Summary
Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.
Abstract
Kalsiyum iyonları bitki savunma yanıt mikrobiyal elicitors ve böcekler, sistemik kalsiyum almak yanında çiklet neden yaralama için kurulan bir parçasını oluşturan kalsiyum sinyal ile biyotik etkileşimleri sırasında anahtar sinyal varlıklar olduğu tahmin edilmektedir bitkilerde sinyalleri. Ancak, kalsiyum vivo içinde biyotik stres sırasında rolü hala belli değildir. Bu iletişim kuralı tarafından hemipteran baş belası besleme sırasında bitkilerde kalsiyum sinyalleri tespit etmek için bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensör kullanımını açıklar. Hemipterans yaprak bitleri gibi küçük bir sayı içeren hücrelerin uzmanlaşmış, ağız, bir bitki yaralama yanıtından farklı bir biyotik stres ile karşılaşınca kalsiyum dynamics eğitim için ideal bir araçtır geliştirmelerde emme uzamış pierce. Buna ek olarak, floresan biyosensörler sinyal molekülleri in vivo hayvan ve bitkiler ölçüm devrim. Bitki kalsiyum dynamics gerçek zamanlı görüntüleme sırasında yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile besleme böcek için model bitki Arabidopsis thaliana GCaMP3, GFP tabanlı kalsiyum Biyoalgılayıcı ifade sağlar. Bir tekrarlanabilir ve sağlam tahlil öncesinde, sırasında ve sonra böcek besleme sitozolik kalsiyum dynamics sürekli ölçüm için izin müstakil GCaMP3 yaprakların Floresans mikroskobu ile geliştirilmiş. Bu bir hızlı kalsiyum son derece lokalize ayrıcalık birkaç dakika içinde oluşan site besleme yaprak biti çevresinde ortaya koymaktadır. Arabidopsis thaliana mutantlar hızlı oluşturulmasında olgusunun moleküler analiz kolaylaştırmak için kullanılmasına iken Protokolü gibi ek böcek türleri, diğer biyotik streslere için adapte edilebilir.
Introduction
Kalsiyum (Ca2 +) tesislerinde en her yerde sinyal unsurlardan biridir. Sitozolik Ca2 + konsantrasyonu geçici bir artış ([Ca2 +]cyt) akış yönündeki bileşenlere karmaşık ağ tarafından deşifre ve her iki abiyotik ve biyotik streslere1,2yanıt olarak ilgilenmektedir. [Ca2 +]cyt artış ilk yanıt için bitki savunma yanıt3,4,5ortak bir parçasını oluşturan mikrobiyal elicitors biridir. [Ca2 +]cyt yükselir ayrıca karşılık yaralama yanında çiklet böcekler, lepidopterans6,7gibi neden gözlenmiştir. Ancak, potansiyel rolü yalnızca birkaç hücreleri zarar biyotik tehditler yaşamak için2 + sinyalleri yanıt değil keşfedilmeyi Ca bitki. Yeşil şeftali yaprak biti Myzus persicae dünya tarım8,9, önemli bir tehdit temsil eden bir hemipteran böcek ve sızma2 + hücre dışı uzaydan içinde gözlenen Ca bırakır M. persicae10ile istila. Yaprakları bir floresan Ca2 + Biyoalgılayıcı, yaprak bitleri ve hangi ile GCaMP3 sunan yeni araçları kullanarak üzerinden M. persicae yemek yerken bitki Ca2 + ölçmek için sağlam ve yinelenebilir bir yöntem sinyalleri bu protokolü özetliyor Ca2 + rolü biyotik etkileşimleri sırasında incelemek.
CA2 +-seçici microelectrodes eski [Ca2 +] bitkiler11,12' ölçmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, Kollarındaki ve floresan yaklaşımları standart haline. Bu biyosensörler Ca2 + bağlamak ve ışık yayarlar un paralellik fırsatları Ca2 + dynamics hücreleri ve tüm dokularda çalışma izin. CA2 + biyosensörler boyalar enjekte veya stabil dönüştürme (genetik olarak kodlanmışYani, biyosensörler) yoluyla organizmanın genom dizisi kodlama Biyoalgılayıcı giriş üzerine üretilen. İkinci kolayca canlı doku olarak gösterilen ve hücre altı Yerelleştirme13yeteneğine sahip olmanın büyük avantajlar sunuyor. Aequorea victoria (denizanası) izole aequorin protein bitkiler14' te dağıtılan ilk genetik olarak kodlanmış Ca2 + Biyoalgılayıcı olduğunu. Kollarındaki bir protein aequorin ağartma chromophore ve autofluorescence15önler dış ışık tarafından uyarma gerektirmez. Aequorin başarıyla Cerayanlar [Ca2 +] sıcaklık16, patojenler17,18,19da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt ölçmek için kullanılan, tuz stres20 ,21ve yaralama7. Ancak, tek tek hücreleri ve zavallı sensör ifade zor13kurcalayarak [Ca2 +] Cerayanlar tespiti yapmak nispeten düşük sinyal şiddeti tarafından dezavantajlı.
