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Developmental Biology

Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521

Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/56146
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 2Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

Summary

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Abstract

Le condizioni prive di Xeno e completamente definite sono parametri fondamentali per una generazione robusta e riproducibile di cellule pluripotenti indotte da umano omogeneo (hiPS). La manutenzione delle cellule hiPS sulle cellule alimentatori o alle matrici non definite sono suscettibili a varianze di lotto, alla contaminazione patogena e al rischio di immunogenicità. Utilizzando la matrice umana ricombinante laminina umana 521 (LN-521) in combinazione con formulazioni di media xeno e definite, riduce la variabilità e consente la generazione costante di cellule hiPS. Il virus Sendai virus (SeV) è un sistema basato su RNA non integrato, evitando quindi le preoccupazioni associate al potenziale effetto dirompente sull'integrità genoma che i vettori integranti possono avere. Inoltre, questi vettori hanno dimostrato un'efficienza relativamente elevata nella riprogrammazione dei fibroblasti dermici. Inoltre, la passaggistica cellulare singola enzimatica agevola la manutenzione omogenea delle cellule hiPS senza una notevole esperienza precedente di ce ce ceCultura. Qui descriviamo un protocollo che è stato ampiamente testato e sviluppato con particolare attenzione alla riproducibilità e alla facilità d'uso, fornendo un modo robusto e pratico per generare cellule umane hiPS definite e prive di xeno dai fibroblasti.

Introduction

Dal momento che la prima derivazione delle linee cellulari hiPS da Takahashi et al. 1 , 2 , le cellule hiPS hanno fornito uno strumento utile per la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e come materiale di origine per la generazione di terapie cellulari in medicina rigenerativa 3 . La coltura di cellule hiPS è da tempo dipendente dalla co-coltura con le cellule di alimentazione di fibroblasti 4 , 5 o su Matrigel 6 e con formulazioni di supporto contenenti serum bovino fetale (FBS). Le varianze batch-to-batch sono una conseguenza comune della natura indefinita di queste condizioni di coltura, con conseguente variazioni imprevedibili, che contribuiscono in modo significativo alla inaffidabilità di questi protocolli 7 . Lo sviluppo di un mezzo definito come Essential 8 (E8) 8 e le matrici di colture cellulari definite ad esempio LN-521 9 , consentonoS per la creazione di protocolli altamente riproducibili e aiuti nella robusta generazione e manutenzione di cellule hiPS omologate 7 , 8 , 9 , 10 .

Lo sviluppo di tecniche di riprogrammazione gratuite di integrazione è stato un salto in avanti. Originariamente, la riprogrammazione dipendeva da vettori retrovirali che sono stati integrati in modo casuale nel genoma con effetti disruptivi sull'integrità genomica 11 . I progressi nelle metodologie di riprogrammazione includono lo sviluppo di vettori basati su RNA. I vettori RNA hanno un vantaggio rispetto al metodo di riprogrammazione basata sul DNA, poiché l'integrazione involontaria attraverso la ricombinazione genomica non è possibile 12 . I vettori SeV forniscono un'elevatissima e transitoria di fattori esogeni attraverso RNA a singolo filamento senza una fase DNA- 11 . I vettori di riprogrammazione consegnati dal SeVSono diluiti per tutta l'espansione cellulare e, infine, spurgati dalla cultura fornendo un metodo di riprogrammazione libero. Successivamente, la manutenzione della pluripotenza dipende dall'espressione endogena dei geni pluripotenziali 2 .

Poiché pionieristici terapie a base di cellule hiPS stanno cominciando a passare a studi clinici, le richieste di lotti standardizzati, la riproducibilità e la sicurezza sono questioni essenziali per affrontare 13 . Pertanto, i prodotti di origine animale devono essere evitati. Ad esempio, l'uso di prodotti xenogeneici è stato associato al rischio di contaminazione degli agenti patogeni non umani. Inoltre, le cellule colte in presenza di componenti animali della coltura animale hanno dimostrato di incorporare acidi silici non umani nelle membrane cellulari che minaccia di rendere le cellule derivate immunogeniche 14 . Quindi, la necessità di eliminare i prodotti xenogeneic è necessaria per qualsiasi futura ricerca clinica. Questo protocollo si applica xeCultura priva di libertà e definizione nel mantenimento delle cellule hiPS che muovono le cellule più vicine alla conformità clinica.

