Summary
Протокол для точно выявления и анализа синапсов в гиппокампа фрагментов с помощью иммунофлюоресценции изложены в этой статье.
Abstract
В головном мозге синапсы являются специализированные соединения между нейронами, определение прочности и распространение нейрональных сигнализации. Количество синапсов жестко регулируется во время разработки и нейрональных созревания. Важно отметить, что дефицит в синапсе номер может привести к когнитивной дисфункции. Таким образом оценка числа синапсов является неотъемлемой частью нейробиологии. Однако как синапсы являются небольшими и очень компактный в мозге, нетронутыми, оценки абсолютного числа является сложной задачей. Этот протокол описывает метод для легко идентифицировать и оценивать синапсы гиппокампа грызунов ломтиками, с помощью микроскопии иммунофлуоресценции. Она включает в себя три шага процедуры для оценки синапсов в конфокальной микроскопии высокого качества изображения, анализируя совместно локализации предварительной и постсинаптических белков в срезах гиппокампа. Это также объясняет, как анализ проводится и дает представитель примеры от возбуждающих и тормозящий синапсы. Этот протокол обеспечивает прочную основу для анализа синапсов и может быть применен к любой исследования, изучение структуры и функции мозга.
Introduction
Человеческий мозг состоит из примерно 1014 синапсы. Количество синапсов жестко регулируется во время развития и созревания центральной нервной системы (ЦНС). На протяжении развития, модулируется синапса номер synaptogenesis и обрезки для формирования функциональных нейронных сетей. Обучения и памяти поддерживаются регулирование числа синапсов и прочность, процесс, известный как синаптических потенцирование и депрессия1. Важно отметить, что стабилизация Зрелые синапсы необходим для поддержания нейрональных сетевых подключений. Кроме того дефицит в синапсе плотность сообщается на ранних стадиях нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (AD)2. Таким образом возможность точно определить и оценить количество синапсов имеет основополагающее значение для оценки мозга физиологии и патологии.
Экстремальные плотности и компактный характер синапсы сделать это сложно оценить их точное число в областях нетронутыми мозга. Химические синапсы в ЦНС, изготовлены из двух нейронов в тесном приложение, разделенных синаптических расщелиной3. Предварительно синаптических терминал или синаптических бутона, вытекает из Аксон и состоит из накопленных везикулы, содержащие нейротрансмиттеров, которые определяют специфику синапса — а именно, глутамата и гамма - аминомасляная кислота (ГАМК) для возбуждающих и ингибирующее синапсов, соответственно. Мембран пузырьков содержат Везикулярный транспортер специфичные для каждой нейротрансмиттер: везикулярный глутамата транспортер (vGlut) для глутамата и Везикулярный транспортер ГАМК (vGAT) для ГАМК. После синаптических терминал является весьма плотной структурой, состоящий из нескольких белков, включая рецепторов, молекул адгезии и леска белков. В возбуждающим синапсы, пост синаптических белков плотность-95 (PSD-95) является наиболее распространенным эшафот белка4, модулирует возбуждающим N-methyl-D-aspartate(NMDA-) и α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (AMPA-) рецептор функция, тогда как gephyrin анкеры, тормозящий рецепторов ингибирующих пост синаптических терминал5. В целом специфичность белков для пред- и пост синаптических отсеков помощи в дифференциации и идентификации синапса подтипов.
Оценки числа синапсов может выполняться с различными методами. Наиболее распространенным является использование электронной микроскопии (EM), который позволяет проводить анализ синапсов в областях мозга компактный и нетронутыми с высоким увеличением и резолюции. Однако этот метод является очень дорогостоящим, требует сложная Пробоподготовка и очень много времени. Другие методы включают в себя использование массива томографии6, которая имеет основной недостаток в том, что он требует специализированных и дорогого оборудования для выполнения анализа. Кроме того трансгенных линий, выражая конкретные синаптических маркеров полезны в оценке синапса номер7, но поколение новых линий может быть ограничительным и дорогостоящим, и Гиперэкспрессия белка может привести к нежелательным пробить фенотипов.
Из-за этих ограничений и для простоты многие исследователи оценки числа синапсов путем изучения уровней всего синаптических белков. Однако синапса потери можно наблюдать до существенные изменения в протеине, как структурная синаптических ремоделирования результаты при разгоне до или после синаптических приложение, без ухудшения качества синаптических белков. Кроме того в AD, синаптических белков уровни являются снижение следующие синапса дегенерация или нейронов смерти8,9. Количественной оценки общего уровня не включайте это различие. Таким образом существует необходимость в разработке надежной, доступной и точный метод для оценки числа синапсов в головном мозге.
