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Biology

En tiempo real en Vivo la grabación de señales de calcio Arabidopsis durante la alimentación de insectos utilizando un Biosensor fluorescente

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56142

Summary

Este protocolo describe un método sencillo para analizar las señales de calcio en las plantas generadas por hemipteran insectos, como pulgones. Thaliana de Arabidopsis transformada con el biosensor de calcio GFP GCaMP3 permiten la proyección de imagen en tiempo real en vivo de la dinámica de calcio con una alta resolución temporal y espacial.

Abstract

Los iones del calcio se predicen para ser entidades de señalización claves durante las interacciones bióticas, con señalización de calcio formando una parte establecida de la respuesta de la defensa de la planta a elicitores microbianas y heridas causadas por la masticación de insectos, obtención de calcio sistémico señales en las plantas. Sin embargo, el papel del calcio en vivo durante el estrés biótico es todavía incierto. Este protocolo describe el uso de un sensor de calcio genéticamente codificados para detectar señales de calcio en las plantas durante la alimentación por una plaga hemipteran. Hemípteros como pulgones perforan un pequeño número de células con especializado, alargado aspira zonas bucales, lo que la herramienta ideal para estudiar la dinámica de calcio cuando una planta se enfrenta a un estrés biótico, que es distinto de una respuesta hiriente. Además, biosensores fluorescentes están revolucionando la medida de señalización moléculas en vivo en animales y plantas. Expresando un biosensor de calcio basada en GFP, GCaMP3, en la planta modelo Arabidopsis thaliana permite la proyección de imagen en tiempo real de la dinámica de calcio planta en insectos de alimentación, con una alta resolución espacial y temporal. Un análisis repetible y robusto ha sido desarrollado utilizando la microscopía de fluorescencia de hojas desprendidas de la GCaMP3, lo que permite la medición continua de la dinámica del calcio citosólico antes, durante y después de la alimentación de insectos. Esto revela una elevación de calcio rápido muy localizada alrededor de este sitio que ocurre dentro de unos minutos de alimentación. El protocolo puede ser adaptado a otros estreses bióticos, como otras especies de insectos, mientras que el uso de Arabidopsis thaliana permite la rápida generación de mutantes para facilitar el análisis molecular del fenómeno.

Introduction

Calcio (Ca2 +) es uno de los elementos de señalización más ubicuos en las plantas. Un aumento transitorio en la concentración citosólica de Ca2 + ([Ca2 +]cyt) es descifrado por una compleja red de componentes aguas abajo y está implicado en la respuesta a ambos estreses bióticos y abióticos1,2. Un aumento de [Ca2 +]cyt es una de las primeras respuestas a elicitores microbianas, formando una parte común de la planta defensa respuesta3,4,5. Aumento de [Ca2 +]cyt también se han observado en respuesta a heridas causadas por la masticación de insectos como lepidópteros6,7. Sin embargo, el papel potencial de la planta de Ca2 + señales en respuesta a amenazas bióticas causantes de daños en sólo unas pocas células en vivo no ha sido explorado. El pulgón verde del durazno Myzus persicae es un hemipteran insecto que representa una amenaza significativa para el mundo agrícola8,9, y Ca2 + la emanación desde el espacio extracelular se ha observado en hojas infestados con M. persicae10. Este esquemas de protocolo un método robusto y repetible para medir la planta Ca2 + señales mientras que M. persicae se alimentan de las hojas utilizando un biosensor de Ca2 + fluorescente, con áfidos y GCaMP3 que ofrece novedosas herramientas con las que a diseccionar el papel de Ca2 + durante las interacciones bióticas.

