Summary
本文概述了一种用免疫荧光法准确识别和分析海马切片突触的协议。
Abstract
在大脑中, 突触是神经元之间的特殊接合点, 决定神经元信号的强度和传播。突触的数量在发育和神经元成熟过程中受到严格的调控。重要的是, 突触数的缺陷会导致认知功能障碍。因此, 对突触数的评价是神经生物学的一个组成部分。然而, 由于突触在完整的大脑中是小而紧凑的, 对绝对数的评估是有挑战性的。本协议描述了一种使用免疫荧光显微镜轻松识别和评价海马鼠切片突触的方法。它包括一个三步的过程, 以评估突触的高品质共聚焦显微镜图像通过分析共存的前后突触蛋白在海马切片。它还解释了如何进行分析, 并给出了有代表性的例子, 从兴奋和抑制突触。该协议为神经突触的分析提供了坚实的基础, 可用于任何研究大脑结构和功能的调查。
Introduction
人脑由大约 1014突触组成。突触数在中枢神经系统的发育和成熟过程中受到严格的调控。在整个发展过程中, 突触数通过突和修剪来调制, 形成功能性神经网络。学习和记忆是由突触数和强度的调节所支持的, 这一过程称为突触增强和抑郁症1。重要的是, 成熟突触的稳定对于维持神经元网络连接至关重要。此外, 在神经退行性疾病 (AD)2的早期阶段, 也报告了突触密度的缺陷。因此, 准确识别和评价突触数的能力是评估脑生理和病理的基础。
突触的极端密度和致密性使得在完整的脑区估计其精确数目具有挑战性。中枢神经系统中的化学突触由两个紧密并列的神经元组成, 由突触分裂的3分离。pre-synaptic 端, 或突触溥, 从轴突产生, 包括累积的囊泡, 其中含有神经递质, 定义突触的特异性, 即谷氨酸和伽玛丁酸 (GABA) 的兴奋性和抑制突触, 分别。囊泡中含有特定于每种神经递质的水泡转运体: 用于 gaba 的谷氨酸和水泡型 gaba 转运蛋白 (vGAT) 的水泡谷氨酸转运蛋白 (vGlut)。后终端是由多种蛋白质组成的高度致密的结构, 包括受体、黏附分子和支架蛋白。在兴奋性突触中, 后 density-95 蛋白 (PSD-95) 是最丰富的支架蛋白4, 调制兴奋性 n-甲基-d-天门冬氨酸 (NMDA) 和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-isoxazolepropionic 酸 (AMPA) 受体功能, 而 gephyrin 锚定抑制受体的抑制后终端5。总的来说, 蛋白质对前后室的特异性有助于突触亚型的分化和鉴定。
对突触数的评价可采用不同的方法进行。最常见的是使用电子显微镜 (EM), 这使得分析的突触在紧凑和完整的脑区, 高放大率和分辨率。然而, 这种技术是非常昂贵的, 需要复杂的样品准备, 是非常耗时。其他技术包括使用阵列层析成像6, 这是一个主要的缺点, 因为它需要专门的和昂贵的设备来执行分析。此外, 表达特定突触标记的转基因线条在评估突触数7时很有用, 但新品系的产生可能是限制性的, 代价高昂的, 而蛋白质的过度使用会导致不良的不相干型.
由于这些限制和简单性, 许多研究人员通过检查突触蛋白水平来评估突触数。然而, 在蛋白质发生重大变化之前, 突触丧失可以观察到, 因为结构突触重塑导致或后并列的扩散, 没有突触蛋白的降解。此外, 在 AD 中, 突触变性或神经元死亡后, 触点蛋白水平降低8,9。总体水平的量化并不能使这种区别。因此, 有必要建立一个可靠的, 容易接近的, 准确的方法来评价突触数在大脑中。
在这篇文章中, 我们描述如何用免疫荧光显微镜在海马鼠脑切片中彻底识别和确定突触的数量。突触的定义是定位前和后标记, 出现在一个有点分布。通过对大脑中 Wnt 信号的研究, 证明了该技术的有效性。Wnts 是分泌蛋白重要的形成, 消除和维持的突触。在体内诱导的 Wnt 叶栅分泌拮抗剂, Dickkopf-1 (Dkk1), 导致兴奋性突触丧失, 同时保留抑制性突触在海马体10。我们说明了在表达 Dkk1 的成年小鼠海马切片中的兴奋和抑制突触的识别和计数, 并强调了这种技术对其他类型组织/培养制剂的可转让性。
Protocol
所有使用小鼠和老鼠的实验都得到批准, 并使用1986《内政部动物 (科学规程) 法》所涵盖的附表1程序进行。人工脑脊液 (ACSF) 配方可以在 表 1 中找到.
