Summary
Este protocolo descreve um método simples para análise de sinais de cálcio em plantas geradas pela alimentação hemipteran insetos, como pulgões. Arabidopsis thaliana transformada com o biosensor de cálcio GFP GCaMP3 permitem a imagem em tempo real na vivo da dinâmica de cálcio com alta resolução temporal e espacial.
Abstract
Íons cálcio estão previstos para ser entidades de sinalização chaves durante interações bióticas, com sinalização de cálcio formando uma parte estabelecida da resposta de defesa a planta elicitores microbianas e ferimento causado por mastigar insetos, suscitando cálcio sistêmico sinais nas plantas. No entanto, o papel do cálcio na vivo durante o estresse biótico é ainda incerto. Este protocolo descreve o uso de um sensor de cálcio geneticamente codificado para detectar sinais de cálcio nas plantas durante a alimentação por uma praga hemipteran. Hemipterans tais como afídios perfuram um pequeno número de células com especializado, alongada chupando bucais, tornando-os a ferramenta ideal para estudar a dinâmica de cálcio quando uma planta é confrontada com um estresse biótico, que é distinto de uma resposta ferindo. Além disso, biosensores fluorescentes estão revolucionando a medição de sinalização moléculas na vivo em animais e plantas. Expressar um biossensor baseado em GFP cálcio, GCaMP3, na planta modelo Arabidopsis thaliana permite para o tratamento de imagens em tempo real da dinâmica de cálcio planta durante a alimentação, com uma alta resolução espacial e temporal de insetos. Um ensaio repetível e robusto foi desenvolvido utilizando a microscopia de fluorescência de desanexado folhas de GCaMP3, que permite a medição contínua da dinâmica de cálcio citosólico antes, durante e após a alimentação do inseto. Isto revela uma elevação de cálcio rápida altamente-localizada em torno do afídio alimentação local que ocorre em poucos minutos. O protocolo pode ser adaptado a outros estresses bióticos, tais como espécies de insetos adicionais, enquanto o uso de Arabidopsis thaliana permite a rápida geração de mutantes para facilitar a análise molecular do fenômeno.
Introduction
Cálcio (Ca2 +) é um dos elementos mais onipresentes sinalização em plantas. Um aumento transitório da concentração de Ca2 + citosólico ([Ca2 +]cyt) é decodificado por uma complexa rede de componentes downstream e está envolvido na resposta para ambos os estresses bióticos e abióticos1,2. Um aumento de [Ca2 +]cyt é uma das primeiras respostas de elicitores microbianas, formando uma parte comum da planta defesa resposta3,4,5. Também foram observados aumentos [Ca2 +]cyt em resposta ao ferimento causado por mastigar insetos, tais como lepidópteros6,7. No entanto, o papel potencial da planta Ca2 + sinais em resposta a ameaças bióticas que causar danos ao apenas algumas células de viver não tem sido explorado. O verde pêssego pulgão Myzus persicae é um inseto hemipteran que representa uma ameaça significativa para o mundo da agricultura8,9, e Ca2 + o efluxo de espaço extracelular tem sido observado em folhas infestadas com M. persicae10. Esta descreve protocolo um método robusto e repetível de medição planta Ca2 + sinais enquanto M. persicae alimentar das folhas usando um fluorescente biosensor de Ca2 + , com pulgões e GCaMP3 oferta de novas ferramentas com as quais disse o papel de Ca2 + durante as interações bióticas.