Questo protocollo descrive un metodo coerente, altamente riproducibile e facile da usare che genera cellule hiPS standardizzate dai fibroblasti. Offre inoltre un sistema di coltura di facile utilizzo per la manutenzione di cellule hiPS stabilite. Questo protocollo è stato utilizzato per ricavare più di 300 linee di cellule hiPS nel centro nazionale svedese di iPS Core a Karolinska Institutet di cui alcune linee sono state precedentemente descritte 15 , 16 .

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Protocol

La raccolta del materiale del paziente e la derivazione delle cellule hiPS è approvata dal Consiglio di revisione dell'etica, Stoccolma, 28 marzo 2012, Numero di registrazione: 2012 / 208-31 / 3. Le fasi della coltura cellulare devono essere eseguite in armadi di biosicurezza, salvo diversa indicazione. Praticare sempre tecniche di manipolazione sterili quando si lavora con le cellule. Lasciare che i supporti, le lastre e i reagenti raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare. Incubare le cellule a 37 ᵒC, 5% CO 2 in alta umidità.

1. Isolamento di fibroblasti umani da biopsia cutanea

  1. Preparazioni di medium di coltura, enzimi digestivi, rivestimento di piatti e strumenti di dissezione.
    1. Preparare il medium Fibroblast: 44,5 ml di Medius Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove, 5 ml di fegato fetale bovino (FBS) e 500 μL di penicillina / streptomicina (PEST) (vedere tabella 1 ), conservare a 4 ° C.
    2. Preparare gli enzimi digestivi ad una concentrazione di lavoro di 1 mg / ml: weiGh aliquote di 4 mg di dispasi e collageno di tipo I in tubi separati da 15 ml e si sciolgono in 4 mi di DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilizzare la soluzione enzimatica passandola attraverso un filtro da 0,22 μm. Preparare ogni volta le soluzioni enzimatiche fresche.
    3. Cappare un pozzetto in una piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti (o piatto da 35 mm di coltura tissutale) per biopsia sezionata con 1 ml di gelatina 0,1% in soluzione salina fosfata tamponata (DPBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Autoclave un set di forbici chirurgiche e pinze per biopsia per la dissezione.
  2. Manipolazione biopsia
    NOTA: procedere alle biopsie del processo il più velocemente possibile dopo essere state prese. Conservare in PBS + 1% PEST per un massimo di 48 ore a 4 ° C. La biopsia dovrebbe essere di 2 - 4 mm di diametro e secondo i permessi etici.
    1. Trasferire la biopsia in un piatto da 35 mm. Spostare la biopsia in un nuovo piatto da 35 mm e immergere la biopsia in 2 ml di etanolo al 70% per 30 s.
    2. Spostare la biopsia in un terzoPiatto da 35 mm e lavare con 1 ml di soluzione salina equilibrata Hank (HBSS) sterile, completa di PEST 1%.
    3. Trasferire la biopsia in un quarto piatto da 35 mm, aggiungere 1 ml di soluzione di dispersione al 0,1% di preparati freschi.
    4. Tagliare la biopsia cutanea in 1 - 2 mm 3 pezzi nel piatto utilizzando forbici e pinze chirurgiche e trasferire pezzi di biopsia inclusa la soluzione di dispersione in un tubo da 15 ml. Aggiungere un ulteriore 2 ml di dispersione.
    5. Sciacquare il piatto da 35 mm con una soluzione di dispasione da 1 ml e trasferire nel tubo da 15 ml.
    6. Incubare la biopsia a 4 ° C per una notte.
