trække grænsen.
-
Klik på knappen "Filamenter" for at oprette en ny glødetråd og klik på næste for at rekonstruere skibet signaler med filamenter algoritme i panelet overgå.
- For at definere den største og den tyndeste diameter, gå til panelet "Skive" og finde opsporing skib. Afstanden bliver automatisk vist på panelet "Foranstaltning" ved at vælge to punkter på den maksimale bredde af fartøjet.
- Gå tilbage til "Overgå" panel og input de målte bredde og klik på næste.
- Juster start og frø punkt tærskel. Vælg "Vælg" i panelet "Kamera". Hvis nogle af de automatisk produceret kugler skal fjernes, skal du trykke på Skift og klikke på punktet. Ved at vælge "Naviger" og omflytning mus, kan strukturen drejes for at sikre, at alle de korrekte punkter er bevaret, og klik derefter på næste.
- Vælg den højeste bundgrænse for den lokale kontrast og klik på næste. Ikke Vælg "Opdage pigge", og fortsætte med at færdiggøre genopbygningen af blodkar cylinder. Farven kan redigeres ved at klikke på fanen "Farve". De statistiske data kan udtrækkes i panelet "Statistik" i den rekonstruerede glødetråd. Overskydende dele kan fjernes i panelet "Rediger".
Bemærk: Andre algoritmer kan bruges til at måle mængden af samlede follikler eller follikulært vægge. I det arbejde, der er fremlagt her, var oocyter præget af autofluorescence af begge sekundære antistoffer. På grund af den store mængde af data, blev en arbejdsstation server brugt til dataanalyse.
5. statistisk analyse
Bemærk: Billede analyse data præsenteres som middel ± standardfejl.
- Udføre sammenligninger mellem folliklerne ved hjælp af uafhængige prøve t-test, og bruge Pearsons korrelation testen til at sammenligne korrelationskoefficienter follikulært væg og kapillær længde. Angiv en værdi af P < 0,05 som grænseværdien for Statistisk signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset metoden passiv klarhed i en hurtig og enkel metode til passiv æggestokken clearing samtidig bevare den follikulære og vaskulære arkitektur og opnå den højeste fluorescerende signal fra mærket markører af fartøjer og follikler. Follikulært Vaskulaturen 3D arkitektur blev fastsat ved immunfarvning for CD31, en markør i endothelial celler6. CD31 farvning i æggestokkene af voksen mus var spores ved hjælp af glødetrådens algoritme og viste indbyrdes forhold mellem follikulært kapillærer og primære og sekundære follikler (figur 1).
Stedet transformation og overflade algoritmer blev brugt til at registrere tyrosin hydroxylase-immunostained oocyter og granulosa og thecal lag og til at beregne det samlede rumfang af follikler7,8. På grund af komprimering af follikler, blev nogle dele af beskårede follikler identificeret semi-manuelt. Efter stedet transformation af enkelte follikulært volumen og oocyter og overflade genopbygning af follikulært muren lag og glødetrådens genopbygning af fartøjerne, klare relationer mellem individuelle follikulært vasculatures og den anden målte indeks, især granulosa og thecal lag diskenheder, blev observeret (figur 2).