1. 急性海马切片准备
- 尽快删除鼠标的大脑, 使用刮刀和锋利的剪刀切割头骨, 并把它放在 ice-cold, 含氧 (95% O 2 , 5% CO 2 ),high-sucrose ACSF (100 毫升).
- 将鼠标的大脑放在培养皿上, 然后用手术刀将小脑和前额皮质的一小部分移除, 然后再 hemisecting 大脑中线.
- 将两个半球放在刚刚切割的一侧, 并将每个半球粘附到 vibratome 的舞台上.
- 剪切 200-300 和 #181; 所有感兴趣区域的 m 厚部分。在海马的情况下, 应该获得大约每半球 3-4 片.
- 使用塑料巴斯德吸管将切片转移到浸没在含氧的腔中 (95% O 2 , 5% CO 2 ) ACSF。保持34和 #176; C 为 30 min.
注: 在这一阶段, 通过将制剂添加到切片室中, 可以对含有活性药理剂 (如重组 Dkk1 蛋白) 的切片进行处理. - 使用画笔从腔室中取出切片, 将其放入24井板中, 并在室温 (RT) 中4% 甲醛 (粉煤灰)/4% 蔗糖中修复20分钟至1小时.
注意: 粉煤灰是有毒的, 穿戴适当的保护. - 在 1X PBS 中清洗切片三次 (每段10分钟).
注意: 只要将切片保留在4和 #176 中, 则可以在这里暂停协议 1-2 天; C 1X PBS.
2。突触标记的免疫荧光分析
注意: 使用的所有缓冲区的食谱都可以在 表 2 中找到.
- 在切片井中用阻塞/permeabilizing 缓冲区 ( 表 2 ) 替换 PBS, 并在 RT 中孵育 4-6 h.
- 在阻断/性缓冲液中稀释1:2、000稀释 vGlut1 多克隆豚鼠抗体.
注: vGlut1 是 pre-synaptic 兴奋性终端可视化的标志。对于后兴奋性突触识别, 使用多克隆抗体抗 PSD-95 和稀释1:500 在同一溶液中。使用最小体积300和 #181; 我在每个井。为了确定海马体的解剖位置, 使用一种抗体, 它也可以识别神经元结构, 如 MAP2 或蛋白。找出正确的浓度的所有主要抗体的突触标记的选择 (前后) 和稀释新的阻断/permeabilizing 缓冲区. - 在4和 #176 中, 在一夜之间 (或在 1-2 天) 内孵育主抗体溶液中的切片; c. 使用震动平台, 剧烈运动.
- 在 PBS 中清洗切片三次 (每段10分钟).
- 在阻塞缓冲区中稀释适当的次级抗体1:500。例如, 当使用 vGlut1 豚鼠抗体时, 应用一种二次抗体, 它可以识别豚鼠的成分 ( 例如, 驴 anti-guinea-猪), 并结合到特定的荧光。当使用 PSD-95 兔抗体时, 应用一种二次抗体, 它可以识别兔子成分 ( 例如, 驴兔), 并将其共轭到不同的特定荧光.
- 在 RT 中对此解决方案中的切片进行 2-3 小时的孵育. 确保切片不受光照的保护, 因为二级抗体对光敏感.
- 在 PBS 中清洗切片三次 (每段10分钟).
- 使用画笔小心地从24个井板中取出切片, 并将它们均匀地放在 pre-labelled 的玻璃幻灯片上。在每个切片的顶部添加一滴安装介质, 然后轻轻地将玻璃片放在切片的顶部。避免气泡的形成。注意使用足够的安装介质 (300-400 和 #181; L), 因为数量不足可能导致干燥切片.
- 在 RT 中保持至少 1-2 天的干燥状态, 并使幻灯片免受光照的保护.
- 将幻灯片存储在4和 #176; c 在短期内, 但对于长期存储, 请将其保持在-20 和 #176; c.
3。共焦图像采集和分析
- 成像使用共焦激光扫描显微镜.
- 通过10x 或20x 目标标识要成像的海马区 ( 例如, 角海马1和 3 (CA1、CA3) 或齿状回 (DG)).
- 更改为40x 或63x 的浸油目标, 以确定连续的突起和有组织的结构, 以确保切片解剖的完整性。使用神经元标记 (如 MAP2) 作为参考 ( 图 1A ).
