Summary
Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het analyseren van calcium signalen in planten die zijn gegenereerd door het voeren van hemipteran insecten, zoals bladluizen. Arabidopsis thaliana getransformeerd met de GFP calcium biosensor GCaMP3 toestaan voor de real-time in vivo imaging van calcium dynamiek met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Abstract
Calciumionen wordt voorspeld dat de belangrijkste signalering entiteiten worden tijdens biotische interacties, met calcium signalering die een gevestigde deel uitmaken van de plant verdediging reactie op microbiële elicitors en tot verwonding veroorzaakt door het kauwen van insecten, aanleiding kunnen geven tot systemische calcium signalen in planten. De rol van calcium in vivo tijdens biotische stress is echter nog onduidelijk. Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch-gecodeerde calcium sensor calcium signalen in planten tijdens het voeden door een hemipteran plaag te detecteren. Hemipterans zoals bladluizen doorboren een klein aantal cellen met gespecialiseerd, langwerpige zuigende monddelen, waardoor ze de ideale tool om te studeren van calcium dynamiek wanneer een plant is geconfronteerd met een biotische stress, die zich onderscheidt van een verwonding reactie. Bovendien, fluorescerende biosensoren zijn een revolutie in de meting van de signalering moleculen in vivo in zowel planten als dieren. Uiting geven aan een GFP gebaseerde calcium biosensor, GCaMP3, in de model plant Arabidopsis thaliana zorgt voor de real-time beeldvorming van plantaardige calcium dynamiek tijdens insect voederen van dieren, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Een herhaalbare en robuuste assay is ontwikkeld met behulp van de fluorescentie microscopie van vrijstaande GCaMP3 bladeren, waardoor voor de continue meting van cytosolische calcium dynamiek vóór, tijdens en na het voederen van insecten. Dit blijkt een uiterst gelokaliseerde snelle calcium hoogte rond de bladluis voederen site die binnen een paar minuten optreedt. Het protocol kan worden aangepast aan andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten, terwijl het gebruik van Arabidopsis thaliana voorziet in de snelle generatie van mutanten te vergemakkelijken van de moleculaire analyse van het fenomeen.
Introduction
Calcium (Ca2 +) is een van de meest alomtegenwoordige signalering elementen in planten. Een tijdelijke stijging van cytosolische Ca2 + concentratie ([Ca2 +]cyt) is gedecodeerd door een complex netwerk van downstream-componenten en is betrokken bij het antwoord op beide abiotische en biotische onderstreept1,2. Een stijging van de [Ca2 +]cyt is één van de eerste reacties op microbiële elicitors, die een gemeenschappelijk deel uitmaken van de plant verdediging reactie3,4,5. Stijgingen van de [Ca2 +]cyt zijn ook waargenomen in reactie op de verwonding veroorzaakt door het kauwen van insecten, zoals vlinders6,7. Echter, de potentiële rol van plant Ca2 + signalen aanleiding om te leven van biotische bedreigingen die schade aan slechts een paar cellen toebrengen is niet onderzocht. De groene perzik bladluis Groene perzikluis is een hemipteran insect dat een belangrijke bedreiging voor de wereld landbouw8,9 vertegenwoordigt, en Ca2 + efflux van de extracellulaire ruimte is waargenomen in laat besmet met M. perzikluis10. Dit protocol schetst een robuuste en herhaalbare methode voor het meten van de plant Ca2 + signalen terwijl M. perzikluis feed van bladeren met behulp van een fluorescerende Ca2 + biosensor, met zowel bladluizen en GCaMP3 aanbod nieuwe hulpprogramma's waarmee de rol van Ca2 + ontleden tijdens biotische interacties.
CA2 +-selectieve microelectrodes waren voorheen gebruikt om te meten [Ca2 +] in planten11,12. Meer recentelijk hebben bioluminescente en fluorescerende benaderingen worden gestandaardiseerd. Deze biosensoren binden Ca2 + en het uitstralen van licht, waardoor voor un-paralleled kansen om te studeren van Ca2 + dynamiek in hele weefsels en cellen. CA2 + biosensoren kunnen worden geïnjecteerd als kleurstoffen of stabiel geproduceerd bij de invoering van de biosensor codering sequentie in het genoom van het organisme via transformatie (dat wil zeggen, genetisch gecodeerd biosensoren). De laatste biedt belangrijke voordelen van het gemakkelijk uitgedrukt in levend weefsel en subcellular localisatie13staat. Het aequorin eiwit, geïsoleerd van Aequorea victoria (kwallen) was de eerste genetisch gecodeerde Ca2 + biosensor ingezet in planten14. Als een bioluminescente eiwit vereist aequorin geen excitatie door externe licht, dat vermijdt chromofore bleken en autofluorescence15. Aequorin is met succes gebruikt om te meten [Ca2 +] fluxen in reactie op verschillende stimuli, met inbegrip van temperatuur16, ziekteverwekkers17,18,19, zout stress20 ,21, en verwonden7. Echter is het nadeel door de relatief lage signaal intensiteit, waardoor de detectie van [Ca2 +] fluxen in afzonderlijke cellen en weefsels met slechte sensor expressie moeilijk13.