Figur 1 : Høj opløsning imaging af en intakt voksen mus æggestok efter clearing med tilpasset passiv klarhed protokollen. (A-B) Sektioner og XYZ store-scan erhvervelse. Tre-dimensionelle (3D) beskåret sekundære (C) og primære (D) follikler (øverste række) og 3D rekonstrueret kapillærer, oocytter og granulosa/thecal celler af samme hårsækken (nederste række) er vist som identificeret af glødetråden, overflade, og Spot transformation algoritmer. Skalere barer = 200 µm (A-B), 50 µm (C), 30 µm (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Sammenlignende indeks af relationer mellem primær og sekundær ovariefollikler og deres vasculatures. Oocyt volumen (A) blev udtrukket efter 3D rekonstruktioner af follikulært volumen og oocyter i enkelte hårsække som fastlagt af Spot transformation algoritme, og follikulært væg volumen (B) var bestemt af overfladen algoritme og kapillærerne blev sporet af glødetrådens algoritme. Den follikulære volumen (C), oocyt volumen/kapillær længde ratio (D), follikulært væg volumen/kapillær længde forholdet (E), follikulært volumen/kapillær længde forholdet (F), den kapillære længde (H), og den Korrelation af kapillar længde og follikulært væg volumen (G) blev beregnet ved hjælp af passende værktøjer i software-pakke. Fejllinjer udgør standardfejl midler. n = 6; * P < 0,05; ** P < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tre-dimensionelle genopbygning af kapillærer i sekundære follikler af musen æggestokken. Dette afslører en hule rum over oocyt side af follikler (hvide firkanter Vis grænser af rummet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuelle undersøgelse præsenterer vi 3D imaging for at vurdere forholdet mellem kapillærer og individuelle voksende follikler. I vores tidligere arbejde ved hjælp af den samme protokol 9, studerede vi roller i store kar, interaktioner mellem follikler, og placeringen af follikler i intakt mus æggestokkene. KLARHED passivitet tillod os at studere mikro - og makro-vasculatures, folliculogenesis og indbyrdes forhold mellem corpora lutea og follikler samt at rekonstruere den æggestokkene arkitektur på forskellige udviklingsstadier.
For at få 3D-billeddata af intakt væv, er clearing processen det første vigtige skridt. Der er to vigtigste strategier — hydrofile reagens-baserede metoder, såsom passiv klarhed10og dehydrering. Fordi dehydrering metoder ofte fører til et fald i fluorescerende signaler og ofte producere giftige organiske løsning affald, har vi fokuseret på forenkle nogle trin i metoden passiv klarhed til brug med forskellige vævstyper.
Den første kritiske procedure i forbindelse med clearing er transcardial perfusion. Under perfusion spiller hjerte til at pumpe en vigtig rolle i hele kroppen omsætning af PBS og hydrogel løsning, der kan skylle ud blod for at formindske baggrund fluorescens. Dermed perfusion kirurgi bør udføres præcist og hurtigt for at undgå for tidlig død af dyret før hydrogel er helt fordelt over hele dyret. Alle agenser skal holdes på is under hele forsøget, som nævnt af Liang et al. 11, eller de vil begynde at polymerisere før perfusion er fuldført. Det næste vigtige skridt er at fjerne hydrogel, og det er nødvendigt at fjerne så meget overskydende gel som muligt, fordi det bevarer antistoffer. Når vævet er ryddet, skal den fjernes fra clearing løsning og gemt i PBS ved 4 ° C, fordi for meget tid i clearing løsning vil forårsage for meget protein til at være tabt. Konfokal mikroskopi imaging indstilles Z-indstillinger altid før rækken X-Y. Hvis X-Y-området ligger ned først, kan ikke Z-indstillinger synkroniseres til feltet hele X-Y.
Passiv klarhed blev først indført af Yang et al. 12 i deres protokol, de udføre ikke trinnet perfusion og i stedet afgasses med kvælstof. Derudover deres clearing løsning omfatter ikke bisacrylamide i opløsningen hydrogel, de anvendte 8% SDS i clearing løsning, og de brugte fælge for brydningsindekset matchende medier. Denne metode blev senere forbedret ved at øge SDS koncentration13, tilføje trinnet perfusion og den nitrogen-fri afgasning procedure14og kombinere metoden med andre clearing metoder såsom PARS-IRKNING15. Her, har vi videreudviklet protokollen ved at kombinere transcardial perfusion og nitrogen-fri afgasning, faldende SDS i clearing løsning til 4%, og ved hjælp af FocusClear som brydningsindekset matchende media, som giver bedre kvalitet mikroskopi billeder.