В этой статье мы опишем, как тщательно выявлять и определять количество синапсов, с помощью микроскопии иммунофлуоресценции в срезах гиппокампа грызунов мозга. Синапсы определяются colocalization пред- и пост синаптических маркеры, которые появляются в пунктата распределения. Мы продемонстрировать действенность этого метода через изучение Wnt сигналов в головном мозге. Wnts являются секретируемые белки важны для формирования, ликвидации и поддержание синапсы. В естественных условиях индукции антагонистом секретируемые Wnt каскада, Dickkopf-1 (Dkk1), приводит к возбуждающим синаптических потери при сохранении ингибирующее синапсов в гиппокампе10. Мы иллюстрируют идентификации и количество возбуждающих и тормозящий синапсов в срезах гиппокампа от взрослой мыши, выражая Dkk1 и выделить передаваемости этой техники в другие типы культуры ткани препаратов.
Protocol
все эксперименты, используя мышей и крыс были утверждены и проводились с использованием процедур график 1 охвачены законом министерство внутренних дел животных (научные процедуры) 1986 года. Искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО) рецепт можно найти в таблице 1.
1. острый гиппокампа фрагмент подготовки
- удалить мозга мыши так быстро, как можно скорее, с помощью шпателя и острые ножницы, чтобы вырезать черепа и поместить его в ледяной, кислородом (95% O 2, 5% CO 2), высокий сахароза Фаго (~ 100 мл).
- Место в мозг мыши на чашку Петри и снять небольшой секции лобной коры с помощью скальпеля перед hemisecting вниз средней мозга и мозжечке.
- Место двух полушарий на стороне, которая была просто вырезать и склеить каждого полушария на сцену vibratome.
- Стрижки 200-300 микрон толщиной полной региона интерес. В случае гиппокампа, должно быть получено приблизительно 3-4 ломтика в полушарии.
- С помощью Пластиковая пипетка Пастера, передачи ломтики в камеру, погруженной в насыщенной кислородом (95% O 2, 5% CO 2) фаго. Сохранить в 34 ° C на 30 мин
Примечание: Лечение ломтики с активных фармакологических агентов, таких как рекомбинантных белков Dkk1, могут выполняться на данном этапе путем добавления агентов к палате фрагмента. - Удалить фрагменты из камеры, используя кисть, поместите их в тарелку 24-Ну и исправить за 20 мин до 1 часа в параформальдегида 4% (сахароза PFA)/4% при комнатной температуре (RT).
Предупреждение: PFA токсичных, носить соответствующую защиту. - Вымойте ломтики три раза в 1 X PBS (10 мин).
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь для 1-2 дней, до тех пор, как ломтики хранятся при температуре 4 ° C в ПБС.
2. Иммунофлюоресценции для Synaptic маркеры
Примечание: Рецепты всех буферов, используемых можно найти в таблице 2.
- Заменить PBS с буфером блокирование/permeabilizing (Таблица 2) в скважинах срез и Инкубируйте на RT для 4-6 ч.
- Развести поликлональных морской свинки антитела против vGlut1 при разбавлении стоматологов в буфере блокирование/permeabilization.
Примечание: vGlut1 является маркером для предварительно синаптических возбуждающим терминала визуализации. Для идентификации после синаптических возбуждающим синапса, используйте Поликлональные антитела против PSD-95 и разбавленных 1: 500 в том же решении. В каждом хорошо используйте минимальный объем 300 мкл. Чтобы определить анатомическое расположение гиппокампа, используйте антитело, которое также может определить структуру нейронов, например MAP2 или тубулин. Выработать правильную концентрации всех первичных антител для синаптических маркеры выбора (до и после синаптических) и разбавленных в буфере свежие блокирование/permeabilizing. - Инкубации срезов в решении основное антитело на ночь (или на 1-2 дня) в 4 ° C. Использование пожимая платформы с энергичным движением.
- Вымойте ломтики три раза в PBS (10 мин).