De ontwikkeling van Ca2 + biosensoren die kunt lichten heeft aangevuld aequorin doordat voor gedetailleerde subcellular en weefsel-niveau analyse van Ca2 + dynamiek. Een van de meest voorkomende fluorescerende biosensoren zijn de energieoverdracht van de fluorescentie-resonantie (FRET)-op basis van Cameleons. FRET Cameleons zijn samengesteld uit twee proteïnen, meestal GVB en YFP, die in nauw contact met de conformationele verandering geïnduceerd door de binding van Ca2 + aan een Calmoduline domein in de regio van de linker GVB-YFP worden gebracht. Dit contact staat de overdracht van energie van GVB naar YFP, en de resulterende wijzigingen in de fluorescentie van deze fluorophores voorziet in de nauwkeurige kwantificering van [Ca2 +] door middel van de berekening van de verhouding van de signalen van de fluorescentie van de twee fluorophores22. FRET Cameleons zijn superieur aan aequorin en niet-ratiometric TL verfstoffen, zoals ze zijn dat minder beïnvloed door de mate van expressie van het eiwit23 en hebben vaak een grotere fluorescerende rendement, waardoor voor cellulaire en subcellular imaging23. Bijvoorbeeld, hebben FRET Cameleons onlangs gebruikt om te identificeren van interlokale Ca2 + signalen in planten en op te lossen op het cellulaire niveau24,25,,26.
Een recente doorbraak met fluorescerende GFP gebaseerde Ca2 + biosensoren is de ontwikkeling van biosensoren hooggevoelige single-fluorophore (single-FP). Single-FP biosensoren bestaan uit één circulair levenservaringen GFP gekoppeld aan een Calmoduline en M13 peptide, Ca2 + binden aan Calmoduline, wat resulteert in een water-gemedieerde reactie tussen Calmoduline en GFP dus over protonate GFP en verhoging van de fluorescerende opbrengst27,28,29. Single-FP sensoren bieden verschillende voordelen ten opzichte van de FRET Cameleons, met inbegrip van eenvoudiger proefopzet en een potentieel hogere temporele resolutie van30imaging. Hoewel één-FP sensoren kunnen niet absolute [Ca2 +] zo eenvoudig kwantificeren als FRET sensoren, ze zijn superieur voor de analyse van de dynamiek van het temporele en ruimtelijke van Ca2 + 5,23signalen. GCaMPs zijn een van de gevaar single-FP sensoren28 en hebben ondergaan verschillende wijzigingen ter verbetering van hun fluorescerende opbrengst, dynamisch bereik, Ca2 + affiniteit en signal-to-noise ratio's31,32 , 33 , 34. de GCaMPs hebben al met succes gebruikt in dierlijke systemen, zoals zebrafish motorische neuronen35 en fruit vliegen neuromusculaire kruispunten34. Willekeurige mutagenese van GCaMP3 heeft geresulteerd in extra klassen van single-FP sensoren, met inbegrip van de ultrasensitive GCaMP6-36 en de GECOs29. Het GECOs werden onlangs gebruikt in Arabidopsis thaliana (voortaan Arabidopsis genoemd) voor het meten van Ca2 + fluxen in reactie op de ATP, chitine en de bacteriële elicitor flg22. Deze studie toonde ook aan dat de R-GECO biosensor presteerde beter dan de FRET Cameleon YC3.6 in termen van maximale signaal verandering en signal-to-noise verhouding5.