    7. Aggiungere 4 ml di collagenasi I 0,1% al tubo e incubare a 37 ° C per 4 ore.
    8. Centrifugare le cellule digerite 300 xg per 3 min, aspirare il surnatante e risospendere il digest in 2 mL di mezzo di fibroblasto.
    9. Rimuovere la soluzione di gelatina dalla piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti. Trasferire la sospensione cellulare includendo eventuali pezzi rimanenti a una piastra di coltura di tessuti a 6 pozzetti (o 35 mM piatto di coltura tissutale) pre-rivestito con gelatina 0,1% in DPBS.
    10. Cambiare il terreno ogni terzo giorno.
  3. Espansione dei fibroblasti umani
    NOTA: I fibroblasti sono pronti per essere passati a un pallone di coltura di tessuti T25 (25 cm2) quando l'80% confluente ( Figura 2B ). I fibroblasti in genere raggiungono l'80% confluenza entro 7 giorni. Tuttavia, il tempo richiesto può variare notevolmente ma non deve superare le 4 settimane.
    1. Aspirare il mezzo e lavare una volta con 2,5 mL di DPBS.
    2. Rimuovere DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule visualizzano i bordi arrotondati e cominciano a staccarsi.
    3. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti, se necessario sciacquare le cellule assicurando una disassociazione appropriata delle cellule. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 xg per 3 min.
    4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di fibroblasti e di fibroblasti di piastre in unColla T25 a coltura cellulare su tessuto cellulare. Quando si espandono i fibroblasti dopo questa fase, dissociare come sopra descritto e sementi 12 x 10 3 cellule / cm 2 .
    5. Una volta che le cellule confluenti sono pronte per essere congelate, espandere o piastra per riprogrammare. Fermare due cicli di fibroblasti prima di iniziare qualsiasi riprogrammazione (vedi sezione successiva per la procedura di congelamento). La riprogrammazione dell'efficienza è generalmente più elevata per i fibroblasti di passaggio più bassi, le cellule al passaggio 2 - 4 sono ottimali. Tuttavia, la riprogrammazione riuscita di fibroblasti fino al passaggio 10 è stata condotta usando questo protocollo.
  4. Congelamento e scongelamento dei fibroblasti
    1. Preparare il mezzo fresco di fibroblast: 90% FBS + 10% dimetilsolfossido (DMSO). Tenere a 4 ° C ( Tabella 1 ). Una volta confluent, il pallone di coltura tessuto T25 può essere congelato in tre cryovials. Preparare 500 μL di mezzo di congelamento di fibroblasti per flaconcino congelato.
    2. Per bloccare le cellule, dissociare cCome descritto nel punto 1.3, contano le cellule usando un emocitometro e trasferiscono porzioni di 3 x 10 5 cellule a 15-mL tubi. Infilare i tubi a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
    3. Resuspendere le pellicole di cellule in 500 μl di 4 ° C di fibroblasto e trasferire in crisi. Posizionare le fiale in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
    4. Per scongelare le celle, immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C. Una volta liquefatto, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e aggiungere 5 mL di mezzo di fibroblasto. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo di fibroblasti. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissuale T25 non rivestito e incubare a 37 ° C.