- Развести 1: 500 соответствующие вторичные антитела в блокирующем буфере. Например при использовании vGlut1 морская свинка антитела, примените вторичные антитела которое узнает свинки компонент (например, осел анти-Гвинея свиньи) конъюгированных к конкретным Флюорофор. При использовании антитела кролика PSD-95, применять вторичные антитела которое узнает кролик компонент (например, осел анти кролик) конъюгированных для различных конкретных Флюорофор.
- Инкубации срезов в этом решении для 2-3 часа на RT. Убедитесь, что фрагменты защищены от света, как вторичные антитела являются светочувствительный.
- Вымойте ломтики три раза в PBS (10 мин).
- Тщательно удалить фрагменты из 24-ну пластину, используя кисть и равномерно разместить их на предварительно помечены стеклянных скольжениях. Добавить каплю монтажа средних поверх каждый фрагмент и затем осторожно поместите стекла coverslip поверх фрагментов. Избегайте образования пузырьков воздуха. Позаботьтесь, чтобы использовать достаточно монтажа средний (300-400 мкл), как недостаточное количество может привести к сухой ломтиками.
- Оставить сохнуть в течение как минимум 1-2 дней в RT и держать слайды, защищенном от света.
- Хранить слайды при температуре 4 ° C, в краткосрочной перспективе, но для длительного хранения, держать их в -20 ° с.
3. Конфокальный захвата изображений и анализ
- изображений с помощью Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
- Определить область гиппокампа для записи образа (например, корню ammonis 1 и 3 (СА1, CA3) или зубчатой извилины (ГД)) с помощью 10 x или 20 x цель.
- Изменения в 40 x или 63 x нефть погружение цель убедиться, срез анатомии нетронутыми путем выявления непрерывной невритов и организованной структуры. Используйте маркер нейронов, например MAP2, как ссылка ( рис. 1A).
- Впоследствии, переключитесь на 60 x нефти погружение цель (NA = ~1.3 - 1.4) и настроить параметры для каждого канала для получения оптимального сигнала и контраст. Установите необходимую интенсивность каждого лазера, чтобы избежать насыщения любой пикселей с помощью параметра Высокая / Низкая контрастность.
Примечание: Эти настройки будет зависеть от Микроскоп используется, но относятся к Таблице материалов для параметров питания лазера в Рисунок 2, рис. 3, и Рисунок 4. Для достижения наилучших результатов используйте 1024 x 1024 пикселей. Параметры должны оставаться неизменными на протяжении различных условий же эксперимента. Дополнительные масштабирования может применяться, если требуется. - Оценить глубину, где окрашивание является даже и приобрести стеки изображений по крайней мере 8 равноотстоящих (250 Нм) самолетов. Затем взять 3 смежных представитель изображения стеки из той же области интереса на ломтик.
Примечание: Глубина может варьироваться от одного фрагмента к другому, но всегда должна быть около 2-5 мкм с поверхности среза. - Повторить приобретение в по крайней мере 3 ломтика на состояние и от 6-8 особей на обращение группы.
- Анализ изображений.
Примечание: Использование автоматизированных изображений программное обеспечение анализа (см. Таблицу материалов). Обратите внимание, что некоторые системы требуют лицензии, тогда как другие являются бесплатными, например ImageJ. Программное обеспечение, используемое должны анализировать изображения в 3D, принимая во внимание все самолеты стека образы. Обратитесь к Таблице материалов для деталей программное обеспечение, используемое в анализе изображений ( рис. 1).- Использовать протокол на основе пользовательских интенсивности порог для выявления всех синаптических puncta и нейрональных маркеры, которые вручную оптимизированы и отобраны в рамках программного обеспечения [см. Таблицу материалов для конкретного программного обеспечения, используемых в этом Протокол].
Примечание: Программа определяет минимальные и максимальные интенсивности для каждого Флюорофор и связывает процент интенсивности для каждого объекта, признанных. Обратите внимание, что процент интенсивности будет меняться согласно Флюорофор используется и антитела против маркер синаптических. - Для синаптических маркеры, убедитесь, что размер фильтры (> 0.1µm 3 и < 0.8µm 3) выбраны в рамках программного обеспечения и применяется к изображению. Настройка параметров, чтобы гарантировать, что выбранные объекты не являются перекрывающимися. Исключить любой объект, который слишком велик или слишком мал, чтобы быть рассмотрены синаптических puncta (см. рис. 2B).