CA2 +-microelectrodos selectivos se utilizaron antiguamente para medir [Ca2 +] en las plantas11,12. Más recientemente, enfoques bioluminiscentes y fluorescentes han ser estandarizados. Estos biosensores se unen Ca2 + y emiten luz, teniendo en cuenta oportunidades sin paralelo para el estudio de dinámica de Ca2 + en células y tejidos todo. Biosensores2 + CA pueden inyectarse como tintes o estable producidos por la introducción del biosensor codificación secuencia en el genoma del organismo a través de la transformación (es decir, genéticamente codificado biosensores). Este último ofrece las principales ventajas de ser fácilmente expresada en tejido vivo y capaz de localización subcelular13. La proteína aequorin, aislada de Aequorea victoria (Medusa) fue el primer genéticamente codificados Ca2 + biosensor en plantas14. Como una proteína bioluminiscente, aequorin no requieren excitación por luz externa, lo que evita la decoloración del cromóforo y autofluorescencia15. Aequorin se ha utilizado con éxito para medir flujos de [Ca2 +] en respuesta a varios estímulos, incluyendo temperatura16, patógenos17,18,19, sal estrés20 ,21e hirió a7. Sin embargo, es perjudicado por la intensidad de señal relativamente baja, haciendo la detección de flujos de [Ca2 +] en las células individuales y de tejidos con sensor pobre expresión difícil13.

El desarrollo de Ca2 + biosensores que pueden emitir fluorescencia ha complementado aequorin permitiéndole realizar detallado análisis subcelular y a nivel de tejido de Ca2 + dinámica. Uno de los biosensores fluorescentes más comunes son la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET)-base Cameleons. TRASTE Cameleons están compuestos de dos proteínas, típicamente PPC y YFP, que se traen en contacto por el cambio conformacional inducido por la Unión del Ca2 + en un dominio de la calmodulina en la región de vinculador de CFP-YFP. Este contacto permite a la transferencia de energía de CFP YFP, y el cambio resultante en la fluorescencia de estos fluoróforos permite la cuantificación exacta de [Ca2 +] mediante el cálculo de la relación de las señales de fluorescencia de los dos fluoróforos22. TRASTE Cameleons son superiores a los tintes fluorescentes aequorin y no proporcionales, ya que son que menos afectados por el nivel de expresión de la proteína23 y a menudo tienen un mayor rendimiento fluorescente, que permite proyección de imagen celular y subcelular23. Por ejemplo, traste Cameleons han utilizado recientemente para identificar Ca2 + señales de larga distancia en las plantas y para resolver a nivel celular24el,25,26.

Un avance con fluorescente basada en GFP Ca2 + biosensores ha sido el desarrollo de biosensores altamente sensible solo-fluoróforo (single-FP). Biosensores de FP solo consisten en una sola circular permutated GFP se relaciona una calmodulina y péptido M13, con Ca2 + Unión a calmodulina, dando por resultado una reacción mediada por el agua entre calmodulina y GFP tan protonate GFP y aumento rendimiento fluorescente27,28,29. FP-solo sensores ofrecen varias ventajas sobre el traste Cameleons, incluyendo el diseño experimental más simple y una potencialmente mayor resolución temporal de30la proyección de imagen. Aunque solo FP sensores no pueden cuantificar absoluto [Ca2 +] como simplemente como sensores de trastes, que son superiores para el análisis de la dinámica temporal y espacial de Ca2 + señales5,23. GCaMPs son uno de los mejor de sensores solo FP28 y han sufrido varias revisiones para mejorar su rendimiento fluorescente, rango dinámico, Ca2 + afinidad y relación señal a ruido31,32 , 33 , 34. el GCaMPs han utilizado con éxito en sistemas animales, tales como frutas y peces cebra las neuronas de motor35 volar ensambladuras neuromuscular34. Mutagénesis al azar del GCaMP3 ha dado lugar a clases adicionales de sensores solo FP, incluyendo el ultrasensible GCaMP636 y los GECOs29. Los GECOs han utilizado recientemente en Arabidopsis thaliana (en adelante denominado Arabidopsis) para medir flujos de Ca2 + en respuesta a ATP, quitina y la flg22 bacteriana elicitor. Este estudio también demostró que el biosensor R-GECO superó el traste Cameleon YC3.6 en términos de máxima señal cambio y signal to noise ratio5.