2. SeV Vector Riprogrammazione dei Fibroblasti

  1. Preparazione di aliquote vettoriali ATTENZIONE: Maneggiare la SeV sotto il contenimento del livello 2 di biosicurezza. Fare riferimento al protocollo del produttore e alle linee guida locali 17 . Il titolo di virus varia tra i lotti.
    1. Prima di preparare aliquote calcolare la quantità di vettore necessaria per 5 x 10 4 celle secondo il protocollo del produttore ( ad esempio , CytoTune 2.0). Il titolo del virus varia generalmente da 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Sciogliere e combinare i vettori 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 e hKlf4 = MOI 3). Portare la quantità calcolata per la riprogrammazione di 5 x 10 4 cellule in tubi autoclavati da 1,5 ml. Aliquote del virus dilatate con il mezzo di fibroblasto a un volume finale di 250 μL per la riprogrammazione.
      NOTA: Ogni fiala è valida per la riprogrammazione di un pozzetto di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti con 5 x 10 4 fibroblasti. Conservare le aliquote del virus a -80 ° C.
  2. SeV Trasduzione vettoriale
    1. Aspira cu cuMescolare e lavare con 1 mL di DPBS. Aspirare DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%). Incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate.
    2. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti e risospendere le cellule e trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare 300 xg per 3 min.
    3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti.
    4. Contare i fibroblasti usando un emocitometro e le sementi di 5 x 10 4 cellule in un pozzo di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte.
    5. Aspirare il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 250 μL della soluzione SeV e incubare a 37 ° C per una notte.
    6. Cambia media media giornaliera in fibroblasti fresche. Lasciare che le cellule trasmesse crescano per 7 giorni prima di essere passate alle piastre rivestite con LN-521. Preparare le piastre LN-521 il giorno prima del passaggio. Fare riferimento al punto 2.3.1 per la procedura di rivestimento.
  3. Riproduzione di fibroblasti trasdurate
    1. Preparazione di LN-521 piatti rivestiti: Diluire LN-521 in DPBS fino ad una concentrazione finale di 0,63 μg / cm 2 . Pipettare 2 ml della soluzione LN-521 per un piatto di coltura tissutale da 60 mm. Sigillare il piatto da 60 mm di coltura tissutale utilizzando il parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
    2. Preparare le aliquote Medie (E8) Essential 8 per una facile manipolazione: 48,5 ml di media E8, 1 ml di supplemento E8 e 500 μL di PEST ( Tabella 1 ).
    3. 7 giorni dopo la trasduzione, passare le cellule ad un LN-521 rivestito piatto da 60 mm di coltura tissutale. Aggiungere 250 μl di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate. Aggiungere 2 mL di fibroblasti e centrifugare le cellule per 3 min a 300 x g.
    4. Aspirare il surnatante. Resuspendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti e contare le cellule in un emocitometro. Aspirare la soluzione LN-521 dalla piastra pre-rivestita e seminare 4 x 10 4 cellule in 5 ml di mezzo di fibroblasti nel piatto LN-521 pre-rivestito da 60 mm. Aggiungere inibitore della Rho-chinasi Y-27632(ROCKi) ad una concentrazione finale di 5 μM. Incubare a 37 ° C per una notte.
    5. Importante, il giorno successivo, cambiare media a media E8. Cambia E8 media ogni giorno. Le colonie cellulari hiPS emergono entro 2-3 settimane.

3. Raccolta delle colonie e espansione delle cellule hiPS

NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti al di fuori dell'armadio della biosicurezza sotto un microscopio stereo. L'uso di hairnet e maschere di procedura è consigliato. Lavori attentamente per non contaminare la cultura cellulare.