Примечание: После того, как оптимизированы, же пороговые значения применяются ко всем изображениям в рамках данного эксперимента. - Подсчитать среднее количество, интенсивность и объем отдельных синаптических puncta (до или после синаптических) с использованием протоколов оптимизированный порог, выбранного программного обеспечения. Нормализовать puncta номер на том поле изображения (примерно 16,928 мкм 3 в системе используется здесь). Нормализовать синаптических puncta интенсивности интенсивности ссылку маркера нейронов.
Примечание: Синапсы, определяются как совместно локализации между до и после синаптических маркеров. Один раз порог протоколы для пред- и пост синаптических puncta hпроспект был создан, программное обеспечение следует определить совместно локализации синаптических puncta как перекрытие 1 пиксель или более в одной плоскости.
Примечание: Для статистического анализа, убедитесь, что все наборы образцов следовать нормальной и однородности дисперсии, определяется Lilliefords и χ2-тесты, соответственно. Образцы, демонстрирующие нормального распределения и однородности дисперсии должны быть проанализированы с параметрических тестов, как описано ниже. Например возбуждающих синаптических puncta анализ должен выполняться односторонний дисперсионный анализ с помощью блокирования и репликации. Каждый индивидуальный эксперимент следует рассматривать как блок; как правило, существует три независимых экспериментов, каждый с 1-3 мышей от каждого состояния.
- Использовать протокол на основе пользовательских интенсивности порог для выявления всех синаптических puncta и нейрональных маркеры, которые вручную оптимизированы и отобраны в рамках программного обеспечения [см. Таблицу материалов для конкретного программного обеспечения, используемых в этом Протокол].
Рисунок 1: анализ синаптических puncta, с помощью анализа изображений программное обеспечение. скриншот (A) протокол настройки порога интенсивности. Приведенный пример является для PSD-95, в котором выбранный puncta имеют определенный размер > 0,1 мкм 3 и < 0,8 мкм 3 и настоящем свернутого перекрывающихся объектов. Обратите внимание, что изображения, отображаемого для одной конфокальный плоскости, чтобы легче визуализации синаптических puncta и точных параметров отбора. (B) скриншот анализа вывода из программного обеспечения (после выбора оптимизированный протокол). Пример сырья синаптических puncta число измерений, основанных на томе. Эти значения затем экспортируются в программу электронных таблиц. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Проверка качества срез и параметров настройки для синаптических puncta. (A) представитель конфокальный изображения (40 x цель) региона интерес: СА1 пласт radiatum (sr) и слой oriens (так) гиппокампа среза определяются путем пятнать MAP2. Шкалы бар = 2 мкм. (B) конфокальный изображения (60 x цель и дополнительные 1.3 X увеличение на приобретение программного обеспечения) из radiatum слоя СА1, с возбуждающим маркеры vGlut1 (зеленый) и PSD-95 (красный)-от гиппокампа ломтиками. Обратите внимание на выявление четких пред- и пост синаптических puncta. Puncta, больше, чем 0,8 мкм 3 исключены из количественного определения (белые стрелки). Шкалы бар = 2 мкм (C) Confocal изображений (60 x цель и дополнительные 1.3 X увеличение на приобретение программного обеспечения) из пласта radiatum СА1, с возбуждающим маркеры vGlut1 (зеленый)-от гиппокампа разделы криостата вырезать из всего мозги Исправлено в версии ПФА. Обратите внимание на наличие больших отверстий и нерегулярные, зажатое vGlut1 окрашивание. Шкалы бар = 2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Representative Results
СИНАПС утрата происходит в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как AD и болезнь Паркинсона2,,1112. Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих дефицита по-прежнему осознаются. Недостатки в Wnt сигнализации были связаны с AD13,14,,1516,17. Wnts, секретируемые гликопротеинов и играть важную роль в формировании синапса и модуляции синаптической передачи18,19,,2021. Недавно мы определили Wnts как ключевых регуляторов синаптических обслуживания в зрелых нервной системы10,22. Для точного изучения воздействия Wnt сигнализации на синапсы в гиппокампе генетически измененных мышей, мы воспользовались подготовки срез мозга и confocal микроскопии для оценки изменения числа синапсов. Мы определили здорового фрагментов, в которых структура была хорошо сохранена (рис. 2A). Кроме того выбор синаптических puncta был тщательно определены, за исключением больших окрашенных объектов, вероятно представляющих агрегированных белков (рис. 2B). Этот критерий был применен ко всем изображениям, с теми же параметрами строгого анализа.