CA2 +-seletivos microeletrodos anteriormente foram usados para medir [Ca2 +] em plantas11,12. Mais recentemente, abordagens bioluminescentes e fluorescentes tem-se padronizado. Estes biosensores vincular Ca2 + e emitem luz, permitindo a un-paralelizadas oportunidades para estudar a dinâmica de Ca2 + em células e tecidos. Biossensores de CA2 + podem ser injetados como corantes ou estàvel produzidas mediante a introdução do biosensor sequência no genoma do organismo através de transformação (ou seja, geneticamente codificado biosensores) de código. O último oferece grandes vantagens de ser facilmente expressa em tecido vivo e capaz de Localização subcellular13. A proteína aequorin, isolada de Aequorea victoria (água-viva) foi o primeiro geneticamente codificado Ca2 + biosensor implantado em plantas14. Como uma proteína bioluminescente, aequorin não requer excitação pela luz externa, o que evita o cromóforo branqueamento e autofluorescência15. Aequorin tem sido usada com sucesso para medir fluxos [Ca2 +] em resposta a vários estímulos, incluindo temperatura16, patógenos17,18,19, sal stress20 ,21e ferindo7. No entanto, isso é desfavorecido pela intensidade sinal relativamente baixo, tornando a detecção de fluxos [Ca2 +] em células individuais e de tecidos com sensor pobre expressão difícil13.
O desenvolvimento de Ca2 + biossensores que pode fluorescem tem complementado aequorin permitindo para análise detalhada subcellular e tecidos-nível da dinâmica de Ca2 + . Dentre os biosensores fluorescentes mais comuns são a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET)-com base em Cameleons. FRET Cameleons são compostos de duas proteínas, normalmente PCP e YFP, que são trazidos no contato próximo pela mudança conformacional induzida pela ligação de Ca2 + para um domínio de calmodulina na região de vinculador YFP-PCP. Este contacto permite a transferência de energia de PCP para YFP, e a mudança resultante na fluorescência destes fluorophores permite a quantificação exata de [Ca2 +] através do cálculo do rácio dos sinais de fluorescência dos dois Fluorophores22. FRET Cameleons são superiores aos corantes fluorescentes aequorin e não-ratiometric, como eles são que menos afetados pelo nível de expressão da proteína23 e muitas vezes têm um maior rendimento fluorescente, permitindo a imagem celular e subcellular23. Por exemplo, FRET Cameleons tem sido recentemente utilizados para identificar o Ca2 + sinais de longa distância em plantas e para resolver estas para o celular nível24,25,26.
Uma descoberta recente com fluorescente GFP-baseado Ca2 + biosensores tem sido o desenvolvimento de biossensores single-fluoróforo altamente sensível (single-FP). Single-FP biosensores consistem em uma única circular permutated GFP associada a calmodulina e peptídeo M13, Ca2 + vinculando a calmodulina, resultando em uma reação mediada por água entre calmodulina e GFP tão quanto protonate GFP e aumento 28,de27,rendimento fluorescente29. Single-FP sensores oferecem várias vantagens sobre o traste Cameleons, incluindo o desenho experimental mais simples e uma potencialmente maior resolução temporal de imagens,30. Embora single-FP sensores não podem quantificar absoluto [Ca2 +] como simplesmente como sensores FRET, eles são superiores, para a análise da dinâmica espacial e temporal de Ca2 + sinais5,23. GCaMPs um do melhor single-FP sensores28 e que foram objecto de várias revisões para melhorar seu rendimento fluorescente, gama dinâmica, afinidade de Ca2 + e sinal-ruído rácios31,32 , 33 , 34. o GCaMPs foram usados com sucesso em sistemas de animais, tais como zebrafish neurônios motores35 e fruta voa junções neuromusculares34. Mutagénese aleatória de GCaMP3 resultou em classes adicionais de single-FP sensores, incluindo o ultra-sensível GCaMP636 e o GECOs29. Os GECOs recentemente foram usados em Arabidopsis thaliana (doravante referido como Arabidopsis) para medir fluxos de Ca2 + em resposta a ATP, quitina e o flg22 de elicitor bacteriana. Este estudo também demonstrou que a biosensor R-GECO superou o traste Cameleon YC3.6 em termos de sinal máxima mudança e sinal-ruído relação5.