Debido a la facilidad de uso, alto rendimiento fluorescente y alta resolución temporal que puede lograrse con biosensores de GCaMP, GCaMP3 fue codificada genéticamente en Arabidopsis bajo el promotor del virus del mosaico del coliflor 35S. Las herramientas genéticas disponibles para la investigación de Arabidopsis permiten el análisis molecular de las Ca2 + señales medido por GCaMP3. Además, el biosensor de GCaMP3 puede verse bajo un microscopio de fluorescencia en lugar de un sistema confocal más costoso. Este protocolo permite que todo tejido imágenes, indispensable cuando se realizan experimentos con estrés bióticos vivo. El experimento está diseñado de tal forma que hojas desprendidas de las plantas 35S::GCaMP3 se flotaban en el agua, para evitar fuga de insectos y restringir la alimentación a un tejido específico. El método descrito en este documento, por tanto, permite el análisis de la hoja dinámica de Ca2 + durante la alimentación por M. persicae, dando por resultado la caracterización de una planta nueva señalización de la respuesta. Este método también puede ser adaptado para trabajar con otros estreses bióticos, como otras especies de insectos y patógenos microbianos y otros tejidos de la planta, como raíces.

Protocol

1. preparación de la planta (días 1 - 4)

  1. el día 1, esterilizar 35S::GCaMP las semillas con tres lavados de etanol 75%, 1 min por lavado y la placa en 100 mm 2 cuadrados placas plásticas con ¼ fuerza Murashige y Skoog (MS) medio (receta: 1,1 g de medio de Murashige y Skoog, 7,5 g de sacarosa, 10 g de agar Formedium y 1 L de agua desionizada) 37.
  2. Estratificar las semillas en la oscuridad por tres días a 8 ° C para obtener germinación sincrónica.
  3. El día 4 del experimento, mover las plantas de semillero de GCaMP a una sala de ambiente controlado (CER) a 23 ° C, con un fotoperíodo oscuro 16 h luz y 8 h.

2. Cría de insectos (días 11 - 12)

  1. el día 11 del experimento, añadir 15 adultos M. persicae a 5 semanas de edad cultivadas en suelo Arabidopsis plantas usando un artista húmedo ' s pincel (tamaño 2 o 4) (crecido en una CER a 22 ° C con 10 h luz y 14 h photoperio oscuro d).
  2. la jaula de los áfidos en la planta mediante la colocación de tubos de plástico transparente (10 x 15 cm) alrededor de la planta y la tapa con una tapa de plástico.
  3. Deja las plantas infestadas de pulgones durante 24 h en un CER a 22 ° C con 16 h luz y 8 h fotoperiodo oscura.
  4. El día 12 del experimento, quite todo el adulto M. persicae con un pincel.
    Nota: Los insectos pueden verse por el ojo de la planta. Esto da una población de ninfas con una edad de desarrollo similar. Aproximadamente se producirán 1 ninfa por adulto durante este período.
  5. Deja las plantas infestadas en una CER menor temperatura a 16 º C, con un 8 h luz y 16 h oscuro fotoperiodo, para evitar que las ninfas de aumentar de tamaño muy rápidamente.

3. Hoja de separación (día 19)

  1. el día 19 del experimento, retire las plantas de semillero de 35S::GCaMP3 de la CER y separar la hoja más grande de cada planta con un par de tijeras afiladas.
  2. Usando un par de pinzas, coloque la hoja separada en el pozo de una placa de 96 pocillos con 300 μL de agua destilada, superficie abaxial hacia arriba. Repetición para hojas adicionales ( figura 1).

Figure 1
figura 1: Análisis de hoja de 35S::GCaMP3. La hoja más grande de cada plantita de Arabidopsis de 16 días de edad 35S::GCaMP3 es separada y flotada en 300 μL de agua destilada en una placa de 96 pocillos. Foto tomada el día después de la separación. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. la placa en la envoltura de plástico transparente y papel de aluminio y dejar a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el estrés de la separación a.

4. microscopía de fluorescencia (días 20 - 22)