Мы использовали систему трансгенные модели, индуцирует экспрессию секретируемые Wnt антагонист Dkk1 у взрослых мышей (iDkk1) под тетрациклин управления (см. Таблицу материалов)10,22. Мы продемонстрировали, что блокада Wnt сигнализации взрослых гиппокампа триггеры возбуждающим синапса потери специально в регионе radiatum СА1 слой (рис. 3). На рисунке 3A иллюстрирует представитель конфокальный изображения возбуждающим пред- и пост синаптических маркеров (vGlut1 и PSD-95, соответственно) приобрел из гиппокампа ломтики iDkk1 мышей, выражая Dkk1 за две недели, а также их соответствующие элементы управления. Мы проанализировали эти образы с помощью программного обеспечения Volocity и продемонстрировали значительное снижение числа возбуждающим синапсы, количественно, Сопредседатель локализация vGlut1 - и PSD-95-меченых puncta в регионе СА1 гиппокампа iDkk1 мышей после индукции Dkk1 за две недели (рис. 3Б, * p < 0,05; Крускала-Уоллиса; 6 мышей на генотип). В radiatum слой СА1 возбуждающих синапса puncta число на 1000 мкм3 было сокращено с 500 управления мышей до 300 в iDkk1 мышей. В противоположность этому, индуцированных Dkk1 выражение не влияет на количество тормозной синапсов (определяется совместно локализации между пред- и пост синаптических маркеры vGAT и gephyrin, соответственно), как показано на рисунке 4A-B (p > 0,05; Крускала-Уоллиса; 3 мышей на генотип).
Важно отметить, что мы провели анализ статистической мощности для оценки соответствующее количество фрагментов и животных, необходимых для создания эти надежные результаты. С помощью R, мы подсчитали, что приблизительно 35 фрагментов за состояние необходимы (3 изображения x 3 ломтиками x 6 животных = 36) обнаружить размер большого эффекта (f = 0,4) с 80% уверенностью (мощность = 0,8) в односторонний дисперсионный анализ с блокировки и репликации, как описано в шаге 3.2.6.
Рисунок 3: потеря возбуждающим синапсов в срезах гиппокампа от мышей iDkk1. (A) представитель конфокальный образы СА1 пласт radiatum шоу возбуждающим синапсов, определенных совместно локализации между vGlut1 и PSD-95 (белые стрелки). Ниже Группа представляет увеличение выделенного прямоугольника. Масштаб баров = 2 мкм. (Б) процент возбуждающим синапсов между элементом управления и iDkk1 был количественно с помощью программного обеспечения, упомянутых в Таблице материалов (* p < 0,05; Крускала-Уоллиса; 6 мышей на генотип). Данные, представленные ± SEM. Эта цифра была изменена ссылка10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: тормозные синапсы изменяются в срезах гиппокампа от мышей iDkk1. (A) представитель конфокальный образы radiatum пласт СА1 ингибирующее синапсов, выявленные Сопредседатель локализации между vGAT и gephyrin (белые стрелки). Ниже Группа представляет увеличение выделенного прямоугольника. Масштаб баров = 2 мкм. (Б) процент ингибирующее синапсов между контролем и iDkk1 мышей, как количественно с помощью программного обеспечения Volocity (p > 0,05; Крускала-Уоллиса; 3 мышей на генотип). Данные, представленные ± SEM. Эта цифра была изменена ссылка10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Высоким сахарозы фаго компоненты | Концентрация | Примечания |
| NaCl | 75 мм | |
| NaHCO3 | 25 мм | |
| ДКК | 2.5 мм | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 мм | |
| Кинуреновая кислота | 1,25 мм | |
| Пировиноградная кислота | 2 мм | |
| ЭДТА | 0,1 мм | |
| CaCl2 | 1 мм | Добавить после оксигенации раствора |
| 2 MgCl | 4 мм | Добавить после оксигенации раствора |
| D-глюкоза | 25 мм | |
| Сахароза | 100 мм | |
| Подводные камеры фаго компонентов | ||
| NaCl | 125 мм | |
| NaHCO3 | 25 мм | |
| ДКК | 2.5 мм | |
| NaH2PO4, 2 H2O | 1,25 мм | |
| CaCl2 | 1 мм | Добавить после оксигенации раствора |
| 2 MgCl |
Таблица 1: Фаго композиция.