Bu belli Ca2 + biyosensörler gelişimi detaylı hücre altı ve doku düzeyinde analiz Ca2 + dynamics için izin vererek aequorin tamamlanmaktadır. Floresans rezonans enerji transferi (FRET) are bir-in en yaygın floresan biyosensörler-Cameleons dayalı. PERDE Cameleons iki protein, genellikle CFP ve YFP, Ca2 + CFP-YFP bağlayıcı bölge, calmodulin etki alanına bağlama tarafından indüklenen konformasyonal değişim tarafından yakın temas getiren oluşur. Bu kişinin enerji aktarımı CFP YFP için ve bu fluorophores floresan elde edilen değişikliği için [Ca2 +] miktar doğru iki floresan sinyallerini oranının hesaplanması ile sağlar fluorophores22. Onlar daha az protein23 ifade düzeyi tarafından etkilenen ve sık sık büyük bir floresan verim var gibi hücresel ve hücre altı görüntüleme23için izin aequorin ve sigara ratiometric floresan boyalar için üstün perde Cameleons. Örneğin, FRET Cameleons son zamanlarda uzun mesafe Ca2 + sinyalleri tesislerinde tanımlamak ve bunlar hücresel düzeyde24,25,26gidermek için kullanılmıştır.
Son bir atılım floresan GFP tabanlı Ca2 + biyosensörler ile son derece hassas tek-fluorophore (tek-FP) biyosensörler gelişme olmuştur. Tek-FP biyosensörler oluşur tek bir dairesel yayın sıralanmış GFP bağlı bir calmodulin ve M13 peptid, calmodulin için bağlama, yani bir su-aracılı tepki GFP arasındaki calmodulin sonuçlanan Ca2 + ile protonate GFP ve artış Floresan verim27,28,29. Tek-FP sensörler perde Cameleons, basit deneysel tasarım ve potansiyel olarak daha yüksek bir zamansal çözünürlük30görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunuyor. Her ne kadar tek-FP sensörler mutlak [Ca2 +] basit ölçmek olamaz zamansal ve mekansal dinamiklerini Ca2 + analizi5,23sinyalleri için FRET sensörler üstün olduklarını. GCaMPs bir best-established tek-FP sensörler28 ve kendi floresan verim, dinamik alan, Ca2 + benzeşme ve sinyal noise oranları31,32 artırmak için çeşitli revizyonlar uğramıştır , 33 , 34. GCaMPs başarıyla kullanıldığını hayvan sistemleri, Zebra balığı motor nöronlar35 ve meyve nöromüsküler kavşak34sinek gibi. GCaMP3 rasgele mutagenesis tek-FP sensörler, vericiyi GCaMP636 ve GECOs29dahil olmak üzere ek sınıflarda sonuçlandı. GECOs son zamanlarda Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis da adlandırılır) Ca2 + Cerayanlar ATP, kitin ve bakteriyel elicitor flg22 karşısında ölçmek için kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada de R-GECO Biyoalgılayıcı perde Cameleon YC3.6 maksimal sinyal değişikliği ve sinyal-gürültü oranı5açısından geride gösterdi.