  1. el día 20 del experimento, retire la placa de 96 pocillos del papel de aluminio y transferir a un estereomicroscopio de fluorescencia. Configurar el microscopio de fluorescencia estéreo para excitar la GFP con una luz de 450-490 nm y para capturar la emisión fluorescente entre 500 y 550 nm.
  2. Recopila los áfidos envejecidos de la colonia fundada el día 11 por retirar la planta del suelo y ponerlo en una caja transparente con tapa. Mantener los insectos contenidos en la caja mientras realiza el experimento.
  3. Coloque la placa de 96 pozos bajo el microscopio. Alterar la exposición a la luz hasta que la fluorescencia de GCaMP3 se puede visualizar claramente en las venas de las hojas desprendidas. Mantener la exposición constante para todos los experimentos; el protocolo actual, una exposición de 1 s se utilizó con una ganancia de 3.5 ( figura 2).
  4. Ajustar el aumento y el zoom del microscopio que pozos de 4 se pueden observar en un marco, para el protocolo actual, se utilizó un 7.8 X aumento y un foco de-127,8330 mm.
  5. Transferir un pulgón a una hoja independiente bajo el microscopio utilizando un pincel húmedo. Dejar una hoja adyacente no tratada como un control, pero tocar ligeramente con el pincel para imitar el contacto que se produce durante la transferencia de pulgón. Recuerde colocar el envoltorio plástico detrás encima de la placa de 96 pocillos en microscopía para evitar que los insectos escapen.
  6. Comenzar la grabación de la fluorescencia de las hojas en pares (1 tratados con áfidos y 1 sin tratamiento) haciendo clic en " iniciar el experimento " en el software del microscopio incorporado ( figura 2). Grabar mediciones 50 min
    Nota: para el protocolo actual, un intervalo de tiempo de 5 s entre mediciones fue utilizado.
  7. Después de 50 minutos, detenga la grabación haciendo clic en " detener experimento " y eliminar el pulgón de la hoja. Guardar las medidas de fluorescencia como archivos de imagen (p. ej., etiquetado archivo formato de imagen, TIFF).
  8. Repetir el experimento con más pares de hojas, la proyección de imagen puede ampliarse para imagen 2 pares de hojas a la vez, lo que permite la proyección de imagen simultánea de 2 genotipos.

5. Recopilación

  1. importar los archivos de imagen a Fiji (J de la imagen) y convierte a 32 bits haciendo clic en " imagen " > " tipo " > " 32 bits; " esto permite la conversión de las imágenes en videos de mapa de calor (ver paso 7).
  2. Deseche las muestras en la que los pulgones no conformarse en un solo lugar durante más de 5 minutos viendo el movimiento de insectos bajo el microscopio.
    Nota: Esto es a menudo la mayoría de las muestras, y hasta 100 tratamientos puede ser necesario para encontrar 30 muestras exhibiendo colocar éxito.
  3. Establece la escala de medición de píxeles (o convertir a mm, si se conoce) y el marco temporal en el mismo intervalo de tiempo utilizado durante la microscopia haciendo clic en " imagen " > " propiedades "
  4. Usando los cursores, coloque una región de interés (ROI) alrededor del área de tejido para análisis GFP.
    Nota: En el protocolo actual, una circular ROI 50 pixeles (0,65 mm) de diámetro fue utilizado en 3 lugares de interés: el pulgón del sitio (Fs), una región sistémica en la nervadura central de la hoja (Sm) y una región sistémica adyacente a la nervadura central de alimentación (" lateral del tejido " Sl) ( figura 2).
    1. Crear el ROI dibujando un óvalo (use el " herramienta óvalo ") y editar el tamaño usando " editar " > " selección " > " especificar. " véase la figura 2.
  5. Para el control sin tratar, seleccionar ROIs en regiones comparables de la hoja a los seleccionados en la hoja tratada (es decir, la misma región de la hoja de donde se alimenta el pulgón de la hoja tratada) ( figura 2).