Vanwege het gemak van gebruik, fluorescerende lucratieve en hoge temporele resolutie die kan worden bereikt met GCaMP biosensoren, was GCaMP3 genetisch gecodeerd in Arabidopsis onder de bloemkool mosaic virus 35S-promotor. De genetische tools beschikbaar voor Arabidopsis onderzoek toestaan voor de gedetailleerde moleculaire analyse van de Ca2 + signalen gemeten door GCaMP3. Daarnaast kan de GCaMP3 biosensor onder een fluorescentie Microscoop in plaats van een duurder confocal systeem worden gevisualiseerd. Dit protocol voorziet in geheel-weefsel imaging, essentieel zijn bij het uitvoeren van experimenten met live biotische onderstreept. Het experiment is zodanig ontworpen dat vrijstaande bladeren van 35S::GCaMP3 planten zijn zweefden in water, om te voorkomen dat insecten ontsnappen en te beperken vervoederen aan een specifieke weefsel. De methode die in dit document worden beschreven daarom voorziet in de analyse van blad Ca2 + dynamiek tijdens het voeden door M. perzikluis, wat resulteert in de karakterisering van een nieuwe plant signalering reactie. Deze methode kan ook worden aangepast om te werken met andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten en microbiële ziekteverwekkers, en met andere plantaardige weefsels, zoals wortels.
Protocol
1. voorbereiding van de plant (dagen 1 - 4)
- op dag 1, steriliseren 35S::GCaMP zaden met behulp van drie 75% ethanol wast, 1 min. per wasbeurt en plaat hen op 100 mm 2 vierkant plastic platen met ¼-kracht Murashige en Skoog (MS) medium (recept: 1,1 g van Murashige en Skoog medium, 7,5 g van sacharose, 10 g Formedium agar en 1 L-geïoniseerd water) 37.
- De zaailingen in het donker voor drie dagen bij 8 ° C tot het verkrijgen van synchrone kiemkracht stratificeren.
- Op dag 4 van het experiment, de zaailingen van de GCaMP te verplaatsen naar een gecontroleerde omgeving kamer (CER) bij 23 ° C, met een 16 h licht en 8u donkere fotoperiode.
2. Insect Rearing (dagen 11 - 12)
- op dag 11 van het experiment, 15 volwassen M. perzikluis voor 5 weken oude grond geteelde Arabidopsis planten met behulp van een vochtig artiest toevoegen ' s kwast (grootte 2 of 4) (gekweekt in een CER bij 22 ° C met 10 h licht en 14u donker photoperio d).
- Cage de bladluizen op de plant door het plaatsen van de doorzichtige plastic buis (10 x 15 cm) rond de plant en cap met een plastic dekseltje.
- Laat de bladluis-aangetaste planten gedurende 24 uur in een CER bij 22 ° C met een 16-h licht en 8-h donkere fotoperiode.
- Op dag 12 van het experiment, het verwijderen van alle volwassen M. perzikluis met behulp van een verfkwast.
Opmerking: Insecten kunnen worden gezien door de gaten van de plant. Dit geeft een bevolking van nimfen met een soortgelijke developmental leeftijd. Ongeveer 1 nimf per volwassene tijdens deze periode zal worden geproduceerd. - Laat de aangetaste planten in een lagere temperatuur CER bij 16 ° C, met een 8 h licht en 16u donkere fotoperiode, om te voorkomen dat de nimfen ook snel in omvang toeneemt.
3. Blad detachement (dag 19)
- op dag 19 van het experiment, de zaailingen van de 35S::GCaMP3 van het CER verwijderen en het grootste blad van elke plant met behulp van een paar scherpe schaar loskoppelen.
- Met behulp van een pincet, plaats de vrijstaande blad in het putje van een 96-wells-plaat met 300 µL van gedistilleerd water, abaxial oppervlak naar boven. Herhaal dit voor extra bladeren ( Figuur 1).
Figuur 1: 35S::GCaMP3 blad Assay. Het grootste blad van elk 16 dagen oude 35S::GCaMP3 Arabidopsis zaailing is vrijstaand en dreef op 300 µL van gedistilleerd water in een 96-wells-plaat. Foto genomen van overmorgen detachement. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- de afdekplaat in doorzichtige plastic wrap en aluminiumfolie en laat op kamertemperatuur 's nachts om de stress van het Detachement te laten verdwijnen.
4. fluorescentie microscopie (dagen 20 - 22)
- op dag 20 van het experiment, de 96-wells-plaat uit de aluminiumfolie te verwijderen en het overbrengen naar een fluorescentie stereomicroscoop. Configureren van de stereo fluorescentie Microscoop GFP prikkelen met een 450-490 nm licht en opnemen van de fluorescerende uitstoot tussen 500 en 550 nm.