Kullanım kolaylığı, yüksek floresan verim ve GCaMP biyosensörler ile elde edilebilir yüksek zamansal çözünürlük nedeniyle, GCaMP3 altında karnabahar mozaik virüsü 35S organizatörü Arabidopsis içinde genetik olarak kodlanmıştır. GCaMP3 tarafından ölçülen Ca2 + sinyalleri detaylı moleküler analizi için genetik araçları Arabidopsis araştırma için kullanılabilir sağlar. Buna ek olarak, GCaMP3 Biyoalgılayıcı bir costlier confocal sistemi yerine bir floresan mikroskop altında görüntülenmeyecektir. Bu iletişim kuralı bütün doku Imaging, ne zaman canlı biyotik streslere ile deneyler temel sağlar. Öyle ki su, böcek kaçış önlemek için ve belirli bir dokusu ile besleme kısıtlamak için müstakil 35S::GCaMP3 bitki yapraklarından satışa çıkardı deney tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan yöntemi bu nedenle M. persicae tarafından besleme sırasında yaprak Ca2 + dinamikleri analiz için sağlar, yanıt sinyali bir roman bitki karakterizasyonu kaynaklanan. Bu yöntem aynı zamanda ek böcek türleri ve mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere ve kökleri gibi diğer bitki doku ile çalışmaya adapte edilebilir.
Protocol
1. bitki hazırlık (gün 1 - 4)
- 1 günde üç % 75 etanol yıkar, yıkama ve plaka başına 1 dk kullanarak tohum onları 100 mm 2 ¼ mukavemetli Murashige ile Plastik tabaklar kare 35S::GCaMP sterilize ve Skoog (MS) orta (tarifi: Murashige ve Skoog orta, 7.5 g Sükroz, 10 g Formedium agar, 1 L de-iyonize su 1.1 g) 37.
- 8 ° C'de zaman uyumlu çimlenme elde etmek için üç gündür karanlıkta fidan tabakalaşmak.
- Gün deneme 4, 16 h ışık ve 8 h karanlık photoperiod ile 23 ° C'de kontrollü ortam Oda (CER) GCaMP fidan taşımak.
2. Böcek Rearing (gün 11 - 12)
- gün deneme 11, 15 yetişkin M. persicae nemli bir sanatçı kullanarak 5-hafta-yaşlı toprak yetiştirilen Arabidopsis bitkiler için eklemek ' (CER 10 h ışık ve 14 h karanlık photoperio ile 22 ° C'de yetiştirilen s boya fırçası (2 veya 4 boyutu) d).
- çevrede belgili tanımlık bitki ve kap plastik bir kapak ile açık bir plastik boru (10 cm x 15 cm) yerleştirerek yaprak bitleri bitki üzerinde kafes.
- Yaprak biti musallat bitkiler için 24 saat 16-h ışık ve karanlık 8-h photoperiod ile 22 ° C'de bir CER bırakın.
- Üzerinde gün 12 deneme, tüm yetişkin M. persicae bir fırça kullanarak kaldırmak.
Not: Böcekler bitkinin göz tarafından görülebilir. Bu perileri ile benzer bir gelişimsel yaş nüfusu verir. Kabaca 1 perisi yetişkin başına bu dönemde üretilecek. - Boyutu çok hızlı artan perileri önlemek için bir 8 h ışık ve 16 h karanlık photoperiod ile bir alt-sıcaklık CER 16 ° C'de musallat bitkiler bırakın.
3. Yaprak dekolmanı (gün 19)
- gün 19 deneme, 35S::GCaMP3 fidan CER kaldırmak ve keskin makas kullanarak her bitkiden en büyük yaprak ayırın.
- Bir çift cımbız kullanarak 300 µL distile su, abaxial yüzey yukarı dönük olacak şekilde içeren bir 96-şey kalıbının kuyuya müstakil yaprak yer. Yineleme için ek yaprakları ( şekil 1).
Resim 1: 35S::GCaMP3 yaprak tahlil. Her 16 bayat 35S::GCaMP3 Arabidopsis fide en büyük yaprak ilişkisi kesildi ve 300 µL distile su bir 96-şey plaka üzerinde süzülüyor. Dekolmanı ertesi gün çekilen fotoğraf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- plaka şeffaf plastik wrap ve alüminyum folyo kapak ve oda sıcaklığında çökmek üzere müfrezesi stres izin vermek için gece bırakın.
4. Floresans mikroskobu (gün 20 - 22)
- 20 gün deneme ve floresan stereomicroscope transfer alüminyum folyo 96-şey plaka çıkarın. Stereo Floresans mikroskobu ile 450-490 nm ışık GFP heyecanlandırmak için ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında yakalamak için yapılandırın.
- Yaşında yaprak bitleri bitki topraktan çıkarıp bir kapak ile şeffaf bir kutu yerleştirerek gün 11 kurulan koloni toplamak. Deney sırasında kutusunda yer alan böcekler devam.