| Блокировка/permeabilizing буфера | Концентрация | Примечания |
| Осел сыворотки | 10% | |
| Тритон X | 0,50% | |
| PBS | 1 x | |
| 10 x PBS | рН 7,4 | |
| NaCl | 1,37 М | |
| KCl | 27 мм | |
| NaH2PO4 | 100 мм | |
| KH2PO4 | 18 мм | |
| PFA/4% 4% сахарозы | рН 7,4 | |
| PBS | 1 x | Разбавить от 10 x |
| PFA | 1.33 М | |
| Сахароза | 117 мм |
Таблица 2: Буферов, используемых для immunofluorescent окраски.
Discussion
Точную оценку числа синапсов имеет важное значение в области нейробиологии. Здесь мы покажем, как оценить плотность синапсов в регионе radiatum пласт СА1 гиппокампа фрагментов как модель системы. Значение в отношении существующих методов проявляется в нашей недавней статье исследования о влиянии Wnt дефицита в гиппокампе и где мы также оценку числа синапсов односекционный EM10. Масштабы синапса потери сходны между односекционный EM и мозг ломтик метод описанный здесь10. Таким образом этот вывод свидетельствует о точности и надежности техники.
Важно отметить, что ограничение односекционный EM и иммуноокрашивания синапсов, изложенные здесь, является неспособность точно оценить абсолютный синапса номер для конкретного мозга регионе. Действительно важно для выявления любых глобальных морфологических изменений, как изменения в общем объеме может повлиять синаптических номер. Еще одним ограничением является то, что некоторые антитела менее эффективны на окрашивание регионах нетронутыми мозга, частично из-за экстремальных плотность синаптических связей. Мы пережили более качественное окрашивание vGlut1 и gephyrin, используя этот фрагмент подготовки и последующей фиксации PFA для максимум 1 час, по сравнению с немедленной фиксации всего мозга в PFA (рис. 2 c). Последние привели к скомканным синаптических окрашивание, с отверстиями в ткани. Тем не менее vGlut1 антитела проникновения в обоих методов (несколько десятков микрон) по-прежнему ограничено. Мы не преодолеть это ограничение, даже с повышенной Антитело инкубации, но обеспечивая проникновение антитела больше, чем общая глубина, которая является образ, не должно быть никакого влияния на конечный результат. Кроме того особое внимание необходимо убедиться, что окрашивание даже на протяжении всего приобретенного стека.
В нашем исследовании мы хотели, чтобы отличить возбуждающим от тормозной синапсы. Следовательно мы выбрали vGlut1/PSD-95 и vGAT/gephyrin, соответственно, как эти белки очень выражены в гиппокампе взрослых мыши и являются специфическими для каждого подтипа синапса4,5. Другие возбуждающих и тормозящий синаптических маркеров могли бы быть использованы для идентификации каждого соответствующего синапса, таких рецепторов, обогащенный в каждом синапсе, включая АМПА и NMDA рецепторы для возбуждающих и ДЕСЕНСИТИЗАЦИИ рецепторов для тормозной синапсы. Другие нейротрансмиттеры или neuromodulators также могут быть идентифицированы с нашего протокола, обеспечивая, что специфические антитела доступны, как показано на дофаминергические синапсы в Полосатое тело22. Кроме того уменьшение толщины каждого среза до 120 мкм можно частично преодолеть низкое количество проб, полученных с острой ломтиками, который является необходимым для исследований в мелких мозговых структур таких как миндалины.
Будущих приложений нашего протокола может быть осуществлена в исследовании мозга различных областей и расстройств. Например в стриатума (области мозга, связанные с болезнью Паркинсона), комбинация vGlut2/PSD-95 или vGlut1/PSD-95 может использоваться для различения возбуждающим синапсы от афферентов, исходя из коры или таламуса, соответственно22.
В заключение мы показали надежный метод для изучения количество синапсов в тканях головного мозга с использованием пред- и пост синаптических маркеров для определения синапса. Важнейшие шаги включают подготовку хорошо гиппокампа ломтиками, фиксации времени до 1 ч в PFA, применение достаточно средний монтажа, использования надежных антител, параметры приобретения соответствующих изображений и строгие синаптических puncta обнаружения. В конечном итоге этот метод является относительно быстро и легко воспроизводимые лабораториями, которые имеют доступ к конфокального микроскопа.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана MRC, ЕС FP7, ARUK, Велком Траст и Паркинсона Великобритании. Мы хотели бы также поблагодарить г-жа Йоханна Buchler за ее вклад конфокальный изображений и члены лаборатории за их конструктивный вклад на рукописи и методологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
- Malenka, R. C., Bear, M. F. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron. 44 (1), 5-21 (2004).