- Verzamelen de leeftijd bladluizen uit de kolonie op dag 11 opgericht door het verwijderen van de plant uit de bodem en de plaatsing ervan in een transparante doos met een deksel. Houden van de insecten opgenomen in het vak terwijl het uitvoeren van het experiment.
- Plaats de 96-wells-plaat onder de Microscoop. Wijzig de blootstelling aan licht totdat de GCaMP3-fluorescentie kan duidelijk worden gevisualiseerd in de aderen van de vrijstaande bladeren. Houd de belichting constant voor alle experimenten; voor het huidige protocol, een 1-s blootstelling werd gebruikt met een winst van 3.5 ( Figuur 2).
- De vergroting en de zoom van de Microscoop aanpassen zodat 4 putten kunnen worden waargenomen in het ene frame; voor het huidige protocol, diende een 7,8 X vergroting en een focus van-127.833 mm.
- Een bladluis overbrengen in een vrijstaand blad onder de microscoop met een vochtige kwast. Laat een aangrenzende blad onbehandeld blijft als een besturingselement, maar licht aanraken met de verfkwast om na te bootsen het aanraken dat tijdens de overdracht van de bladluis optreedt. Vergeet niet om de plastic omslag terug aan de top de 96-wells-plaat tijdens microscopie om te voorkomen dat het insect ontsnappen.
- Beginnen met het opnemen van de fluorescentie van de bladeren in paren (1 bladluis behandeld en onbehandeld 1) door te klikken op " beginnen experiment " in de ingebouwde Microscoop software ( Figuur 2). Registreren van metingen voor 50 min.
Opmerking: voor het huidige protocol, een tijdsinterval van 5 s tussen metingen werd gebruikt. - Na 50 min, opname stoppen door te klikken op " experiment beëindigen " en de bladluis uit het blad verwijderen. De fluorescentie metingen opslaan als beeldbestanden (bijvoorbeeld TIFF tagged image file format,).
- Herhaal het experiment met verdere paren van bladeren; beeldvorming kan worden uitgebreid naar image 2 paar van bladeren tegelijk, waardoor voor de gelijktijdige beeldvorming van 2 genotypen.
5. Gegevensverzameling
- de afbeeldingsbestanden importeren in Fiji (afbeelding J) en hen omzetten van 32 bits door te klikken op " Image " > " Type " > " 32-bit; " Dit zorgt voor de omzetting van de beelden in heatmap video's (zie stap 7).
- Negeren de monsters waarin de bladluizen niet op één locatie waar meer dan 5 min regelen doen door het insect verkeer onder de Microscoop bekijken.
Nota: Dit is vaak de meerderheid van de monsters, en tot 100 behandelingen kan worden verplicht tot 30 monsters exposeren succesvolle afwikkeling vinden. - Ingesteld de metingsschaal pixels (of converteren naar mm, indien bekend) en het tijdsbestek op hetzelfde tijdsinterval zoals gebruikt tijdens de microscopie door te klikken op " Image " > " eigenschappen. "
- Met behulp van de cursor, een regio van belang (ROI) plaats rond het gebied van weefsel GFP p.a..
Opmerking: In het huidige protocol, werd een circulaire ROI 50 pixels (0,65 mm) in diameter gebruikt op 3 locaties van belang: de bladluis voederen site (Fs), een systemische regio op de hoofdnerf van het blad (Sm) en een systemische gebied grenzend aan de hoofdnerf (" lateraal weefsel " Sl) ( Figuur 2).- Maken de ROI door een ovaal tekenen (gebruik de " ovaal-tool "), en bewerken met behulp van de grootte " bewerken " > " selectie " > " opgeven. " Zie Figuur 2.
- Voor de onbehandeld controlegewas, selecteert u ROIs in vergelijkbare regio's van het blad aan die geselecteerd op het behandelde blad (dat wil zeggen, dezelfde regio van het blad als waar de bladluis gevoed op de behandelde blad) ( Figuur 2).