Devido à facilidade de uso, fluorescente de alto rendimento e alta resolução temporal que pode ser conseguida com GCaMP biosensores, GCaMP3 foi geneticamente codificado em Arabidopsis sob promotor do vírus do mosaico da couve-flor 35S. As ferramentas de genéticas disponíveis para a investigação de Arabidopsis permitem a análise molecular detalhada de Ca2 + sinais medidos por GCaMP3. Além disso, o biosensor de GCaMP3 pode ser visualizado sob um microscópio de fluorescência, ao invés de um sistema mais caro e confocal. Este protocolo permite todo-tecido de imagem, essencial quando conduzindo experimentos com estresses bióticos ao vivo. O experimento é projetado tais que desanexados folhas de plantas de 35S::GCaMP3 estão flutuando na água, para evitar a fuga de insetos e para restringir a alimentação de um tecido específico. O método descrito neste artigo, portanto, permite a análise de folha dinâmica de Ca2 + durante a alimentação por M. persicae, resultando na caracterização de uma planta nova sinalização resposta. Esse método também pode ser adaptado para trabalhar com outros estresses bióticos, como outras espécies de insetos e patógenos microbianos e com outros tecidos vegetais, tais como raízes.
Protocol
1. preparação da planta (dias 1 - 4)
- no dia 1, esterilizar 35S::GCaMP sementes usando três lavagens de etanol 75%, 1 min por lavagem e placa-los em 100 mm 2 quadrados placas plásticas com ¼-força Murashige e Médio de Skoog (MS) (receita: 1,1 g do meio de Murashige e Skoog, 7,5 g de sacarose, 10 g de ágar de Formedium e 1 L de água deionizada) 37.
- Estratificar as mudas no escuro por três dias a 8 ° C, para obter a germinação síncrona.
- No dia 4 do experimento, mover as mudas de GCaMP para uma sala de ambiente controlado (CER) a 23 ° C, com um fotoperíodo escuro 16 h luz e 8 h.
2. Crescimento de insetos (dias 11 - 12)
- no dia 11 do experimento, adicionar 15 adultos M. persicae a 5 semanas de idade solo cultivado Arabidopsis plantas usando uma artista úmida ' s pincel (tamanho 2 ou 4) (crescido em uma CER a 22 ° C, com 10 h luz e 14 h photoperio escuro d).
- os pulgões na planta da gaiola, colocando o tubo de plástico transparente (10 x 15 cm) em torno da planta e a tampa com uma tampa de plástico.
- Deixar as plantas infestadas afídio para 24h em uma CER a 22 ° C com um 16-h luz e o fotoperíodo escuro 8-h.
- No dia 12 do experimento, remover todos os adultos de M. persicae usando um pincel.
Nota: Os insetos podem ser vistos pelo olho na planta. Isto dá uma população de ninfas com uma idade de desenvolvimento similar. Aproximadamente 1 ninfa por adulto será produzida durante este período. - Deixar as plantas infestadas em uma CER de temperatura inferior a 16 ° C, com um 8 h luz e 16 h escuro fotoperíodo, para impedir que as ninfas aumentando de tamanho muito rapidamente.
3. Folha de desprendimento (dia 19)
- no dia 19 do experimento, retire as mudas de 35S::GCaMP3 do CER e desanexar a maior folha de cada planta, usando um par de tesouras afiadas.
- Usando um par de pinças, coloque a folha destacada dentro do poço de uma placa de 96 poços contendo 300 µ l de água destilada, abaxial superfície voltada para cima. Repita para folhas adicionais ( Figura 1).
Figura 1: ensaio de folha de 35S::GCaMP3. A maior folha de plântulas de Arabidopsis cada 16 dias atrás 35S::GCaMP3 é desanexada e flutuavam em 300 µ l de água destilada em uma placa de 96 poços. Foto tirada no dia após o desprendimento. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- cobrir a placa em envoltório plástico e papel alumínio e deixe à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o estresse do destacamento a diminuir.