Figure 2
figura 2: análisis bajo el microscopio de la fluorescencia GCaMP3. La izquierda: hoja control sin tratar. Derecho: tratados de áfidos hoja. El sitio de alimentación del áfido se indica con una flecha. Barra de escala = 1 mm. (A) imagen de campo claro. Ampliación: 7.8 X, foco:-127,8330 mm, exposición: 1 s. (B) imagen GFP showiNG el ROIs utilizados para el análisis cuantitativo de la fluorescencia. FS = sitio de alimentación, Sm = nervadura central sistémica, Sl = tejido lateral sistémico. Ampliación: 7.8 X, foco:-127,8330 mm, exposición: 1 s. La GFP estaba emocionado con una lámpara de halogenuro metálico de 450 a 490 nm y emisión fluorescente fue capturado entre 500 y 550 nm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. usar el plugin de analizador de la serie de tiempo haciendo clic en " Plugins " > " analizador de la serie de tiempo " para analizar los valores de fluorescencia crudo (F) en el retorno de la inversión en el tiempo. Añadir el ROI de interés (" Add [t] "). Asegurándose de que el ROI está seleccionado, seleccione " obtener media; " esto mostrará una tabla de valores F para cada fotograma en que ROI.
  2. Copiar estos datos en una hoja de cálculo.
  3. Calcular el área de la señal alimentación del sitio seleccionando primero la región usando el " herramienta Selección a mano alzada. " detallar la máxima señal GFP y luego calcular el área de esta forma haciendo clic en " analizar " > " medida. "
  4. Calcular la velocidad de la señal alimentación de sitio usando el plugin de MTrackJ haciendo clic en " Plugins " > " de seguimiento " > " MTrackJ. "
    1. haga clic en el " añadir " botón y haga clic en el cursor en el centro de la señal de cuando primero está visible. Haga clic en nuevo en el borde de la señal en su punto de más extensión. Haga clic en " medida " para calcular la velocidad de la señal de.

6. Análisis de datos

  1. definir el punto de pulgón resolver jugando a través de los marcos de imagen del microscopio en Fiji.
    Nota: El tiempo de establecimiento es el marco que el pulgón se queda en un solo sitio durante 5 minutos o más. También se puede calcular la duración de resolver eventos de las imágenes en Fiji.
  2. Normalizar los datos F (ΔF/F) según la ecuación ΔF/F = (F - F 0) / f 0, donde F 0 es la fluorescencia basal promedio calculado del promedio de F sobre el primero 60 frames de la grabación antes de este se establecieron. Repetición para el control sin tratar.
  3. Parcela la fluorescencia de GFP normalizada (ΔF/F) con el tiempo ese retorno de la inversión en la hoja tratada y no tratada. Deseche las muestras (ambas hojas) si el control no tratado muestra grandes oscilaciones de Ca 2 + (es decir, ΔF/F se levanta por encima de 0,2).
  4. Repetir hasta por lo menos 20-30 muestras viables han sido analizadas por genotipo.

7. Creación de vídeo de tiempo-curso

  1. convertir archivos de la imagen de 32 bits en heatmaps usando el plugin NucMed_Image LUTs haciendo clic " Plugins " > " NucMed " > " tablas de búsqueda. " en el menú de tablas de búsqueda, seleccione " azul rojo verde " para convertir las imágenes en mapas de calor.
  2. Mejorar el contraste de heatmap para resaltar la GFP pulgón produce señales usando " proceso " > " mejorar contraste " > " ajustar pixeles saturados %. "
  3. Agregar información de tiempo usando el plugin de estampilla de tiempo haciendo clic en " Plugins " > " matriz de tiempo ". Establecer la " hora de inicio " en " 0 " y el " intervalo de " basado en el intervalo de tiempo utilizado para la microscopía (e.g., 5 s).
  4. Exportar este video como un audio video interleaved archivo (AVI).
    Nota: Este video puede luego ser editado en otros paquetes de software (por ejemplo, Microsoft Movie Maker).

Representative Results

Figura 3 y figura 4 son representante de los resultados de un experimento comparando una hoja tratada con pulgón con un control sin tratar. Un aumento muy localizado en la fluorescencia de GFP puede verse alrededor del sitio de alimentación en pocos minutos en la mayoría de las muestras, mientras que la dinámica de Ca2 + en la estancia de la hoja de control no tratados relativamente estable (Figura 3A y 3B). También es posible observar aumentos secundarios de la fluorescencia de GFP después del pico inicial en algunos experimentos (figura 3B). En hasta un 50% de las hojas tratadas, no colocan los áfidos y las muestras deben ser descartadas. De las muestras en que establecimiento se produce, el 27% de las muestras no exhiben claros aumentos en la fluorescencia de GFP alrededor del sitio de alimentación (figura 3 y tabla 1); por lo tanto, 25-30 muestras replicadas deben ser promediadas para el análisis cuantitativo. Visualización de la zona y la velocidad de la elevación decyt de sitio [Ca2 +] alimentación deben revelar una señal de alrededor de 110 μm a 6 μm/s (tabla 1). Además, no hay elevaciones decyt de [Ca2 +] deben detectarse sistémica dentro de la hoja sobre el tratamiento del pulgón, ya sea en la nervadura central sistémica (Figura 4A) o las regiones de tejido lateral sistémica (Figura 4B). Una muestra representativa de la [Ca2 +] dinámica decyt con el tiempo se muestra en el Video 1. También es posible analizar el comportamiento de asentamiento de pulgón por rastrear el número y duración de los eventos individuales colocar bajo el microscopio. Resultados representativos para estos comportamientos se muestran en la tabla 1, muestra que los áfidos unos 10 min antes de instalarse, y cuando se instalan con éxito, esta tiene una duración de 20 minutos en promedio. Por lo tanto, los insectos se colocan en un lugar único para la totalidad de la elevación decyt de [Ca2 +].