- Arendt, T. Synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 118 (1), 167-179 (2009).
- Missler, M., Sudhof, T. C., Biederer, T. Synaptic cell adhesion. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (4), a005694 (2012).
- Chua, J. J., Kindler, S., Boyken, J., Jahn, R. The architecture of an excitatory synapse. J Cell Sci. 123 (Pt 6), 819-823 (2010).
- Dobie, F. A., Craig, A. M. Inhibitory synapse dynamics: coordinated presynaptic and postsynaptic mobility and the major contribution of recycled vesicles to new synapse formation. J Neurosci. 31 (29), 10481-10493 (2011).
- Jackson, R. J., et al. Human tau increases amyloid beta plaque size but not amyloid beta-mediated synapse loss in a novel mouse model of Alzheimer's disease. Eur J Neurosci. 44 (12), 3056-3066 (2016).
- Heck, N., et al. A new automated 3D detection of synaptic contacts reveals the formation of cortico-striatal synapses upon cocaine treatment in vivo. Brain Struct Funct. 220 (5), 2953-2966 (2015).
- Sultana, R., Banks, W. A., Butterfield, D. A. Decreased levels of PSD95 and two associated proteins and increased levels of BCl2 and caspase 3 in hippocampus from subjects with amnestic mild cognitive impairment: Insights into their potential roles for loss of synapses and memory, accumulation of Abeta, and neurodegeneration in a prodromal stage of Alzheimer's disease. J Neurosci Res. 88 (3), 469-477 (2010).
- Harwell, C. S., Coleman, M. P. Synaptophysin depletion and intraneuronal Abeta in organotypic hippocampal slice cultures from huAPP transgenic mice. Mol Neurodegener. 11 (1), 44 (2016).
- Marzo, A., et al. Reversal of Synapse Degeneration by Restoring Wnt Signaling in the Adult Hippocampus. Curr Biol. 26 (19), 2551-2561 (2016).
- Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), (2012).
- Janezic, S., et al. Deficits in dopaminergic transmission precede neuron loss and dysfunction in a new Parkinson model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (42), E4016-E4025 (2013).
- Caricasole, A., et al. Induction of Dickkopf-1, a negative modulator of the Wnt pathway, is associated with neuronal degeneration in Alzheimer's brain. J Neurosci. 24 (26), 6021-6027 (2004).
- De Ferrari, G. V., et al. Common genetic variation within the low-density lipoprotein receptor-related protein 6 and late-onset Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9434-9439 (2007).
- Liu, C. C., et al. Deficiency in LRP6-mediated Wnt signaling contributes to synaptic abnormalities and amyloid pathology in Alzheimer's disease. Neuron. 84 (1), 63-77 (2014).
- Purro, S. A., Dickins, E. M., Salinas, P. C. The Secreted Wnt Antagonist Dickkopf-1 Is Required for Amyloid beta-Mediated Synaptic Loss. J Neurosci. 32 (10), 3492-3498 (2012).
- Rosi, M. C., et al. Increased Dickkopf-1 expression in transgenic mouse models of neurodegenerative disease. J Neurochem. 112 (6), 1539-1551 (2010).
- Budnik, V., Salinas, P. C. Wnt signaling during synaptic development and plasticity. Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 151-159 (2011).
- Ciani, L., et al. Wnt signalling tunes neurotransmitter release by directly targeting Synaptotagmin-1. Nat Commun. 6, 8302 (2015).
- Dickins, E. M., Salinas, P. C. Wnts in action: from synapse formation to synaptic maintenance. Front Cell Neurosci. 7, 162 (2013).
- Inestrosa, N. C., Varela-Nallar, L. Wnt signalling in neuronal differentiation and development. Cell Tissue Res. 359 (1), 215-223 (2015).
- Galli, S., et al. Deficient Wnt signalling triggers striatal synaptic degeneration and impaired motor behaviour in adult mice. Nat Commun. 5, 4992 (2014).