4. microscopia de fluorescência (dias 20 - 22)
- no dia 20 do experimento, retire a placa de 96 poços da folha de alumínio e transferi-lo para um microscópio de fluorescência. Configurar o microscópio de fluorescência estéreo para excitar GFP com lume de 450-490 nm e capturar a emissão fluorescente entre 500 e 550 nm.
- Recolher os pulgões envelhecidos da colônia estabelecida no dia 11, retirando a planta do solo e colocá-lo em uma caixa transparente com uma tampa. Manter os insetos contidos na caixa durante a realização do experimento.
- Coloque a placa de 96 poços sob o microscópio. Altere a exposição à luz, até que a fluorescência de GCaMP3 pode ser visualizada claramente nas veias das folhas isoladas. Manter a exposição constante para todos os experimentos; para o protocolo atual, utilizou-se uma exposição de 1-s com um ganho de 3,5 ( Figura 2).
- Ajustar a ampliação e o zoom do microscópio tal que 4 poços podem ser observados em um quadro; para o protocolo atual, utilizou-se 7.8 X ampliação e um foco de-127,8330 mm.
- Transferir um afídio para uma folha isolada sob o microscópio, usando um pincel úmido. Deixar uma folha adjacente não for tratada como um controle, mas levemente tocá-lo com o pincel para imitar o toque que ocorre durante a transferência de pulgão. Não esqueça de colocar o envoltório plástico volta em cima da placa de 96 poços durante a microscopia para impedir que os insetos escapem.
- Começar a gravação de fluorescência das folhas em pares (1 pulgão-tratados e 1 não tratado), clicando em " começar o experimento " no software interno do microscópio ( Figura 2). Registro de medições de 50 min.
Nota: para o protocolo atual, um intervalo de tempo de 5 s entre medições foi usado. - Depois de 50 min, parar a gravação clicando no " parar o experimento " e remover o pulgão da folha. Salve as medições de fluorescência como arquivos de imagem (por exemplo, etiquetado imagem formato de arquivo, TIFF).
- Repetir o experimento com mais pares de folhas; imagem latente pode ser estendido para 2 pares de folhas de imagem ao mesmo tempo, permitindo a imagem simultânea de 2 genótipos.
5. Coleta de dados
- importar os arquivos de imagem para Fiji (Image J) e convertê-los para 32 bits clicando no " imagem " > " tipo " > " de 32 bits; " isto permite a conversão das imagens em vídeos heatmap (consulte a etapa 7).
- Descartar as amostras em que os pulgões não se estabelecem no mesmo local por mais de 5 min, exibindo o movimento inseto sob o microscópio.
Nota: Este é, frequentemente, a maioria das amostras, e até 100 tratamentos pode ser necessários para encontrar 30 amostras exibindo resolução bem-sucedida. - Definir a escala de medição de pixels (ou converter para mm, se for conhecido) e o frame de tempo para o mesmo intervalo de tempo utilizado durante a microscopia clicando no " imagem " > " Propriedades. "
- Usando o cursor, coloque uma região de interesse (ROI) em torno da área de tecido para análise GFP.
Nota: No protocolo atual, uma circular ROI 50 pixels (0.65 mm) de diâmetro foi usada em 3 locais de interesse: o pulgão alimentação local (Fs), uma região sistêmica sobre a nervura central da folha (Sm) e uma sistêmica região adjacente do fulcro (" lateral tecido " Sl) ( Figura 2).- Criar o ROI por desenhar uma forma oval (use o " ferramenta oval ") e editar o tamanho usando " editar " > " seleção " > " especificar. " Veja a Figura 2.
- Para o controle não tratado, selecione ROIs em regiões comparáveis da folha para os selecionados na folha tratada (i.e., a mesma região da folha como onde o pulgão alimentados com a folha tratada) ( Figura 2).