Figure 3
Figura 3: GCaMP3 se puede utilizar para detectar pulgones produce Ca2 + señales en el sitio de alimentación en hojas separadas. Izquierda: rastros representativos (n = 30) de la fluorescencia de GFP normalizada (ΔF/F) alrededor del sitio de alimentación de una hoja de 35S::GCaMP3 . Las huellas muestran 5 min antes de colocar hasta 25 minutos después colocar. Control = equivalente ubicación en una hoja sin tratamiento 35S::GCaMP3 . Derecha: imagen de Estereomicroscopio representante decyt elevación de [Ca2 +] visto por un áfido sitio sobre una hoja de 35S::GCaMP3 de alimentación. La fluorescencia de GFP es codificados por colores según la escala de inserción. La identificación de áfidos en blanco y el sitio de alimentación indicado con una punta de flecha. Ampliación: 7.8 X, foco:-127,8330 mm, exposición: 1 s. La GFP estaba emocionado con una lámpara de halogenuro metálico de 450 a 490 nm y la emisión fluorescente fue capturada entre 500 y 550 nm. (A) un ejemplo de una gran pulgón-inducida [Ca2 +]cyt elevación. (B) un ejemplo de un promedio de pulgón-inducida [Ca2 +] elevación decyt . (C) un ejemplo de no inducida por el pulgón de la [Ca2 +]cyt elevación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetro Promedio (± SEM)
[Ca2 +] elevación de CyT
Porcentaje de muestras con una elevación decyt de [Ca2 +] 73%
Velocidad de frente de onda un 5,9 μm/s (± 0.6)
Área máxima de difusión 110 μm2 (± 18)
Comportamiento del áfido
Número de los settles de (> 5 min) 2 (± 0.1)
Número total de settles (de todas las duraciones) 3.8 (± 0.4)
Tiempo establecido para la proyección de imagen b 20 minutos (± 2)
Tiempo hasta primer settle c 11 min (± 1.4)
Se estableció el porcentaje de tiempo total 62% (± 3)

Tabla 1: [Ca2 +]cyt elevación y parámetros de comportamiento del áfido durante 35S::GCaMP3 proyección de imagen. Parámetros calculan de muestras viables en que establecimiento de > 5 minutos ocurrió. (A) la velocidad de la señal visible desde el punto de inicio hasta el punto más alejado de la extensión. (B) duración de los eventos de sedimentación iniciales utilizado para el análisis de fluorescencia. (C) tiempo transcurrido entre el comienzo de la proyección de imagen y el pulgón primero resolver. [Ca2 +] datos de elevación de CyT sometidos previamente a la célula de la planta (estado actual: inicial del control de calidad).

Figure 4
Figura 4: GCaMP3 no se detecta pulgón produce Ca2 + señales sistémicas al sitio de alimentación. Rastros representativos (n = 30) de la fluorescencia de GFP normalizada (ΔF/F) en localizaciones sistémicas a este sitio en la alimentación hojas de 35S::GCaMP3. Las huellas muestran 5 min antes de colocar hasta 25 minutos después colocar. Control = equivalente ubicación en una hoja sin tratamiento 35S::GCaMP3 . (A) ΔF/F en la región de la nervadura central sistémica. (B) ΔF/F en la región del tejido lateral sistémica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Screenshot
Video 1: florecimiento de GCaMP3 paso del tiempo como un pulgón alimenta. La fluorescencia de GFP es codificados por colores según la escala de inserción. La ubicación del sitio de alimentación de pulgón se indica con una flecha. Izquierda: hoja 35S::GCaMP3 expuesta a un adulto M. persicae . Derecha: Una 35S::GCaMP3 control de áfidos no hoja. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Discussion