Figuur 2: analyseren van GCaMP3 fluorescentie onder de Microscoop. Links: onbehandeld controlegewas blad. Rechts: bladluis behandeld blad. De bladluis voederen site wordt aangegeven met een pijlpunt. Schaal bar = 1 mm. (A) helder veld afbeelding. Vergroting: 7.8 X, focus:-127.833 mm, blootstelling: 1 s. (B) GFP afbeelding kleurendng de ROIs gebruikt voor de kwantitatieve analyse van fluorescentie. FS = voederen site, Sm = systemische hoofdnerf, Sl = systemische laterale weefsel. Vergroting: 7.8 X, focus:-127.833 mm, blootstelling: 1 s. Het GFP werd opgewekt met behulp van een 450 tot 490 nm HQI-lamp en fluorescerende emissie werd gevangengenomen tussen 500 en 550 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- de Time serie Analyzer plugin gebruiken door te klikken op " Plugins " > " Time serie Analyzer " voor het analyseren van de waarden van de ruwe fluorescentie (F) in de ROI na verloop van tijd. Toevoegen van de ROI van belang (" toevoegen [t] "). Om ervoor te zorgen dat de ROI is geselecteerd, selecteert u " krijgen gemiddeld; " Dit geeft een tabel met F waarden voor elk frame in die ROI.
- Deze gegevens in een spreadsheet kopiëren.
- Berekenen van de oppervlakte van het voederen site signaal door eerst te selecteren met behulp van de regio de " freehand selectie gereedschap. " een overzicht van de maximale GFP-signaal en vervolgens het berekenen van de oppervlakte van deze vorm door te klikken op " analyseren " > " maatregel. "
- Bereken de snelheid van het voederen site signaal met behulp van de MTrackJ plugin door te klikken op " Plugins " > " Tracking " > " MTrackJ. "
- Klik op de " toevoegen " en klik vervolgens de cursor in het midden van het signaal wanneer het eerst zichtbaar is. Klik opnieuw op de rand van het signaal op het punt van verst gespreid. Klik op " maatregel " om te bereken de snelheid van het signaal.
6. Data-analyse
- definiëren het punt van bladluis oplossen door te spelen door de afbeeldingsframes van de Microscoop in Fiji.
Opmerking: De tijd om zich te vestigen is het frame waarin de bladluis in één enkele locatie voor 5 min of meer blijft. De duur van de beslechting van gebeurtenissen kan ook worden berekend op basis van de beelden in Fiji. - Normaliseren de F-gegevens (ΔF/F) volgens de vergelijking ΔF/F = (F - F 0) / f 0, waar F 0 de fluorescentie gemiddelde basislijn is berekend op basis van de gemiddelde waarde van F gedurende de eerste 60 frames van de opname vóór de bladluis geregeld. Herhaal dit voor de onbehandeld controlegewas.
- Plot de genormaliseerde GFP-fluorescentie (ΔF/F) na verloop van tijd voor dat ROI in het blad van behandeld en onbehandeld. Monsters (beide bladen) negeren als het onbehandeld controlegewas grote Ca 2 + transiënten (dat wil zeggen, ΔF/F stijgt boven 0,2 toont).
- Herhaal totdat ten minste 20-30 levensvatbare monsters hebben geanalyseerd per genotype.
7. Tijdsverloop Video schepping
- converteren de 32-bits afbeelding naar heatmaps met behulp van de plugin NucMed_Image LUTs bestanden door te klikken op " Plugins " > " NucMed " > " Lookup tabellen. " selecteren In het menu tabellen opzoeken " blauw groen rood " de beelden omzetten in warmte kaarten.
- Verfraaien het contrast van de heatmap Markeer de bladluis-ontlokte GFP signalen met behulp van " proces " > " contrast verbeteren " > " aanpassen verzadigde pixels %. "
- Toevoegen als u tijdinformatie de tijd Stamper-plug-in gebruiken door te klikken op " Plugins " > " tijd Stamper ". Stel de " begintijd " op " 0 " en de " interval " op basis van het tijdsinterval gebruikt voor de microscopie (bijvoorbeeld 5 s).
- Deze video exporteert als een audio video interleaved (AVI-bestand).