Figura 2: analisando GCaMP3 fluorescência sob o microscópio. Esquerda: folha controle não tratado. Direita: folha de afídio-tratados. O local de alimentação do pulgão é indicado com uma ponta de flecha. Barra de escala = 1 mm. (A) imagem de campo brilhante. Ampliação: 7,8 X, foco:-127,8330 mm, exposição: 1 s. (B) GFP imagem mostrng o ROIs utilizado para a análise quantitativa da fluorescência. FS = local de alimentação, Sm = nervura sistêmica, Sl = tecido lateral sistêmico. Ampliação: 7,8 X, foco:-127,8330 mm, exposição: 1 s. O GFP foi animado usando uma lâmpada de iodetos metálicos 450 a 490 nm e emissão fluorescente foi capturado entre 500 e 550 nm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- usar o plugin de analisador de série de tempo clicando " Plugins " > " analisador de série de tempo " para analisar os valores brutos da fluorescência (F) no ROI ao longo do tempo. Adicionar o ROI de interesse (" Add [t] "). Certificar-se de que o ROI é selecionado, selecione " obter média; " isto irá exibir uma tabela de valores de F para cada quadro em que ROI.
- Copiar esses dados para uma planilha.
- Calcular a área do sinal de alimentação local, primeiro selecionando a região usando o " ferramenta de seleção à mão livre. " delinear o máximo sinal GFP e então calcular a área desta forma clicando " Analyze " > " medida. "
- Calcular a velocidade do sinal de alimentação local, usando o plugin MTrackJ clicando " Plugins " > " rastreamento " > " MTrackJ. "
- clique sobre o " Add " botão e, em seguida, clique o cursor no centro do o sinal quando o primeiro é visível. Clique novamente na borda do sinal no seu ponto de mais distante de se espalhar. Clique " medida " para calcular a velocidade do sinal.
6. Análise de dados
- definir o ponto de afídio, fixando-se por jogar através de quadros de imagem do microscópio em Fiji.
Nota: O tempo de resolução é o quadro, durante o qual o pulgão permanece em um único local por 5 min ou mais. A duração da regularização de eventos também pode ser calculada a partir das imagens em Fiji. - Normalizar os dados F (ΔF/F) de acordo com a equação ΔF/F = (F - F 0) f 0, F 0 Cadê a fluorescência de base média calculada a partir da média de F sobre os primeiros 60 frames da gravação antes do pulgão estabeleceu-se. Repita para o controle não tratado.
- Sinopse a fluorescência de GFP normalizada (ΔF/F) ao longo do tempo para o ROI na folha tratada e não tratada. Descartar amostras (duas folhas), se o controle não tratado mostra grandes transientes de Ca 2 + (i.e., ΔF/F ascensões acima de 0,2).
- Repetir até pelo menos 20-30 amostras viáveis foram analisadas por genótipo.
7. Tempo-curso de criação de vídeo
- converter arquivos de imagem de 32 bits em heatmaps usando o plugin NucMed_Image LUTs clicando " Plugins " > " NucMed " > " tabelas Lookup. " no menu de tabelas de pesquisa, selecione " azul verde vermelho " para converter as imagens de mapas de calor.
- Melhorar o contraste do heatmap para destacar o GFP afídio-suscitou sinais usando " processo " > " melhorar contraste " > " ajustar pixels saturados %. "
- Adicionar informações de tempo usando o plugin do Stamper de tempo clicando no " Plugins " > " tempo Stamper ". Definir o " tempo começar " em " 0 " e o " intervalo " baseado no intervalo de tempo usado para a microscopia (por exemplo, 5 s).
- Exportar este vídeo como um áudio vídeo intercalados arquivo (AVI).