- 96-şey plaka mikroskop altında yerleştirin. GCaMP3 floresan açıkça müstakil yaprakları damarlarında görüntülenmeyecektir kadar ışık pozlama değiştirmek. Pozlama tüm deneyler için sabit tutmak; Geçerli iletişim kuralı için bir 1-s pozlama 3.5 ( Şekil 2) bir kazanç ile kullanıldı.
- Öyle ki 4 kuyu bir çerçevede görülebilir büyütme ve mikroskop zoom ayarlayın; geçerli iletişim kuralı için bir 7,8 X büyütme ve-127.833 mm odak kullanıldı.
- Bir yaprak biti nemli boya fırçası kullanma mikroskop altında müstakil bir yaprak aktarın. Bitişik bir yaprak bir denetim olarak tedavi edilmezse terk ama yaprak biti aktarım sırasında oluşan dokunmadan taklit etmek için boya fırçası ile hafifçe dokun. Böcek kaçan gelen önlemek için mikroskobu sırasında geri 96-şey plaka üstüne plastik wrap yerleştirmek unutmayın.
- Başlamak çiftleri (1 yaprak biti tedavi ve tedavi edilmezse 1) yapraklarında Floresans kaydı tıklatarak " deneme başlatmak " içinde belgili tanımlık yapılı-içinde mikroskop bilgisayar yazılımı ( Şekil 2). Kayıt 50dk ölçülerini
Not: geçerli iletişim kuralı, bir zaman aralığı 5 için s ölçümler arasında kullanıldı. - Sonra 50 dk, yanında tıkırtı üstünde kaydı durdurmak " durdurmak deney " ve yaprak yaprak biti kaldırmak. Floresans ölçümleri görüntü dosyaları (Örneğin, etiketli görüntü dosyası biçimi, TIFF) olarak kaydedin.
- Yaprak daha fazla çiftleriyle denemeyi tekrarlamak; görüntüleme 2 genotip eşzamanlı görüntüleme için izin veren bir kerede 2 Çift yaprak görüntüye uzatılabilir.
5. Veri toplama
- görüntü dosyaları Fiji (görüntü J) alabilir ve yanında tıkırtı üstünde 32 bit dönüştürebilir " resim " > " türü " > " 32-bit; " bu heatmap videolar (bkz. adım 7) görüntülerin dönüşüm sağlar.
- Atmak içinde yaprak biti razı tek bir konumda birden fazla 5 min için mikroskop altında böcek hareketi görüntüleyerek örnekleri.
Not: Bu kez örnekleri çoğunluğu, ve en çok 100 tedaviler başarılı yerleşme sergilenmesi 30 örnekleri bulmak için gereken. - Piksel (veya biliniyorsa mm, Dönüştür) Ölçüm ölçeği ve zaman dilimi için kullanılan aynı zaman aralığını mikroskobu sırasında yanında tıkırtı üstünde ayarlayın " resim " > " özellikler. "
- Tu§ları doku GFP analiz için çevresinde ilgi (ROI) bir bölge koyun.
Not: geçerli protokolünde bir dairesel ROI 50 piksel (0,65 mm) çapında kullanıldı faiz 3 yerlerde: site (Fs), midrib (Sm) yaprağın sistemik bir bölge ve sistemik bölge midrib için bitişik besleme yaprak biti (" lateral doku " Sl) ( Şekil 2).- Yatırım Getirisi bir oval çizerek oluşturma (kullanın " oval aracı ") ve boyutu kullanarak düzenlemek " düzenleme " > " seçim " > " belirt. " bkz: Şekil 2.
- Bu tedavi yaprak (Yani, yaprak yaprak biti tedavi yaprağına beslenen nerede olarak aynı bölge) seçili yaprak karşılaştırılabilir bölgelerinde ROIs tedavi edilmezse denetim için seçin ( Şekil 2).
Resim 2: GCaMP3 floresan mikroskop altında analiz. Sol: tedavi edilmezse denetim yaprak. Sağ: yaprak yaprak biti tedavi. Yaprak biti beslenme sitesi ok ucu ile belirtilir. Ölçek çubuğu 1 mm. (a) parlak alan görüntü =. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. (B) GFP görüntü showiNG Floresans kantitatif analiz için kullanılan ROIs. FS = besleme site, Sm sistemik midrib, Sl = sistemik yan doku =. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. GFP 450-490 nm metal halide lamba kullanarak heyecan duymuştur ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında ele geçirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- tıklatarak zaman serisi Çözümleyicisi eklentisi kullanmak " eklentileri " > " zaman serisi Analyzer " (F) ham Floresans değerlerde ROI zamanla çözümlemek için. İlgi YG ekleyin (" Ekle [t] "). ROI seçili olduğundan emin yapma seçin " ortalama; al " bu o yatırım Getirisini her çerçeve için F değerlerinin bir tablosu görüntüler.