Efter passiv klarhed, kan Konfokal multiphoton mikroskopi og billede analyse udføres for at opnå den intakte 3D arkitektur af æggestokkene follikulært Vaskulaturen. Denne protokol forvandler en ikke-lys-gennemtrængelige intakt æggestokken til en optisk gennemsigtig hydrogel-hybridiseret nanoporous form, der er relevante for penetration af makromolekyler såsom antistoffer16. I modsætning til klassisk 2D Sektional histologiske analyser tillader passiv klarhed og farvning med specifikke markører 3D kortlægning af relationer mellem kapillærer og individuelle voksende follikler.
I voksent væv opstår aktiv vaskulære remodellering og angiogenese primært under patologiske processer såsom sårheling, fraktur reparation, tumor og metastase formationer, retinopathies, forårsaget og leddegigt17. Dog repræsenterer cykliske ændringer under folliculogenesis en enestående kapacitet til Vaskulaturen remodeling. Efter dannelsen af antrum i sekundære follikler, follikulært væske udfylder det og omgiver oocyt, der indeholder en egnet mikromiljø oocyt modning og follikulære udvikling18. Tidligere 2D billeddiagnostiske undersøgelser viste, at ovariefollikler er omgivet af et netværk af kapillærer i theca interna19. Granulosa lag er nonvascular, og hver follikel er omgivet af sine egne kapillærer. Overensstemmelse med den væsentlige rolle i CD31 i vasculogenesis6, vi fandt en stigning i kapillær længde under folliculogenesis i overgangen fra primær til sekundær follikler (tal 2 g og 2 H). I stedet for en tilfældig fordeling af kapillærerne omkring de enkelte primære eller sekundære follikler, 3D rekonstruktion af kapillærer viste, at kapillær afdelinger fordelt i follikler var påvises i større follikler, og i de fleste tilfælde disse kapillar grene dannet en hule rum (figur 3).
Én stor bekymring er tilpasset metoden tager relativt lang tid at fjerne æggestokken, at den lange tid er nødvendig for den bedste clearing effekt. For at spare tid, anbefaler vi indsamle alle de nødvendige prøver ad gangen og rydder dem sammen fordi de ryddede væv kan gemmes i PBS og 0,02% natriumazid ved 4 ° C i flere måneder. En anden begrænsning er arbejde afstand af Konfokal mikroskop. Højere forstørrelse målet linser har kortere arbejdstid afstande, som kunne være en hindring for billeddannelse af tyk prøver.
Flere protokoller er blevet indført for billeddannelse af gennemsigtige og intakt væv, herunder BABB20, skala21, 3DISCO22, ClearT23, SeeDB24, klarhed16, passiv klarhed (med4 eller uden hydrogel25), PAGTEN12, KUBISK26,27, FASTClear28, og faktum29, men kun tre af dem har været brugt til hele æggestokkene væv clearing og evaluering9, 30,31. SeeDB30 og ScaleA231 har været indført til billeddannelse af hele æggestokkene væv, men disse protokoller tillader kun en enkelt immunfarvning trin. Passiv klarhed, dog giver mulighed for flere protein-mærkning reaktioner, som vist i den nuværende undersøgelse og i vores tidligere undersøgelse9.
Afslutningsvis, giver vores tilpasset protokol til bestemmelse af 3D strukturelle forholdet mellem follikulært lag og blodkar ved hjælp af hele afklaret æggestokkene væv en ny tilgang til at studere angiogenese i forskellige æggestokkene sygdomme såsom polycystisk ovariesyndrom og æggestokkene kræftformer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra den kinesiske særlig fond for Postdocs (nr. 2014T70392 til YF), den National Natural Science Foundation of China (nr. 81673766 til YF), den nye lærer Priming fond, Fudan University Zuoxue grundlæggelse og udvikling Projekt af Shanghai Peak discipliner-Integrativ medicin (20150407).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
References
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