Nota: Este vídeo pode ser editado ainda mais em outros pacotes de software (por exemplo, Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Figura 3 e Figura 4 são representante resulta de uma experiência de comparar uma folha de afídio-tratados com um controle não tratado. Um altamente localizado aumento na fluorescência de GFP pode ser visto ao redor do local de alimentação em poucos minutos na maioria das amostras, enquanto a Ca2 + dinâmica na estadia de folha de controle não tratados relativamente estável (Figura 3A e 3B). Também é possível observar aumentos secundários na fluorescência de GFP após o pico inicial em alguns experimentos (Figura 3B). Em até 50% das folhas tratadas, os pulgões não resolver e as amostras devem ser descartadas. Das amostras na qual resolução ocorre, 27% das amostras não exibem claro aumento na fluorescência de GFP em torno do local de alimentação (Figura 3 e tabela 1); Portanto, devem ser média de 25-30 amostras para análise quantitativa. Visualização da área e velocidade da alimentação elevação local [Ca2 +]cyt devem revelar um sinal de cerca de 110 µm viajar a 6 µm/s (tabela 1). Além disso, não há elevações decyt [Ca2 +] devem ser detectadas sistemicamente dentro da folha tratamento de afídio, do fulcro sistêmico (Figura 4A) ou regiões sistêmica tecido lateral (Figura 4B). Uma amostra representativa de [Ca2 +]cyt dinâmica ao longo do tempo é mostrada no vídeo 1. Também é possível analisar o comportamento de assentamento de afídio rastreando o número e duração dos eventos de assentamento individuais sob o microscópio. Resultados representativos para esses comportamentos são mostrados na tabela 1, mostrando que os pulgões leva em torno de 10 min antes de se estabelecer, e quando eles resolver com êxito, isso dura por 20 min em média. Portanto, os insetos são resolvidos em um único local para a totalidade dacyt elevação [Ca2 +].
Figura 3: GCaMP3 pode ser usado para detectar afídio-suscitou Ca2 + sinais no local de alimentação em folhas desanexados. Esquerda: traços representativos (n = 30) da fluorescência de GFP normalizada (ΔF/F) em torno do local de alimentação de uma folha de 35S::GCaMP3 . Os traços exibem 5 min antes de se estabelecer até 25 min pós-fixando-se. Controle = local equivalente em uma folha não tratados 35S::GCaMP3 . Direito: imagem de microscópio estereoscópico representante de [Ca2 +]cyt elevação vista em torno de um afídio alimentando o site sobre uma folha de 35S::GCaMP3 . A fluorescência de GFP é codificados por cores de acordo com a escala de baixo-relevo. A identificação de afídio delineada em branco e local de alimentação indicado com uma ponta de flecha. Ampliação: 7,8 X, foco:-127,8330 mm, exposição: 1 s. O GFP foi animado usando uma lâmpada de iodetos metálicos 450 a 490 nm, e a emissão fluorescente foi capturada entre 500 e 550 nm. (A) um exemplo de um grande induzida por pulgão [Ca2 +]cyt elevação. (B) um exemplo de uma média induzida por pulgão [Ca2 +]cyt elevação. (C) um exemplo de não induzida por pulgão [Ca2 +]cyt elevação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro | Média (± SEM) |
| [Ca2 +] elevação de CYT | |
| Percentagem de amostras exibindo uma elevação decyt [Ca2 +] | 73% |
| Velocidade da frente de onda de um | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Área máxima de propagação | 110 µm2 (± 18) |
| Comportamento de afídio | |
| Número de acordos (> 5 min) | 2 (± 0.1) |
| Número total de instala-se (todas as durações) | 3.8 (± 0,4) |
| Estabeleci-me tempo para imagem b | 20 min (± 2) |
| Tempo até o primeiro resolver c | 11 min (± 1,4) |
| Porcentagem do tempo total gasto resolvido | 62% (± 3) |
Tabela 1: [Ca2 +]cyt elevação e parâmetros de comportamento afídio durante 35S::GCaMP3 Imaging. Parâmetros calculados a partir de amostras viáveis na qual resolução de > 5 min ocorreu. (A) a velocidade do sinal visível do ponto de início para o ponto mais distante de propagação. (B) a duração dos eventos assentamento iniciais utilizado para a análise da fluorescência. (C) período de tempo entre o início da imagem latente e o pulgão primeiro resolver. [Ca2 +] dados de elevação CYT anteriormente apresentados para a célula vegetal (status atual: inicial QC).