Opmerking: Deze video kan vervolgens worden bewerkt verder in andere softwarepakketten (bijvoorbeeld Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Figuur 3 en Figuur 4 zijn vertegenwoordiger resultaten van een experiment vergelijken een bladluis behandeld blad met een onbehandeld controlegewas. Een uiterst gelokaliseerde verhoging van fluorescentie GFP kan worden gezien rond het voederen site binnen een paar minuten in de meerderheid van de monsters, terwijl de Ca2 + dynamiek in het onbehandeld controlegewas blad verblijf relatief stabiel (figuur 3A en 3B). Het is ook mogelijk om te observeren secundaire verhogingen in GFP fluorescentie na de eerste piek in sommige experimenten (figuur 3B). Tot 50% van de behandelde bladeren, bladluizen, neem geen genoegen en de monsters moeten worden weggegooid. Van de monsters in welke afwikkeling plaatsvindt, vertonen 27% van de monsters geen duidelijke verhogingen in GFP fluorescentie rond het voederen site (Figuur 3 c en tabel 1); 25-30 monsters moeten daarom worden gemiddeld voor kwantitatieve analyse. Visualisatie van het gebied en de snelheid van het voederen site [Ca2 +]cyt hoogte moeten onthullen een signaal van ongeveer 110 µm reizen op 6 µm/s (tabel 1). Bovendien moeten geen [Ca2 +]cyt waterstand systemisch worden gedetecteerd binnen het blad op een bladluis behandeling, in de systemische hoofdnerf (figuur 4A) of de systemische laterale weefsel regio's (figuur 4B). Een representatieve steekproef vancyt dynamiek [Ca2 +] na verloop van tijd wordt weergegeven in de Video 1. Het is ook mogelijk om te analyseren van bladluis beslechting gedrag door het bijhouden van het aantal en de duur van afzonderlijke beslechting gebeurtenissen onder de Microscoop. Representatieve resultaten voor deze gedragingen worden weergegeven in tabel 1, waaruit blijkt dat de bladluizen ongeveer 10 min nemen voordat het einde, en als ze met succes regelen, dit gemiddeld gedurende 20 minuten duurt. Dus, de insecten worden afgewikkeld in een enkele locatie voor het geheel van decyt hoogte [Ca2 +].
Figuur 3: GCaMP3 kan worden gebruikt om te detecteren bladluis-ontlokte Ca2 + signalen op het voederen Site in vrijstaande verlaat. Links: vertegenwoordiger sporen (n = 30) van genormaliseerde GFP fluorescentie (ΔF/F) rond het voederen site van een 35S::GCaMP3 blad. De sporen weergeven 5 min voordat tot 25 min na afwikkeling Controle = equivalente locatie op een blad van onbehandelde 35S::GCaMP3 . Rechts: vertegenwoordiger stereomicroscoop afbeelding vancyt hoogte [Ca2 +] gezien rond een bladluis voederen site op een blad van de 35S::GCaMP3 . De fluorescentie GFP is kleurgecodeerde volgens de schaal inzet. De id van de bladluis geschetst in wit en de voeding site aangegeven met een pijlpunt. Vergroting: 7.8 X, focus:-127.833 mm, blootstelling: 1 s. Het GFP werd opgewekt met behulp van een 450 tot 490 nm HQI-lamp en de fluorescerende uitstoot tussen 500 en 550 nm werd gevangengenomen. (A) een voorbeeld van een grote bladluis-geïnduceerde [Ca2 +]cyt hoogte. (B) een voorbeeld van een gemiddelde bladluis-geïnduceerde [Ca2 +]cyt hoogte. (C) een voorbeeld van geen bladluis-geïnduceerde [Ca2 +]cyt hoogte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Met de parameter | Gemiddelde (± SEM) |
| [Ca2 +] CYT hoogte | |
| Percentage van de monsters worden getoond van eencyt hoogte [Ca2 +] | 73% |
| Snelheid van wave front een | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Maximale oppervlakte van de verspreiding | 110 µm2 (± 18) |
| Bladluis gedrag | |
| Aantal afwikkelt (> 5 min) | 2 (± 0,1) |
| Totaal aantal afwikkelt (duur) | 3.8 (± 0,4) |
| Tijd geregeld voor imaging- b | 20 min (± 2) |
| Tijd tot eerste settle c | 11 min (± 1.4) |
| Percentage van de totale tijd doorgebracht geregeld | 62% (± 3) |
Tabel 1: [Ca2 +]cyt hoogte en Parameters voor servergedrag bladluis tijdens 35S::GCaMP3 Imaging. Parameters berekend op basis van levensvatbare monsters in welke afrekening > 5 min is opgetreden. (A) snelheid van de zichtbaar signaal vanaf het punt van inleiding tot het verste punt van verspreiding. (B) de duur van de initiële beslechting gebeurtenissen die worden gebruikt voor de analyse van fluorescentie. (C) lengte van de tijd tussen het begin van beeldvorming en de eerste bladluis regelen. [Ca2 +] CYT hoogte gegevens eerder voorgelegd aan de plantaardige cel (huidige status: eerste QC).