- 随后, 切换到60x 油浸目标 (NA = 〜 1.3-1.4), 并调整每个通道的设置以获得最佳信号和对比度。设置每个激光的强度, 以避免使用高/对比选项的任何像素的饱和度.
注意: 这些设置将取决于所使用的显微镜, 但请参阅 图 2 中使用的激光电源设置的 材料表 , 图 3 和 图 4 。为取得最佳效果, 请使用 1024 x 1024 像素分辨率。在同一实验的不同条件下, 设置应保持不变。如果需要, 可以应用其他缩放. - 评估染色均匀的深度, 并获取至少8等距 (250 nm) 平面的图像堆栈。然后从每片相同的感兴趣区域中取3相邻的代表图像堆栈.
注: 深度可能因切片而异, 但应始终为大约 2-5 和 #181; m 从切片的表面. - 按每个条件至少3片重复采集, 每个治疗组 6-8 动物.
- 图像分析.
注意: 使用自动图像分析软件 (请参见 材料表 )。请注意, 有些系统需要许可证, 而另一些则是免费的, 例如 ImageJ。使用的软件必须在3D 中考虑到堆栈图像的所有平面。有关在图像分析中使用的软件的详细信息, 请参阅 材料表 ( 图 1 )。- 使用为强度阈值协议来识别所有突触点和神经元标记, 它们是在软件中手动优化和选择的 (请参见 材料表 中的特定软件协议].
注意: 该软件为每个荧光标识一个最小和最大强度, 并将每个被识别对象的强度百分比关联起来。请注意, 强度的百分比将根据所使用的荧光和对突触标记的抗体而变化. - 对于突触标记, 请确保在软件中选择大小过滤器 (#62; 0.1 和 #181; m 3 和 #60; 0.8 和 #181; m 3 ), 并将其应用于映像。调整参数以确保所选对象不重叠。排除任何太大或太小而不能被视为突触点的对象 (请参见 图 2B ).
注意: 一旦经过优化, 相同的阈值将被应用到给定实验中的所有图像中. - 使用软件中选择的优化阈值协议, 对单个突触点 (或后) 的平均数、强度和体积进行量化。将点数字规范化到图像字段的体积 (大约16928和 #181; m 3 在此处使用的系统中)。将突触点强度正常化为参考神经元标记的强度.
注: 突触被定义为两个前后标记之间的共存。一旦后前点 h 的阈值协议建立, 软件应确定共存的突触点作为重叠的1像素或以上的单一平面.
注: 对于统计分析, 确认所有样本均遵循 Lilliefords 和 #967 所确定的方差的常态和均匀性; 2-测试分别。如下所述, 应通过参数测试分析显示正态分布和方差均匀性的样本。例如, 兴奋性突触点分析应使用 one-way 的变异因子进行阻断和复制。每个单独的实验应该被认为是一个块;通常, 有三独立的实验, 每一个 1-3 的老鼠从每个条件.
- 使用为强度阈值协议来识别所有突触点和神经元标记, 它们是在软件中手动优化和选择的 (请参见 材料表 中的特定软件协议].
图 1: 基于图像分析的突触点分析软件和 #160; ( ) 强度阈值协议自定义的屏幕快照。给出的例子是 PSD-95, 其中所选的点具有定义的大小和 #62; 0.1 和 #181; m 3 和 #60; 0.8 和 #181; m 3 和当前最小化的重叠对象。请注意, 显示的图像是一个共焦平面, 使突触点和准确的参数选择更容易可视化。( B ) 软件分析输出的屏幕快照 (在选择优化协议之后)。一个例子的原始突触点数字测量的基础上的体积。然后将这些值导出到电子表格软件。 请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 突触点的切片和参数设置的质量检查。( a ) 具有代表性的感兴趣区域的共焦图像 (40x 目标): 海马切片的 CA1 层 radiatum (sr) 和地层 oriens (如此) 通过 MAP2 染色进行识别。缩放条形图 = & #160; 2 和 #181; m. ( B ) 共焦图像 (60x 目标和获取软件上的额外1.3X 放大倍数) CA1 地层 radiatum, 兴奋 markers-vGlut1 (绿色) 和 PSD-95 (红色)-从海马切片。注意明确前后和点的识别。点大于0.8 和 #181; m 3 从量化 (白色箭头) 中排除。缩放条形图 = & #160; 2 和 #181; m (C) 共焦图像 (60x 目标和在采集软件上增加1.3X 放大率) CA1 地层 radiatum, 兴奋 markers-vGlut1 (绿色)-从低温切海马部分从整个大脑固定在粉煤灰。注意存在大孔和不规则, 成群 vGlut1 染色。标尺 = & #160; 2 和 #181; m. 请单击此处查看此图的较大版本.