  1. Preparare la coltura del tessuto LN-521 a 24 pozzetti il ​​giorno prima della raccolta. Diluire LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm 2 . Pipettare 250 μL della soluzione LN-521 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti. Piastre di tenuta con parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
    NOTA: le colonie sono pronte per essere selezionate quando raggiungono una dimensione di diametro superiore a 1 mm. Le colonie dovrebbero presentare spigoli vivi e crescere in monogeno omogeneoOlayers ( figura 2D ).
  2. Aspirare la soluzione LN-521 e aggiungere 500 μl di E8 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti.
  3. Tagliare le colonie in pezzi più piccoli con un bisturi in un modello a griglia sotto uno stereomicroscopio. Raschiare meccanicamente i fogli delle cellule dal piatto e trasferire i fogli utilizzando una pipetta da 200 μl al pozzetto preparato ( Figura 2D -2E ). Raccogliere le colonie in pozzetti separati.
  4. Lasciare che le cellule si attacchino senza cambiare mezzo per 48 h. Successivamente, cambiare E8 media giornalmente.
  5. Quando le colonie hanno raggiunto dimensioni superiori a 5 mm, le cellule enzimatiche passano come singole cellule a un nuovo pozzetto di una piastra rivestita con LN-521.
  6. Aspira il mezzo di coltura cellulare dalle cellule e lavare con 250 μL di DPBS.
  7. Aspira DPBS. Aggiungere 250 μL di reagente di dissociazione e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
  8. Osservate che le cellule hanno cominciato a arrotondare. distaccareLe cellule dalla piastra sciacquando le cellule con reagente di dissociazione poche volte.
  9. Aggiungere 500 μl di mezzo E8 a un tubo da 15 ml. Trasferire le cellule nel reagente di dissociazione nel tubo e centrifugare per 3 min a 300 x g.
  10. Aspirare la soluzione LN-521 dal pozzetto pre-rivestito LN-521 e aggiungere 500 μl di temperatura ambiente E8.
  11. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 500 μl di mezzo E8.
  12. Contare le cellule usando un emocytometro e le sementi di 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 nel pozzetto preparato LN-521 preparato (1,25 x 10 4 - 2,5 x 10 4 cellule / cm 2 ). Il formato della coltura cellulare può essere facilmente rielaborato per adattarsi allo scopo previsto.
  13. Aggiungere ROCKi ad una concentrazione finale di 10 μM. Incubare le cellule a 37 ° C.
  14. Cambia E8 media ogni giorno. Le cellule sono solitamente pronte al passaggio dopo 4 - 6 giorni. Le cellule di passaggio enzimatico come singole cellule come descritte sopra, quando il confluento circa il 90%.
    NOTA: I vettori di riprogrammazione sono progressivamente diluiti durante l'espansione delle cellule hiPS e non rilevabili dopo il passaggio 12. Le cellule che sono riprogrammate imparzialmente spesso cessano di proliferare attorno al passaggio 6 - 10 o perdono la loro caratteristica pluripotente morfologia delle cellule staminali ( Figura 3B ).
  15. Congelamento e scongelamento delle cellule hiPS
    1. Per congelare le cellule, dissociare enzimaticamente le cellule come singole cellule come sopra descritto, contare le cellule in un emocitometro e trasferire le cellule di 2,5 x 10 5 in un tubo da 15 mL contenente 1 mL di mezzo E8. Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
    2. Resuspendere il pellet cellulare in 250 μl di cryomedium PSC a 4 ° C e trasferire in un cryovial. Posizionare il flaconcino in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
    3. Per scongelare le cellule, preparare un pozzetto LN-521 pre-stratificato di una coltura di tessuto da 24 pozzettiPiastra aspirando la soluzione LN-521 ed aggiungendo 250 μl di mezzo E8. Immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C finché rimane solo un piccolo ghiaccio.
    4. Aggiungere 250 μl di E8 Medium al crioviale e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere 1 ml di mezzo E8. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 250 μl di media di temperatura ambiente E8. Trasferire la sospensione cellulare nel pozzetto preparato e aggiungere un supplemento di vitalità cellulare di 1% o 10 μM ROCKi. Incubare la piastra di coltura tissutale a 37 ° C.

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Representative Results

Dalla biopsia alle cellule hiPS

L'intero processo dalla biopsia alle cellule hiPS stabilite, lontano dal vettore di riprogrammazione e pronto per la caratterizzazione, richiede circa 16 settimane ( Figura 1 ). Una sequenza più dettagliata è specificata nella Figura 2A . Circa 4 settimane sono necessarie per stabilire e ampliare le colture di fibroblasti. Le prime colonie di cellule hiPS hanno cominciato a emergere circa tre settimane dopo la trasmissione vettoriale Sendai. Le colonie sono state raccolte meccanicamente per il primo passaggio e poi passate enzimaticamente come singole cellule.

Istituzione di culture fibroblastiche umane

Quando le colture di fibroblasti umane erano cresciute fino alla confluenza e presentarono morfologia accettata, furono prima espanse e congelate per due passaggiPrima di essere placcato per la trasduzione ( Figura 2B ).