Figuur 4: GCaMP3 niet wordt gedetecteerd door bladluis-ontlokte Ca2 + signalen systemische aan het voederen Site. Vertegenwoordiger sporen (n = 30) van genormaliseerde GFP fluorescentie (ΔF/F) op locaties aan de bladluis voederen site in systemische 35S::GCaMP3 verlaat. De sporen weergeven 5 min voordat tot 25 min na afwikkeling Controle = equivalente locatie op een blad van onbehandelde 35S::GCaMP3 . (A) ΔF/F in de regio van systemische hoofdnerf. (B) ΔF/F in de regio van systemische laterale weefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: GCaMP3 bloeien Over tijd als een bladluis Feeds. De fluorescentie GFP is kleurgecodeerde volgens de schaal inzet. De locatie van de bladluis voederen site wordt aangegeven met een pijlpunt. Links: 35S::GCaMP3 blad blootgesteld aan een M. perzikluis volwassen. Rechts: Een 35S::GCaMP3 neen-bladluis controle blad. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Discussion
De in dit document beschreven methode voorziet de real-time analyse van plant Ca2 + signalering tijdens een biotische stress zoals insecten voeden. Het toont aan dat een van de eerste reacties van de plant op dergelijke bedreigingen een gelokaliseerde [Ca2 +]cyt hoogte rond het voederen site van het insect is. Door het gebruik van mutanten, deze methode zal toestaan voor de de moleculaire en fysiologische karakterisatie van dergelijke signalen, die niet eerder mogelijk was. Een cruciale stap in dit protocol is te zorgen dat de vrijstaande bladeren niet overdreven gestoord zijn tijdens het detachement (stap 3.2) of bij het overbrengen van insecten naar de bladeren (stap 4.5). Gezien het feit dat het huidige protocol een relatieve meting van [Ca2 +]cyt in plaats van een absolute concentratie biedt, is het essentieel dat de instellingen van de Microscoop, worden gedurende het gehele experiment constant gehouden. Er is ook het potentieel voor menselijke bias tijdens de selectie van ROIs en de analyse van de gegevens, en als zodanig, is het raadzaam dat de experimenten zijn uitgevoerd dubbelblinde.
Er zijn verschillende belangrijke voordelen van meten [Ca2 +]cyt tijdens biotische stress met dit protocol. Eerst, kan het gebruik van een enkele fluorophore met een hoge opbrengst te TL de beeldvorming worden uitgevoerd op een stereomicroscoop, die is minder kostbaar dan het gebruik van een confocal microscoop. Het gebruik van een enkele fluorophore maakt ook gegevensverzameling en analyse eenvoudig, aangezien er slechts één meting om te registreren. Bovendien is het gebruik van een stereomicroscoop zorgt voor de beeldvorming van hele bladeren, die essentieel is, gezien het feit dat vele biotische interacties, met inbegrip van plant-bladluis interacties, op grote ruimtelijke schaal optreden. De hoge temporele resolutie van de afbeelding mogelijk met GCaMP3, gebaseerd op de snelle scheiding van Ca2 + van de sensor na bindende23,30 en de TL hoogrentende vangen, voorziet van de metingen te nemen tot elke 5 s. Bovendien, de blad-bepaling voorkomt het ontsnappen van het insect, een sleutel beperken stap naar dergelijke experimenten op hele planten (in voorbereiding). De vrijstaande bladeren er ook voor zorgen dat het insect vanaf een vooraf gedefinieerde locatie voedt, waardoor voor de analyse van Ca2 + dynamiek vóór, tijdens en na de voeding. Dit protocol zorgt er ook voor dat de bladeren van soortgelijke ontwikkelingsstadia worden gebruikt voor analyse.