- Bu verileri elektronik tabloya kopyalayın.
- Beslenme sitesi sinyal alan bölge kullanarak seçerek hesaplamak " serbest seçim aracı. " maksimal GFP sinyal anahat ve sonra bu şeklin alanını tıklatarak hesaplamak " analiz " > " ölçü birimi. "
- Tıklatarak MTrackJ eklentisi kullanarak beslenme site sinyal hızını hesaplayın " eklentileri " > " izleme " > " MTrackJ. "
- tıklayın üzerinde " Ekle " düğmesini tıklatıp ardından imleci ortasına ilk görünür olduğunda sinyal. Tıklayın tekrar sinyal onun noktada en uzak kenarına yayıldı. ' I tıklatın " ölçü " sinyal hızını hesaplamak için.
6. Veri analizi
- tanımla yaprak biti Fiji mikroskobu üzerinden görüntü kareleri ile oynayarak yerleşme amacı.
Not: yerleşme zamanı sırasında yaprak biti 5 dakika veya daha fazla tek bir konumda kalır çerçevedir. Olaylar yerleşme süresi de Fiji görüntülerden hesaplanabilir. - Normale göre denklem ΔF/F F veri (ΔF/F) = (F - F 0) / f 0 F 0 ortalama temel Floresans nerede, hesaplanan F ortalama kayıt önce yaprak biti ilk 60 kare üzerinden gelen yerleşmiş. Tedavi edilmemiş kontrol için tekrar ediyorum.
- Tedavi ve tedavi edilmezse varak ki ROI için zaman içinde normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) arsa. Tedavi edilmemiş kontrol büyük Ca 2 + geçişler (Yani, ΔF/F yükselir yukarıda 0,2) gösteriyorsa örnekleri (her iki yaprağı) atmak.
- Genotip en az 20-30 uygun örnekleri analiz var kadar yineleyin.
7. Zaman-ders Video oluşturma
- 32-gem imge eğe içine heatmaps tıklatarak NucMed_Image AÜSS eklentisi kullanarak dönüştürmek " eklentileri " > " NucMed " > " arama tabloları. " arama tabloları menüsünde seçin " mavi yeşil kırmızı " ısı haritaları için görüntüleri dönüştürmek.
- Yaprak biti elde edildi GFP vurgulamak için heatmap karşıtlığını sinyalleri kullanarak geliştirin " işlem " > " kontrastı Artır " > " ayarlamak doymuş piksel %. "
- Ekle zaman bilgi yanında tıkırtı üstünde zaman Stamper eklentisi kullanarak " eklentileri " > " zaman Stamper ". Ayarla " başlangıç saati ", " 0 " ve " aralığı " mikroskobu (Örneğin, 5 s) için kullanılan saat aralığı temel.
- Bu video bir audio video Interleaved (AVI) dosyası olarak verin.
Not: Bu video sonra düzenlenebilir daha diğer yazılım paketleri (Örneğin, Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Şekil 3 ve şekil 4 vardır temsilcisi sonuçları bir yaprak biti tedavi yaprağı Tedavi edilmezse denetimi ile karşılaştırarak bir deneme. Ca2 + dynamics tedavi edilmezse denetim yaprak kalmak nispeten (şekil 3A ve 3B) kararlı iken GFP Floresans çok yerelleştirilmiş bir artış örnekleri, çoğunluğu bir kaç dakika içinde beslenme sitenin etrafında görülebilir. GFP Floresans bazı deneyler (3B rakam) ilk zirve sonra ikincil artar gözlemlemek mümkündür. % 50 tedavi yaprak, yaprak bitleri değil razı ve örnekleri atılmalıdır. Hangi yerleşme oluşur içinde örnekleri örnekleri % 27'si açık artar GFP floresan çevresinde besleme (şekil 3 c ve Tablo 1); içinde sergilemek değil Bu nedenle, 25-30 Çoğalt örnekleri kantitatif analiz için ortalama. Çevrenin görselleştirme ve beslenme sitesi [Ca2 +]cyt yükselme hızı yaklaşık 110 µm 6 µm/s (Tablo 1) seyahat bir sinyal ortaya çıkarmak. Buna ek olarak, hiçbir [Ca2 +]cyt yükselmeler sistemik yaprak yaprak biti tedavi, sistemik midrib (şekil 4A) veya sistemik yan doku bölgeleri (şekil 4B) üzerine içinde tespit edilmelidir. Temsil edici bir örnek [Ca2 +]cyt dinamiklerinin zaman içinde Video 1' de gösterilen. Yaprak biti yerleşim davranışı numarası ve mikroskop altında bireysel dispersiyon olayların süresini izleyerek analiz etmek mümkündür. Bu davranışlar için temsilcisi sonuçları Tablo 1' de, yerleşmeden önce yaklaşık 10 dk yaprak bitleri almak ve başarıyla razı olduğunda, bu ortalama için 20 dakika sürer gösterilen gösterilir. Bu nedenle, böcekler [Ca2 +]cyt ayrıcalık tamamını için tek bir konum düzenlenmiştir.