Figura 4: GCaMP3 não consegue detectar o pulgão-suscitou Ca2 + sinais sistêmicos para o local de alimentação. Traços representativos (n = 30) da fluorescência de GFP normalizada (ΔF/F) em locais sistêmicas para o pulgão alimentando o site em folhas de 35S::GCaMP3. Os traços exibem 5 min antes de se estabelecer até 25 min pós-fixando-se. Controle = local equivalente em uma folha não tratados 35S::GCaMP3 . (A) ΔF/F na região da nervura sistêmica. (B) ΔF/F na região de tecido lateral sistêmica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: florescimento de GCaMP3 longo do tempo como se alimenta um afídio. A fluorescência de GFP é codificados por cores de acordo com a escala de baixo-relevo. A localização do local de alimentação pulgão é indicada com uma ponta de flecha. Esquerda: folha de 35S::GCaMP3 exposta a um M. persicae adultos. Direita: Uma 35S::GCaMP3 controle de pulgão não folha. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Discussion
O método descrito neste artigo permite a análise em tempo real da planta Ca2 + sinalização durante um estresse biótico tais como alimentação de insetos. Ele demonstra que uma das respostas a primeira planta de tais ameaças é uma localizadas [Ca2 +]cyt elevação ao redor do local de alimentação do inseto. Através da utilização de mutantes, esse método permitirá a caracterização molecular e fisiológica de tais sinais, que não era possível anteriormente. Um passo crítico no presente protocolo é garantir que as folhas isoladas não são excessivamente perturbadas durante o processo de desprendimento (passo 3.2) ou ao transferir os insetos para as folhas (etapa 4.5). Dado que o protocolo atual fornece uma medida relativa da [Ca2 +]cyt ao invés de uma concentração absoluta, é vital que as configurações do microscópio são mantidas constantes durante todo o experimento. Há também o potencial para viés humano durante a seleção de ROIs e a análise dos dados, e como tal, é recomendável que os experimentos são realizados duplo-cego.
Existem várias vantagens significativas de medição [Ca2 +]cyt durante estresse biótico com este protocolo. Primeiro, o uso de um fluoróforo único com um alto rendimento fluorescente permite a imagem a ser realizado em um estereomicroscópio, que é menos caro do que usar um microscópio confocal. O uso de um único fluoróforo também faz análise e coleta de dados simples, como não há apenas uma medição para gravar. Além disso, o uso de um microscópio estereoscópico permite a geração de imagens de folhas inteiras, que é essencial, dado que muitas interações bióticas, incluindo interações planta-pulgão, ocorrem em grande escala espacial. A alta resolução temporal da imagem captura possível com GCaMP3, baseado na dissociação rápida de Ca2 + do sensor após ligação23,30 e o fluorescente de alto rendimento, permite para as medidas a serem tomadas até cada 5 s. Além disso, o ensaio de folha evita a fuga do inseto, uma chave limitando o passo para a realização de tais experiências sobre plantas inteiro (em preparação). As folhas destacadas também assegurar que o inseto se alimenta de um local pré-definido, permitindo a análise da dinâmica de Ca2 + antes, durante e após a alimentação. Este protocolo também garante que folhas de estádios de desenvolvimento semelhantes são utilizadas para análise.