Representative Results
神经退行性病变早期发生于 AD 和帕金森氏病等神经系统疾病2,11,12。然而, 这些赤字背后的分子机制仍未得到很好的理解。Wnt 信号的缺陷与 AD13、14、15、16、17有关。Wnts 是分泌的糖蛋白和发挥重要作用的突触形成和调制的突触传输18,19,20,21。最近, 我们发现 Wnts 作为神经突触维护的关键调节器在成熟神经系统10,22。为了准确地研究 Wnt 信号对转基因小鼠海马突触的影响, 我们利用脑切片制备和共聚焦显微镜对突触数的变化进行了评价。我们确定了健康的切片, 其中结构保存完好 (图 2A)。此外, 对突触点的选择进行了仔细的定义, 排除大的染色对象可能代表聚集的蛋白质 (图 2B)。该判据适用于所有图像, 并具有相同的严格分析参数。
我们使用一个转基因模型系统, 诱导在四环素控制下的成年小鼠 (iDkk1) 分泌的 Wnt 拮抗剂 Dkk1 的表达 (见材料表)10,22。我们证明, 阻断 Wnt 信号在成年海马触发兴奋性突触损失, 特别是在 CA1 地层 radiatum 地区 (图 3)。图 3A说明了具有代表性的兴奋和后标记 (分别为 vGlut1 和 PSD-95) 的共焦图像, 它们从 iDkk1 鼠的海马切片中获得, 表达 Dkk1 两周, 以及它们各自的控制。我们使用 Volocity 软件对这些图像进行分析, 并证明了点小鼠海马 CA1 区共存 vGlut1 和 PSD-95-labeled iDkk1 的兴奋性突触数量显著减少。诱导 Dkk1 两周 (图 3B, * p 和 #60; 0.05;克鲁斯卡尔-瓦利斯试验;每型6只小鼠)。在 CA1 地层 radiatum, 兴奋性突触点数每1000µm3减少了500的控制小鼠到300在 iDkk1 小鼠。相反, 诱导 Dkk1 表达不影响抑制突触的数量 (由共存之间的后标记 vGAT 和 gephyrin 分别确定), 如图 4A-b所示 (p & #62; 0.05;克鲁斯卡尔-瓦利斯试验;每型3只小鼠)。
重要的是, 我们进行了统计功率分析, 以估计适当数量的切片和动物所需的产生这些可靠的结果。使用 R, 我们计算, 每个条件需要大约35片 (3 图像 x 3 切片 x 6 动物 = 36), 以检测一个大的影响大小 (f = 0.4) 与80% 信心 (功率 = 0.8) 在 one-way 方差分析与阻塞和复制, 如步骤3.2.6 中所述。
图 3: iDkk1 小鼠海马切片的兴奋性突触丧失.(A) CA1 层 radiatum 的具有代表性的共焦图像显示兴奋性突触, 由 vGlut1 和 PSD-95 之间的共存 (白色箭头) 识别。下面板表示突出显示的矩形的放大倍数。缩放条形图 = 2 µm. (B) 控制和 iDkk1 之间兴奋性突触的百分比是使用材料表中提到的软件 (* p & #60; 0.05;克鲁斯卡尔-瓦利斯试验;每型6只小鼠)。数据代表± SEM。此图已从引用10中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: iDkk1 小鼠的海马切片中的抑制突触不变.(A) 具有代表性的 CA1 层 radiatum 的共焦图像, 由共存之间的 vGAT 和 gephyrin (白色箭头) 识别的抑制性突触。下面板表示突出显示的矩形的放大倍数。缩放条形图 = 2 µm (B) 控制和 iDkk1 小鼠之间的抑制性突触百分比, 使用 Volocity 软件进行量化 (p & #62; 0.05;克鲁斯卡尔-瓦利斯试验;每型3只小鼠)。数据代表± SEM。此图已从引用10中进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本.