Riprogrammazione dei fibroblasti umani utilizzando vettori SeV

Aumento dei livelli di morte cellulare sono stati riscontrati nei giorni successivi alla trasduzione SeV e sono state osservate piccole modifiche alla morfologia dei fibroblasti. L'emergenza delle prime colonie di hiPS è stata rilevata dal 12 giorno post-trasduzione ( Figura 2A , 2C ). Le colonie pronte per essere raccolte sono state attese circa tre-quattro settimane di post-trasduzione ( Figura 2A , 2D ). Seeding le cellule negli importi specificati in questo protocollo ha prodotto un'abbondanza di colonie emergenti (<20). Si raccomanda la selezione selettiva delle colonie che presentano la morfologia favorevole. Le caratteristiche della colonia preferivano le massa celle compatte appiattite, la crescita come monostrati omogenei, indi distinguibili Cellule vidual con bordo tagliente verso i fibroblasti circostanti ( Figura 2D ). Le colonie di cellule hiPS sono state tagliate in un modello a griglia utilizzando un bisturi e passati meccanicamente ( Figura 2E ). I cloni hiPS raccolti sono stati lasciati per 48 ore per aderire alla piastra senza cambi di media. I cloni di hiPS erano altamente omogenei, tuttavia pochi fibroblasti originati dalla piastra di riprogrammazione sono stati tollerati durante i primi due passaggi ( Figura 2F ). Occorre evitare le raccolte di colonie con frontiere difficili e grandi massa di cellule eterogenee non compatte ( Figura 2G ). Le linee cellulari ottenute da hiPS si sono sviluppate come monolayer denso, con un elevato rapporto nucleo-citochlima e hanno definito i bordi luminescenti. Al contrario, le colonie non homogene aderenti che non soddisfano tali criteri sono state scartate ( Figura 2H ) per evitare le colture di popolazioni di cellule miste.

P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Convalida dei cloni delle cellule hiPS

La caratterizzazione della pluripotenza delle cellule derivate è stata eseguita dopo che il vettore SeV è stato perso e la manutenzione dello stato pluripotente è stata guidata dall'espressione di fattori endogeni. Prima di procedere con la convalida della cella hiPS, assicurarsi che l'espressione vettoriale SeV sia stata persa. Seguendo questo protocollo, il RNA vettore SeV non è più rilevabile dal passaggio 12 secondo la nostra esperienza, quindi un punto di partenza appropriato di caratterizzazione ( Figura 3A ). La colorazione immunocitochimica per marcatori pluripotenziali OCT4, SSEA4 e NANOG dovrebbe dare un risultato omogeneamente positivo ( Figura 3B ). Le cellule contenenti cellule parzialmente riprogrammate che non hanno espresso fattori di pluripotenza sono stati scartati ( Figura 3C ). L'espressione di mRNA di geni pluripotenziali endogeni è mostrata dal PC in tempo reale R (RT-PCR) in Figura 3D .

Le cellule staminali pluripotenti dovrebbero essere prontamente in grado di differenziarsi nei tre strati germinali. Il potenziale di differenziazione delle cellule hiPS è stato valutato mediante la formazione di corpi embriodici (EB) 18 . Gli EBs galleggianti liberi generati dalle cellule hiPS sono mostrati in Figura 3E e l'espressione mRNA di marcatori specifici del livello germi dopo 21 giorni di differenziazione EB è rappresentata nella Figura 3F .