El método descrito en este trabajo permite el análisis en tiempo real de la planta Ca2 + señalización durante un estrés biótico tales como alimentación de insectos. Demuestra que una de las primeras respuestas de la planta a estas amenazas es una localizada [Ca2 +]cyt elevación alrededor del sitio de alimentación del insecto. Mediante el uso de mutantes, este método permitirá la caracterización molecular y fisiológica de dichas señales, que no era previamente posible. Un paso crítico en este protocolo es asegurar que las hojas desprendidas no son excesivamente alteradas durante el proceso de separación (paso 3.2) o al transferir insectos a las hojas (paso 4.5). Dado que el protocolo actual proporciona una medida relativa de [Ca2 +]cyt en lugar de una concentración absoluta, es vital que la configuración del microscopio se mantiene constante durante todo el experimento. También existe el potencial para sesgo humano durante la selección de ROIs y el análisis de los datos, y como tal, se recomienda que se llevan a cabo los experimentos de doble ciego.

Hay varias ventajas de la medición [Ca2 +]cyt durante estrés biótico con este protocolo. En primer lugar, el uso de un fluoróforo solo con un alto rendimiento fluorescente permite la proyección de imagen a realizar en un estereomicroscopio, que es menos costosa que el uso de un microscopio confocal. El uso de un fluoróforo solo también simplifica el análisis y recopilación de datos, ya que hay una sola medida para grabar. Además, la utilización de un estereomicroscopio permite la proyección de imagen de hojas enteras, que es esencial dado que muchas de las interacciones bióticas, incluyendo las interacciones planta-pulgón, ocurren en una escala espacial grande. La alta resolución temporal de imagen captura posible con GCaMP3, basado en la disociación rápida de Ca2 + del sensor después de enlace23,30 y el alto rendimiento fluorescente, permite que las medidas a tomar hasta cada 5 s. Además, el análisis foliar previene el escape del insecto, una clave limitando el paso a la realización de experimentos en plantas enteras (en preparación). Las hojas desprendidas también aseguran de que el insecto se alimenta desde un lugar previamente definido, permitiendo el análisis de Ca2 + dinámica antes, durante y después de la alimentación. Este protocolo también se asegura de que hojas de etapas de desarrollo similares se utilizan para el análisis.

La principal desventaja de este protocolo se origina el uso de un biosensor no proporcionales. Con solo FP biosensores, variación en la emisión de GFP puede resultar de variables experimentales distintos de [Ca2 +]cyt, como cambios en el pH celular, el movimiento o el nivel de expresión del biosensor. Estos temas no se encuentran con Cameleons traste en traste, como la transferencia de energía de PPC a YFP sólo ocurre al enlace de Ca2 + . Otras condiciones que alteran las propiedades fluorescentes de los fluoróforos individual están poco probable que imitan los cambios opuestos en intensidad del CFP y de YFP y el cálculo radiométrica que es inherentemente normaliza las mediciones para muchos de estos otros artefactos ópticos23,30. Esto hace más confiable con traste Cameleons estimaciones de absoluta [Ca2 +]cyt . Por lo tanto, GCaMP3 se utiliza mejor como un biosensor para medir la relativa [Ca2 +]cyt, aunque es todavía suficiente para detectar y caracterizar fenómenos biológicos en las plantas5,(in preparation). Por lo tanto, es esencial utilizar los controles para mostrar que el efecto observado es debido a la Ca2 +, incluyendo Ca2 +-relacionados con la genética mutantes(en preparación) o farmacológicas Ca2 + canal inhibidores como La3 + . Lo importante, solo FP biosensores típicamente mostrar un mayor rendimiento fluorescente y mayor rango dinámico (es decir, un aumento de floración sobre enlace de Ca2 + ) que traste Cameleons23, que la hace más adecuada para GCaMP nivel de tejido la proyección de imagen, mientras que traste Cameleons son una herramienta útil para la proyección de imagen celular con un microscopio confocal5,25.