Het grootste nadeel van dit protocol is afkomstig van het gebruik van een niet-ratiometric biosensor. Met single-FP biosensoren, kan variatie in GFP emissie voortvloeien uit experimentele variabelen dan [Ca2 +]cyt, zoals veranderingen in cellulaire pH, beweging of het niveau van de expressie van de biosensor. Deze kwesties zijn niet ondervonden met FRET Cameleons tijdens FRET, zoals de overdracht van energie van GVB naar YFP treedt alleen op bij Ca2 + bindend. Andere voorwaarden die de fluorescerende eigenschappen van de individuele fluorophores wijzigen zijn onwaarschijnlijk om na te bootsen de conflicterende wijzigingen in de intensiteit van het GVB en YFP, en de berekening van de ratiometric die inherent wordt gebruikt normaliseert de metingen voor veel van deze andere optische artefacten23,30. Dit maakt de schattingen van de absolute [Ca2 +]cyt betrouwbaarder met FRET Cameleons. Bijgevolg, GCaMP3 het best gebruiken als een biosensor voor het meten van relatieve [Ca2 +]cyt, hoewel er nog steeds voldoende om te detecteren en karakteriseren van biologische fenomenen in planten5,(in preparation). Het is daarom essentieel om besturingselementen te gebruiken om te laten zien dat de waargenomen effect veroorzaakt door Ca2 + wordt, met inbegrip van Ca2 +-gerelateerde genetische mutanten(in voorbereiding) of farmacologische Ca2 + kanaal remmers zoals La3 + . Nog belangrijker is, weer single-FP biosensoren meestal een grotere fluorescerende rendement en een groter dynamisch bereik (dat wil zeggen, een toename van bloeien op Ca2 + bindende) dan FRET Cameleons23, waardoor de GCaMP meer geschikt voor weefsel-niveau imaging, terwijl FRET Cameleons een nuttig instrument voor cellulaire beeldbewerking met een confocal microscoop5,25 vormen.
Tijdens de uitvoering van dit protocol is het mogelijk dat sommige kwesties waarvoor het oplossen van problemen zullen ontstaan. Bijvoorbeeld, is het raadzaam dat monsters waarin het besturingselement (onbehandeld) blad bevat grote [Ca2 +]cyt waterstand zich bevinden verwijderd (stap 6.3). Dergelijke transiënten zijn waarschijnlijk het gevolg van stress veroorzaakt door de microscopie. Inderdaad, blauw licht is bekend te ontlokken van Ca2 + signalen38,39,40,41, en de hoge intensiteit licht kan ook resulteren in temperatuur en osmotische benadrukt, die beide ook uitlokken [Ca2 +]cyt waterstand21,25,42. Daarom, ter beperking van dergelijke benadrukt, is het belangrijk om uit te voeren van het experiment in een goed geventileerde en temperatuurgevoelig kamer en om te voorkomen dat onnodig lange belichtingstijden. Het is ook belangrijk dat het niet verstoren van de bladeren overdreven tijdens detachement of tijdens de microscopie ter voorkoming van touch-ontlokte [Ca2 +]cyt waterstand43,44,45. Problemen kunnen ook optreden met insect regelen. Met M. perzikluis, doen de insecten niet vestigen op de bladeren in verschillende monsters. Dit zou een gevolg van wond-ontlokte verdediging in de vrijstaande bladeren46,47, of de verstoring van de insecten door het blauwe licht. Inderdaad, visie in M. perzikluis wordt beheerst door drie researchdieren, waarvan één met een piek gevoeligheid van 490 nm48. De microscopie blootstelling te beperken en de behandeling van de bladluizen met zorg kunnen verminderen van nood en moedigen regelen.
Het protocol beschreven in het huidige document geeft nieuwe inzichten op het moleculaire begrip van plant-insect interacties en de reactie van de plant op biotische stress. Het stelt voor de visualisatie van een van de eerste reacties van de plant op het voederen van insecten, en vergemakkelijkt verder onderzoeken door middel van de aanzienlijke Arabidopsis genetische hulpbronnen beschikbaar. Bovendien, dit protocol voorziet in het gebruik van levende organismen, in tegenstelling tot extraheert49 of elicitors50. Deze techniek kan in de toekomst worden toegepast op andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten nematoden en microbiële ziekteverwekkers, alsmede op abiotische benadrukt. De microscopie van GCaMP3 kan ook worden gewijzigd naar image andere plantaardige weefsels, alternatieve ROIs op het blad, of zelfs hele planten. Bovendien, er is het potentieel voor de biosensor als genetischely gecodeerd in extra plantensoorten. Bijgevolg, het protocol beschreven in dit document heeft de potentie om undercover de moleculaire basis van Ca2 + signalering in een bereik van roman biotische interacties tussen planten en andere soorten.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang te verklaren.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) voor naar de raadgeving over microscopie. De auteurs ook bedank het John Innes Centre tuinbouw en entomologie afdelingen voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door een PhD studententijd van het John Innes Foundation (T.V.), het verlenen van B/JJ004561/1 van de BBSRC en de John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. en D.S.), een jaar in de industrie plaatsing van het John Innes Centre (M.A.) , een zomer studententijd van de biochemische Society of de UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) en subsidies MCB 1329723 en IOS-1557899 van de National Science Foundation (M.T. en S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