Figura 1
Figura 1: Diagramma di flusso da biopsia della pelle a cellule hiPS.
Panoramica dei passaggi chiave del protocollo. L'illustrazione include la raccolta di biopsia, l'isolamento dei fibroblasti, la trasduzione di SeV, la raccolta delle colonie e l'espansione clonale delle cellule hiPS.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: passi critici nella generazione di celle hiPS.
(A) Timeline che evidenzia importanti punti di tempo nel protocollo, tra cui la placcatura di fibroblasti, la trasduzione di SeV, i cambiamenti medi e i rivestimenti. Passage 12 delle cellule hiPS è evidenziato come l'inizio degli esperimenti di caratterizzazione. (B) Immagine del campo luminoso dei fibroblasti confluenti in coltura con morfologia tipica. (C) Emergenza di colonie di cellule hiPS da fibroblasti trasdurate. (D) Pronti a scegliere la colonia che presenta caratteristiche preferenziali, la massa compatta compatta, le singole cellule distinguibili con bordi affilati verso i fibroblasti circostanti (passaggio 0). (E) hiPSLe colonie di cellule vengono tagliate in un modello a griglia e passate meccanicamente . (F) Colonia aderente dopo pochi giorni di crescita. Le cellule hiPS aderenti sono circondate da un numero insolitamente elevato di fibroblasti originati dalla piastra di riprogrammazione. I fibroblasti possono essere raschiati dalla piastra e probabilmente scompaiono con successivi passaggi delle singole cellule (passaggio 1). (G) Colonie che presentano morfologia che non ricordano le cellule completamente riprogrammate; Confini difficili, grande massa di cellule eterogenea incompatibile. (H) Immagine del campo luminoso che esemplifica una linea cellulare hiPS omogenea completamente riprogrammata in un primo passaggio rispetto ad una linea cellulare altamente eterogenea. Le barre di scala indicano 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 Figura 3: Caratterizzazione delle cellule hiPS.
(A) RT-PCR di marcatori specifici del vettore SeV. Le cellule hiPS al passaggio 3 vengono utilizzate come controllo positivo per i vettori di riprogrammazione. Al passaggio 12 le cellule sono negative per l'espressione di segnalatori specifici del virus Sendai specifici spina dorsale (SeV B), Sendai specifici KLF4 (KLF4 SeV), Sendai specifici cMYC (cMYC SeV), controllo PCR (GAPDH) e nessun template (-). (B) Esempio rappresentativo della linea completamente omogenea riprogrammata di hiPS a passo 12. L'immagine luminosa del campo delle cellule hiPS rivelano che le cellule crescono in monosangue stretto con bordi luminescenti e con grandi nuclei e piccoli citoplasmi. Colorazione immunocitochemica di marcatori pluripotenziali OCT4, NANOG, SSEA4 e colorazione nucleare 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) che dimostrano un'espressione positiva omogenea. (C) Linea cellulare che esprime espressione eterogenea per il marker di pluripotenza NANOG. Il culturE contiene cellule parzialmente riprogrammate e vanno scartate. (D) RT-PCR dell'espressione di mRNA di marcatori pluripotenziali NANOG, OCT4, controllo PCR (GAPDH) e nessun template (-) che indica l'espressione di marcatori pluripotenziali. (E) Corpi embrioni galleggianti liberi generati da cellule hiPS. (F) RT-PCR dopo 21 giorni di differenziazione del corpo embrionale dimostrano che le cellule hiPS derivate sono in grado di differenziarsi dai tre strati germinali. Marcatori endodermici AFP e GATA4, marcatori mesodermici RUNX e HAND1, marcatori ectodermici NCAM e NESTIN, controllo PCR (GAPDH) e nessun template (-). Le barre di scala indicano 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il risultato atteso di questo protocollo è la generazione di successo di diverse linee cellulari hiPS derivate clonali. Importante, il metodo per la manutenzione e l'espansione delle cellule hiPS stabilite qui descritto è affidabile e può essere eseguita con poca esperienza precedente della coltura delle cellule staminali. La passaggio di cellule enzimatiche con ROCKi insieme alla matrice LN-521 è noto per mantenere le cellule come cariotipicamente normali, pluripotenti e facilmente capaci di differenziarsi evitando l'eterogeneità indotta che il passaggio basato sulla colonia può stimolare 10 , 19 , 20 . Le cellule hiPS coltivate su LN-521 possono essere passate come singole cellule senza l'aggiunta di ROCKi 10 , l'aggiunta di ROCKi tuttavia rende il protocollo più semplice per i gestori meno esperti e riduce il tempo necessario per la derivazione di celle hiPS.