Durante la ejecución de este protocolo, es posible que algunos problemas que requieren solución de problemas surgirán. Por ejemplo, se recomienda que las muestras en las que la muestra de hoja de control (sin tratamiento) son grandes elevaciones decyt [Ca2 +] descartados (paso 6.3). Estos transitorios son probablemente el resultado de estrés inducido por la microscopia. De hecho, la luz azul se conoce para obtener la Ca2 + señales de38,39,40,41, y la luz de alta intensidad podría también resultar en temperatura y estrés osmóticos, los cuales también provocan [Ca2 +]cyt elevaciones21,del25,42. En consecuencia, para reducir esas tensiones, es importante para realizar el experimento en una habitación bien ventilada y con temperatura controlada y evitar Tiempos de exposición innecesariamente largas. También es importante no alterar demasiado las hojas durante la separación o la microscopia para evitar que toque sacada [Ca2 +]cyt elevaciones43,44,45. Problemas pueden encontrarse también con colocar insectos. Con M. persicae, los insectos no colocar en las hojas en varias muestras. Esto podría ser el resultado de defensa produce heridas en las hojas desprendidas46,47, o la perturbación de los insectos por la luz azul. De hecho, visión en M. persicae se rige por tres fotorreceptores, uno de ellos con una sensibilidad máxima de 490 nm48. Reducir la exposición de microscopía y manejo de los áfidos con cuidado pueden reducir la angustia y alentar a resolver.

El protocolo descrito en el documento actual le da nuevas perspectivas en la comprensión molecular de las interacciones planta-insecto y la respuesta de la planta al estrés biótico. Permite la visualización de una de las primeras respuestas de la planta para alimentarse de insectos y facilita aún más las investigaciones mediante el uso de las considerable Arabidopsis recursos genéticos disponibles. Además, este protocolo permite el uso de organismos vivos, como los extractos de49 o elicitores50. En el futuro, esta técnica podría aplicarse a otros estreses bióticos, como otras especies de insectos, nemátodos y patógenos microbianos, así como a estreses abióticos. La microscopía de GCaMP3 puede modificarse también para otros tejidos de la planta, alternativa ROIs en la hoja, o plantas incluso toda la imagen. Además, existe el potencial para el biosensor que genéticaly en especies adicionales. En consecuencia, el protocolo descrito en este artículo tiene el potencial encubierto la base molecular de Ca2 + en una variedad de nuevas interacciones bióticas entre las plantas y otras especies.

Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) para el Consejo sobre microscopía. Los autores también desean agradecer a los departamentos de Entomología por su asistencia y John Innes Centre hortícola. Este trabajo fue financiado por una beca de doctorado de la Fundación John de Innes (T.V.), donación de B/JJ004561/1 de la BBSRC y la Fundación de John Innes (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. y D.S.), un año en colocación de industria de la John Innes Centre (M.A.) , una beca de verano de la sociedad bioquímica de la UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) y subvenciones MCB 1329723 y IOS 1557899 de la National Science Foundation (M.T. y S.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis John Innes Centre/Universty of Wisconsin - Step 1.1
100 mm2 square plastic plates R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water - For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis - - For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer) clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn - Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2 Hobbycraft 610101 To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate ThermoFisher Scientific 2101 To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil Wrap Film Systems, Telford, UK 26B06 To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap SC Johnson & Son, Racine, WI, USA To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope Leica Microsystems - For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0 Leica Microsystems Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a National Institutes of Health, USA) - For image analysis (Step 6.1)

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References

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Bioquímica número 126 calcio pulgón GCaMP microscopía insecto GFP
En tiempo real <em>en Vivo </em>la grabación de señales de calcio <em>Arabidopsis</em> durante la alimentación de insectos utilizando un Biosensor fluorescente
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Vincent, T. R., Canham, J., Toyota,More

Vincent, T. R., Canham, J., Toyota, M., Avramova, M., Mugford, S. T., Gilroy, S., Miller, A. J., Hogenhout, S., Sanders, D. Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor. J. Vis. Exp. (126), e56142, doi:10.3791/56142 (2017).

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