Şekil 3: GCaMP3 algılamak yaprak biti elde edildi Ca için kullanılabilir2 + besleme sitedeki müstakil bırakır, sinyalleri. Sol: temsilcisi izlemeler (n = 30) normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) 35S::GCaMP3 yaprak. besleme sitenin çevresinde, İzlerini 5 dk 25 dk sonrası yerleşme kadar yerleşmeden önce görüntüler. Denetim eşdeğer bir tedavi edilmezse 35S::GCaMP3 yaprak konumunda =. Sağ: temsilcisi stereomicroscope görüntüsücyt 35S::GCaMP3 yaprak ücreti besleme bir yaprak biti görülme [Ca2 +] ayrıcalık. GFP Floresans iç metin ölçeğin göre renk kodlu. Özetlenen beyaz ve beslenme sitesi yaprak biti kimliği ok ucu ile gösterilir. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. GFP 450-490 nm metal halide lamba kullanarak heyecan duymuştur ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında ele geçirildi. (A) bir büyük yaprak biti kaynaklı [Ca2 +]cyt ayrıcalık örneği. (B) bir ortalama yaprak biti kaynaklı [Ca2 +] örneğicyt ayrıcalık. (C) hiçbir yaprak biti kaynaklı [Ca2 +]cyt ayrıcalık örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Parametre | Ortalama (± SEM) |
| [Ca2 +] CYT yükseklik | |
| Örnekleri [Ca2 +]cyt ayrıcalık görüntüleme yüzdesi | % 73 |
| Hızını dalga açık bir | 5.9 µm/s (± 0,6) |
| Yayılan en fazla alan | 110 µm2 (± 18) |
| Yaprak biti davranış | |
| Yerleşir sayısı (> 5 dk) | 2 (± 0.1) |
| Yerleşir (tüm sürelerin) toplam sayısı | 3,8 (± 0,4) |
| B görüntüleme için zaman yerleşti | 20 dk (± 2) |
| Zamana kadar ilk yerleşmek c | 11 dk (± 1.4) |
| Harcanan toplam zamanın yerleşmiş | %62 (± 3) |
Tablo 1: [Ca2 +]cyt yükseklik ve yaprak biti davranış parametrelerini 35S::GCaMP3 sırasında görüntüleme. Parametreleri hesaplanan yerleşme hangi içinde kalıcı örneklerinden > 5 dk oluştu. (A)hızını görünür sinyal başlama noktasından en uzak noktaya yayılmış. (B) süresi Floresans çözümlemesi için kullanılan ilk yerleşim olaylar. (C) görüntüleme başlangıcı ve ilk yaprak biti arasındaki sürenin uzunluğunu yerleşmek. [Ca2 +] Bitki hücre için daha önce gönderdiğiniz cyt yükseklik verileri (geçerli durumu: ilk QC).