| 高蔗糖 ACSF 成分 | 浓度 | 注意 |
| nacl | 75毫米 | |
| NaHCO3 | 25毫米 | |
| 氯化钾 | 2.5 毫米 | |
| NaH2PO4, 2H2O | 1.25 毫米 | |
| Kynurenic 酸 | 1.25 毫米 | |
| 丙酮酸 | 2毫米 | |
| edta | 0.1 毫米 | |
| CaCl2 | 1毫米 | 溶液加氧后添加 |
| 氯化镁2 | 4毫米 | 溶液加氧后添加 |
| d-葡萄糖 | 25毫米 | |
| 蔗糖 | 100毫米 | |
| 沉水室 ACSF 组件 | ||
| nacl | 125毫米 | |
| NaHCO3 | 25毫米 | |
| 氯化钾 | 2.5 毫米 | |
| NaH2PO4, 2H2O | 1.25 毫米 | |
| CaCl2 | 1毫米 | 溶液加氧后添加 |
| 氯化镁2 |
表 1: ACSF 组成。
| 阻塞/permeabilizing 缓冲区 | 浓度 | 注意 |
| 驴血清 | 10% | |
| 海神-X | 0.50% | |
| pbs | 1x | |
| 10x PBS | pH 值为7。4 | |
| nacl | 1.37 M | |
| 氯化钾 | 27毫米 | |
| NaH2PO4 | 100毫米 | |
| 2PO4 | 18毫米 | |
| 4% PFA/4%sucrose | pH 值为7。4 | |
| pbs | 1x | 从10x 稀释 |
| 粉煤灰 | 1.33 M | |
| 蔗糖 | 117毫米 |
表 2: 用于荧光染色的缓冲器。
Discussion
对突触数的精确评估是神经科学领域的关键。在这里, 我们展示了如何评价 CA1 层 radiatum 区的突触密度作为一个模型系统。关于现有方法的意义, 在我们最近的一篇关于海马 Wnt 缺乏效应的研究中得到了证明, 我们也通过开路 EM10来评估突触数。突触损失的大小类似于开路 EM 和脑切片方法在这里描述的10。因此, 这一发现证明了该技术的准确性和可靠性。
重要的是, 开路 EM 和免疫突触的限制, 如这里所介绍的, 是无法准确估计的绝对突触数的特定大脑区域。事实上, 确定任何全球性的形态学变化是很重要的, 因为总体积的变化会影响突触的数量。另一个限制是, 某些抗体是不太有效的染色完整的脑区, 部分由于极端密度突触连接。我们经历了更高质量的染色 vGlut1 和 gephyrin 使用此切片准备和后续的粉煤灰固定最多1小时, 与即时固定的整个大脑在煤灰 (图 2C)。后者导致成群突触染色, 在组织中有孔。尽管如此, vGlut1 抗体的渗透仍然是限制在两种方法 (一对夫妇几十微米)。我们没有克服这个限制, 即使增加了抗体的培养, 但提供的抗体渗透大于总深度, 是成像, 不应该对最终结果的影响。此外, 应特别小心, 以确保染色甚至在整个获得的堆栈。
在我们的研究中, 我们想区分兴奋和抑制性突触。因此, 我们分别选择了 vGlut1/PSD-95 和 vGAT/gephyrin, 因为这些蛋白在成年小鼠海马中有很高的表达, 并且特定于每个突触子类型4,5。其他兴奋和抑制突触标记可以用来识别每个突触, 如在每个突触丰富的受体, 包括 NMDA 和 AMPA 受体的兴奋和 GABAA 受体抑制突触。其他的神经递质或调也可以与我们的协议, 以确保特定的抗体是可用的, 如在纹状体的多巴胺突触的显示22。此外, 减少每个切片的厚度到120µm 可以部分克服低数量的样品获得的急性切片, 这是必要的研究小大脑结构, 如杏仁核。
我们的议定书的未来应用可以在研究不同的脑区和疾病。例如, 在纹状体 (大脑中与帕金森病相关的区域), vGlut2/PSD-95 或 vGlut1/PSD-95 的组合可以用来区分从皮层或丘脑传入来的兴奋性突触,分别为22。
最后, 我们已经证明了一种可靠的方法来检查脑组织中的突触数量, 使用前后标记来定义突触。关键步骤包括制备良好的海马切片, 在粉煤灰中固定时间长达1小时, 应用足够的安装介质, 使用可靠的抗体, 适当的图像采集设置, 以及严格的突触点检测。最终, 这种方法是相对较快的, 很容易重现的任何实验室可以获得共焦显微镜。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了湄公河协会、欧盟 FP7、ARUK、惠康信托和帕金森英国的支持。我们还要感谢 Ms. Buchler 对共焦图像和实验室成员在手稿和方法方面的建设性投入的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
| Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
| Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
| Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
| Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
| Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
| Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
| Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
| Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
| Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
| Super Glue | Loctite | 1446875 | |
| 95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
| 24-well plate | Corning | 3524 | |
| Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
| Petri Dish | Corning | 430167 | |
| iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for solutions: | |||
| NaCl | Sigma | V800372 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
| Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| D-Glucose | Sigma | G5767 | |
| Sucrose | Sigma | S8501 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
| PFA | Sigma | P6148 |
References
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