Riprogrammare l'efficienza è geNerally non un problema con questo protocollo; I vettori SeV hanno un'efficienza di riprogrammazione relativamente alta> 1% per i fibroblasti 11 . Si prevede l'emergere di un'abbondanza di colonie (<20). Si raccomanda di scegliere tre volte il numero di colonie necessarie. È stato osservato che una parte dei cloni selezionati non riesce ad aderire dopo la raccolta. Inoltre potrebbero essere necessarie colonie supplementari per compensare le colonie parzialmente riprogrammate. Le colonie parzialmente riprogrammate sono in alcuni casi in grado di aderire e crescere sostenute dall'espressione esogena di geni pluripotenziali dai vettori SeV. Poiché i vettori SeV vengono diluiti, queste cellule cesseranno di proliferare e dissociarsi, di solito apparenti intorno al passaggio 6-8. L'eterogeneità della cultura è anche un segno di riprogrammazione parziale e le righe eterogenee devono essere scartate ( Figura 2H ).

La scelta ottimale di riprogrammare le condizioni di vettore e di cultura dipende dalScopo delle cellule generate. Tuttavia, per evitare varianze da batch-to-batch che influenzano i risultati, è consigliabile definire le condizioni. La scelta di un sistema vettoriale non integrato è suggerita per preservare l'integrità genomica delle cellule riprogrammate. Varianti SeV sono stati scelti in questo protocollo a causa della robustezza, relativamente alta efficienza e basse mani sul tempo richiesto. I vettori SeV vengono diluiti durante le divisioni delle cellule e non sono rilevabili al passaggio 12, assicurando così che i dati generati non siano influenzati dall'espressione esogena. A causa delle richieste meticolose messe su cellule destinate a scopi clinici, la riprogrammazione di SeV può essere una barriera alla traduzione clinica poiché è difficile provocare la completa spargimento di tutto il materiale vettoriale. La riprogrammazione mediata da mRNA può essere vantaggiosa se derivano celle con uso previsto nelle terapie cellulari 12 . Questi metodi sono tuttavia molto più intensi e più complicati da utilizzare 21 . Il metodo qui deScritto per la coltura di fibroblasti è anche inadatto alle applicazioni cliniche. Poiché entrambi i FBS e la gelatina sono xenogeneici e non definiti, considerate di passare questi a prodotti definiti senza xeno 22 .

Si raccomanda di utilizzare tecniche di manipolazione sterile e di test di infezione del micoplasma regolari mentre si lavora con qualsiasi forma di coltura cellulare. La pelle umana contiene molti microrganismi che potrebbero prosperare nelle condizioni in cui le cellule vengono coltivate se non correttamente gestite. Si raccomanda pertanto di essere più vigile nel trattamento delle biopsie cutanee e durante i primi giorni di coltura dopo l'elaborazione della biopsia. L'istituzione della coltura di fibroblasti dalle biopsie cutanee è infatti un processo che richiede tempo. Dopo aver elaborato la biopsia cutanea, inizialmente saranno segni deboli delle cellule fibroblast adesive, quindi attendere almeno una settimana per trovare alcune cellule fibroblast che presentano la morfologia prevista nella cultura. Il tempo necessario per la creazione di fibroblastiLe colture in vitro dalle biopsie dipendono da una varietà di fattori tra cui la dimensione della biopsia, l'età del donatore e come la biopsia è stata manipolata da quando è stata presa. È preferibile riprogrammare i fibroblasti di passaggio iniziale per un'efficienza di riprogrammazione ottimale 23 .

In sintesi, qui descriviamo un metodo robusto e facile da usare per la generazione di cellule HiPS altamente omogenee.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da segnalare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da agenti di finanziamento SSF (B13-0074) e VINNOVA (2016-04134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

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References

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Biologia dello sviluppo Numero 125 cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo riprogrammazione vettori di Virus Sendai fibroblasti Laminina umana ricombinante chimica Xeno-free chimicamente definita 521
Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521
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Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

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