Resim 4: GCaMP3 yaprak biti elde edildi Ca2 + sinyalleri besleme siteye sistemik algılayamaz. Temsilcisi izlemeler (n = 30) normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) sitedeki besleme yaprak biti için sistemik yerlerde, 35S::GCaMP3 bırakıyor. İzlerini 5 dk 25 dk sonrası yerleşme kadar yerleşmeden önce görüntüler. Denetim eşdeğer bir tedavi edilmezse 35S::GCaMP3 yaprak konumunda =. (A)ΔF/F sistemik midrib bölgesi. (B) ΔF/F sistemik yan doku bölgesinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: GCaMP3 Variety zamanlı bir yaprak biti beslemeleri olarak. GFP Floresans iç metin ölçeğin göre renk kodlu. Yaprak biti besleme sitesinin konumu ok ucu ile belirtilir. Sol: bir M. persicae için yetişkin maruz 35S::GCaMP3 yaprağı. Sağ: Bir 35S::GCaMP3 no-yaprak biti denetimi yaprak. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntemi bitki gerçek zamanlı analiz için böcek besleme gibi biyotik stres sırasında sinyal Ca2 + sağlar. Bu tür tehditlerin ilk bitki yanıtlarını bir yerelleştirilmiş [Ca2 +]cyt yükselmesine beslenme çevresinde böcek biri olduğunu gösterir. Mutantlar kullanımı ile bu yöntem sağlayacak böyle sinyallerin moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu daha önce mümkün değildi. Bu iletişim kuralı kritik bir adımda müstakil yaprakları (Adım 3.2) ayırma işlemi sırasında veya böcekler yaprakları (Adım 4.5) aktarırken aşırı rahatsız olmadığını sağlamaktır. Geçerli protokol bir mutlak konsantrasyon yerine [Ca2 +]cyt göreli bir ölçü sağlar verilen bu mikroskop ayarları deney boyunca sabit tutulur hayati önem taşımaktadır. Ayrıca insan önyargı için potansiyel ROIs yelpazesi ve veri analizi sırasında ve bu nedenle, bu deneyler çift-kör yapılmaktadır önerilir.
Bu iletişim kuralı ile biyotik stres sırasında [Ca2 +]cyt ölçme çok önemli avantajı vardır. Birincisi, tek bir fluorophore ile yüksek bir floresan verimli kullanımı confocal mikroskop kullanarak daha az pahalı olduğu bir stereomicroscope üzerinde yapılacak görüntüleme sağlar. Kaydetmek için bir ölçüm olarak tek bir fluorophore da veri toplama ve analiz basit, kullanır. Buna ek olarak, bir stereomicroscope kullanımına bitki yaprak biti etkileşimler de dahil olmak üzere birçok biyotik etkileşimler meydana büyük bir kayma ölçekte verilen bu gerekli olan tüm yaprakları, görüntüleme için izin verir. Görüntü yüksek zamansal çözünürlük GCaMP3, bağlama23,30 ve yüksek floresan verim sonra Ca2 + algılayıcı disassociation hızlı temel ile mümkün yakalama, ilâ alınması ölçülerini sağlar Her 5 s. Ayrıca, yaprak tahlil böcek, Bütün bitkiler (hazırlık aşamasında)üzerinde bu tür deneyler için adım sınırlayan bir anahtar kaçış engeller. Müstakil yaprakları da böcek önce sırasında ve sonrasında beslenme Ca2 + dinamikleri analiz için izin önceden tanımlanmış bir konumdan beslemeleri emin olun. Bu iletişim kuralı da benzer gelişim aşamalarında yaprakları analiz için kullanılmasını sağlar.
Ana dezavantajı ise bu protokol bir sigara ratiometric Biyoalgılayıcı kullanımından kaynaklanır. İle tek-FP biyosensörler, GFP emisyon varyasyon [Ca2 +]cyt, hücresel pH, hareket veya Biyoalgılayıcı ifade düzeyinde değişiklikler gibi dışında deneysel değişkenleri neden olabilir. YFP CFP enerji aktarımı yalnızca Ca2 + bağlama üzerine gerçekleştiği sırada bu sorunları perde Cameleons ile perde sırasında karşılaşılan değil. Bireysel fluorophores floresan özelliklerini değiştirmek diğer koşullara karşı değişiklikleri CFP yoğunluğunu YFP taklit vermemektedirler ve bunların çoğu ölçülerini doğal olarak kullanılır ratiometric hesaplama normalleştirir diğer optik eserler23,30. Bu mutlak [Ca2 +]cyt tahminler FRET Cameleons ile daha güvenilir kılar. Algılamak ve bitkiler5,(in preparation)biyolojik olayları ayırdetmek hala yeterli olsa da sonuç olarak, GCaMP3 en iyi bir Biyoalgılayıcı göreli [Ca2 +]cyt, ölçmek için kullanılır. Bu nedenle, gözlenen etkisi Ca2 +Ca dahil2 +nedeniyle, olduğunu göstermek için denetimleri kullanmak esastır-genetik mutantlar(hazırlık aşamasında) veya farmakolojik Ca2 + kanal inhibitörleri La3 + gibi ilişkili . Önemlisi, tek-FP biyosensörler genellikle büyük floresan verim ve daha fazla dinamik alan (Yani, Variety Ca2 + bağlama üzerine bir artış) perde Cameleons23GCaMP için daha uygun hale getirir, daha görüntüler doku düzeyinde görüntüleme, perde Cameleons bir confocal mikroskop5,25ile hücresel görüntüleme için yararlı bir araç iken.