A principal desvantagem deste protocolo origina-se o uso de um biossensor não-ratiometric. Com single-FP biosensores, variação na emissão de GFP pode resultar de variáveis experimentais que não [Ca2 +]cyt, tais como mudanças no pH celular, movimento ou o nível de expressão do biosensor. Estas questões não forem encontradas com FRET Cameleons durante o traste, como a transferência de energia do PCP para YFP só ocorre após a ligação de Ca2 + . Outras condições que alteram as propriedades fluorescentes do fluorophores individuais são improváveis imitar as mudanças opostas na intensidade de PCP e YFP, e o cálculo de ratiometric usado inerentemente normaliza as medições para muitos destes outros artefatos ópticos23,,30. Isto faz estimativas de absoluta [Ca2 +]cyt mais confiável com FRET Cameleons. Consequentemente, GCaMP3 é melhor usado como um biossensor para medir o relativo [Ca2 +]cyt, embora seja ainda suficiente para detectar e caracterizar fenômenos biológicos em plantas5,(in preparation). Portanto, é essencial usar controles para mostrar que o efeito observado é devido a Ca2 +, incluindo Ca2 +-relacionado mutantes genéticos(em preparação) ou farmacológica Ca2 + canal inibidores como La3 + . Importante, single-FP biosensores normalmente exibem um maior rendimento fluorescente e maior alcance dinâmico (ou seja, um aumento em florescimento mediante vinculação de Ca2 + ) que FRET Cameleons23, que faz GCaMP mais adequado para imagem de nível de tecido, enquanto FRET Cameleons são uma ferramenta útil para a imagem latente de celular com um microscópio confocal5,25.
Durante a execução do presente protocolo, é possível que alguns problemas que exigem solução de problemas surgirão. Por exemplo, é recomendável que as amostras em que os visores de folha de controle (não tratado) grande [Ca2 +]cyt elevações são descartados (etapa 6.3). Esses transientes são provavelmente o resultado de stress induzido pela microscopia. Com efeito, a luz azul é conhecido eliciar Ca2 + sinais38,39,40,41, e a luz de alta intensidade pode também resultar em temperatura e stress osmóticos, ambos os quais também eliciar [Ca2 +]cyt elevações21,25,42. Consequentemente, para reduzir tais tensões, é importante realizar o experimento em um quarto bem ventilado e com temperatura controlada e evitar desnecessariamente longos tempos de exposição. Também é importante para não perturbar as folhas excessivamente durante o destacamento ou durante a microscopia para evitar toque-suscitou [Ca2 +]cyt elevações43,44,45. Problemas também podem ser encontrados com resolução de insetos. Com M. persicae, os insetos não se estabelecem nas folhas em várias amostras. Isso pode ser um resultado de defesa de ferida-suscitou a moradia folhas46,47, ou a perturbação dos insetos pela luz azul. Na verdade, visão de M. persicae é regido por três fotorreceptores, incluindo um com uma sensibilidade de pico de 490 nm48. Redução da exposição de microscopia e manipulando os pulgões com cuidado podem reduzir a aflição e incentivar a resolução.
O protocolo descrito no jornal atual dá novas perspectivas para a compreensão molecular das interações inseto-planta e a resposta da planta ao estresse biótico. Permite a visualização de uma das respostas a primeira planta para alimentação de insetos e facilita ainda mais as investigações através da utilização de Arabidopsis genéticas recursos disponíveis. Além disso, este protocolo permite a utilização de organismos vivos, ao contrário de extratos49 ou elicitores50. No futuro, esta técnica poderia ser aplicada a outros estresses bióticos, como outras espécies de insetos, nematoides ou patógenos microbianos, bem como a estresses abióticos. A microscopia de GCaMP3 também pode ser modificada para outros tecidos vegetais, ROIs alternativos na folha, ou mesmo toda plantas de imagem. Além disso, existe o potencial para o biosensor ser genéticaly codificado em espécies de plantas adicionais. Por conseguinte, o protocolo descrito neste documento tem o potencial de disfarçado a base molecular de Ca2 + sinalização em uma gama de interações bióticas romance entre plantas e outras espécies.
Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) para o Conselho a respeito de microscopia. Os autores também desejam agradecer a John Innes Centre hortícola e departamentos de Entomologia por sua assistência. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de estudo de doutoramento de John Innes Foundation (TV), conceder B/JJ004561/1 do BBSRC e o John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. e D.S.), um ano na colocação da indústria do John Innes Centre (M.A.) , uma bolsa de estudo de Verão da sociedade de bioquímica do UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) e subvenções MCB 1329723 e 1557899-IOS da Fundação Nacional de ciência (M.T. e S.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
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