Bu iletişim kuralı çalıştırılırken, bazı konularda sorun giderme gerektiren ortaya çıkacak mümkündür. Örneğin, bu büyük [Ca2 +]cyt yükselmeler vardır (tedavi edilmezse) denetim yaprak görüntüler (adım 6.3) atılma örnekleri önerilir. Böyle geçişler olasılıkla mikroskobu tarafından indüklenen stres sonucu oluşur. Gerçekten de, mavi ışık bilinen Ca temin için sinyalleri2 + 38,39,40,41ve yoğun ışık da sıcaklık ve ozmotik vurguluyor, neden olabilir her ikisi de Ayrıca [Ca2 +]cyt yükselmeler21,25,42temin. Sonuç olarak, böyle stres azaltmak için iyi havalandırılmış ve ısı kontrollü bir odada deney yapmak için ve gereksiz yere uzun pozlama süreleri önlemek için önemlidir. Yaprakları aşırı dekolmanı veya dokunmatik elde edildi [Ca2 +]cyt yükselmeler43,44,45önlemek için mikroskobu sırasında değil bozmaya önemlidir. Sorunlarla da böcek yerleşme ile karşılaşılabilir. M. persicaeile böcekler birkaç örnekte yapraklarda razı değil. Bu yara elde edildi savunmasında müstakil yaprakları46,47ya da böcekler tarafından mavi ışık rahatsızlık sonucu olabilir. Nitekim, M. persicae imgelemde 490 nm48bir en yüksek hassasiyetle da dahil olmak üzere üç photoreceptors tarafından yönetilir. Mikroskopi maruz kalma azaltmak ve yaprak biti itina ile işleme sıkıntı azaltmak ve yerleşme teşvik olabilir.
Geçerli kağıt özetlenen Protokolü bitki böcek etkileşimleri moleküler anlayışı ve biyotik stres bitki yanıt üzerine yeni anlayışlar verir. Bu böcek besleme için ilk bitki yanıtlardan birini görselleştirme sağlar ve araştırmalar önemli Arabidopsis genetik kaynakları kullanılabilir kullanımı ile daha da kolaylaştırır. Ayrıca, bu iletişim kuralı için canlı organizmalar, kullanımına izin verir olarak49 veya elicitors50ayıklar. Gelecekte, bu teknik ek böcek türleri, nematodlar veya mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere yanı sıra abiyotik stres uygulanabilir. GCaMP3 mikroskobu diğer bitki doku, yaprak veya hatta bütün bitkiler alternatif ROIs görüntü için de değiştirilebilir. Ayrıca, genetik olarak Biyoalgılayıcı için potansiyel olduğunuly ek bitki türü kodlanmış. Sonuç olarak, bu yazıda belirtilen iletişim kuralı moleküler temeli bitki ve diğer türler arasında roman biyotik etkileşimlerin bir aralıktaki sinyal Ca2 + gizli potansiyeline sahiptir.
Disclosures
Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Mikroskobu ile ilgili tavsiyeler için Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) teşekkür etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca John Innes Merkezi Bahçe ve Entomoloji bölümler onların yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser bir doktora öğrencilik gelen John Innes Vakfı (TV), tarafından desteklenen hibe B/JJ004561/1 BBSRC ve John Innes Vakfı (TV, M.A., J.C., S.M., S.H., m. ve D.S.), bir yıl içinde sanayi yerleşim John Innes Merkezi (M.A.) , İngiltere'de (JC), JST PRESTO (M.T.) ve hibe MCB 1329723 ve IOS-1557899 Ulusal Bilim Vakfı (M.T. ve S.G.) biyokimyasal toplumdan bir yaz öğrencilik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
